Système endocrinien

Pour calculer des marges de sécurité avant la première administration de médicaments à des êtres humains, 720 souris, 840 rats et 800 lapins vont être utilisés dans 65 études, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent les composés par voie orale, intramusculaire, sous-cutanée ou intraveineuse, sur des durées allant d'un jour à six mois, avec prélèvements de sang, de tissus, de fèces, d'urine, de salive et de larmes. Des mises à mort intermédiaires sont prévues pour prélever les tissus aux différents temps de l'étude. Le porteur écrit à deux reprises que ce projet est "indispensable" à la première administration chez l'humain, sans que la nature des composés testés soit précisée.

Objectifs

L'objectif de ce projet est de déterminer les propriétés pharmacocinétiques et pharmacodynamiques d'un ou plusieurs composés pharmaceutiques après administration unique ou répétée chez des rongeurs ou des lagomorphes. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme, conformément aux lignes directrices ICH S3 M2 et ICH S3 (TK).

Bénéfices attendus

L'ensemble des études du projet vise à identifier un profil métabolique, pharmacocinétique, pharmacodynamique de biodistribution permettant le calcul de marge de sécurité chez l'Homme en gardant à l'esprit en permanence le ratio bénéfice/risque du produit concerné pour la santé humaine. La réalisation de ce projet est indispensable à la réalisation de la première administration chez l'Homme.

Procédures

Les animaux sont traités par différentes voies (principalement orale mais aussi intramusculaire, sous- cutanée ou intraveineuse…) de façon journalière (voire plusieurs fois/j) hebdomadaire, ou de manière plus espacée (ex: toutes les 2 semaines, mensuel), avec le(s) produit(s) d’intérêt. La durée de l’administration est généralement rapide (quelques secondes à quelques minutes) et peut atteindre 1 heure dans le cas de perfusion intraveineuse. La durée des études peut être courte (1j) ou longue [1 semaine, 2 semaines, 1, 3, ou 6 mois]. Des prélèvements sanguins, tissulaires, de fèces, urinaires ou/et de fluides corporels (salive, larmes) seront réalisés au cours du temps et analysés afin de déterminer les niveaux du ou des composés administrés, de leurs métabolites ou d’autres marqueurs pharmacologiques pour permettre l’analyse pharmacocinétique, pharmacodynamique et de biodistribution. D’autres prélèvements sanguins ou urinaires sont également possibles pour bilan urinaire, hémato-biochimique ou hormonal par exemple. L’ensemble de ces prélèvements sont réalisés à une fréquence et aux volumes conformes aux recommandations éthiques en vigueur. Tout prélèvement dépassant ces recommandations devra être justifié et fera l'objet d'une réévaluation par le comité d'éthique (balance bénéfice/contrainte pour l'animal). Les animaux seront examinés quotidiennement afin de déceler tout signe clinique. Les consommations alimentaire et/ou hydrique pourront être suivies. Des examens ophtalmologiques, échographiques, radiologiques, comportementaux peuvent être réalisés. Le poids corporel sera mesuré à différents temps au cours du projet. Les animaux seront euthanasiés à la fin du projet et un examen microscopique sera réalisé sur les tissus collectés si nécessaire. La manipulation des animaux durant les interventions est généralement inférieure à 1h/animal/jour (en considérant par ex. 1 journée avec 1 administration + 6 prélèvements sanguins soit environ 30 min). Jusqu’à une vingtaine d’interventions peuvent être réalisées par animal et par semaine (en considérant par exemple 1 administration quotidienne et 12 prélèvements sanguins dans la semaine). Une mise en diurèse n’excédant pas 16h est aussi possible. Une mise à jeun temporaire (en présence d’eau) peut être nécessaire (maximum 16h) pour les rongeurs. Dans certaines situations, les animaux peuvent être soumis à un hébergement individuel dans leur cage (en cas d’agressivité ou de soins individuels par exemple).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus correspondent aux effets pharmacologiques du produit administré (ex : action au niveau du système nerveux central), à l’inconfort, au stress et/ou à la douleur transitoires liés aux procédures [prélèvements, administration répétée, contention, mise à jeun éventuelle (uniquement pour les rongeurs)] et/ou aux effets systémiques (exemples : pertes de poids, baisse de consommation alimentaire) qui peuvent être observés. Un hébergement en individuel (rare), avec contacts olfactifs, visuels et sonores préservés et enrichissements additionnels, peut être requis (ex. pour suivre la consommation alimentaire individuelle ou pour des études par voie dermale).

Devenir

En parallèle des prélèvements sanguins, réalisés au cours de l’étude, l’évaluation de la pharmacocinétique, de la pharmacodynamie et de la biodistribution, peut nécessiter des euthanasies intermédiaires afin d’effectuer des prélèvements tissulaires et/ou une analyse histopathologique selon les différents temps de prélèvements définis dans l’étude. Ceci pour permettre l'évaluation de l'exposition du composé ou des composés dans le tissu cible, et /ou pour évaluer les potentiels effets toxiques sur les organes et tissus, respectivement. A ce titre tous les animaux de ce projet seront euthanasiés en fin d’étude.

Remplacement

L'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution d'un composé ou de plusieurs composés administrés dans un organisme complet ne peut pas être réalisée qu'avec des études in vitro, car il n'existe pas d'alternative complète in vitro pour ce type d'évaluation en raison de la complexité d'un organisme vivant. Seule l’observation sur un organisme vivant dans son ensemble permet d’évaluer les différentes phases d’absorption, de métabolisme, de distribution et d’élimination du/des composé(s), de définir les relations et/ou interactions entre ces différentes phases et de pouvoir déterminer l’exposition du/des composé(s) administré(s) dans l’organisme.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est très variable en fonction du design de l’étude et du nombre de doses testées. En effet, des animaux des deux sexes seront utilisés uniquement pour permettre l'évaluation de l'effet du sexe sur les paramètres pharmacocinétiques et pharmacodynamiques et sur la biodistribution. Par ailleurs, il peut y avoir une comparaison avec des composés de référence, un criblage de plusieurs produits, etc. Mais le nombre d’animaux par groupe correspondra au minimum permettant une analyse statistique fiable, conformément aux recommandations des lignes directrices. Ce projet permettra de réaliser 65 études, 35 chez le rat; 10 chez la souris et 20 chez le lapin, avec un nombre d'animaux déterminé à minima afin d'obtenir des résultats robustes et fiables permettant d'atteindre tous les objectifs de l'étude en procédant à toutes les analyses nécessaires.

Raffinement

En général, les doses utilisées sont des doses pharmacologiques, faibles et similaires à celles utilisées chez l'Homme. L'état général des animaux est surveillé quotidiennement. Les paramètres suivants peuvent être contrôlés régulièrement afin d’évaluer l’état de santé des animaux : poids corporel et consommation de nourriture et d’eau, température corporelle, signes cliniques, morbidité/mortalité, etc. Toute anomalie est signalée au Directeur d’étude et/ou au vétérinaire selon la sévérité et le degré d’urgence. Si un ou plusieurs points limites sont atteints (perte de poids continue, signes locaux ou généraux ne pouvant être traités/soulagés par des soins (ex : antibiotique/anti- inflammatoire), que la douleur de l’animal ne peut être soulagée ou que l’inconfort ne peut pas être suffisamment limité à son minimum, la décision d'interrompre le traitement ou d'euthanasier l'animal sera prise. Des prélèvements sanguins seront effectués selon les bonnes pratiques vétérinaires de fréquence et de volume. Certains traitements sont réalisés sous anesthésie locale ou générale pour éviter le stress, le douleur ou l’inconfort, par ex : les administrations intramusculaires et intra-articulaires. Les rongeurs et les lapins sont hébergés en groupe dans la majorité des situations. Cependant, soit en raison d'incompatibilités sociales observées parfois chez le lapin ou les souris mâles, soit dans certaines situations expérimentales rares (rongeur uniquement) un hébergement individuel peut être nécessaire. Il devra être dûment argumenté (ex : voie d’administration dermale, bilans d'élimination en collectant les urines et fèces). Le cas échéant, des enrichissements supplémentaires seront proposés et le contact visuel et olfactif sera maintenu.

Choix des espèces

Les espèces rat, souris et lapin sont des espèces de laboratoire très largement utilisée en recherche biomédicale (littérature et connaissance très larges) et sont couramment utilisées pour l'évaluation pharmacocinétique, pharmacodynamique et de la biodistribution et acceptées par les autorités. Le choix de l’espèce/souche est dicté par différents facteurs : résultats déjà existants (essais préliminaires in vitro et in vivo), voie d'administration choisie, métabolisme vitro et/ou pharmacocinétique/pharmacodynamique. De façon standard, les rats, souris et lapins seront âgés de 6 à 10 semaines, 6 à 8 semaines et 3 à 4 mois, respectivement, correspondant à un niveau « jeune adulte » de croissance et de développement nécessaire et suffisant pour conduire les expérimentations. Toutefois, ce projet pourra être effectué avec des animaux juvéniles ou avec des animaux plus âgés (> 1 an) en fonction de l’objectif de l’évaluation et de manière à ce que l’état physiologique de l’animal permette une réponse non équivoque des systèmes analysés après traitement avec le(s) composé(s) et ainsi permettre une évaluation adéquate des paramètres ciblés. Les animaux ne doivent pas être gravides.

Nourries vingt semaines à un régime gras jusqu'à l'obésité et au diabète, puis gavées chaque jour pendant vingt-huit jours et isolées en cage individuelle sur toute cette période, 220 souris subissent aussi quatorze incisions de la veine de la queue pour mesurer leur glycémie. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que le régime peut altérer les capacités motrices au point de rendre l'animal incapable d'accéder à la nourriture et à la boisson, créer un état dépressif et de l'anxiété, et que l'hébergement individuel sera "source d'angoisse prolongée". Toutes sont tuées à la fin de la procédure pour les analyses post-mortem.

Objectifs

La prévalence mondiale de l’obésité est en constante progression. L'obésité est un facteur de risque majeur pour le développement du diabète de type 2 et de perturbations cardiométaboliques dont la MAFLD (Metabolic dysfunction-Associated Fatty Liver Disease). Cette pathologie est principalement caractérisée par une profonde perturbation du métabolisme du foie et par un développement de fibrose. Actuellement, aucune approche médicamenteuse efficace n’est commercialisée à l’heure actuelle. L’objectif de notre projet est d’étudier les potentielles interactions entre 2 cibles thérapeutique sur l’évolution de fibrose dans un modèle de souris souffrant de MAFLD.

Bénéfices attendus

La prise en charge et le traitement du diabète de type II et de ses complications est un enjeu de santé publique de plus en plus prégnant. Les stratégies médicamenteuses bien que multiples voient leurs limites dans le fait qu’elles ne ciblent généralement qu’un récepteur et donc qu’un point précis du métabolisme, limitant ainsi leur efficacité. Ce projet permettra de nous renseigner sur le réel potentiel thérapeutique d’une double approche pharmacologique dont les deux stratégies ont déjà chacune démontré des effets hépato-protecteurs. Ceci pourrait avoir un réel impact pour les patients.

Procédures

Pendant les 20 premières semaines de la procédure, les souris seront manipulées hebdomadairement pour monitorer leur masse corporelle. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 10 minutes par souris cette période. Pendant les 28 jours de traitements pharmacologique, la masse corporelle sera évaluée quotidiennement. Cette action mécanique durera 30 secondes par souris à chaque fois, soit un total de 14 minutes par souris cette période. De plus, l’administration quotidienne des traitements pharmacologiques par gavage oro-pharyngé nécessitera l’immobilisation de chaque animal pendant 10 secondes supplémentaires, soit 19 minutes au total par animal sur cette période et 29 minutes sur l’ensemble du projet. Pour chaque test nécessitant une mesure de glycémie, une petite incision à la veine caudale sera réalisée après avoir appliqué un anesthésique local afin de prélever du sang total et ainsi réaliser une mesure à l’aide du glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle).

Impact sur les animaux

En plus d’une altération des paramètres métaboliques, un régime gras de longue durée peut entrainer une prise de poids importante et altérer les capacités motrices de l’animal au point de le rendre incapable d’accéder à la nourriture et la boisson. Le régime gras peut également altérer la santé mentale des animaux et créer un état dépressif et de l’anxiété. Enfin, l’hébergement en cages individuelles pendant les 28 derniers jours de la procédure sera source d’angoisse prolongée.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.

Remplacement

L’obésité, le diabète de type 2 et le développement de MAFLD sont le fruit de dérégulations multifactorielles entraînant une élévation incontrôlée du glucose sanguin et une perturbation de l’homéostasie lipidique ayant des conséquences dramatiques sur de nombreux tissus et organes. Afin d’étudier ces aspects, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux a été calculé sur la base de projets similaires précédemment réalisés. Grâce à notre expérience du travail sur les molécules antidiabétiques, nous avons pu au cours des projets réduire le nombre d’animaux par groupe en optimisant les temps et doses de traitement. En effet, il ne nous est plus nécessaire de réaliser des effets doses, ni de multiplier les temps de traitements, pour un large spectre de molécule, dont celles utilisées dans ce projet. De plus, l’utilisation des animaux a été réfléchie afin qu’un maximum de données soient obtenues avec un minimum de douleurs et de stress pour les animaux. Ainsi des tests in vivo et des prélèvements d’organes seront réalisés chez les mêmes animaux. Pour ces raisons, avec une seule dose et un seul temps de traitement, nous avons réduit le nombre d’animaux pour mener à bien ce projet et obtenir un puissance statistique suffisante.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupe (10 animaux par cages) pendant les 20 premières semaines avec un enrichissement de leur milieu de vie, dans une pièce calme et tempérée. Les aliments et l’eau de boisson seront fournis ad libitum. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins pourront être apportés si l’état de santé des rongeurs le nécessite. Pendant les traitements pharmacologiques, les souris seront amenées à être hébergées de manière individuelle afin de pouvoir monitorer la prise alimentaire quotidienne pouvant être influencée par les différends traitements. Pour chaque cas, un enrichissement plus important sera apporté dans chaque cage. De plus, le contact visuel et olfactif entre animaux sera maintenu via l’utilisation de cages transparentes sans couvercle filtrant.

Choix des espèces

L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées avec des données bibliographiques abondantes ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. Le début du projet fera appel à des souris de 12 semaines. Considérant les 20 semaines de régime WD, les animaux seront âgés de 32 semaines lors du commencement de l’approche pharmacologique et de 36 semaines lors de la fin de l’expérimentation.

Une injection sous la peau tous les deux jours pendant trente-cinq jours, deux passages sur tapis de course, deux gavages au glucose et deux séances d'imagerie sous anesthésie. 256 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour que leurs organes soient pesés et analysés. Elles sont d'abord rendues obèses par douze semaines de régime hyperlipidique, afin de tester une molécule anti-obésité seule ou associée à une molécule de référence. Le porteur résume les nuisances à des injections "pouvant altérer le bien-être" des animaux, écrit être "malheureusement contraint" d'utiliser des modèles animaux, et précise que l'efficacité de cette molécule a déjà été validée in vitro et in vivo par ses collaborateurs américains.

Objectifs

L'obésité est un problème de santé publique majeur et croissant qui est fréquemment associé à des complications métaboliques telles que le diabète de type 2, l'hypertension, des concentrations de lipides élevées dans le sang et les maladies hépatiques. Le développement de nouvelles molécules susceptibles de réguler la prise alimentaire, de réduire la masse grasse et de renforcer la masse musculaire est actuellement en plein essor. L’objectif de ce projet est de tester l'effet d’une nouvelle molécule pharmaceutique d’intérêt donnée seule ou en combinaison avec une molécule de référence.

Bénéfices attendus

Notre étude, en améliorant la connaissance sur les effets et le mode d’administration de nouvelles molécules pour lutter contre l'obésité et ses complications nous permettra de préparer la mise en place d’une étude clinique de phase 1 et à terme une meilleure prise en charge des patients obèses. Cette étude permettra de déterminer si au-delà de la perte de masse grasse attendue, on peut aussi espérer voir une augmentation de la masse musculaire.

Procédures

Les souris recevront tous les 2 jours une injection sous-cutanée sur une période de 35 jours. Des prélèvements de sang ponctuels seront effectuées à j32 et à J53. Les souris subiront deux gavages oraux avec du glucose à jour 32 et 53. Une mesure d'activité physique sur tapis de course sera réalisée à jour 26 et à jour 47. Une mesure de dépense énergétique sera faite à jour 29 et 50. A jour 35 et 56, une acquisition d’images d'une durée de 30 à 40 minutes sera réalisée sur animaux anesthésiés pour déterminer le pourcentage corporel en masse grasse et masse maigre. Un prélèvement sanguin terminal sera réalisé sous anesthésie avant la mise à mort.

Impact sur les animaux

Le protocole comporte des actes (injections sous cutanée) pouvant altérer le bien-être temporaires des animaux et apporter un stress sur une courte durée.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récolter et peser différents organes pour définir les conséquences du traitement et permettre des analyses moléculaires des modifications induites.

Remplacement

Il est à noter que l'efficacité de la molécule a déjà été validé par nos collaborateurs américains via une étude pilote réalisée in vitro et in vivo. Le métabolisme énergétique et le développement de l'obésité est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes et de diverses voies métaboliques. Il est donc actuellement impossible d’étudier ce paramètre d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.

Réduction

Ce projet a été construit avec la volonté de mettre en place et de respecter « la règle des 3 R ». Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en oeuvre. Le nombre d’animaux nécessaires pour chaque expérimentation a été défini en fonction de notre expérience passée et d'un logiciel dédié au calcul d'effectif. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations. Les cages seront enrichies par des frisottis et un dôme en carton. Après une semaine d'adaptation et d'acclimatation, les souris seront nourries pendant 12 semaines avec le régime hyperlipidique. Afin de limiter les souffrances expérimentales, une surveillance attentive et quotidienne des animaux sera réalisée au cours de la procédure. Des signes cliniques définissant les points limites, au-delà desquels l’expérimentation serait arrêtée et l’animal euthanasié, ont été fixés.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser de manière intégré les mécanismes de régulation de l'homéostasie énergétique. Ce modèle nous permet également d’avoir accès à de nombreux outils de biochimie (et/ou de biologie moléculaire qui nous permettront de découvrir de nouveaux déterminants moléculaires. Nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines au moment de la mise sous régime hyperlipidique et la fin des études sera prévue 16 à 19 semaines plus tard. A cet âge, les paramètres métaboliques sont stables et ceci nous permet de réduire les variations individuelles et ainsi le nombre d'animaux requis en expérimentation animale.

Pour établir le rôle de la testostérone dans la réponse à la malnutrition infantile, 44 souris juvéniles sont castrées ou opérées à blanc dès le sevrage, puis nourries cinq semaines d'un régime pauvre en protéines. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré et toutes les souris sont tuées pour prélèvement d'organes. Après six heures de jeûne, chacune est gavée de glucose, la queue incisée, puis saignée dix fois de suite. Le porteur affirme que la castration de souriceaux n'induit pas de conséquences délétères au-delà des suites opératoires attendues, et annonce des points limites "suffisamment prédictifs" qui restent à établir.

Objectifs

La malnutrition infantile est un problème majeur à travers le monde. Elle entraîne un retard de croissance, ainsi qu’un métabolisme altéré chez les enfants. Des études récentes ont suggéré que la réponse à la malnutrition infantile pourrait être différente en fonction du sexe, les garçons étant plus susceptibles que les filles. En accord avec cela, de précédentes études ont permis de montrer qu’un régime alimentaire mimant la malnutrition impactait différemment les souris juvéniles mâles et femelles. En effet, les mâles malnutris souffrent d’un retard de croissance et d’altérations du métabolisme plus importantes que les femelles. Au contraire, l’apparition de la puberté est retardée chez les femelles malnutries mais pas chez les mâles. Notre hypothèse est que les hormones sexuelles (testostérone et oestrogène) régulent cette réponse différente en fonction du sexe. En combinant une approche de castration avec un modèle de régime faible en protéines induisant la malnutrition, l’objectif de ce projet est de caractériser le rôle de la testostérone dans la réponse des mâles à la malnutrition juvénile. La castration est préférée pour avoir une réponse physiologique intégrée de la présence des hormones sexuelles, en plus de l’impossibilité d’implanter de pompes osmotiques contenant des inhibiteurs de la testostérone à cause de la taille trop petite des animaux.

Bénéfices attendus

Les altérations physiologiques induites pas la malnutrition dans un contexte juvénile sont encore mal connues, de même que les mécanismes moléculaires sous-tendant ces altérations. Ce projet permettra d’élucider le rôle de la testostérone dans les adaptations physiologiques à la malnutrition juvénile. Nous pourrons ainsi mieux appréhender la physiologie des animaux juvéniles en contexte de malnutrition, ce qui permettra d’optimiser à long terme la prise en charge des enfants souffrant de malnutrition juvénile

Procédures

Les souris seront nourries soit avec un régime contrôle, soit avec un régime nutritionnel pauvre en protéines, mimant la malnutrition infantile, pendant 5 semaines. Les animaux seront mesurés chaque semaine sous anesthésie générale pendant 3 minutes puis pesés (< 1 min) pendant 5 semaines. Une première moitié subira une castration chirurgicale impliquant une anesthésie générale pendant 20 minutes ainsi qu’une procédure chirurgicale de 15 minutes. L’autre moitié subira une chirurgie contrôle impliquant une anesthésie générale pendant 20 minutes ainsi qu’une procédure chirurgicale de 15 minutes. Dans le cadre d’un test métabolique, toutes les souris seront mises à jeun pendant 6 heures puis gavées avec du glucose, suite à une contention (environ 10 secondes). Elles auront ensuite une incision à la queue (environ 1 seconde) puis subiront 7 prélèvements de sang à la queue (environ 5 secondes par prélèvement) et trois prélèvements additionnels à la queue pour mesurer le taux d’insuline (environ 1 minute). A la fin de la procédure, toutes les souris auront un prélèvement sang en veine sous-mandibulaire sous anesthésie générale (3 minutes d’anesthésie, 30 secondes de prélèvement).

Impact sur les animaux

Les mesures et les pesées engendreront un stress modéré sans douleur associé à la contention de l’animal et à l’anesthésie, pendant une courte durée. L’orchidectomie ou la chirurgie contrôle entraîneront un stress ainsi qu’une douleur modérée de moyenne durée lors du réveil après la chirurgie, limitée grâce à la prise en charge. Le jeûne induit un stress léger sur la souris, sans douleur. Le test de tolérance au glucose induira un stress modéré lié à la contention et au gavage des souris, ainsi qu'une douleur légère de courte durée liée à l'incision d’un bout de queue d’environ 1 mm et une douleur légère liée au prélèvement de gouttes de sang au niveau de la queue. Le gavage des animaux induit une possibilité de fausse route ou irritation à cause de la sonde.

Devenir

L‘ensemble des animaux mis en procédure seront mis à mort en vue du prélèvement des organes d’intérêt.

Remplacement

Cette étude implique une réponse intégrée de l'organisme à l'ingestion de divers régimes alimentaires et à la suppression de la production d’une hormone, ce qui nécessite une étude chez l’animal. Aucun modèle in vitro ne permet de reproduire la complexité d'un organisme dans son entier dans un contexte de malnutrition ni ne permet l'étude des fonctions métaboliques liées à la communication entre plusieurs organes. C'est pourquoi cette étude nécessite l'expérimentation animale. La souris sera utilisée car il s'agit d'un bon modèle pour étudier les modifications induites par une malnutrition protéique sur la croissance et le métabolisme dans un contexte physiologique, ainsi que les conséquences locales et systémiques de ces modifications.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au maximum pour permettre une analyse statistique appropriée, tout en palliant le problème de la variabilité inter-individuelle. Ayant déjà des données solides et reproductibles sur l’effet de la malnutrition protéique chez les mâles juvéniles, la procédure pilote ne comporte qu’un seul groupe que nous comparerons avec nos données précédentes. Pour la procédure complète, le nombre de 10 animaux par groupe a été évalué en prenant en compte la puissance du test statistique souhaité (80%), grâce à nos études précédentes. Le test statistiqueprendra en compte le régime alimentaire et la castration chirurgicale. Dans une optique de réduction, nous allons prélever en fin de procédure l’ensemble des organes qui pourraient nous intéresser (muscle, tissu adipeux par exemple) mais sur lesquels nous n’avons pas prévu de travailler pour le moment et les conserver au congélateur pour d’éventuelles analyses ultérieures. Les mères, qui n'auront pas subi de procédure expérimentale, seront réformées dans l'animalerie et pourront être réutilisées.

Raffinement

La croissance en taille et en poids sera mesurée individuellement chaque semaine. La prise alimentaire sera également mesurée pour vérifier que les animaux s’alimentent correctement, et la nourriture sera mise directement dans la litière au début de la procédure expérimentale afin de faciliter l’accès aux souriceaux qui viendront d’être sevrés. Des points limites suffisamment prédictifs seront établis pour anticiper tout stress et toute souffrance animale afin d'y remédier le plus efficacement possible. En cas d'intervention induisant un biais expérimental trop important, les animaux seront mis à mort. Le protocole du régime expérimental, et le test de tolérance au glucose oral ont déjà été employés au laboratoire et ne devraient pas apporter de souffrance animale. L’orchidectomie sur des juvéniles a déjà été décrite dans la littérature et n’induit pas de conséquences délétères sur les animaux au-delà des effets post-chirurgicaux attendus. L’utilisation de l’anesthésie gazeuse est établie comme permettant une induction rapide des animaux, un ajustement facile de l’anesthésie pendant la chirurgie en fonction de la fréquence respiratoire, et permettant un réveil plus rapide et plus facile pour les animaux. La température des animaux sera contrôlée pendant et après chirurgie pour permettre un rétablissement rapide. L’augmentation du nombre de visites après la chirurgie, et la prise en charge de la douleur avec une grille d’évaluation permettra d’ajuster le traitement pour chaque animal. Les expérimentateurs réalisant la chirurgie seront formés auprès de collaborateurs expérimentés pratiquant cette opération sur des souris juvéniles en amont de la procédure.

Choix des espèces

La souris, qui est un animal omnivore, est un modèle classique en nutrition humaine. En raison de la connaissance de sa physiologie, et des modèles disponibles, il s'agit d'un modèle préclinique de choix afin d’étudier l’effet d’une hormone dans une étude nutritionnelle. Les animaux utilisés seront suivis pendant les 35 jours après le sevrage (procédure commencée à jour 21 ; P21) en fonction du poids du juvénile (poids non inférieur à 8g) jusqu’au jour 56 (P56). L'objectif du projet est d'étudier les effets d’une suppression de la production de testostérone sur le métabolisme et la croissance pendant la période juvénile. Pour cela, les animaux doivent être inclus dans la procédure dès le sevrage, qui est une période clé pour la croissance et le développement du métabolisme énergétique.

Sélectionnés pour deux mutations spontanées qui les rendent obèses et diabétiques, 600 rats reçoivent une à deux administrations quotidiennes du composé à tester, puis cinq prises de sang après six heures de jeûne, avant traitement puis à deux, quatre, six et huit semaines. À six semaines viennent les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, de 210 minutes, la surcharge en insuline pouvant les mettre en difficulté pour revenir à une glycémie normale. Des cathéters sont ensuite implantés dans la jugulaire et la carotide sous anesthésie, avec cinq jours d'isolement, avant un "clamp" terminal de 210 minutes à jeun sous perfusion continue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués pour récupérer tissus et sang, le porteur ne rapportant l'effectif de 600 qu'au besoin de dix animaux exploitables par groupe en fin de clamp.

Objectifs

Le diabète a touché 8,5% de personnes de plus de 18 ans dans le monde. 90% des personnes diabétiques sont atteintes de diabète de type 2, forme de diabète associé à l’obésité. Le nombre de personnes diabétiques ne cesse d’augmenter. Le diabète a des conséquences dramatiques sur le fonctionnement de certains organes comme le foie, le système nerveux, les reins ou le cœur et certaines de ces conséquences sont mortelles. Le diabète de type 2 se caractérise par deux phases, la phase de résistance à l’insuline où les niveaux plasmatiques d’insuline sont très élevés pour essayer de contrer l’hyperglycémie puis au fur et à mesure les cellules béta pancréatiques sécrétant l’insuline se fatiguent, ne sont plus capables de répondre et meurent. On parle alors de phase de dépendance à l’insuline. Plus le diabète de type 2 est traité précocement, moins les conséquences sont dramatiques. Ainsi, il est important de développer des thérapies qui ciblent la phase de résistance à l’insuline. Pour se faire, des animaux rendus obèses et diabétiques par l’apparition de deux mutations spontanées ont été séléctionnées puis reproduits entre eux pour créer une lignée. La résistance à l’insuline peut être évaluée de différentes manières : en réalisant des tests de tolérance à l’insuline et au glucose mais la technique dite "clamp" car elle permet la mesure de la sensibilité à l’insuline au niveau des différents organes et de façon bien précise, en utilisant des radiotraceurs. Ainsi, au cours de ce projet, des rats obèses seront traités ou non par des molécules et leur résistance à l’insuline sera évaluée par des tests de tolérance puis un "clamp".

Bénéfices attendus

Par cette étude, de nouveaux traitements ciblant la résistance à l’insuline et donc les phases précoces du diabète peuvent être trouvés. Également, comme le diabète évolue très vite vers une stade d’insulinopénie, c'est à dire que le corps ne sécrète plus d'insuline, des traitements ciblant les phases plus avancées du diabète peuvent être trouvées.

Procédures

Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles. L'administration dure environ 1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié. Cinq prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal (avant traitement et 2, 4, 6 et 8 semaines après traitement) afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang se fait sur animal vigile et libre de ses mouvements, il est préalablement habitué à ce geste. La prise de sang dure environ 2 minutes par animal, et nécessite que l'animal ait un jeun de 6h. Un test de tolérance au glucose et un test de tolérance à l’insuline pourront être effectués après 6 semaines de traitement, ces tests durent 210 minutes. La surcharge en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant du glucose. L’implantation de cathéters à demeure dans la veine jugulaire et dans l'artère carotide : la chirurgie est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. Les animaux seront hébergés en cage individuelle pendant les 5 jours post chirurgie. Une manipulation de 210 minutes appelée « clamp » est réalisée après 8 semaines de traitement. Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue.

Impact sur les animaux

1 – L’évolution de la maladie liée au phénotype des rats va induire une obésité et donc une baisse d’activité des animaux, lorsque le diabète va s’installer, les animaux vont uriner plus et avoir besoin de s’hydrater plus, ils peuvent également perdre du poids lors des stades plus avancés. 2 – Les traitements : le geste de traitement réalisé à répétition génère un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé. 3 – Les mises à jeun (6h) lors des prélèvements de sang peuvent être une source de stress, notamment pour des animaux diabétiques. 4- Lors de la mesure de la composition corporelle, l'animal est placé dans un tube à contention pendant environ 2 minutes, cela peut engendrer un stress modéré. 5 –La surcharge en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose. 6 – La chirurgie (implantation des cathéters jugulaire et carotide) est faite sous anesthésie et analgésie, par du personnel formé et l’état des animaux est surveillé de près. L’anesthésie et la cicatrisation sont plus difficiles chez un animal diabétique. 7- Les animaux seront hébergés en individuel après la chirurgie pendant 5 jours, cela va induire un stress. 8- Clamp : Pendant toute la durée du clamp, l’animal est à jeun, il est connecté à une perfusion et reçoit de l’insuline et du glucose par voie veineuse de façon continue. Cette manipulation terminale peut être source de stress.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (comptage des radioéléments, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...).

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screening, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. D’ailleurs, la société possède aujourd’hui une plateforme in vitro pour y répondre. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Toutes les étapes de la procédure seront réalisées sur le même animal. Des étapes de screening sont réalisées afin d’obtenir des groupes homogènes et les animaux ayant les meilleurs critères permettant d’avoir des données fiables et exploitables en fin d’étude et d’éviter de répéter plusieurs fois la dite étude. Nous effectuerons des tests statistiques, le nombre de données par groupe nécessaire pour être statistiquement robuste et donc pouvoir conclure sur l’effet d’un traitement est de 10 en fin de clamp.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rats de les mordiller. Après chaque prélèvement de sang, nous ajouterons des rouleaux de coton en guise de « récompense ». La durée de ces projets étant longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. La chirurgie sera effectuée sous une couverture analgésique adaptée. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre plusieurs des points limites définis, l'animal serait euthanasié. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de soluté de réhydratation est envisagée. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante. Les prélèvements de sang effectués en cours d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques.

Choix des espèces

L’espèce a été choisie car son phénotype altéré induit le développement d’un diabète et de l’obésité sous régime normal avec une phase d’hyperinsulinémie à 5-7 semaines d’âges et une phase d’insulinopénie à l’âge de 13-15 semaines. Le rat est une espèce adaptée pour l’étude de la résistance à l’insuline par clamp lors de son jeune âge puisque les données obtenues sont assez homogènes. La chirurgie pour la mise en place du cathéter impacte très peu l'obésité et la résistance à l'insuline. Lors des âges plus avancés, ces rats spontanément diabétiques et obèses développent un diabète avec une insulinopénie et une mort des cellules béta ce qui permet d’identifier ce modèle de rat comme étant adapté pour l’étude des stades avancés du diabète. Ainsi, il permet aussi d’évaluer l’effet préventif de certains traitements sur l’évolution du diabète. L’espèce a été choisie car son phénotype altéré induit le développement d’un diabète et de l’obésité sous régime normal avec une phase d’hyperinsulinémie à 5-7 semaines d’âge et une phase d’insulinopénie à 13-15 semaines d'âge.

Pendant les tests de tolérance au glucose et à l'insuline, la glycémie est suivie en cinétique et du glucose est administré si le seuil défini est franchi. 644 souris génétiquement modifiées pour développer de l'athérosclérose vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Elles subissent des contentions et des injections intrapéritonéales jusqu'à trois fois par semaine, un gavage, deux mises à jeun de cinq heures, des prélèvements de sang à la queue par microcoupure et un prélèvement rétro-orbitaire sous anesthésie. Le porteur annonce un effectif calculé par analyse de puissance sans donner ni le nombre de groupes ni le nombre d'individus par groupe.

Objectifs

L’obésité est associée à une augmentation du risque de développer des maladies cardiovasculaires, en particulier des pathologies des artères du cœur (maladie coronarienne) ou des artères carotides, pouvant entraîner l’infarctus du myocarde ou des accidents vasculaires cérébraux. Ces maladies des artères sont causées par la formation de plaques d’athérome (ou athérosclérose). L’athérosclérose est caractérisée par une réaction inflammatoire chronique dans la paroi des artères, impliquant divers types de cellules immunitaires, dont les macrophages. Cependant, l’impact de l’obésité sur la fonction des macrophages dans l’athérosclérose reste méconnu. Ce projet a pour objectif de (i) caractériser avec précision les macrophages vasculaires dans un modèle combinant l’obésité et l’athérosclérose chez la souris et (ii) évaluer le ciblage thérapeutique des macrophages dans le traitement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité chez la souris, et utilisera pour ce faire un modèle d'athérosclérose associé à l'obésité induite par des régimes particuliers riches en gras et/ou cholesterol. Ce projet nous permettra d’approfondir les connaissances concernant l’impact de l’obésité sur les mécanismes inflammatoires de l’athérosclérose et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité thérapeutique du ciblage des macrophages dans le développement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra d’approfondir les connaissances concernant l’impact de l’obésité sur les mécanismes inflammatoires de l’athérosclérose et de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques potentielles. Ce projet permettra également d’évaluer l’efficacité thérapeutique du ciblage des macrophages dans le développement de l’athérosclérose dans un contexte d’obésité.

Procédures

-Contention (maximum 3 fois par semaine; quelques secondes) -Injections intrapéritonéales (maximum 3 fois par semaine; quelques secondes) -Injections intraveineuses sous anesthésie (1 fois, quelques secondes) -Gavage par sonde gastrique (1 fois, quelques secondes) -Prélèvement de sang à la queue sur souris vigiles (2 fois prélèvements répétés sur une période de 2 heures) -Mise à jeun (2 fois 5 heures) -Individualisation pendant les tests de tolérance au glucose ou à l'insuline (2 fois; environ 2h)-Anesthésie (1 fois; quelques minutes) -Prélèvement sanguin rétroorbital sous anesthésie (1 fois; quelques secondes)

Impact sur les animaux

Inconfort lié à la préhension et contention des animaux (nuisance légère de courte durée); injections intrapéritonéales : douleur de courte durée au point d'injection (nuisance légère de courte durée); inconfort lié au gavage du glucose lors du test de tolérance au glucose (nuisance légère de courte durée); prélèvement de sang lors des tests d’intolérance au glucose et à l’insuline: douleur de courte durée au site de prélèvement par microcoupure de la pointe de la queue (nuisance légère de courte durée); mise à jeun des souris avant tests d’intolérance au glucose et à l’insuline: stress liée au retrait temporaire de la nourriture (nuisance légère de courte durée); stress lié à l'individualisation des animaux durant la durée des tests de tolérance à l'insuline et au glucose (nuisance légère de courte durée)

Devenir

Tous les animaux sont mis à morts à la fin de la procédure. La mise à mort est nécessaire pour prélèvement d'organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Les questions scientifiques adréssées dans ce projet ne peuvent l'être que grâce à l'utilisation d'un modèle animal in vivo. En effet, l’athérosclérose et l’obésité sont des maladies impliquant divers organes et types cellulaires interagissant de manière complexe. Les mécanismes cellulaires et moléculaires de l'athérosclérose et de l’obésité doivent être étudiés dans un modèle qui imite le plus fidèlement possible la pathologie humaine. Actuellement il n'existe pas de système in vitro qui reproduise, imite ou permette la modélisation des interactions cellulaires et moléculaires qui conduisent au développement de l’obésité et de l’athérosclérose. L’expérimentation in vivo est également le seul modèle permettant d’appréhender l’intégration et la participation d’acteurs de différents tissus dans une même pathologie. Les modèles in vivo sont donc une étape indispensable dans la compréhension des mécanismes impliqués dans l’obésité et l’athérosclérose, ou pour évaluer le potentiel effet de nouvelles approches thérapeutiques.

Réduction

Nous avons déterminé un nombre minimum de souris par groupes expérimentaux pour garantir une analyse statistique fiable, à partir de calculs statistiques (analyse de puissance) et à partir de notre expérience préalable sur les méthodes utilisées dans ce projet. Les données obtenues seront analysés à l'aide de tests statistiques prédéfinis et appropriés. Des mesures spécifiques sont mises en oeuvre pour éviter les biais expérimentaux: randomisation, analyse des données "en aveugle". Nous visons toujours à maximiser l'information qui peut être récupérée à partir d'un seul animal.

Raffinement

Les animaux sont maintenus dans des groupes de plusieurs individus dans un environnement enrichi. Un enrichissement complémentaire spécifique à la procédure sera implémenté : bâtonnets de bois pour éviter la pousse ou abrasion dentaire anormale des animaux sous régime riche en gras (aliment mou). Lors des procédures expérimentales, les nuisances seront réduites au maximum par l'utilisation de protocoles d’anesthésie adaptés et l’établissement de points limites stricts et adaptés aux procédures. Pour la procédure des tests métaboliques de tolérance à l'insuline et au glucose, la glycémie sera suivie en cinétique et l'apport de glucose sera réalisé si nécessaire en fonction des points limites définis. Les animaux feront l’objet d’une surveillance par les expérimentateurs pour repérer l’éventuelle apparition de signes cliniques de souffrance ou de mal-être.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de l’athérosclérose dans un organisme biologique complexe, développant une pathologie présentant des similitudes à l'athérosclérose humaine. Les souris génétiquement modifiées présentant une prédisposition à l'athérosclérose utilisées dans ce projet représentent un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche, ce qui permettra une intégration et comparaison des résultats obtenus à la littérature scientifique existante. Les complications cardiovasculaires de l'obésité se manifestent à l'âge adulte. Nous utiliserons donc des souris âgées de 8 à 12 semaines au début des expériences, ce qui constitute un âge adulte. De plus, cet âge est communément utilisé dans les modèles souris d'athérosclérose et d'obésité, facilitant ainsi l'intégration et la comparaison de nos données à la litérature existante.