Système endocrinien

816 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles enchaînent mises à jeun, contentions répétées, gavages et injections, et une inflammation intestinale leur est provoquée par un produit ajouté à l'eau de boisson, avant un prélèvement sanguin terminal. Le porteur décrit des signes de souffrance attendus, poil hérissé, perte de poids, léthargie, dos courbé, ataxie et tremblements. Il affirme que ces phénomènes sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme", tout en indiquant avoir déjà utilisé des organoïdes intestinaux pour une partie des questions.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposées comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action intestinale de l'insuline contribue à l'hyperperméabilité et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales au cours du diabète. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) -Un 1er lot d'animaux vigiles feront l'objet d'une mise a jeun (14h), de 2 à 7 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). Ce 1er lot d'animaux recevra également un traitement dans l'eau de boisson (7 jours) induisant une inflammation intestinale. -Un 2ieme lot d'animaux fera l'objet d'une mise a jeun (14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune), de 0 à 5 administrations orale de produit (1 min chacune), d'un prélèvement de sang (1min) et de 2 injections de produit (1min). -Un 3ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 4 à 9 contentions (30 secondes chacune), de 2 à 7 administrations orale de produit (1min) d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). -Un 4ième lot d'animaux fera l'objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 3 à 8 contentions (30 secondes chacune) de 1 à 6 administrations orale de produit (1min), d'un prélèvement de sang (1min) et d'une injection de produit (1min). - Tous les animaux seront placés sous analgésie anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

L'identification, les prélèvements, l’anesthésie/analgésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou liées à l’inflammation intestinale. Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale ou l’infection par des entéropathogènes, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend 816 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

280 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent contentions, biopsies, mises à jeun, gavages, prélèvements de sang et injections, certaines recevant une pompe osmotique implantée chirurgicalement sous la peau et un diabète induit provoquant polydipsie et glycosurie. Le porteur décrit des signes de souffrance possibles comme un poil hérissé, une perte de poids et une léthargie, avant un prélèvement sanguin terminal. Il indique que les dérégulations métaboliques et inflammatoires sont "impossibles à étudier directement chez l'Homme" et recourt à l'animal quand la culture in vitro ne suffit pas.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote. Il exerce trois fonctions principales, qui sont cruciales pour le maintien de l’homéostasie : i) la digestion et l’absorption des nutriments ii) un rôle endocrine et iii) un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage consécutif de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2, les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action d’un facteur qui médie les effets du glucose, conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice potentiel de ce projet serait de mieux comprendre la fonction d'un facteur relayant habituellement les effets du glucose dans l'intestin. Il permettrait de notamament de comprendre si son blocage pourrait suffir à renforcer la barrière formée par l'intestin et ainsi empêcher l'augmentation de la perméabilité intestinale en cas d'hyperglycémie, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques, dans le contexte clinique des patients diabétiques et/ou obèses.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes). Un 1er lot d’animaux feront l’objet de deux mises à jeun (5h et 14h), de 6 administrations orales de produit (1min chacunes), de 3 prélèvements de sang (1min pour le prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvementcaudal) et de 2 injections de produit (1min chacun). ; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), Un 2ieme lot d’animaux feront l’objet de deux mises à jeun (5h et 14h), de 6 administrations orales de produit (1min chacunes), de 3 prélèvements de sang (1min pour le prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvementcaudal) et de 2 injections de produit (1min chacun). ; 1 minute par prélèvement mandibulaire et 30sec par prélèvement caudal), Ces animaux seront également placés sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). Un 3ieme lot d’animaux feront l’objet de trois mises à jeun (deux de 4h et une de 14h), de 8 administrations orales de produit (1min chacune), d’un prélèvement de sang (1min) et d’une injection de produit (1min). Un 4ieme lot d’animaux feront l’objet de trois mises à jeun (deux de 4h et une de 14h), de 8 administrations orales de produit (1min chacune), d’un prélèvement de sang (1min) et d’une injection de produit (1min). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). L’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, peut entraîner l’apparition de signes généraux de souffrance : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. L'étude comprend au total 280 animaux. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser les conséquences intestinales de la perte d’action du glucose à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas au glucose.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post- opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 10 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Spontanément diabétiques, elles reçoivent chaque semaine pendant quatorze semaines une injection de protéines à tester, subissent un test de tolérance au glucose et des prélèvements de sang répétés, avant une ponction aortique terminale. Le porteur signale le stress lié aux manipulations, au gavage et aux mesures de glycémie, et rappelle que ces souris résistent tardivement à l'acidocétose. Il affirme qu'il est "nécessaire" de démontrer l'efficacité des composés dans un modèle proche de la maladie humaine avant tout essai clinique.

Objectifs

En 2021, le nombre de diabétiques de type 1 (DT1) dans le monde était de 8,4 millions dont 20% ont moins de 20 ans. Plus de 500 000 nouveaux cas apparaissent chaque année et ce chiffre est en constante augmentation. A ce jour, le seul traitement des DT1 approuvé à ce jour est l’insuline. Néanmoins, des complications sévères peuvent se développer et l’espérance de vie des DT1 est réduite de 10 à 15 ans comparé à un individu non diabétique. Le DT1 survient suite à la destruction auto-immune de la plupart des cellules bêta β. Néanmoins, il persiste un petit nombre de cellules bêta fonctionnelles même 50 ans après le diagnostic. Il a par ailleurs été montré, en particulier dans un modèle de DT1 présentant des caractéristiques proches du DT1 humain, la souris diabétique, qu’activer la prolifération des cellules bêta prévenait l’apparition du DT1 dans ce modèle.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de sélectionner une nouvelle molécule présentant un effet antidiabétique grâce à l’augmentation de la masse des cellules bêta pancréatiques, seul ou en combinaison avec les traitements existants et ainsi ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques chez le patient diabétique de type 1.

Procédures

Chaque animal recevra une fois par semaine pendant 14 semaines une injection des protéines à tester ou du véhicule (14 injections) plus une administration de glucose le jour du test de tolérance au glucose, test qui dure 120 minutes. Des prélèvements de sang seront effectués sur chaque animal vigile : - 1 goutte de sang une fois par semaine pendant 14 semaines pour la mesure de la glycémie (durée de prélèvement 2-5 secondes) - 6 prélèvements de sang le jour du test de tolérance au glucose (durée de prélèvements 2-5 secondes, ou de 30 à 60 secondes pour les 4 temps où l'insuline sera dosée dans le plasma). Un prélèvement de sang sur animal anesthésié : ponction aortique immédiatement avant l'euthanasie.

Impact sur les animaux

Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux avec un diabète de type 1 (DT1), qui apparaît spontanément dans le modèle utilisé. La principale complication du DT1 est l’acidocétose diabétique, résultant de l’accumulation de corps cétonique dans le sang. Cependant, les souris utilisées ont la particularité d’être résistante à l’acidocétose, ou du moins son apparition est tardive (souris de plus d’un an); et leur utilisation dans ce projet est à 6 mois d’âge au maximum. Les nuisances attendues liées aux expérimentations sont: le stress dû aux multiples manipulations et mesures de glycémie, au gavage et éventuellement au point d'injection pour l'administration d'insuline. Les techniques employées dans ce projet pour suivre la glycémie sont des techniques utilisées également chez l’homme, comme le test de tolérance au glucose.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées afin de prélever les tissus d’intérêt, tels que le pancréas pour mesurer la masse des cellules bêta et évaluer l’infiltration par les cellules immunitaires et le thymus et la rate pour réaliser un profil immunologique.

Remplacement

L’objectif final du projet est d’évaluer le potentiel thérapeutique de composés sélectionnés au préalable sur des tests in vitro pour le traitement du diabète de type 1. Cependant, avant tout essai clinique, il est nécessaire de démontrer l’efficacité de ces composés dans des modèles physiopathologiques dont les caractéristiques sont proches de la pathologie humaine.

Réduction

Les produits testés dans le projet sont des produits qui auront montré un effet positif significatif dans des tests in vitro (lignées de cellules bêta pancréatiques et îlots de Langerhans). Des études précédentes sur les souris spontanément diabétiques montrent que l’utilisation d’un minimum de 14 à 16 animaux par groupe de traitement est nécessaire pour obtenir une puissance statistique suffisante et donc des effets significatifs sur la glycémie, sachant que l’incidence du diabète est de 60 à 80% chez la souris femelle spontanément diabétique que nous allons utiliser. Pour limiter le nombre d‘animaux utilisés, 3 protéines seront testées par étude, évitant ainsi de multiplier le nombre de groupes contrôles. Par la suite, la protéine d’intérêt sélectionnée sera testée en combinaison avec une seule dose de produit commercial (dose usuelle dans la littérature) afin de limiter le nombre d’animaux par étude.

Raffinement

Une réduction de la douleur, la souffrance et l’angoisse est mise en place dès que cela est possible. Les animaux sont hébergés à au moins 3 par cage, afin de favoriser leur interaction sociale et réduire leur stress. De plus, un enrichissement de leur milieu sera effectué par un ajout de tunnels, de matériaux de nidification et de bûchettes de peuplier à ronger. Un suivi quotidien de tous les animaux sera réalisé par les zootechniciens (observation comportement, état de santé général et état sanitaire de leur cage). Les points limites sont les suivants : troubles du comportement; signes d'absence de toilettage (poil hirsute, pelage sale); perte de poids supérieure à 20%. L’ensemble des procédures de ce projet vise à concilier une interprétation fiable des résultats et le respect du bien-être animal. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation.

Choix des espèces

Les souris ont une physiologie métabolique proche de l'homme notamment en ce qui concerne la régulation de la glycémie et sont souvent utilisées comme modèles de pathologie humaine comme le diabète. Nous utiliserons une lignée de souris spontanément diabétique comme le modèle de choix du DT1, de par leur susceptibilité au développement spontané d’un diabète auto-immun avec des caractéristiques similaires au diabète humain de type 1. Il s'agit de jeunes adultes, âgés de 6 à 9 semaines à la livraison, qui seront traités pendant 14 semaines par les molécules à tester ou le placebo. Après acclimatation au sein de notre animalerie pendant au minimum une semaine, les traitements commenceront à l’âge de 9 – 10 semaines. A cet âge les souris sont déjà diabétiques mais sans que la maladie ne soit trop grave et provoque une acidocétose. Chez l'Homme, le diabète de type 1 apparait majoritairement chez les adolescents et jeunes adultes.

768 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 48 tuées comme donneuses de moelle osseuse et 720 transférées vers un autre protocole de tests comportementaux. Rendues obèses par un régime gras pendant 18 semaines, elles reçoivent du busulfan induisant une myélodysplasie, une greffe de moelle et des prélèvements sanguins répétés, pour étudier le rôle de la protéine DNase1L3 dans le syndrome métabolique et la dépression liés à l'obésité. Le porteur décrit la perte de poids et l'anémie post-busulfan comme "transitoires". Les 720 survivantes prolongeront l'expérimentation dans une animalerie dédiée aux tests d'anxiété et de dépression, sous une autre autorisation.

Objectifs

Nous avons observé que la déficience en DNase1L3 rend les souris plus susceptibles au développement du syndrome métabolique induit par l’obésité. Un de nos objectif courant est de caractériser les mécanismes moléculaires et cellulaires de la DNase1L3 dans le contexte de l’obésité. De plus, l’obésité induit des troubles neuropsychiatriques comme la dépression. Un deuxième objectif de notre travail est d’évaluer l’impact de la déficience en DNase1L3 sur la survenue des syndromes neuropsychiatrique induits pas l’obésité. Tous les concepts, incluant l’état de l’art, le rationnel de notre étude ainsi que sa méthodologie sont décrits dans la section suivante.

Bénéfices attendus

Notre projet permettra de mettre en évidence le rôle de la DNase1L3 dans la régulation de l’inflammation chronique induite par l’obésité ainsi que ces mécanismes d’actions. De plus, il nous permettra de déterminer si une dérégulation de la DNase1L3 peut contribuer aux troubles neuropsychiatriques induits par l’obésité. Ainsi notre projet pourra conduire aux développements de nouvelles approches thérapeutique basées sur la supplémentation en DNase1L3 afin de limiter l’inflammation chronique induite par l’obésité qui est à l’origine du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques.

Procédures

Les souris sont soumises à un régime riche normal et riche en graisse durant 18 semaines. Une myélodysplasie est induite par le Busulfan durant 4 jours. Une reconstitution des souris myélodysplasique est faite par transfer de cellules de moelle osseuses . La reconstitution se fait par une seule injection et a lieu en 1 mois. Des prises de sang retroorbitaires sont effectué toutes les six semaines. Un test de tolérance au glucose par injection i.p de glucose et prise de sang a la base de la queue est effectué toutes les 6 semaines aussi.

Impact sur les animaux

1. Placer les animaux sur un régime riche dans le temps imparti pour l’expérimentation augmente leur poids d’une manière considérable sans causer une altération significative de l’état général de l’animal. 2. La génération de souris chimérique nécessite l’induction d’une myélodysplasie par un traitement aux Busulfan. Ce traitement induit une perte de poids

Devenir

Procédure 1 : 288 animaux sont inclus dans cette procédure. 48 animaux sont utilisés en tant que donneur de moelle osseuse et sont euthanasiés par dislocation cervicale a l’issue de cette procédure. Le prélèvement de la moelle osseuse ne peut être effectue que sur des animaux morts. Le reste des animaux (240), constituent les animaux chimériques receveur de moelle osseuse qui seront gardés en vie et donc inclus dans les procédures qui suivent. Procédure 2. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un régime normal (360) et un régime riche en graisse (360). Tous les animaux de cette procédure sont gardés en vie en passent dans la procédure 3. Procédure 3. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à des prises de sang. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie en passent dans la procédure 4. Procédure 4. Dans cette procédure 720 animaux sont inclus et sont soumis à un test de tolérance au glucose. Tous les animaux de ces procédures sont gardés en vie et transférés dans l’animalerie NutriNeuro ou ils seront soumis à des tests comportementaux. Une autre DAP a été soumise pour cela.

Remplacement

Il n'existe pas de méthode alternative à ce projet car seul un modèle murin récapitulant les éléments de la physiopathologiques observés chez l'homme, peut apporter la preuve du rôle de la DNase1L3 dans le développements d’un syndrome métabolique et dans la régulation des troubles neuropsychiatriques qui découlent de l’inflammation induite par l’obésité. De plus les études comportementales afin d’évaluer le développent de l’anxiété et des états dépressifs ne peuvent être réalisé que sur des animaux vivants. Les conclusions recherchées ne peuvent pas être obtenues par des modèles alternatifs in vitro ou ex vivo, qui ne reconstituent pas de manière optimale la complexité de la régulation des états mentaux par les processus inflammatoires.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires par lot ainsi que le nombre d’itérations expérimentales a été déterminé pour pouvoir réaliser des tests statistiques robustes. Afin de réduire le nombre d’animaux nous avons également optimisé leur utilisation. En effet sur les mêmes animaux nous allons à la fois évaluer la survenue du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques. Cela nous permet de réduire l’utilisation des animaux d’un facteur deux.

Raffinement

1.Hébergement : les animaux sont hébergés dans des conditions veillant au respect de leur bienêtre (en fratrie) et avec un milieu enrichi afin de limiter leur stress. Les animaux sont suivis quotidiennement afin de détecter tout inconfort ou souffrance. Une étroite collaboration entre le personnel de l'animalerie et notre équipe d'expérimentateurs, permet d'intervenir immédiatement sur les animaux en cas de nécessité. 2. Contention : les animaux sont manipulés avec soin par un personnel formé qui maitrise des méthodes de préhensions douces, les animaux sont attrapés par la peau du dos afin de ne pas les manipuler par la queue. 3. Formation : une grande maîtrise technique est demandée à nos expérimentateurs qui sont régulièrement formés au sein de l'institut pour le bien-être animal. 4. Minimiser la douleur : Les prises de sang retro-orbitaires sont réalisés sur des animaux anesthésiés afin de réduire l’inconfort de cette procédure. De plus, les prises de sang réalisées à l’extrémité de la queue incluent une anesthésie locale pour réduire la douleur qui peut être induite par cette procédure.

Choix des espèces

Nous utiliserons les souris C57Bl/6 pour cette expérimentation. Les souris déficientes pour la DNase1L3, DNase1, TLR9 et IFNAR sont uniquement disponibles dans cette espèce et sur ce fond génétique. De plus, elles sont très sensibles aux régimes alimentaires pour l'induction de l’obésité (Surwit et al., Diabetes, 1988). Comme l’Homme, elles développent une obésité, un diabète de type II, une stéatose hépatique et des troubles neuropsychiatriques (dépression et anxiété) un fois exposées à un régime riche en graisse, alors qu’avec une alimentation standard, elles restent minces et ne développent pas de problèmes métaboliques ni de troubles neuropsychiatriques. En plus des souris congénique B6/SJL (pep boy, CD45.1) seront utilisées pour réaliser des chimères de moelle osseuse. Leur utilisation est necessaire afin d'évaluer l'efficacité de nos greffes qui est rendu possible par l'analyse de l'expression du variant de la molécule CD45. Les souris seront nourries dès l’âge de 12 semaines par HFD. L’exposition des souris C57BL/6 de cet age à un régime HFD ad libidum conduit à une obésité et au développent du syndrome métabolique et des troubles neuropsychiatriques assez proche de ceux se développant chez l’homme. Les premières manifestations apparaissent environ 6 semaines après l’introduction du régime HFD mais l’hyperglycémie, l’insulino-résistance, la stéatose hépatique ainsi que les troubles neuropsychiatriques sont observées vers 18 semaines post régime HFD (Surwit et al. ; Diabetes, 1988).

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq jours d'injections pour désactiver la signalisation thyroïdienne dans leur tissu adipeux brun, la moitié étant ensuite exposée à 4 °C pendant 72 heures avant un prélèvement de sang sous anesthésie et la mise à mort, pour distinguer l'action centrale et périphérique des hormones thyroïdiennes. Le porteur indique n'attendre aucun effet délétère des injections et que le froid abaisse la température corporelle durant les premières heures. Il affirme qu'aucun modèle in vitro n'est adapté et qu'une alternative cellulaire exigerait 128 animaux contre 32 ici.

Objectifs

Le tissu adipeux brun (TAB) est capable d’utiliser les lipides et le glucose pour les transformer en chaleur (thermogenèse). Ce processus est dépendant des hormones thyroïdiennes (HT). Il était jusque-là établi que les hormones produites par la thyroïde passaient dans le sang pour jouer leur rôle directement dans le TAB, (action périphérique). Mais des études montrent que l’administration d’HT dans le cerveau des souris active directement le TAB (action centrale). Cela suggère que le cerveau est la cible principale des HT, ce qui bouscule ce qui était précédemment établi. Ces résultats restent encore controversés. A court terme, l’objectif de ce projet est donc d’arriver à distinguer la part de l’action centrale et périphérique des HT pour ses fonctions métaboliques dans le TAB afin de tirer au clair les données contradictoires jusqu’alors publiées. Pour cela, nous utilisons une lignée mutante murine qui ne dispose plus de signalisation thyroïdienne spécifiquement dans le TAB. L’utilisation de cette lignée a mis en évidence de nombreux indices suggérant que le froid déclencherait la multiplication des cellules du TAB (afin d’augmenter la quantité de chaleur produite par le tissu) ainsi que la production de lipides (mécanisme appelé lipogenèse, nécessaire pour alimenter la thermogenèse du TAB), mais pas chez les souris mutantes. Cela suggère que ces mécanismes seraient contrôlés par les HT directement dans le TAB, et pas dans le cerveau. Ainsi, cette étude pose la question suivante : l’altération de signalisation thyroïdienne dans le TAB empêche t-elle une lipogenèse et prolifération efficaces, du TAB ? Actuellement, notre modèle murin est le seul à permettre la distinction entre l’effet central et périphérique des hormones, grâce à la spécificité tissulaire des mutations induites.

Bénéfices attendus

Ce projet présente deux bénéfices principaux. Premièrement, il viendra confronter les données publiées dans la littérature qui suggèrent que la cible des HT est le cerveau (qui médie ensuite les effets aux autres tissus) et non pas les tissus périphériques comme il était jusque-là pensé. La démonstration ou la réfutation de ces découvertes sont primordiales afin de comprendre comment les HT régulent le métabolisme et la dépense énergétique. Egalement, il est d’intérêt sociétal de trouver des innovations aux moyens de prévention/traitement de l’obésité et le TAB a dès sa découverte suscité un engouement particulier pour sa capacité à utiliser lipides et glucides et ainsi consommer des calories . Les HT participent au contrôle de la thermogenèse du TAB, puisque des souris hyperthyroïdiennes ont une forte activité du TAB, résultant en une plus grande dépense énergétique et une plus faible susceptibilité à l’obésité et aux désordres métaboliques qui lui sont associés. Toutefois, l’injection d’HT ne peut pas être considérée comme une option viable à ces problématiques puisqu’elle va également avoir des effets métaboliques sur le cœur ou les os, déclenchant des effets secondaires tels que la tachycardie ou l’ostéoporose, par exemple. Il est ainsi crucial de comprendre comment les HT régulent spécifiquement la thermogenèse du TAB, et notamment le métabolisme des lipides, afin de, à plus long terme et avec les progrès de la pharmacologie, concevoir de nouvelles molécules ne stimulant que les activités métaboliques des HT sur le TAB tout en s’affranchissant des effets secondaires néfastes.

Procédures

Les animaux vigiles seront injectés en intrapéritonéal quotidiennement pendant 5 jours avec un produit permettant d’induire la mutation de la signalisation thyroïdienne dans le TAB) via une contention manuelle. Pour réduire le stress généré par cette technique, les animaux seront préalablement contentionés manuellement sans injection, tous les jours pendant une semaine afin de les accoutumer à l’expérimentateur et à la contention. La moitié des effectifs seront ensuite exposés à 4°C pendant 72h, une température à laquelle les animaux arrivent à maintenir leur température corporelle (données publiées et données du laboratoire). Durant cette exposition, les groupes sociaux et un enrichissement de la cage seront maintenus pour faciliter le maintien de la température corporelle. Au bout de 48h au froid, une injection intrapéritonéale unique sera réalisée sur tous les animaux (avec un marqueur de prolifération des cellules), un geste auquel ils auront été accoutumés précédemment. Pour finir, un prélèvement sanguin sera réalisé sous anesthésie profonde puis les animaux seront mis à mort pour prélèvement des tissus d’intérêts.

Impact sur les animaux

Aucun effet délétère à l’injection du produit utilisé pour induire les mutations dans le TAB n’a jusque-là été observé aux doses utilisées ici . Ce protocole et ces doses ont été déterminées sur les recommandations de la bibliographie, en réduisant les doses préconisées aux doses minimales mises au point dans notre laboratoire permettant l’induction des mutations dans notre modèle murin. De la même manière, aucun effet délétère n’a été observé par une injection unique du produit utilisé pour marquer les cellules prolifératives) aux doses utilisées fréquemment dans notre laboratoire. Cette dose a été choisie sur la base des données bibliographiques ayant définies cette dose comme étant la dose la plus faible permettant le marquage de toutes les cellules prolifératives. Nous savons que l’exposition au froid fasse diminuer la température corporelle des souris les 4 premières heures avant de revenir proche de la normale au bout de 8h . De plus, les souris mutantes défendent leur température corporelle de la même manière que les animaux non-mutants à 4°C pendant 72h en présence de nourriture dans la cage. Les animaux mutants tendent à consommer légèrement plus de nourriture que les animaux contrôles pour défendre de manière similaire leur température corporelle . La présence de nourriture permet aux souris de palier à la baisse de température, c’est pourquoi des méthodes de facilitation d’accès à la nourriture seront mises en place. De la même manière, tout le matériel nécessaire à la réalisation d’un nid sera maintenu.

Devenir

Cette étude vise à comprendre le rôle des HT dans la prolifération et la lipogenèse du TAB en réponse au froid. Pour cela plusieurs prélèvements terminaux doivent être réalisés. En effet, l’entièreté du TAB doit être analysé pour mesurer les paramètres questionnés. Egalement, une quantité importe de sang doit être prélevée afin de contrôler le taux d’hormones thyroïdiennes circulant, une étape incontournable pour contrôler la pertinence de notre modèle transgénique.

Remplacement

Ce projet nécessite de manière incontournable l’utilisation d’animaux puisqu’elle vise à comprendre le rôle des HT spécifiquement dans le TAB . Aucun modèle in vitro n’est adapté pour répondre aux questions posées. Notamment, une lignée cellulaire provenant du TAB ne répond que très peu aux HT et cette réponse est très différente comparée au tissu in vivo. Une autre alternative in vitro a mis en évidence une limitation puisque dans nos conditions, un très grand nombre d’animaux serait nécessaire pour cette étude (nombre d’animaux estimé à 128, contre 32 en utilisant les animaux entiers). Par ailleurs, la lipogenèse (production de lipides, que nous étudierons dans cette expérience) est un processus impliquant directement plusieurs organes, notamment le foie, dont le métabolisme est lui-même contrôlé par le cerveau. Enfin , l’observation de la lipogenèse et de la prolifération est étudiée en réponse au stimuli principal en conditions physiologiques, à savoir une exposition au froid. Le froid est détecté par les récepteurs sensoriels présents à la surface de la peau. Aucun modèle non-animal n’est capable de récapituler cette complexité multi-organes ni de répondre directement au froid. L’étude de processus métaboliques impliquant nécessairement plusieurs organes en réponse à un stimuli environnemental implique l’utilisation d’animaux.

Réduction

Les études préliminaires réalisées dans le cadre de ce projet nous permettent d’affirmer que 6 animaux par groupe sont suffisants pour détecter une différence de lipogenèse et de prolifération . Néanmoins, la quantité de TAB étant limitée (30mg) l’utilisation de ce tissu peut être délicate. Egalement, un des points limites peut être atteint lors de l’exposition au froid. En ce sens, le groupe d’animaux par groupe est augmenté à 8, toutefois, l’expérience sera d’abord réalisée avec 6 animaux : si aucun point limite n’est atteint et que les extractions aboutissent et répondent aux questions posées, les 2 animaux restants par groupe ne seront pas utilisés. Si un problème technique est rencontré, les animaux supplémentaires pourront être utilisés. Ainsi, nous utilisons le nombre minimal d’animaux en prévoyant une marge pour s’adapter aux limitations techniques que nous pouvons rencontrer. De cette manière, nous ne préovoyons pas de répétition d’expérience. Par ailleurs, la procédure a été optimisée afin d’en tirer le plus d’information possible, à savoir la lipogenèse et la prolifération en réponse au froid, afin de ne pas avoir à dupliquer cette exposition et ne pas utiliser plus d’animaux. Enfin, plusieurs tissus seront prélevés, puisqu’ils pourront être utilisés à posteriori afin de regarder les effets d’une exposition au froid sur ceux-ci, sans avoir à exposer d’autres animaux.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe de 3-4 animaux par cage en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, feuille de papier, bois à ronger), et ce même pendant l’exposition au froid. Nos expériences précédentes montrent une température des animaux plus faible les 8 premières. Ainsi, pendant cette première phase, les animaux seront surveillés toutes les heures afin de détecter le plus rapidement possible des comportements anormaux. Ensuite, les animaux seront surveillés la journée toutes les 4h, soit quatre points de surveillance quotidiens. En dehors de l’exposition au froid, les animaux seront surveillés et pesés tous les jours. La souffrance des animaux est évaluée au comportement, comportant entre autres la prostration, le pelage et la posture. Egalement, les animaux seront aussi pesés lors des visites (tous les jours) et pendant l’exposition au froid (deux fois fois par jour) afin de contrôler l’absence de perte de poids significative, définissant un point limite de l’expérience. Une attention particulière sera également portée à l’aggressivité entre les animaux. Si de l’aggressivité ou des blessures résultantes sont détectées, les animaux blessés/responsables seront écartés et les blessures soignées à la Vétédine. Les animaux blessés ne seront pas exposés au froid, ou retirés du froid afin de permettre une cicatrisation optimale de leur blessure.

Choix des espèces

Les récepteurs des hormones thyroïdiennes de la souris sont très similaires à ceux de l’homme et chez ces deux espèces les hormones thyroïdiennes stimulent la dépense énergétique. Comprendre comment les hormones thyroïdiennes stimulent ce processus chez la souris apportera donc de précises indications sur les mécanismes présents chez l’Homme et pourront, à terme, être utilisés pour développer de nouveaux composés pharmacologiques afin d’augmenter la dépense énergétique et ainsi lutter contre l’obésité et les désordres métaboliques qui lui sont associés. Ce modèle est aussi le plus utilisé de nos jours pour ce genre d’études ce qui nous permet d’une part de comparer directement nos résultats avec ceux publiés dans la littérature, et d’autre part de les comparer avec les résultats obtenus précédemment dans notre groupe. Nous nous intéressons à la régulation de la physiologie du TAB chez l’adulte, les souris utilisées auront donc entre 2 et 4 mois. Les animaux ne sont pas utilisés au-delà car le tissu adipeux brun tend à décroître avec l'âge.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de tamoxifène puis d'un inhibiteur, un gavage à l'huile d'olive et des prélèvements sanguins à la queue toutes les heures pendant quatre heures, avant une exposition au froid à 6 °C durant quatre heures avec mesure de température rectale, pour étudier la résistance à l'obésité liée à l'absence de cavéoline-1 hépatique. Le porteur qualifie ces procédures de "légères" tout en déclarant une gravité modérée. Il présente au conditionnel de futures thérapies contre le diabète et l'obésité et décrit le maintien de la physiologie de l'"organisme" comme "nécessaire".

Objectifs

L’obésité et le diabète de type 2 connaissent une croissance alarmante. La production de glucose par le foie favorise le développement du diabète de type 2 et l'obésité. Nous avons récemment identifié dans le foie une voie de production de glucose impliquant des vésicules. L'absence de cette voie vésiculaire spécifiquement dans le foie protège de l’hyperglycémie et de la prise de poids induite par un régime riche en graisses et en sucre. L’objectif de ce projet de recherche fondamentale est donc de déterminer si une diminution de l’absorption des lipides ou une augmentation de la thermogenèse sont impliquées dans cette protection.

Bénéfices attendus

A court terme, les bénéfices de ce projet sont de déterminer les mécanismes de régulation de la production de glucose par le foie et leurs conséquences sur le métabolisme énergétique. A long terme, cette caractérisation permettrait de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques dans le cadre du diabète et/ou de l'obésité.

Procédures

A l’âge de 8 semaines, les animaux subiront une injection péritonéale journalière de tamoxifène pendant 5 jours (douleurs légères). A l’âge de 25 semaines, les animaux subiront une injection intrapéritonéale (douleurs légères) d'inhibiteur de la clairance des triglycérides sanguins puis un gavage (douleurs légère) avec de l'huile d'olive. Des prélèvements sanguins à la queue (douleurs légères) seront effectués toutes les heures durant 4 heures (environ 20µL à chaque prise soit moins de 200µl au total). A l’âge de 27 semaines, les animaux seront soumis à une température de 6°C pendant 4h. En effet, une augmentation de la thermogenèse n’est pas observable à neutralité thermique, les souris doivent être exposées à de faibles températures pour stimuler ce processus. La température rectale sera mesurée avant et après chaque exposition au froid.

Impact sur les animaux

Les injections de tamoxifène induisent une modification génique, conduisant à la réduction la production hépatique de glucose, sans effet délétère sur la glycémie des animaux. Les effets de l’inhibiteur de la clairance des triglycérides sont transitoires et n’impactent ni le poids, ni la prise alimentaire, ni le bien-être des animaux. Toutes ces procédures légères réalisées une seule fois n'auront pas d'impact à long terme sur les 160 souris étudiées. La procédure est toutefois qualifiée de sévérité modérée.

Devenir

Les souris seront mises à mort à la fin du protocole selon une méthode autorisée par la législation afin de prélever les tissus pour étudier les mécanismes impliqués.

Remplacement

Cette étude ne peut pas être réalisée sur cellules ou organoïdes car la fonction étudiée (la production de glucose par le foie) a des impacts sur l’ensemble du métabolisme et implique des dialogues entre organes. Conserver la physiologie de l'organisme est nécessaire pour comprendre les mécanismes régulant la production de glucose hépatique et leurs impacts sur la physiologie. Les études de ce projet seront donc réalisées in vivo dans des modèles de souris transgéniques ciblant des modifications géniques spécifiques au foie.

Réduction

Le nombre de souris a été calculé au plus juste à partir des connaissances des pathologies étudiées, des modèles animaux, et du métabolisme glucidique, mais aussi des résultats d’études précédentes ayant permis de valider la preuve de concept. Afin de pouvoir faire une analyse statistique, des groupes de 10 souris seront analysés. Au total, ce projet nécessitera 160 souris mâles et femelles transgéniques et contrôles.

Raffinement

Les souris seront élevées et hébergées par groupe en milieu enrichi pour favoriser la nidation (coton de nidation, bois à ronger) et contrôlé, seront observés quotidiennement et pesés régulièrement pour suivre leur prise de poids. Lors du gavage (parfaitement maîtrisée par les personnes en charge de l’expérimentation animale), la sonde sera préalablement trempée dans une solution d’eau sucrée pour favoriser la déglutition de l’animal. Pendant l’exposition au froid, les souris seront libres de leur mouvement et auront un accès libre à la nourriture et à l’eau. Ce projet sera réalisé chez la souris, dont les régulations métaboliques sont plus semblables à l’homme que les vertébrés inférieurs. La lignée murine choisie est sensible au développement du diabète et des maladies métaboliques et permet de comparer les résultats des souris contrôles avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique. Le diabète de type 2 se déclarant principalement chez l’adulte, l’étude sera réalisée sur des souris adultes. Les souris seront mises à mort à la fin du protocole ou lors de l’atteinte d’un point limite défini dans le projet selon les méthodes autorisées par la législation.

Choix des espèces

Les études portant sur le rôle de la production hépatique de glucose sur le métabolisme glucidique et énergétique réalisées sur des vertébrés inférieurs tels que le poisson montrent que les régulations observées ne sont pas les mêmes que chez les mammifères. Nous souhaitons donc réaliser nos expériences avec des modèles animaux dont les systèmes de régulation sont semblables à l’homme, tels que les rongeurs. Nous souhaitons utiliser dans nos expériences des souris C57BL/6J. Cette lignée murine a été choisie pour pouvoir comparer les résultats avec nos lignées transgéniques utilisées sur le même fond génétique et car c’est une souche sensible au développement du diabète et des maladies métaboliques. De plus, le modèle murin est compatible avec une étude en laboratoire en raison de sa petite taille, de sa manipulation aisée et des nombreux outils d’analyse disponibles. Dans ce projet, nous étudierons la production hépatique de glucose à l’âge adulte car les maladies métaboliques étudiées (obésité, diabète) se développement avec l’âge dans notre modèle comme chez l’homme.

48 souris ob/ob, prédisposées à l'obésité et au diabète, vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des prises de sang hebdomadaires et plusieurs tests de tolérance au glucose et à l'insuline par gavage, avant mise à mort pour prélèvement du foie, du pancréas et d'autres tissus. Le porteur teste des extraits végétaux présentés comme "d'origine 100 % naturel" et n'attend "aucune nuisance" hormis chez les témoins. Il affirme être "contraint" d'utiliser des modèles animaux, l'homéostasie du glucose ne pouvant selon lui s'étudier in vitro.

Objectifs

Les objectifs principaux de la recherche sur le diabète de type 2 sont donc doubles : d’une part de mieux élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les enjeux principaux de la recherche sur le diabète de type 2 sont donc doubles : d’une part de mieux élucider les mécanismes impliqués dans l’apparition de la maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Chaque semaine un prélèvement de sang (25microlitres) sera réalisé pour mesurer la glycémie, la triglycéridémie et la cholestérolémie des souris. Deux tests de tolérance au glucose seront réalisés au jour 7 et 21. Au cours de ces tests, deux prélèvements de 20 microlitres de sang pour la mesure d’insuline au temps 0 et 30 minutes. Une mesure de glycémie sera effectuée à partir d’une micro-goutte de sang (1-2 microlitres) au temps 0, 15, 30, 60 et 120 minutes après le gavage oral. Un test de tolérance à l'insuline sera réalisé au jour 25. Au cours de ce test, une mesure de glycémie sera effectuée à partir d’une micro-goutte de sang (1-2 microlitres) au temps t0 t+30, t+60, t+90, t+120, t+150 et t+180 minutes pour évaluer la glycémie.

Impact sur les animaux

Les souris ob/ob développent de l'obésité et du diabète. A l'exception des souris contrôles recevant la solution véhicule. Les autres souris devraient voir leur homéostasie glucidique s'améliorer sans nuisances ou effets indésirables attendus.

Devenir

Toutes les souris seront mises à mort à l'issu de la procédure. Afin d'explorer les mécanismes anti-diabétiques de la metformine et des extraits végétaux, nous recolterons le foie, le pancréas le tissu adipeux gonadal, le muscle soléaire et le sang. Des analyses métaboliques,histologiques, biochimiques et transcriptomiques seront réalisées sur ces échantillons.

Remplacement

L’homéostasie glucido-lipidique est un processus physiologique complexe, impliquant l’action combinée d’une multitude d’organes. Il est donc actuellement impossible d’étudier la physiopathologie du diabète d’une façon intégrale ex vivo ou in vitro et nous sommes malheureusement contraints d’utiliser les modèles animaux.

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables au succès du projet seront mises en œuvre. Nous avons pris soin d’optimiser au mieux nos expérimentations en choisissant les lignées murines les plus adaptées à l’étude. Les procédures ont été réfléchies afin de réduire au maximum le stress et les souffrances des animaux soumis aux expérimentations.

Raffinement

Enfin, les procédures ont été réfléchies pour réduire au maximum le stress et les souffrances des souris soumises aux expérimentations. La cage sera enrichie par des frisottis ou une petite maison en carton.

Choix des espèces

Le modèle murin est le modèle de choix, il est utilisé depuis longue date pour caractériser les mécanismes impliqués dans la mise en place de l’insulino-résistance et du diabète. Il existe deux modèles murins de diabète de choix largement utilisés : les souris Db/Db et Ob/Ob. Ces modèles sont intéressants car ils possèdent les 3 stades de l’évolution du diabète observé chez l’homme : une phase très précoce ou les animaux sont normo-glycémiques et normo-insulinosensibles, une phase de 4 à 6 semaines ou l’insulino-résistance progresse mais est compensée par une sur-production pancréatique d’insuline, une troisième phase définie par une défaillance de la fonction pancréatique et l’établissement du diabète. Les souris seront âgées de 6 semaines au début du protocole. Il n’est pas possible d’obtenir des souris plus jeunes chez Charles River. Nous souhaitons initier le traitement des souris Ob/Ob à un âge très précoce lorsque les souris sont encore normo-glycémiques et normo-insulinosensibles. La littérature montre que l’insulino-résistance s’installe progressivement chez ces souris entre 6 et 10 semaines et les souris sont diabétiques après 12 semaines. Notre hypothèse est que l’apport en extraits végétaux permettra de retarder l’apparition du diabète ou d’en atténuer la sévérité.

361 rongeurs, 280 souris et 81 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteurs du défaut génétique de la maladie de stockage du glycogène de type III, ils reçoivent une injection unique d'un vecteur de thérapie génique à doses croissantes, quatre anesthésies générales, des prélèvements sanguins répétés et des tests de force musculaire, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de déterminer la dose efficace de cette thérapie génique en développement non clinique, en vue d'une future application chez l'humain. Le porteur affirme que le ciblage simultané de trois tissus n'est pas réalisable in vitro et que les deux espèces sont nécessaires, seul le rat reproduisant l'atteinte cardiaque.

Objectifs

La maladie de stockage du glycogène de type III (ou GSD III pour glycogen storage disease III) est une maladie génétique héréditaire rare causée par des mutations dans le gène AGL (pour amyloglucosidase glucanotransférase) qui fabrique l’enzyme débranchante du glycogène nommée GDE. Cette enzyme joue un rôle essentiel dans la transformation du glycogène, molécule de stockage composée de successions de glucose, en unité élémentaire de glucose dans les muscles et le foie. Dans la pathologie, le glycogène non décomposé s’accumule dans les muscles squelettiques et cardiaque et dans le foie, altérant leurs fonctions. L'apparition de la maladie commence dès la petite enfance et comprend l'hypoglycémie, l'hyperlipidémie (excès de graisses dans le sang) et l’élévation des taux sanguins d'enzymes hépatiques causée par la mort des cellules du foie. Au niveau du foie, les symptômes tardifs peuvent inclure une hépatomégalie (foie anormalement gros), reflétant une affection chronique (cirrhose) et, parfois, des tumeurs hépatiques non cancéreuses. Des maladies du cœur peuvent apparaitre. Les fonctions immunitaires sont altérées. Certaines personnes sont de petite taille. Aucun traitement curatif n'existe à ce jour. Notre étude vise à définir la dose efficace d’un traitement de thérapie génique ayant pour but de réintroduire un gène fonctionnel fabriquant la GDE dans les cellules hépatiques et musculaires. Un vecteur recombinant dérivé d’un virus portant le gène AGL fonctionnel sera injecté à doses croissantes dans des modèles de souris et de rats porteurs du défaut du gène agl et l'effet de la thérapie génique sera évalué au cours du temps au niveau des fonctions musculaires, cardiaques et hépatiques.

Bénéfices attendus

A court terme, les effets bénéfiques du traitement chez les souris et les rats porteurs du défaut du gène agl devraient permettre de stabiliser ou de diminuer l'accumulation de glycogène au niveau du foie et des muscles squelettiques et cardiaques, ce qui devrait entrainer une régénération des tissus, une amélioration de la masse et de la force musculaire et une amélioration de la fonction cardiaque. Ce projet de développement non clinique devrait permettre de déterminer la dose minimale efficace du traitement sur tous les organes cibles afin d'envisager, dans un second temps, une application clinique pour le traitement de la GSDIII par thérapie génique.

Procédures

Les souris et les rats recevront tous une injection intraveineuse unique de vecteur thérapeutique en début de protocole : chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Pour réaliser l’ensemble des tests et prélèvements, les souris et les rats recevront 4 anesthésies générales par voie intrapéritonéale. Chaque injection ne prendra pas plus de 2 minutes. Les souris subiront 3 mesures de test fonctionnels de suspension et de test d'agrippement et trois mesures de l'activité électrique musculaire espacées chacune de 2 mois. Chaque mesure ne prendra pas plus de 20 minutes. Les souris subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les souris subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les souris seront euthanasiées après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques. Les rats subiront 3 mesures d’électrocardiogramme et d’échocardiogramme. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats subiront 4 prélèvements de sang espacés de 2 mois, dont un prélèvement terminal avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 10 minutes. Les rats subiront une mesure de force musculaire juste avant l'euthanasie. Chaque mesure ne prendra pas plus de 30 minutes. Les rats seront euthanasiés après la mesure de force musculaire et les organes prélevés pour analyses histologiques.

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à des périodes de jeûne contrôlé de 4 heures avant les prélèvements sanguins, ce qui pourraient entrainer une sensation de faim, de stress et une hypoglycémie. Ils seront maintenus en contention manuelle ou dans une boite à contention pour les injections intraveineuses, ce qui pourrait entrainer un stress. Certains actes d’évaluation fonctionnelle seront réalisés sous anesthésie gazeuse, ce qui pourrait entrainer une confusion de l’animal au réveil en cas de surdosage. Des douleurs locales pourraient être ressenties au moment du prélèvement d’un petit morceau de queue ou d’oreille (acte réalisé pour l’identification des animaux), au moment des injections intraveineuses du produit thérapeutique, des injections intra-péritonéales d’anesthésique, des injections sous-cutanées d’analgésique, ainsi qu’un moment des prélèvements de sang par voie sous-mandibulaire. Des lésions locales de type inflammatoire accompagnées de douleurs localisées pourraient être causées par la pose d’électrodes transcutanés au moment de la mesure de l’activité électrique du muscle ou lors de certains tests de mesure de la fonction musculaire réalisés sur animal éveillé, notamment si un animal présente des blessures aux griffes ou aux pattes au moment du test. Toutes les nuisances possibles sont localisées et réversibles, ce qui constitue pour l’animal un niveau global de contrainte modérée.

Devenir

P1 et P2: Euthanasie. P3: toutes les souris hétérozygotes seront euthanasiées, toutes les souris homozygotes seront utilisées dans la procédure 1, une partie des souris wild-type sera utilisée dans la procédure 1 (14 souris) et le reste des souris wild-type sera euthanasié (56 souris).

Remplacement

Le projet consiste à mesurer l'effet thérapeutique du transfert génétique du gène agl au niveau du foie, du cœur et des différents muscles squelettiques: ce test n'est pas réalisable dans les modèles cellulaires car il est impossible de cibler trois tissus simultanément in vitro et d’étudier la biodistribution relative de notre molécule thérapeutique entre les différents organes cibles. L'utilisation d’animaux ne peut donc pas être remplacée dans notre projet.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction du nombre de souris, nos prévisions d'effectifs sont basées sur des calculs de statistiques prédictives visant à observer une amélioration de la fonction musculaire dans les 2 modèles murins utilisés (souris et rats). Ces calculs permettent de prévoir un effectif de 7 souris et de 8 rats par groupe et par sexe, les deux sexes devant être inclus dans les études de recherche de dose thérapeutique afin de prendre en compte une éventuelle variabilité des effets liée au sexe (soit 14 et 16 individus par groupe pour les souris et les rats, respectivement). Pour les études réalisées sur les souris, 4 doses seront testées en parallèles d’un témoin non traité et d’un groupe de référence d’animaux en bonne santé, et 3 doses seront utilisées pour les études réalisées sur les rats avec les mêmes groupes témoins, soit un total de 84 souris et de 80 rats pour l’ensemble de l’étude.

Raffinement

Les souris et les rats étant des animaux sociaux, aucun animal ne sera isolé dans une cage, sauf si des traitements spécifiques s'avéraient nécessaires. Les animaux recevront une injection unique du traitement par veine caudale, et subiront 3 prélèvements de sang au cours des 4 mois du protocole (un avant le traitement et un tous les deux mois). Ces prélèvements seront réalisés au niveau d'une veine du museau sur animaux vigiles maintenus en contention (souris) ou sous anesthésie gazeuse (rats). Les animaux subiront également un prélèvement de sang d’un volume plus important au moment de l’euthanasie, par prélèvement au niveau du sinus rétro-orbital, sous anesthésie générale. Au cours du protocole, tous les animaux seront soumis à différents tests fonctionnels permettant de mesurer l’effet du traitement au niveau des muscles squelettiques (souris et rat) et du cœur (rats seulement). Les tests douloureux seront réalisés soit sous anesthésie gazeuse, soit sous anesthésie générale et un antalgique fort sera administré par voie sous cutanée avant de le réaliser. Le même antalgique sera également administré pendant les 48 heures qui suivront la fin de certains tests. Tous les tests fonctionnels seront effectués dans une salle dédiée isolée du lieu d'hébergement, dans un environnement calme. Les animaux seront également pesés deux fois par semaine pendant tout le protocole afin de détecter le moindre signe de souffrance.

Choix des espèces

Les rongeurs sont les modèles les plus couramment utilisés par la communauté scientifique du domaine pour estimer l'efficacité d'approches thérapeutiques sur les pathologies génétiques. Le modèle de souris de la GSDIII permet une évaluation fonctionnelle très complète de différents groupes musculaires, mais ne reproduit pas l’atteinte cardiaque des individus affectés par la GSDIII. Le rat est le seul modèle reproduisant cet aspect de la pathologie. L'utilisation des deux modèles de GSDIII permettra de valider l’effet du traitement sur l’ensemble des organes affectés par la pathologie. Les souris et les rats seront de jeunes adultes âgés de 4 mois au moment du traitement et de 8 mois à la fin du protocole. La caractérisation préalable des deux modèles a permis de déterminer que la pathologie sera déjà présente au moment du traitement, ce qui permettra de tester l’effet de réversion de la pathologie, et non pas sa simple prévention. Ce choix permet de se rapprocher au plus juste de la pathologie humaine, qui sera traitée majoritairement après l’apparition des symptômes.