Système endocrinien

256 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des lignées génétiquement modifiées privées de gènes clés du métabolisme sont créées, puis soumises à des prélèvements sanguins répétés, à des tests de tolérance au glucose après jeûne et à une diète cétogène presque totalement dépourvue de sucres, avant une mise à mort pour prélever les organes. L'objectif est de mesurer les contributions respectives du foie et du rein dans la production des corps cétoniques, avec une visée translationnelle vers l'usage humain de la diète cétogène. Le porteur affirme que l'étude des délétions géniques tissu-spécifiques n'est faisable que sur des souris.

Objectifs

Le projet a pour objectif de déterminer les contributions relatives foie et des reins dans la production des corps cétoniques lors d’une administration d’une diète cétogène. Pour pouvoir déterminer les contributions des deux organes à la foi dans l’anabolisme (synthèse) des corps cétoniques (par les deux organes) et dans le catabolisme (utilisation) par le foie, les enzymes clé pour la synthèse (HMGCS2) et l’utilisation (OXCT1) des corps cétoniques seront deletée dans le foie ou les reins (OXCT1) et dans le rein (SCOT1) pour générer de lignées knock out tissues spécifiques. La génération des lignées de souris constitue le premier objectif du projet. Le deuxième objectif est d’étudies le métabolisme de ces lignées de souries pendant une diète contrôle, enrichie en gras et sucres et cétogène.

Bénéfices attendus

Le projet présenté vise à améliorer les connaissances scientifiques sur le métabolisme des corps cétoniques. Dans les humaines, la diète cétogène est utilisé dans des conditions cliniques particulières come approche nutritionnel reconnu (épilepsie) ou dans des études exploratoires (certains types de cancer, ou comme diète avant une chirurgie bariatrique). Notre projet pourra apporter des nouveaux acquis scientifiques utiles dans ce contexte translationnelle vers l’utilisation de la diète cétogène dans l’homme.

Procédures

L'intervention principale sur les animaux consistera dans des prélèvements sanguins et prélèvement de queue pour génotypage. La prise de la glycémie chaque deux semaines (7 fois pendant le protocole nutritionnel) sera faite à l'état vigil après 6 heures de jeûne. Une ponction de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) permettra de mesurer la glycémie au glucomètre. La tolérance au glucose sera évalué à 8 et 16 semaines (2 fois pendant le protocole nutritionnel) à l'état vigil après 6 heures de jeûne, suite à une injection intra-péritonéale de glucose 2mg/g du poids de la souris. Pour cela, des ponctions de la veine caudale (4-5 microlitres de sang) seront effectués à l'extrémité de la queue aux temps 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes, afin de suivre la courbe de la glycémie et de l'insulinémie. L'incision de la queue sera réalisée au temps t0, puis les prélèvements suivants seront effectués par simple grattage du caillot sanguin. Lors des prélèvements d'un fragment minime de queue pour le génotypage l’utilisation d’une crème anesthésiante à la lidocaïne sera envisagée afin de minimiser toute douleur et/ou souffrance associée au prélèvement.

Impact sur les animaux

Par rapport aux données de la littérature sur les souris sauvages (wild-type), les protocoles d’alimentation cétogène présentés dans ce projet ne devraient pas être susceptibles de générer des effets indésirables. Néanmoins, si l’administration de la diète cétogène (presque totalement dépourvue en sucres) devrait générer de la souffrance (inappétence, perte de poids, troubles comportementales), notamment dans les lignées transgéniques, le protocole sera terminé et les souris retournées à la diète standard avant mise à mort. La génération de souris transgéniques pourrait aussi engendrer un phénotype dommageable. Celui-ci pourrait consister dans des effets sur les paramètres métaboliques qui pourraient être manifestes à la naissance tels que hypo or hyperglycémie ou cétoacidose. Pour déceler ces événements, si les nouveaux nés montreront des signes de souffrance, la glycémie et cétonemie seront mesurées avec le kit Nova pro glu/ket qui mesure la glycémie et cétonemie de façon simultanée. Si avérées, ces évènements mèneront à l’arrêt de la génération de la ligne transgénique.

Devenir

Les protocoles se termineront avec une prise de sang retroorbitale (après anesthesie), et mise a mort par dislocation cervicale pour pouvor recuperer differents organes et tissues. La necessité de faire les analyses biochimiques justifie la mise à mort et recuperation de ces tissus et organes.

Remplacement

L’utilisation d’animaux est essentielle pour la réalisation du projet car il requiert l’analyse des effets des diètes au niveau de l’organisme et, d’un point de vue mécanistique, l’étude des Knock-outs tissue-spécifiques pour les gènes Oxct-1 et HMGCS2 ne peut être faisable que sur des souris.

Réduction

Notre stratégie de réduction, tout en restant dans de limites imposée par la nécessité d’obtenir une puissance statistique satisfaisant, nous permet d’avancer une demande d’utilisation de 256 souris au maximal.

Raffinement

Dans ce projet nous essayerons de raffiner et optimiser les procédures expérimentation pour réduire au maximum l’inconfort et les stress subie par les animaux. En plus, les protocoles ont été prévus de façon d’obtenir le plus d’informations possible de chaque animal en imposant, en même temps, le "moindre coût" en terme de mal être des animaux. Le raffinement dans le protocole expérimentale s’applique tout au long de la vie des animaux, et en particulier pendant la durée des protocoles nutritionnels. Pour satisfaire les conditions de raffinement, nous planifierons les protocoles de façon à éviter des perturbations susceptibles de procurer le stress de l’animal. De plus, les recours à l’anesthésie/analgésie est prévu pour les prises de sang et nous utiliserons des procédures d’euthanasie appropriées (dislocation cervicale) et sous anesthésie. Ces procédures de raffinements nous permettront aussi de générer des résultats de meilleure qualité et d’exploiter au mieux les résultats obtenus lors de l’expérimentation.

Choix des espèces

Comme notre projet est à l’interface entre le métabolisme et la signalisation cellulaire, le recours au model murin nous permettra i) dans les études nutritionnelles sur les souris wild-type d’obtenir des données nouvelles et originales dans le contexte de la grande quantité de littérature décrivant les effets d’une diète obésogène sur les souris et ii) en ce que concerne les études mécanistiques en utilisant les modèles KO, tissue-spécifiques, d'éclaircir les métabolisme des corps cétoniques et des effets bénéfiques potentielles de la diète cétogène. L’intervention nutritionnelle (diète contrôle, hypercalorique, cétogène) débutera chez des souris âgées de 5 semaines et se poursuivra pendant 16 semaines consécutives. Il est important que le protocole nutritionnel débute peu de temps après le sevrage pour maximiser les effets métaboliques. La présence de troubles métaboliques (hyperglycémie, intolérance au glucose …) chez la souris sous diète hypercalorique/hyperglycémique après 8 semaines de régime est connue, permettant de valider les potentiels effets bénéfiques d'une diète cétogène administée après les 8 semaines de diète hypercalorique/hyperglycémique. A la fin du protocole, les souris seront âgées de 21 semaines.

410 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 150 reproductrices euthanasiées à six mois et 260 produites transférées vers un autre projet déjà autorisé. Cette demande porte sur le seul élevage d'une lignée à phénotype dommageable, dont les individus développent des plaies dorsales et une perte de poil à partir de six mois, sans autre intervention. La souffrance déclarée tient donc à la lignée génétiquement modifiée elle-même, produite pour étudier le rôle de l'enzyme KDM6B dans le diabète de type 2. Le porteur affirme que la souris est le "modèle de référence" de l'obésité et du diabète et qu'aucune méthode sans animaux vivants ne peut remplacer ces procédures.

Objectifs

L’inflammation est reconnue comme un déterminant majeur de la mise en place du diabète de type 2 (DT2) et de ses complications cardiovasculaires. L’inflammation est notamment conduite par une activation de certaines cellules du système immunitaire (monocytes circulants et des macrophages tissulaires). La susceptibilité à développer un diabète de type-2 et de souffrir des complications cardiovasculaires semble être également associée à des facteurs environnementaux. Des études récentes suggèrent que ces facteurs environnementaux se traduisent par une modification de l’expression des gènes (notamment inflammatoires) par des mécanismes dit épigénétiques (modification de l’expression d’un gène sans modification de sa séquence génétique). L’enzyme KDM6B (Histone Lysine Demethylase 6B) est impliquée dans ses modifications épigénétiques. L'objectif du projet est de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait démontrer l'importance des modifications épigénétiques dans la mise en place et le développement du diabète de type 2 et dans ses complications. Ce projet de recherche fondamental a pour objectif de définir les conséquences de l'invalidation de KDM6B spécifiquement au niveau des macrophages, sur l’inflammation et l’homéostasie glucidique chez des souris. A terme, moduler l'activité de KDM6B pourrait être proposé comme une nouvelle approche thérapeutique pour contrôler l'inflammation afin d'atténuer le risque de diabète de type 2.

Procédures

Cette demande d'autorisation de projet est uniquement une demande pour l'élevage d'une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable. Les animaux ne subirront pas d'intervention.

Impact sur les animaux

La lignée murine KDM6B MKO est une lignée à phénotype dommageable. En effet, les souris KDM6b MKO et WT peuvent développer des plaies au niveau du dos à partir de l'âge de 6 mois : perte de poil et lésions cutanées. Avant l'âge de 6 mois, les animaux ne présentent pas de phénotype dommageable.

Devenir

Les 150 animaux en accouplement seront euthanasiés à l'age de 6 mois. Les animaux produits par les accouplements seront utilisés pour créer les groupes expérimentaux d'un autre projet déjà autorisé.

Remplacement

Afin de prouver l'implication de la protéine KDM6B, dans le développement du diabète de type-2, la stratégie d'invalidation génique dans des cellules spécifiques comme les macrophages a été utilisée. Ces souris sont actuellement disponibles. De plus, la souris est le modèle de référence dans l'étude de l'obésité et du diabète Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants. Le nombre d'animaux utilisés dans ce projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisés sera réduit à son maximum. 150 souris seront placées en accouplement : à raison de 5 accouplements en parallèle à renouveler tous les 6 mois durant 5 ans : 3 souris (1 mâles + 2 femelles) x 5 accouplements x 10 semestres = 150. 260 animaux seront produits afin d'être utilisés dans un autre projet déjà autorisé.

Raffinement

Les animaux sont stabulés en portoirs ventilés et ont un accès ad libitum a la nourriture. Les conditions de température et d'hygromètrie sont controlées et monitorées tous les jours. Le cycle d'éclairage est de 12h par jour (8h-20h). Pour s’assurer du « bien être » des souris, elles bénéficieront de coton et de « maisons » en carton afin de les occuper et afin qu’elles puissent se construire un « nid ». Les souris seront sous surveillance journalière. Les points suivants seront considérés comme points limites : 1. Tout dérèglement physiologique aboutissant à une incapacité prolongée ou irréversible à se nourrir ou à boire 2. Modification du comportement caractéristique d'une douleur intense, une détresse ou une souffrance (absence de locomotion, pelage hérissé et/ou terne, prostration, dos vouté) 3. Anomalies pouvant entrainer une douleur intense, une détresse ou une souffrance : ulcères, tumeurs, fractures... 4. Apparition de plaies/lésions au niveau du dos.

Choix des espèces

Le modèle murin est utilisé dans ce projet car les modèles génétiques utilisés ont déjà été validés chez la souris. Les souris sont faciles à manipuler et la présence du centre d’explorations fonctionnelles sur le site permet d’utiliser ce modèle dans de bonnes conditions d’élevage. Les animaux seront mis en accouplement à partir de l'age de 56 jours qui est l'age de maturité sexuelle des souris.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, un gavage, des prélèvements de sang et l'implantation chirurgicale d'une pompe osmotique, avec induction d'un diabète et d'une inflammation intestinale. Le porteur reconnaît une polydipsie, un poil hérissé, une léthargie, un dos courbé, une ataxie et des tremblements possibles. Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est directement en contact avec le bol alimentaire et les bactéries de la flore intestinale et assure donc un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. Bien que l’hyper-perméabilité intestinale et le passage concomitant de produits bactériens dans le sang aient été proposés comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique qui accompagne l'obésité et le diabète de type 2 (DT2), les mécanismes moléculaires à l’origine des défauts d’intégrité épithéliale lors de ces pathologies demeurent mal compris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action de l’insuline, une caractéristique du diabète, conduit indépendemment de l'obésité et de l'hyperglycémie, à une altération de la fonction barrière de l'intestin et une susceptibilité accrue à l'inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline contribue, indépendemment de l'obésité, à l'hyperperméabilité intestinal et au risque accru d'inflammation ou d'infection intestinales. Notre projet permettra l'identification dans l'épithélium intestinal des cibles cellulaires et des voies de signalisation dérégulées au cours de la résistance à l'insuline, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

-1 lot d’animaux vigiles fera l’objet d’une mise à jeun (14h), de 6 à 7 contentions (45 secondes chacune), d’une administration orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -1 autre lot d’animaux vigiles fera l’objet de 2 mises à jeun (4h et 14h), de 7 à 8 contentions (45 secondes chacune), de 2 administrations orale de produit (1 minute chacune), de 2 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun), d’un prélèvement de sang mandibulaire (1 minute chacun) et de 2 à 3 injections de produit (45 secondes chacune). Une partie de ces animaux sera également placée sous anesthésie et analgésie pour la réalisation d’un acte chirurgical (implantation sous cutanée d'une pompe osmotique, 20 minutes). -Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Les prélèvements, l’anesthésie, la contention le gavage et les injections sont des sources de stress pour les animaux. Certains actes peuvent induire une sensation de douleur chez l'animal : douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille) ou encore les douleurs post-opératoire (implantation de la pompe) ou liées à l’inflammation intestinale. De plus, la chirurgie comporte un risque pour l'animal lié à l'anesthésie (réveil, dépression respiratoire, hypothermie). Les souris rendues diabétiques présenteront une polydipsie associée à une glycosurie. L’implantation des pompes osmotiques en sous cutanée peuvent entraîner localement une inflammation (rougeur, gonflement) ou une infection (écoulements). Concernant les procédures incluant l’induction d’une inflammation intestinale, l’infection par des entéropathogènes, ou l’induction d’un diabète, l’apparition de signes généraux de souffrances peut survenir : poil ébouriffé (ou hérissé), perte de poids, écoulement des yeux, léthargie, dos courbé, ataxie, tremblement.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but d'obtenir des modèles de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Ils permettent d'obtenir une représentation simplifiée de systèmes biologiques impossibles à étudier directement chez l'Homme. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux issus de souris diabétiques pour démontrer que la résistance à l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 480 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests statistiques adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus des expérimentations ont préalablement été effectuées pour caractériser la réponse des cellules épithéliales intestinales à l'insuline à partir d'organoides intestinaux issus de souris dont l’intestin ne répond pas à l’insuline. Cette technique ne nécessite donc aucun traitement chez la souris. Elle permet également à partir d'une seule souris d'étudier plusieurs parties de l'intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée et dose des traitements seront réalisées selon les protocoles préétablis et maitrisés par notre équipe. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures (analgésiques, anesthésiques) afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive et des soins adaptés. L’application des points limites établis (apparence, mobilité, comportement, changement de poids, suivi post-opératoire) pour chaque procédure de ce projet sera effectué.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Par ailleurs, le choix de cette espèce est motivé par la volonté de comparer les résultats de ce projet obtenus sur des modèles de perte d'action globale globale de l'insuline à ceux d'un autre projet obtenus sur des souris génétiquement modifiées, déficientes pour l’action de l’insuline spécifiquement au niveau intestinal. Les souris utilisées seront âgées de 12 à 14 semaines pour toutes les procédures. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des mises à jeun, une biopsie, des administrations orales et injections répétées et jusqu'à quatorze prélèvements de sang à la queue, un test de tolérance à l'insuline pouvant provoquer une hypoglycémie prononcée. Le projet vise à décrire le rôle de l'insuline intestinale dans la prise de poids sous régime gras, le porteur affirmant que ce régime "n'entraîne pas de souffrances". Il indique avoir utilisé des organoïdes intestinaux mais présente le recours à la souris comme nécessaire pour ces dialogues inter-organes.

Objectifs

L’intestin est composé d’un épithélium simple, directement en contact avec le bol alimentaire et le microbiote et assure entre autres, un rôle de barrière sélective entre la lumière digestive et le milieu intérieur. L’hyper- perméabilité intestinale a été proposée comme un des facteurs participant à l'inflammation chronique de bas grade qui accompagne l'obésité, état inflammatoire qui favoriserait la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, équilibre glycémique). Nos premiers résultats montrent que la perte d'action intestinale de l’insuline conduit à une altération de la fonction barrière de l'intestin chez la souris. Dans ce contexte, l’objectif de ce projet est d’évaluer si la perte d'action intestinale de l’insuline favorise ou accélère la la prise de poids et certains désordres métaboliques associés (résistance à l'insuline, équilibre glycémique) chez des souris soumises à un régime riche en graisse.

Bénéfices attendus

Le bénéfice attendu de ce projet est la mise en évidence que la perte d'action de l'insuline et l'hyperperméabilité intestinale associée favorise ou accélère la prise de poids et l'altération de l'équilibre glycémique au cours d'un régime obésogène. Notre projet identifiera à la fois les cellules cibles impliquées et les voies de signalisation permettant l'action de l'insuline dans l'épithélium intestinal, ce qui est essentiel pour la conception de stratégies préventives et thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux feront l'objet d'une contention et d'une prélèvement par biopsie (30 secondes) - 1er lot d'animaux : 2 mises à jeun (14h et 6h), 4 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral, 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun) - 2ième lot d'animaux : 2 mises à jeun (14h et 6h), 8 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun) -3ieme lot d'animaux: 2 mises à jeun (14h et 6h), 16 contentions (30 secondes) pour un suivi pondéral, 1 à 2 administration orale de produit (1min chacune), 2 injections de produit (1 min chacune), 14 prélèvements de sang caudal (30 secondes chacun). Tous les animaux seront placés sous analgésie et anesthésie profonde pour un prélèvement sanguin terminal unique (30 secondes par souris).

Impact sur les animaux

Aucun des modèles murins ne présente de phénotype dommageable à l’état basal et le regime gras n'entraine pas de souffrances. Les deux régimes offerts sont appétents et ne provoqueront pas de stress ou de trouble dans le comportement alimentaire des animaux. Il y a un stress lors de l’anesthésie, de la contention et des injections. L'animal peut avoir une sensation de douleur de courte durée au site d’injection (piqûre de l’aiguille). Le test de tolérance à l'insuline peut entraîner une hypoglycémie prononcée chez la souris.

Devenir

A la fin de chaque procédure les animaux seront euthanasiés en vu de prélevements de sang et d'organes pour des analyses ultérieures.

Remplacement

Dans ce projet, les modèles animaux seront développés dans le but de mimer certaines caractéristiques de pathologies métaboliques (diabète) et inflammatoires (inflammation intestinale, infections entériques). Les dérégulations métaboliques et la réponse inflammatoire sont des phénomènes complexes faisant intervenir de nombreux dialogues inter-organes. Les animaux seront donc utilisés quand les questions soulevées par le projet ne pourront pas être résolues par des systèmes de culture in vitro. Cependant, nous avons utilisé des systèmes de culture tridimensionnelle à partir d'organoides intestinaux pour démontrer que la perte d'action de l'insuline altère certaines fonctions propres à l'épithélium intestinal.

Réduction

L'étude statistique permettant de calculer au plus juste le nombre d'animaux a été réalisée. L'étude comprend au total 360 animaux. Les analyses statistiques seront réalisées avec un logiciel approprié. La "significativité" des différences expérimentales sera évaluée par des tests adaptés à la comparaison de deux groupes ou plus. De plus, pour caractériser la réponse de l’intestin à l’insuline, nous avons utilisé une technique in vitro qui ne nécessite pas de traitement sur animaux vigiles et qui permet à partir d’une seule souris d’étudier plusieurs parties de l’intestin (duodénum, iléon et colon), et l'effet de plusieurs traitements, réduisant ainsi considérablement le nombre de souris.

Raffinement

La durée sous régime et les tests métaboliques seront réalisés selon les protocoles préétablis et maitrisés. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Les deux régimes offerts sont appétents et ne provoqueront pas de stress ou de trouble dans le comportement alimentaire des animaux. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification et de petite maison. L'euthanasie de l'animal se fait sous analgésie et anesthésie profonde. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés et l’application des points limites établis.

Choix des espèces

La souris est un modèle de choix pour les études ayant attrait à la caractérisation de pathologies métaboliques et inflammatoires. Seule cette espèce possède des modèles présentant une délétion spécifique du récepteur de l'insuline dans des tissus d’intérêt, permettant ainsi la caractérisation de l'action de l'insuline au cours de ces pathologies. Les souris utilisées seront âgées de 8 à 9 semaines à chaque début de procédure. Nous avons choisi de travailler sur des souris adultes afin qu’elles aient un tractus intestinal totalement mature.

219 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue pour prélèvements, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque hamster est hébergé seul seize semaines en conditions hivernales, exposé au froid à 8 °C pour entrer en hibernation, et subit deux chirurgies, la pose d'un capteur de température puis d'une pompe diffusant des hormones, la moitié des animaux étant en plus castrés. Le porteur indique que des injections pratiquées pendant la torpeur peuvent provoquer une douleur aiguë et le réveil de l'animal, et que la castration peut entraîner une hémorragie et des douleurs supplémentaires. Il affirme que l'hibernation met en jeu l'organisme entier et qu'aucun moyen de substitution ne permet de la modéliser, justifiant le recours au hamster syrien.

Objectifs

L’hibernation est une adaptation physiologique et comportementale qui permet la survie de l’espèce pendant les périodes saisonnières défavorables (en hiver : température extérieure basse et pénurie des ressources alimentaires). Tout au long de l’hibernation, afin d’économiser de l’énergie, l’animal va réaliser des cycles d’éveil/sommeil, alternant entre des phases actives avec une température corporelle à 37°C et des épisodes de torpeur, caractérisés par un endormissement profond associé à une hypothermie corporelle sévère. La température corporelle s’ajustant sur les températures extérieures froides de l’hiver peut descendre à 5°C. Des travaux antérieurs suggèrent que les hormones thyroïdiennes du cerveau seraient impliquées dans ces processus d’hibernation. Nous allons vérifier cela chez une espèce hibernante : le hamster syrien.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet concernent les connaissances obtenues en recherches fondamentales sur le système nerveux central, le métabolisme ainsi que sur la biologie d'un animal hibernant.

Procédures

Les hamsters syriens seront hébergés seul pendant 16 semaines dans des conditions où les jours sont courts comme en hiver mais également exposés au froid afin d'obserser les comportements hibernatoires des animaux. Les animaux subiront deux actes chirurgicaux à 2 semaines d'intervalle. Le premier acte durera moins d'une heure 1 h pour l'insertion d'un capteur télémétrique de température corporelle, permettant le suivi à distance de l'hibernation des animaux. Le deuxième acte, d'une durée de 2h30 maximum pour la mise en place d'une mini-pompe diffusant des hormones. Ils seront exposés au froid (8°C) pour entrer en hibernation. Lors d'utilisation de pompe rechargeable, des injections transcutanées sont réalisées en phase de torpeur (animaux profondément endormis). Une castration est ajoutée à la première chirurgie pour la moitié des animaux. L'évolution de l'hibernation des animaux est surveillée pendant 6 semaines environ.

Impact sur les animaux

Lors des chirurgies, l’anesthésie générale peut induire une hypothermie, de la sécheresse occulaire et une légère déshydratation. Au niveau du site d’incision, il y a des risques de douleur, d’inflammation et d’infection de la plaie. Une perte de poids légère (inférieure à 5%) sur 24h est attendue, mais devrait être transitoire. Elle pourrait se maintenir en cas de complications post-chirurgicales (inflammation, infection, douleur). L’insertion de la pompe sous la peau du dos pourrait éventuellement gêner la motricité de l’animal (encombrement, frottements) si celle-ci est trop proche du cou ou des membres antérieurs. Dans le cas d'utilisation de la pompe rechargeable, lors d'un épisode de torpeur, des injections transcutanées sont réalisées et peuvent induire une douleur aigüe légère et son réveil. La castration peut induire une hémorragie et de douleurs supplémentaires.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort pour prélèvements en fin d'expérience.

Remplacement

L’expérience doit être réalisée sur l’animal entier. Les processus impliqués dans l’hibernation font intervenir l’ensemble de l’organisme, aussi est-il impossible, en l’état actuel de nos connaissances, de réaliser une telle étude sur des organes isolés. Aucun moyen de substitution ne permet de modéliser les différentes étapes de l’hibernation et les processus liés à chaque étape ni les relations entre les organes périphériques et le cerveau.

Réduction

Le nombre d'animaux (8 par groupe) a été calculé pour obtenir des résultats statistiquement robustes et de faible variance pour comparaisons inter-groupe.

Raffinement

Pour éviter les agressions dans les jours courts comme en hiver, les animaux seront hébergés en cages individuelles enrichies avec de la frisure de nidation et un bâton à ronger. Lors des chirurgies, les animaux bénéficieront d'une anesthésie générale et d'analgésiques locaux. La température corporelle sera maintenue à l’aide d’un tapis chauffant. Un anti-inflammatoire non stéroïdien sera administré en post-chirurgie. La longueur du cathéter entre la canule et la pompe est tout particulièrement ajustée afin de pas gêner le hamster syrien dans ses mouvements. Des points limites ont été établis afin de soustraire l'animal à la souffrance.

Choix des espèces

Le modèle animal choisi est le hamster syrien (Mesocricetus auratus) car c’est un animal hibernant. Les animaux sont des adultes mâles (entre 3 et 9 mois ; poids corporel moyen 120 g) car notre expérience requiert qu’ils soient sexuellement matures et ce sexe nous permet de voir facilement si le système reproducteur de l'animal est activé ou inhibé grâce à la taille des testicules.

480 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une chirurgie du cerveau sous anesthésie pour y injecter des virus, d'autres un jeûne de 24 heures, des injections répétées et un régime gras destiné à les rendre obèses, afin d'étudier le rôle d'une protéine dans la prise alimentaire. Le porteur décrit la découverte récente d'un gène jusque-là inconnu et renvoie les applications contre l'obésité et le diabète à un horizon lointain. Il affirme avoir déjà validé son approche in vitro mais conclut au "besoin" de la souris, seule à réunir les organes en jeu dans la régulation énergétique.

Objectifs

Le maintien de la balance énergétique dépend de l'équilibre entre les apports et les dépenses énergétiques. Il existe des systèmes de régulation de la prise alimentaire qui permettent un équilibre entre les apports énergétiques, les dépenses et le maintien du poids corporel autour d'une constante. Une dérégulation du système peut conduire à l'obésité et aux maladies métaboliques qui lui sont fortement associées comme le diabète. Nous avons récemment mis en évidence une fonction inattendue d’une protéine dans la régulation de l’appétit. Nos données mettent en évidence le rôle d’un variant génétique associé au diabète de type 2. Toutefois le mécanisme moléculaire sous-jacent à cette découverte reste incomplet. Nous avons récemment identifié un nouveau gène jusqu’alors inconnu qui pourrait contribuer à la régulation de l’appétit chez la souris. Nos données préliminaires confirment que cette nouvelle cible pourrait représenter un nouveau mécanisme favorisant l'obésité. Par conséquent, ce projet vise à comprendre comment cette protéine est impliquée dans l’homéostasie énergétique.

Bénéfices attendus

Au cours de la dernière décennie, l'humanité a été confrontée à une épidémie d'obésité et de Diabète de type 2 (DT2) en rapide augmentation. Le nombre de sujets touchés continue d'augmenter dans les économies de marché établies. Plus important encore, la propagation de l'épidémie est encore plus spectaculaire dans les économies émergentes et en développement très peuplées. Le mode de vie sédentaire et la suralimentation, caractéristiques de notre société moderne, expliquent cette propagation épidémique de la maladie. Une approche simple consisterait donc à adapter les habitudes personnelles en conséquence. Malheureusement, cette approche ne fonctionne que pour un petit sous-ensemble de la population, car elle exige une maîtrise de soi très forte et n'est pas suffisante lorsque le diabète est déjà apparent. Si d'énormes efforts de recherche ont été déployés pour élucider et cibler les pathomécanismes de l'obésité et du DT2, le tableau est encore loin d'être complet. Par conséquent, de nouvelles perspectives de recherche menant à des approches thérapeutiques sont fortement demandées pour prévenir les énormes coûts de santé et les conséquences négatives du mode de vie moderne. Notre étude se concentre sur un rôle potentiel d'une nouvelle protéine clé dans la régulation neuronale de la prise alimentaire et du comportement alimentaire. Cette étude est pertinente et innovante pour plusieurs raisons. Nous avons déjà montré le rôle spécifique de cette voie de signalisation dans le contrôle de la prise alimentaire, une fonction qui n'avait jamais été mise en avant jusqu’à présent. Comme le contrôle de la prise alimentaire est très complexe, les expériences suggérées sont conçues pour explorer davantage le mécanisme moléculaire impliqué dans la prise alimentaire et le gain de poids. Cette étude nous permettra de déterminer si cette protéine jusqu'alors inconnue est une nouvelle cible thérapeutique dans l’obésité.

Procédures

320 animaux subiront, sous anesthésie générale, une chirurgie stéréotaxique afin d’injecter des adénovirus associés dans une zone particulière du cerveau. La durée de la chirurgie, de l’induction de l’anesthésie au réveil, est 1h – 1h30. Les 320 animaux (+160 pas de stéréotaxie) seront soumis à des tests métaboliques (1 test par semaine - 2 tests prévus). Pour chaque test ils subiront 4 injections IP (1inj/jour pendant 4 jours - durée 10 sec/inj). 240 souris seront soumises à un régime enrichi en gras qui entrainera une prise de poids.

Impact sur les animaux

La chirurgie stéréotaxique est utilisée pour délivrer des vecteurs viraux (adénovirus associés) dans une zone particulière du cerveau. Ces vecteurs permettront l'expression de notre protéine d'intérêt ou shRNA. La chirurgie pourrait provoquer une réaction inflammatoire locale post- chirurgicale. Différents tests métaboliques sont décrits dans ce projet: Le premier est un test de sensibilité à la ghréline (hormone de la faim). Une habituation des animaux sera nécessaire. Pour ce faire, une injection IP de NaCl 0.9% sera réalisée quotidiennement pendant 3 jours. Le jour du test les animaux subiront une injection IP de ghréline qui stimulera leur appétit. Le deuxième est un test de réalimentation après un jeûne de 24H. L'effet de la mise à jeun sera la stimulation de leur appétit et une perte de poids passagère. Une diète riche en gras pour créer un environnement obésogène sera mis en place chez les souris, ce qui peut créer un inconfort chez les souris. Pour les expériences nécessitant la mesure de la prise alimentaire, les souris seront individualisées dans les cages.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés et leur cerveau sera prélevé pour des études histologiques.

Remplacement

Toutes les validations experimentales in vitro ont été réalisées. Nous avons ainsi apporté la preuve de concept in vitro que notre approche expérimentale fonctionne. Pour tester nos hypothèses, nous avons besoin de la souris. En effet, la régulation de l'homéostasie énergétique nécessite la participation de plusieurs organes interdépendants (foie, îlots de Langerhans dans le pancréas, muscles, tissus adipeux, cerveau). Ces mécanismes de régulation ne sont présents que dans des organismes complexes tels que la souris.

Réduction

Nous utiliserons un total de 480 animaux. Le nombre d’animaux testés dans chaque expérience nous permettra une comparaison statistique adaptée entre les différents groupes tout en tenant compte des impératifs de réduction. Par ailleurs, toujours par souci de réduction, plusieurs procédures expérimentales (avec un temps de récupération adaptée pour les animaux) seront réalisées chez les mêmes cohortes de souris.

Raffinement

Les animaux sont hébergés dans des cages avec un enrichissement essentiel pour leur bien-être (Coton + Carton). La litière des animaux est remplacée une fois par semaine. Le stress lié aux procédures nécessitant l'isolement des animaux sera diminué par l'usage de cages transparentes rendant leurs congénères visibles. L'usage d'anesthésique et d'analgésique sera systématique pour les chirurgies stéréotaxiques potentiellement douloureuses. L'habituation des souris à l'opérateur aura systématiquement lieu quelques jours avant l'expérience par du personnel qualifié afin d’éviter le stress lié à la manipulation des animaux. Les animaux seront surveillés quotidiennement par du personnel qualifié pour prendre les mesures appropriées en cas d'apparition de signes d'inconfort ou de douleur après avis vétérinaire. Des points limites seront déterminés pour éviter toute souffrance animale. Les injections stéréotaxiques seront réalisées par une personne détentrice d'une formation en chirugie et formée spécifiquement à cet acte chirurgical.

Choix des espèces

Pour l'étude du métabolisme, la souris est un modèle animal déjà validé. D’autre part, l’utilisation des souris se justifie également par l’existence de lignées génétiquement modifiées. Les chirurgies stéréotaxiques pour l'injection des AAVs seront réalisées chez des animaux âgés de 18 semaines, stade auquel toutes les structures cérébrales sont pleinement développées. Les animaux seront nourris avec de la nourriture riche en gras dès l'âge de 5 semaines afin de favoriser une prise de poids optimale

3 615 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent des injections d'antigènes combinés à un adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund qui peut provoquer ulcérations et fièvre, puis des prises de sang répétées, à raison de deux lapins par protocole pour 1 590 protocoles. Il s'agit d'une production commerciale d'anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche publiques et privées, non d'une étude scientifique. Le porteur affirme qu'aucune méthode in vitro n'est aussi efficace pour cette production et écarte les banques d'anticorps existantes au nom du temps et du budget.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation de substances médicamenteuses. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 1590 protocoles sont envisagés.

Procédures

Injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) Prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

4 022 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent pendant six mois un régime riche en gras et en sucre, des gavages et injections quotidiens pouvant atteindre 210 gestes, une coupure de la queue pour les prises de sang et un isolement en cage individuelle que le porteur décrit comme stressant. L'objet est de comprendre le rôle du microbiote intestinal dans le diabète et la stéatose, avec des pistes thérapeutiques annoncées pour une "préoccupation majeure de santé publique". Le porteur affirme qu'aucun système in vitro ne simule le lien entre microbiote, intestin et organes, et juge le recours aux souris "nécessaire".

Objectifs

Le tube digestif est un milieu complexe dans lequel coexistent des cellules de l’hôte, une grande diversité de microorganismes (constituant le microbiote) et des molécules provenant de l’alimentation. Les bactéries et les produits qu’elle sécrètent y jouent un rôle crucial pour la bonne santé de l’hôte. Ainsi un déséquilibre de la diversité de microorganismes a été montré chez les patients atteints de maladies métaboliques comme le diabète ou stéatose hépatique non alcoolique. Notre travail de recherche vise à mieux comprendre les interactions entre l’hôte et les bactéries intestinales dans des conditions physiologiques (individus sains) et pathologiques (individus malades). Des travaux suggèrent que certaines bactéries du tube digestif et produits bactériens sont responsables de dérèglements métaboliques chez l’hôte. L’objectif de ce projet est d’explorer les mécanismes, d’identifier le rôle des bactéries et les cellules associées impliquées dans ces dérèglements dans trois modèles murins de maladies métaboliques (prédiabète, diabète et stéatose hépatique non alcoolique).

Bénéfices attendus

Les maladies métaboliques sont une préoccupation majeure de santé publique et leur incidence est en constante augmentation. Les maladies métaboliques sont associées à un régime alimentaire déséquilibré et à l’obésité. De nombreux travaux étudiant l’obésité témoignent d’une perturbation du microbiote intestinal et d’une augmentation des réponses inflammatoires dans les intestins ou dans les organes périphériques, associées à une dérégulation métabolique de l’hôte. Malgré la prise en charge thérapeutique des patients obèses, la persistance de l’inflammation et d’une perturbation du microbiote conduisent souvent à un retour de la maladie au cours de la vie de l’individu. Il apparait alors aujourd’hui essentiel d’identifier les mécanismes impliqués pour proposer des solutions permettant le dépistage et le traitement des maladies métaboliques. Ce projet amènera une meilleure compréhension de l’implication du microbiote dans la réponse inflammatoire liée à l’obésité et de ses effets sur les maladies métaboliques comme le diabète et la stéatose et ainsi proposer de nouvelles voies thérapeutiques permettant le traitement et la prévention de ces maladies.

Procédures

Pendant une durée maximale de 30 semaines, les souris recevront un régime alimentaire riche en gras, en sucre ou en cholestérol susceptible de moduler leur ingestion quotidienne et leur prise de poids. Les souris seront soumises à des injections (quelques secondes) ou des gavages (quelques secondes) quotidiens pour une période comprise entre 12 et 30 semaines soit 210 au maximum. Deux gavages et 1 injection seront aussi réalisés en fin de protocole au cours de deux tests qui seront espacés d’une semaine chacun, ainsi qu’une petite coupure à l’extrémité de la queue (1 seconde) et massage (quelques secondes). Nous effectuerons 2 collectes de fèces lors de l‘émission naturelle en début et fin de protocole. La durée maximale de la collecte est estimée à 30 min maximum. Un prélèvement de sang de la joue sera réalisé une fois sur animaux vigiles en fin de procédure avant l’euthanasie. Ce prélèvement dure 15 à 20 secondes.

Impact sur les animaux

Pour étudier l’impact du microbiote qui est différent entre les individus et suivre la prise alimentaire qui est une donnée essentielle à nos études, les animaux seront placés en cage individuelle ce qui entraine un stress modéré. Les prélèvements fécaux (émission naturelle de fèces par la souris en début et en fin de protocole) et pesées des animaux (une fois par semaine) seront réalisées sur tous les animaux dans des pots de récolte ou de pesée, ce qui entraine un stress léger. Les animaux seront soumis à des gavages et des injections quotidiens tout au long du protocole. Bien que chaque action engendre un stress léger et de très courte durée (moins de 10 secondes), cette répétition de gestes engendre un stress requalifié de léger à modéré. La procédure de prélèvement de sang nécessaire à la lecture de la glycémie (OGTT, IPGTT) et l’insulinémie (ITT) présente une douleur légère car il est réalisé via une petite coupure au niveau de la queue réalisée une seule fois par l'expérimentateur lors du premier prélèvement du test. . Par la suite un simple massage permet de prélever du sang sans avoir à recouper la queue. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l'expérience. Ces trois tests nécessitent une mise à jeun de 6 heures. Afin d’éviter une période de jeûne trop drastique lors de ces tests, ceux-ci ne seront pas réalisés durant la phase nocturne mais en phase diurne. Un délai minimum d’une semaine séparera deux tests (OGTT/IPGTT/ITT). Les bactéries (pro-ALPK1) et molécules (ADP-H, agonistes et antagonistes) administrées n’ont pas d’effet indésirable connu chez les animaux. Pour les souris soumises aux régimes riches en graisse, la prise de poids associée à ces régimes sur la durée d’exposition n’affecte pas leur mobilité.

Devenir

L’ensemble des animaux sera mis à mort à la fin de chaque procédure pour le prélèvement de leurs organes et tissus utilisés pour des analyses nécessaires à ce projet.

Remplacement

Il n’existe aujourd’hui pas de modèle ou de technique in vitro permettant de simuler un système digestif en lien avec le microbiote, l’inflammation intestinale, les tissus périphériques (foie, tissus adipeux) et la régulation de la glycémie. Le recours à des animaux est donc nécessaire pour intégrer l’ensemble des données sur les bactéries du microbiote intestinal en lien avec les données biologiques obtenues à partir des différents tissus.

Réduction

Le choix des molécules et bactéries testées dans ce projet l’ont été préalablement sur des systèmes cellulaires in vitro. Ainsi, nous avons sélectionné les bactéries et molécules les plus intéressantes et les plus activatrices pour réduire le nombre de molécules et bactéries à tester in vivo. Nous avons prévu d’inclure 12 souris par groupe expérimental, car d’après les études déjà menées au laboratoire, ce nombre apparait nécessaire afin de permettre la mise en évidence de différences statistiques significatives compte-tenu de la variabilité connue des paramètres mesurés. Nous allons tester 2 bactéries ou molécules en même temps ce qui permettra de diminuer le nombre de contrôles entrant dans le protocole expérimental. Chaque lignée de souris provient d’élevages indépendants.

Raffinement

Les souris bénéficieront d’un enrichissement avec du papier pour réaliser des nids et une maison en propylène rouge pour permettre aux souris de faire ce nid et se cacher. Elles auront également un bâton à ronger. Afin de palier au stress induit par l’isolement, les cages seront en plexiglass transparentes et mises côte à côte pour permettre les interactions visuelles, sonores et olfactives entre les animaux. Ces enrichissements permettent d'assouvir au mieux les comportements naturels de l'animal. Les animaux seront observés chaque jour (surveillance visuelle) et plus précisément deux fois par semaine au moment de la prise alimentaire quantifiée (par pesée de l’aliment) et de la prise de poids des animaux. En cas de blessure, un traitement local sera appliqué si celle-ci est légère sinon l’animal sera exclu du protocole et euthanasié. Les souris dormant le jour, nous réaliserons les mises à jeun pendant la journée afin de limiter la sensation de faim.

Choix des espèces

Les animaux auront 8 semaines au début de la procédure, âge auquel le système immunitaire est mature et le microbiote intestinal stabilisé. Le modèle souris est largement étudié dans les recherches sur les maladies métaboliques, ce qui permet l’accès à de nombreuses données physiologiques et metaboliques. Nous disposons également de données préliminaires sur ce modèle animal. De plus, les délétions de gènes spécifiques dans un type de cellules donné sont uniquement présent dans ce modèle.