Système endocrinien
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Evolution de la menstruation chez les primates
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- Recherche fondamentale
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- Système endocrinien
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Babouins : 6
Singes écureuils : 6
Capturées à la main deux à trois fois par semaine et anesthésiées à chaque fois pour une prise de sang et un frottis vaginal, 6 femelles ouistitis et 6 femelles singes écureuils subissent ensuite l'ablation de l'utérus, avec un risque d'hémorragie interne, d'abcès ou d'éventration. Au total, 18 femelles primates, dont 6 femelles babouins soumises sous anesthésie à une biopsie par raclage, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, et toutes restent en vie dans leur groupe social d'origine. Le projet doit retracer l'évolution de la menstruation chez les primates, et le porteur écrit qu'il servira aussi à évaluer si l'utilisation de primates non-humains comme "modèles de recherche" pour l'endométriose "est pertinente". Les ouistitis et les singes écureuils ont été retenus, explique-t-il, parce qu'ils n'ont pas de menstruation, comme point de comparaison avec les babouins.
Objectifs
Les objectifs du projet sont la caractérisation au niveau cellulaire, génétique et fonctionnel de l’évolution de la menstruation chez les primates. Ce projet répond à une question cruciale mais sous-étudiée liée à l’évolution de l’espèce humaine, ayant des conséquences sérieuses au niveau médical.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser les réseaux moléculaires mis en jeu lors du cycle hormonal et de la menstruation à l'état sain chez les primates, et d'évaluer leur conservation entre espèces. La caractérisation de cet état sain est une base indispensable à la compréhension des mécanismes pathologiques, et pour évaluer si l'utilisation actuelle de primates non-humains comme modèles de recherche pour les maladies telles que l'endométriose est pertinente.
Procédures
Babouins : Le suivi des cycles des 6 femelles babouins se fait par observation (non-invasive) pendant 3 mois. Le jour de la biopsie par raclage les animaux seront capturés dans leurs enclos respectives à l’aide des tunnels de capture et transférés dans des cages à fond amovible pour être anesthésiés avant de suivre la biopsie. La durée de la capture peut prendre 30 minutes. La durée de la biopsie, 1 heure. Ouistitis et Singes écureuils : Le suivi des cycles des 6 femelles ouistitis et 6 femelles singes écureuils se fait par dosage sanguin de la progestérone et suivi de l’indice caryopyknotique de l’épithélium vaginal. Les animaux doivent être capturés entre 2 et 3 fois par semaine(les prélèvements pourront être plus espacés lors du suivi du 2ème et 3ème cycle selon la concordance aux valeurs de références) pour faire un prélèvement sanguin à faible volume et un frottis vaginal. Les animaux seront capturés manuellement. L’ensemble des prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. La durée normale de l’intervention est de 10 minutes (maximum 30 minutes). Les 6 ouistitis et singes 6 écureuils subiront une hystérectomie. Le temps d’anesthésie générale requis pour une hystérectomie chez une petite espèce comme le Singe écureuil ou le Ouistiti est de une heure maximum. (avec un temps de préparation de l’animal d’environ 30 minutes et environ 30 minutes d’acte chirurgical pur).
Impact sur les animaux
Babouins : Le suivi des cycles des femelles babouins se fait par observation (non-invasive). La biopsie par raclage est un acte bien maîtrisé et peu invasif et n’induira pas de douleur importante apparente. Dans ce genre d’intervention le risque d’hémorragie est minime. Cependant en cas d’hémorragie la manipulation sera directement arrêtée. L’animal sera pris en charge directement par l’équipe vétérinaire de l’établissement. Ouistitis et Singes écureuils : Le suivi des cycles des femelles ouistitis et singes écureuils se fait par dosage sanguin de la progestérone et suivi de l’indice caryopyknotique de l’épithélium vaginal. Les animaux doivent être capturés dans leurs enclos entre 2 et 3 fois par semaine (les prélèvements pourront être plus espacés lors du suivi du 2ème et 3ème cycle selon la concordance aux valeurs de références) pour faire un prélèvement sanguin à faible volume et un frottis vaginal. Les animaux seront capturés manuellement. Ce geste est très bien maîtrisé par l’établissement. À part de le stress lié à ce type de manipulation, aucun effet indésirable cumulatif n’est attendu sur ces animaux. L’ensemble des prélèvements seront réalisés sous anesthésie générale. Le protocole anesthésique est un protocole fiable et sûr car il est réalisé en routine dans l’établissement. Les prélèvements se feront sur la veine fémorale principalement mais d’autres veines pourraient être utilisées telles que les veines saphènes, jugulaire et céphalique pour éviter l’apparition d’hématomes importants. Les ouistitis et singes écureuils subiront une hystérectomie. Plusieurs complications post-chirurgicales peuvent survenir avec des degrés de gravités différents (hématomes, infections urinaires, surinfections de la plaie chirurgicale (abcès), hémorragies internes ou encore éventration). Les actes pré-opératoires, opératoires et post-opératoires sont réalisés de sorte à minimiser les risques de survenue de ces complications. Toutefois, en cas de complications septiques de plaies une antibiothérapie à large spectre sera initiée (Amoxicilline/Acide clavulanique 15 mg/kg BID PO ou 15 mg/kg IM tous les 2 jours). Dans le cas d’autre complications, l’animal sera immédiatement pris en charge par l’équipe vétérinaire de l’établissement. Dans tous les cas l’animal sera isolé et surveillé par l’équipe vétérinaire de l’établissement jusqu’à récupération complète.
Devenir
Tous les femelles seront gardées en vie et dans leurs groupes sociaux d’origine après chacune des procédures.
Remplacement
La menstruation est un phénomène tissulaire complexe qui ne peut pas être étudié fonctionnellement sur des cellules en culture. L’étude du transcriptome et des régions de régulation de la transcription nécessite l’utilisation d’échantillons de tissus prélevés directement sur les animaux avec un suivi strict du cycle hormonal. Il n’existe pas de banque de tissu pour cet organe en ces conditions.
Réduction
Pour chaque espèce nous utiliserons 6 individus (soit 18 animaux au total). 3 femelles seront prélevées dans la phase lutéale et 3 femelles en fin de cycle (menstruation ou phase équivalente pour les espèces non menstruantes). Ce nombre correspond au nombre minimum de réplications par espèce nécessaire à l'interprétation des résultats de l'étude.
Raffinement
Tous les prélèvements de tissu se feront sous anesthésie générale et couverture antalgique. Pour les babouins, la biopsie se fera par raclage en minimisant au maximum le stress pour l’animal et l’invasivité du prélèvement. Toutes nos animaleries font l’objet d’un planning de mise à disposition d’enrichissements adaptés à chaque espèce. Les enrichissements sont soit structurels (divers perchoirs, balançoires...), périodiques (jeux de manipulations proposés selon un rythme hebdomadaire) ou alimentaires (graines dans la litière pour fourragement, glaçons surprises, friandises...). Ce programme est supervisé par notre responsable du bien-être animal et validé par la structure en charge du bien-être animal.
Choix des espèces
La menstruation est présente seulement chez certains primates. Nous avons sélectionné pour l’étude cinq primates non-humains et l’Homme. Chez les Cercopithecinae, un clade proche phylogénétiquement de l’Homme, nous trouvons des espèces avec menstruation (e.g. babouin olive, macaque rhésus). Dans la super-famille Ceboidae, incluant des espèces plus éloignées phylogénétiquement, nous trouvons des espèces sans menstruation comme le Singe écureuil et le Ouistiti commun. Cette configuration nous permettra de mettre en évidence les différences fonctionnelles qui sous-tendent l’apparition des menstruations chez les primates en tenant compte de la structure de l’arbre phylogénétique. L'étude nécessitant des échantillons de tissu utérin à la fin du cycle menstruel, tous les animaux utilisés sont des adultes en âge de procréer.
Etude des effets rénaux et oculaires de la protéine Claudine19
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160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance allant de légers à sévères, une partie étant opérée sous anesthésie sans réveil. Modèles d'une maladie rénale rare, elles sont hébergées sept jours en cage à métabolisme et subissent jusqu'à onze prises de sang par ponction de la veine mandibulaire, la mise à mort se faisant par ablation des reins sous anesthésie provoquant une hémorragie fatale. Le porteur indique qu'une partie des animaux peut développer une cécité progressive et éprouver angoisse et douleur lors des ponctions. Il affirme que le remplacement n'est pas possible car il s'agit d'étudier une mutation sur un organisme "entier".
Objectifs
Chez l'humain, les anomalies de la protéine claudine-19 sont responsables d'une maladie rare appelée hypomagnésémie familiale avec hypercalciurie et néphrocalcinose ; cette maladie est caractérisée par une perte massive de calcium et de magnésium dans l'urine, qui se complique de dépôts de calcium dans le rein (néphrocalcinose) et d'insuffisance rénale chronique, nécessitant le recours à la dialyse et à la transplantation rénale entre 20 et 40 ans. Elle se complique également d'une atteinte oculaire menant à la cécité. La fonction de la protéine claudine-19 est inconnue. Le but de cette étude est de déterminer cette fonction. Les objectifs sont -d'identifier les anomalies sanguines et urinaires provoquées par l'inactivation de la protéine claudine-19, -de mesurer les conséquences de l'inactivation sur la capacité du rein à conserver le calcium et le magnésium, -d'étudier l'évolution de la fonction rénale au cours de la vie des animaux - d'étudier l'apparition et le développement de la néphrocalcinose, d'étudier le développement et les mécanismes de l'atteinte oculaire.
Bénéfices attendus
Les résultats permettront de déterminer le rôle de la protéine claudine-19 dans le fonctionnement du rein et de l'œil des mammifères terrestres. Plus généralement, cette étude apportera des éléments permettant de mieux comprendre les mécanismes de transport transépithélial des électrolytes dans divers épithéliums. Cette étape est un préalable sur le chemin devant permettre de développer un traitements efficace de l'hypomagnésémie familiale avec hypercalciurie et néphrocalcinose et de prévenir les complications délétères (insuffisance rénale et cécité). Le projet permettra 1. de connaitre précisément l'impact de l'inactivation de claudine-19 sur l'homéostasie ionique, 2. de comprendre l'adaptation des différents segments tubulaires rénaux à la perte de fonction de claudine-19, de comprendre le phénotype global et, 3. de connaitre précisément l'impact de l'inactivation de claudine-19 sur la physiologie oculaire.
Procédures
Les animaux sont soumis - à un hébergement en cage à métabolisme individuelle pendant 7 jours pour recueil d'urine - à un prélèvement sanguin, unique pour certains des animaux ou répétés chez d'autres animaux (jusqu'à 11 sur une période de 10 mois) par ponction de la veine mandibulaire chez l'animal vigile - à une anesthésie terminale par injection intrapéritonéale. Par ailleurs, indépendamment des effets indésirables des procédures énumérés ci-dessus, il est possible, mais pas certain, que les animaux développent une cécité progressive au cours de leur existence.
Impact sur les animaux
Les effets ci-après ne sont pas tous attendus mais ils sont possibles ; perte de poids, angoisse et intolérance à l'hébergement en cage à métabolisme, hémorragie au point de ponction, douleur lors de la ponction transcutanée
Devenir
Mise à mort : A l'issue de chaque procédure, le projet prévoit une éxérèse des reins pour étude des transcrits et des protéines ou pour dissection d'une branche large acendante de l'anse de Henle pour expérience de microperfusion tubulaire ; dans tous les cas, l'éxérèse des reins est réalisée sous anesthésie générale et provoque une hémorragie fatale
Remplacement
La complexité des déterminants des transports ioniques transépithéliaux et de leurs conséquences systémiques est telle que le remplacement n'est pas possible puisqu'il s'agit d'étudier les conséquences d'une mutation génétique sur un organisme entier, avec toute sa complexité et ses capacités d'adaptation. Il n'y a pas d'alternative à cette étude, les modèles cellulaires existant ne permettant pas de rendre compte de la complexité du fonctionnement de l'organisme intact. La description phénotypique des rétines des souris ne peut s’envisager que sur des rétines entières parcourues par une vascularisation active, du vivant de l'animal ; pas de remplacement possible à ce stade de l’étude.
Réduction
Cent soixante (160) animaux seront utilisés dans cette étude. Les 2 examens ophtalmologiques pratiqués n’étant pas invasifs pour les yeux (il s’agit d’imageries), nous examinerons les 2 yeux de chaque animal et nous pratiquerons l’OCT et l’angiographie l’une après l’autre sur les mêmes animaux, profitant des mêmes anesthésies générale et locale. Ceci diminue de beaucoup le nombre d’animaux nécessaires. Le nombre d’animaux par groupe est réduit au maximum de façon à assurer des observations fiables et utilisables. Les 2 yeux de chaque souris serviront à la fois à ces examens vivo et à d’autres analyses ex vivo (après euthanasie), puisque la précision de ces examens remplace l’histologie de la rétine et économise les animaux qui auraient dû être euthanasiés pour cela. Les mesures réalisées dans la domaine de l'homéostasie tiennent compte de l'état de l'art de manière à avoir la meilleure performance des mesures réalisées et réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux par groupe a été calculé en tenant compte de la variabilité des paramètres d’intérêt en fonction des conditions expérimentales; les nombres d'animaux nécessaires ont été déterminés en appliquant des tests statistiques appropriés. Les comparaisons intergroupes seront réalisées à l’aide de tests non paramétriques sans appariement, en raison de l’absence de certitude quant à la normalité de la distribution des variables. En se basant sur notre expérience de la dispersion des variables pertinentes, nous avons calculé que pour une puissance beta de 80 %, un risque alpha de 5% et une différence des médianes des groupes d’au moins 40 %, les effectifs nécessaires étaient de 10 animaux par groupe.
Raffinement
Toutes les procédures le nécessitant seront réalisées sous anesthésie. Par procédure le nécessitant, est définie toute procédure générant une douleur ou une souffrance supérieure à une piqure transcutanée par une aiguille. Dans la mesure du possible, en fonction des contraintes des procédures, les animaux bénéficient d’un environnement enrichi (l’environnement est enrichi par des tunnels en carton et/ou des abris en plastique, et des boules de ouate) et leur souffrance est prise en compte et atténuée au maximum. Des points limites ont été définis et les animaux font l'objet d'une surveillance.
Choix des espèces
Le modèle d'inactivation génique de la claudine 19 a été développé chez la souris. Les animaux sont utilisés à partir de l'âge de 8-9 semaines. Les animaux ont alors terminé leur phase de croissance rapide et sont considérés comme matures. Leur taille permet la réalisation des manoeuvres expérimentales.
Relation between feed efficiency and robustness in rainbow trout
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1200 truites arc-en-ciel vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis gardées vivantes pour entretenir des lignées de l'élevage. Elles subissent un jeûne de trois semaines et des mesures de poids sous anesthésie, 30 d'entre elles faisant l'objet de prises de sang répétées par ponction de la veine caudale. Le projet vise à estimer l'efficacité alimentaire pour réduire les coûts et l'impact environnemental de l'aquaculture. Le porteur affirme qu'il n'existe pas d'alternative in vitro et qu'il est "nécessaire" de mesurer cette efficacité dans des conditions proches de l'élevage commercial.
Objectifs
Dans un contexte de développement durable de l’aquaculture, il existe aujourd’hui une volonté grandissante de sélectionner les poissons ayant la meilleure EA possible. L’EA peut être vue comme la capacité à produire plus à partir d’une même quantité d’aliment ingérée. En effet, d’une part, l’alimentation représente de 30 à 70% des coûts de production, et, d’autre part, l’utilisation de granulés entrainent de lourds impacts environnementaux à différents niveaux : de la production des ingrédients qui les composent aux rejets dissous des effluents d’élevage. Améliorer l’EA requiert de pouvoir quantifier précisément l’ingestion individuelle ce qui reste, encore aujourd’hui, difficile à entreprendre chez les poissons élevés en larges groupes. C’est pourquoi, des critères indirects pour l'estimation de l’EA ont été évalués ces dernières années chez les poissons. Chez la truite arc en ciel, il a été démontré que la perte de poids au jeûne combinée aux performances de croissance observée après le jeûne peut expliquer jusqu’à 60% de la variabilité de l’ingéré individuel un critère d’estimation de l’EA. Les poissons perdant le moins de poids durant le jeûne sont supposés être ceux avec une meilleure EA car ayant de moindres besoins d’entretien. Bien que potentiellement intéressante, une sélection sur un tel critère pose alors la question de la capacité des poissons à maintenir de bonnes performances pour d’autres caractères associés à la robustesse (santé, reproduction).
Bénéfices attendus
Ce projet se basera sur l’utilisation d’un modèle biologique tout à fait pertinent, deux lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle : lignée grasse (LG) et lignée maigre (LM). Ces deux lignées expérimentales divergentes constituent un modèle biologique de choix dans ce projet, en effet elles ont montré une utilisation différente de l’énergie. Nous faisons l’hypothèse qu’elles réagissent différemment à l’effet du jeûne avec des réponses différentes en terme d’EA. Sur le plan scientifique, le projet REFER-Trout, permettra de tester l’intérêt de la perte de poids au jeûne comme paramètre indirect d’estimer de l’EA, difficile à mesurer chez la truite arc-en-ciel en conditions de production, tandis que les analyses de sang permettront de tester les relations entre EA et d’autres fonctions biologiques et notamment l’immunité. Ces connaissances seront utiles pour mieux appréhender l’allocation des ressources chez le poisson et affiner la notion de robustesse.
Procédures
Les animaux seront soumis à des mesures non-invasives de poids et d'adiposité (3 fois sur l'ensemble de l'expérience) qui concerne l'ensemble des individus (n = 1200) et nécessitent l'anesthésie et l'émersion des animaux. Des prises de sang, par ponction de la veine caudale, répétées sur un nombre limité d’individus (n = 30) seront réalisées également lors des périodes de mesures décrites précédemment (3 fois sur l'ensemble de l'expérience). L'ensemble des mesures biométriques et d'échantillonnage de sang sera réalisée dans un temps limitant l'émersion à une durée maximale de 1 minute.
Impact sur les animaux
La procédure est classée en modérée en raison du jeûne prolongé de trois semaines combiné à des prises de sang répétées sur un nombre limité d’individus, qui si, mal réalisés peuvent conduire à générer de la douleur et du stress et une sensibilité accrue aux pathogènes. Les prises de sang sont effectuées sur 30 poissons afin de réduire au maximum le nombre d’individus concernés tout en permettant des résultats exploitables. Les prises de sang auront lieu uniquement lors des phénotypages, ce faisant, les poissons concernés n’auront pas à subir des anesthésies et manipulations supplémentaires.
Devenir
A la fin de la procédure, l’ensemble des individus (1200 poissons) seront gardés en vie pour compléter les effectifs destinés à l’entretien des lignées grasse et maigre au sein de l'établissement utilisateur (UE PEIMA, INRAE).
Remplacement
Ce projet ne peut être réalisé qu’in vivo. Il n’y a pas d’alternative in vitro pour caractériser l’EA des truites arc en ciel et, plus largement, des animaux d’élevage. De plus, l’objectif étant, in fine, de promouvoir une aquaculture durable par la réduction des intrants alimentaires, il est nécessaire de mesurer l’EAs des poissons dans des conditions proches de l’élevage commercial.
Réduction
Nous avons recours à un matériel biologique original, les lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipide du muscle. Les individus utilisés pour l’expérimentation envisagée seront issus de l’entretien annuel de ces lignées. Nous avons réduit le nombre d'animaux au minimum nécessaire pour avoir une puissance statistique suffisante. Le nombre d'animaux impliqués correspond au strict minimum requis pour déterminer avec le plus de précision possible la loi de distribution des caractères ciblés et ainsi d'être mieux en mesure de différencier statistiquement les caractéristiques de chaque lignée. Ces chiffres permettent de s'assurer de la robustesse de nos analyses statistiques et nous semblent être un minimum pour mettre en œuvre une analyse de variance fiable.
Raffinement
Avant et pendant les procédures, une surveillance du comportement des animaux est effectuée pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l’angoisse subies. Tout au long de l’expérimentation et tout particulièrement durant la phase de jeûne prolongée, les poissons seront observés au moins 2 fois par jour et les poissons au comportement anormal (léthargie, perte d’équilibre) seront péchés et mis à mort. Par ailleurs, aucune manipulation ne sera réalisée durant la phase de jeûne, la plus critique de l’expérimentation, afin de minimiser autant que possible le stress généré.
Choix des espèces
La truite arc en ciel est l’espèce principalement étudiée au laboratoire. Il s’agit de l’espèce prépondérante de la pisciculture en France et l’une d’une des espèces les plus élevées en Europe. Elle est par ailleurs un modèle biologique largement diffusée dans la communauté scientifique (environ 50 000 références). De plus, les lignées expérimentales divergentes pour la teneur en lipides du muscle, LG et LM, permettent de réaliser le projet sur un matériel biologique original. Les truites arc-en-ciel sont utilisées au stade juvénile (animaux non matures). Ce stade est plus sensible aux stress que les poissons maturants.
Etude préliminaire de l’impact anti-tumoral de GPER et/ou de son agoniste spécifique sur les glioblastomes (EU porteur; EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
128 souris vont être utilisées, dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe sous la peau de cellules de glioblastome, puis des séances de chimiothérapie et de radiothérapie avec des anesthésies répétées. Le porteur teste une molécule censée bloquer la croissance tumorale en ciblant un récepteur aux œstrogènes, dans une preuve de concept avant un éventuel modèle dans le cerveau. Il affirme que le remplacement par des méthodes sans animaux n'est pas possible pour ce cancer lié au statut hormonal.
Objectifs
Les gliomes sont des tumeurs astrocytaires (cellules gliales du cerveau) qui constituent l'un des groupes les plus fréquents de tumeurs cérébrales chez l'adulte. La forme la plus sévère est le glioblastome (GBM, grade IV) dont la récidive est systématique et la survie médiane n'excède pas 15 mois. Ces tumeurs touchent préférentiellement les hommes et les femmes ménopausées, suggérant un rôle neuroprotecteur des hormones féminines (oestrogènes). Des études sur des modèles murins indiquent que les oestrogènes limitent l'agressivité de la tumeur et sont bénéfiques pour la survie des patients atteints de ce type de tumeur. Cependant, aucune donnée n'est aujourd'hui disponible sur le rôle des voies de réponses aux oestrogènes dans les cellules tumorales, notamment celles initiées par le récepteur GPER (récepteur membranaire des oestrgènes couplé à la protéine "G"). Ceci apparait donc comme un axe de recherche pertinent. Dans une étude préliminaire pluridisciplinaire, nous avons analysé les données moléculaires de patients atteints de GBM et identifié que ce récepteur GPER était jutement plus présent chez les femmes qui survivent longtemps avec une tumeur cérébrale que chez les hommes qui présentent un pronostic plus sombre. In vitro, nous avons pu montrer pour la première fois que l'activation de GPER par la molécule "G1" est capable de bloquer la multiplication des cellules tumorales. La combinaison du G1 avec le traitement de radio et chiomiothérapie standard conduit à un effet anticancéreux amplifié. A terme, le ciblage de GPER par le G1 pourrait constituer une stratégie thérapeutique innovante, ce que nous voulons démontrer via une étude préliminaire "in vivo".
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet initial constitueront une base pour proposer l'utilisation du G1 et/ou l'invalidation de GPER pour le traitement des GBM. Cette étape est indispensable pour soutenir la valorisation clinique de nos travaux. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature scientifique) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences de survie entre les hommes et les femmes atteints de GBM. En cas de résultats probants, cela permettrait de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant l'utilisation de médicaments ciblant des récepteurs des oestrogènes comme GPER, dans le cas du traitement de certaines tumeurs marquées par un échec thérapeutique (chimiosensibilisation).
Procédures
injection sous-cutanée de cellules tumorales (procédure 1) : 1 seule itération durée 5 min - administration des traitements (procédure 2 ) : schéma de traitement étalé sur 3 semaines pour l'administration des traitements - (chimiothérapie et radiothérapie) : 3 jours de traitement x 3 semaines = 9 itérations pour chaque groupe. La durée des traitements est de 3 min maximum (quelques secondes pour l'administration par voie intra-veineuse et quelques minutes pour la radiothérapie).
Impact sur les animaux
La nuisance associée à ces procédures est surtout à liée à la fréquence des anesthésies et des traitements (3 par semaine sur 3 semaines soit 9 au total).
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à l'issue des procédures 1, 2 et 3. Tous les animaux seront ensuite mis à mort à l'issue de la procédure 4.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte pas possible puisque le développement des glioblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence des hormones naturellement présentes chez les souris males ou femelles ...) En l'occurence, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Des études préliminaires ont déjà été réalisées in vitro mais aussi en biologie moléculaire et ont donné des résultats très encourageants. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.
Réduction
Dans le cadre de notre étude, 2 lignées tumorales sont utilisées: une exprimant normalement le récepteur aux oestrogènes GPER (wt) et l'autre non (GPER-KO) sur un modèle de greffe de cellules tumorales sous-cutanée. Cette étude préliminaire fait office de preuve de concept et permet de valider/invalider l'efficicacité des traitements testés sur un modèle de première ligne (injection de cellules tumorales en sous-cutanée) en utilisant un effectif d'animaux assez réduit (8 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus à partir de cette étude pilote, une étude avec un nombre plus grand d'animaux sera envisagée sur un modèle de greffe intra-cérébrale plus proche de la pathologie clinique.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique), puis à la suite de la xénogreffe (pesée 3 fois par semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale 3 fois par semaine). Une vigilance accrue sera également exercée pendant le temps d'admiministration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'évolution de la tumeur). Un suivi quotidien garantissant le bien-être des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau boisson et croquettes ad libitium, enrichissement sous forme de feuilles de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Lorsqu'un point limite sera atteint, l'animal sera mis en mort.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins, (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées athymiques sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris Nude (mâles ou femelles) seront âgées de 6-12 semaines au moment des greffes (22 à 30g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.
Etude préliminaire de l’impact anti-tumoral de GPER et/ou de son agoniste spécifique sur les glioblastomes (EU porteur; EU1/2)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en gravité modérée. Ces souris immunodéprimées reçoivent une greffe sous la peau de cellules de glioblastome, puis neuf séances de chimiothérapie et de radiothérapie sur trois semaines, avec des anesthésies répétées. Le porteur teste une molécule censée bloquer la multiplication des cellules tumorales, dans une étude qu'il qualifie de preuve de concept avant un éventuel modèle de greffe dans le cerveau. Il affirme que le remplacement par des méthodes sans animaux n'est pas possible pour ce cancer lié au statut hormonal.
Objectifs
Les gliomes constituent l'un des groupes de tumeurs cérébrales les plus fréquents chez l'adulte. La forme la plus sévère est le glioblastome (GBM) dont la survie médiane n'excède pas 15 mois. Ces tumeurs touchent préférentiellement les hommes et les femmes ménopausées, suggérant un rôle protecteur des hormones féminines (œstrogènes). Des études sur des modèles murins indiquent que les œstrogènes limitent l'agressivité de la tumeur et sont bénéfiques pour la survie des patients atteints de ce type de tumeur. Cependant, aucune donnée n'est aujourd'hui disponible sur les modalités de réponses des cellules tumorales aux œstrogènes. Ceci apparait donc comme un axe de recherche pertinent. Dans une étude préliminaire pluridisciplinaire, nous avons analysé les données moléculaires de patients atteints de GBM et identifié qu'un récepteur était justement plus présent chez les femmes qui survivent longtemps avec une tumeur cérébrale que chez les hommes qui présentent un pronostic plus sombre. In vitro, nous avons pu montrer pour la première fois que l'activation de ce récepteur parune molécule (G1) bloque la multiplication des cellules tumorales. La combinaison du G1 avec le traitement de radio et chiomiothérapie actuellement prescrit des GBM conduit à un effet anticancéreux amplifié. A terme, l'utilisation de cette molécule (G1) pourrait constituer une stratégie thérapeutique nouvelle, ce que nous voulons démontrer via une étude préliminaire "in vivo".
Bénéfices attendus
Les résultats attendus de ce projet initial constitueront une base pour proposer l'utilisation d'une molécule (G1) pour le traitement des GBM. Cette étape est indispensable pour soutenir la valorisation clinique de nos travaux. En effet, ce projet innovant (très peu décrit dans la littérature scientifique) permettrait à terme de mieux comprendre les processus responsables des différences de survie entre les hommes et les femmes atteints de GBM. En cas de résultats probants, cela permettrait de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques pour la recherche clinique, notamment en employant l'utilisation de médicaments interagissant avec des récepteurs des œstrogènes dans le cas du traitement de certaines tumeurs résistantes au traitement standard.
Procédures
injection sous-cutanée de cellules tumorales (procédure 1) : 1 seule itération durée 5 min - administration des traitements (procédure 2 ) : schéma de traitement étalé sur 3 semaines pour l'administration des traitements -(chimiothérapie et radiothérapie) : 3 jours de traitement x 3 semaines = 9 itérations pour chaque groupe. La durée des traitements est de 3 min maximum (quelques secondes pour l'administration par voie intra-veineuse et quelques minutes pour la radiothérapie).
Impact sur les animaux
La nuisance associée à ces procédures est surtout à liée à la fréquence des anesthésies et des traitements (3 par semaine sur 3 semaines soit 9 au total).
Devenir
Tous les animaux seront gardés en vie à l'issue des procédures 1, 2 et 3. Tous les animaux seront ensuite mis à mort à l'issue de la procédure 4.
Remplacement
Le remplacement des expérimentations animales par des méthodes alternatives n'est dans ce contexte pas possible puisque le développement des glioblastomes dépend de phénomènes biologiques complexes (influence des hormones naturellement présentes chez les souris males ou femelles ...) En l'occurence, notre projet est directement associé à l'impact du statut hormonal engendré par le sexe des animaux. L'ensemble de ces facteurs complexes ne peut être appréhendé qu'in vivo sur un modèle animal. Des études préliminaires ont déjà été réalisées in vitro mais aussi en biologie moléculaire et ont donné des résultats très encourageants. Il est donc primordial de conforter ces résultats sur un modèle "in vivo" de façon à se rapprocher le plus possible de la réalité clinique.
Réduction
Dans le cadre de notre étude, 2 lignées tumorales sont utilisées: une exprimant normalement le récepteur aux oestrogènes GPER (wt) et l'autre non (GPER-KO) sur un modèle de greffe de cellules tumorales sous-cutanée. Cette étude préliminaire fait office de preuve de concept et permet de valider/invalider l'efficicacité des traitements testés sur un modèle de première ligne (injection de cellules tumorales en sous-cutanée) en utilisant un effectif d'animaux assez réduit (8 animaux par groupe). En fonction des résultats obtenus à partir de cette étude pilote, une étude avec un nombre plus grand d'animaux sera envisagée sur un modèle de greffe intra-cérébrale plus proche de la pathologie clinique.
Raffinement
Une attention toute particulière sera portée aux animaux, d'une part lors de l'implantation de la tumeur (réalisée sous anesthésie chimique), puis à la suite de la xénogreffe (pesée 3 fois par semaine, observation quotidienne du comportement, vérification de l'alimentation et de l'hydratation, suivi de la croissance tumorale 3 fois par semaine). Une vigilance accrue sera également exercée pendant le temps d'admiministration des traitements (pesée quotidienne, vérification du comportement et de l'évolution de la tumeur). Un suivi quotidien garantissant le bien-être des animaux sera mené (température d'hébergement optimale, eau boisson et croquettes ad libitium, enrichissement sous forme de feuilles de sopalin et de bâtonnets en bois à ronger). Lorsqu'un point limite sera atteint, l'animal sera mis en mort.
Choix des espèces
Dans les études menées en oncologie, les modèles animaux utilisés sont majoritairement les modèles murins, (souris et rats). Les souris constituent l'espèce de référence compte tenu de leur accessibilité et de leur facilité de manipulation. Les souris immunodéprimées athymiques sont classiquement utilisées dans le cas de greffes de cellules tumorales humaines, car du fait de leur immunodéficience, il n'y a pas de réaction de rejet du greffon tumoral implanté. Les souris Nude (mâles ou femelles) seront âgées de 6-12 semaines au moment des greffes (22 à 30g), les animaux jeunes étant plus adaptés au développement de tumeurs cérébrales. L'intérêt lié au choix de cette tranche d'âge est également lié au fait que les animaux ont atteint leur maturité sexuelle et que leur système hormonal est fonctionnel.
La lactation comme période de reprogrammation du système métabolique et endocrine de la descendance exposée in utero à une hyperglycémie maternelle.
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
1 748 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les mères subissent une manipulation nutritionnelle, des traites manuelles de lait et des tests de tolérance au glucose, tandis que leur descendance est soumise à des tests comportementaux, des prélèvements sanguins et une chirurgie avec pose d'un cathéter à la jugulaire pouvant durer trois heures. Le porteur indique que les petits sont tués à différents stades, de huit à deux cent soixante jours, pour prélever leurs organes. Il affirme qu'aucune méthode alternative ne rend compte de la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance.
Objectifs
Le diabète gestationnel (DG), (8% des naissances en France), serait à l’origine du diabète de type 2 (DT2) chez 47% des patients âgés de 10-22 ans. Cette intolérance au glucose, transmise de génération en génération, contribuerait à l’explosion épidémique de la prévalence du DT2 dans le monde. Quelques études récentes montrent que, chez des enfants de 7 ans, exposés à une hyperglycémie maternelle in utero, la durée d’allaitement exclusif est inversement corrélée aux teneurs circulantes en hémoglobine glyquée (marqueur du DT2). Cependant, ces données épidémiologiques, parfois contradictoires, ne prouvent pas que la composition du lait maternel impacte le risque métabolique de la descendance. Nous émettons l’hypothèse que la lactation pourrait avoir un impact sur le devenir métabolique de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie maternelle qui pourrait s’expliquer en partie par des adaptations du métabolisme maternel et de la composition du lait. Nous avons préalablement montré dans des modèles rongeurs de programmation métabolique avec adoptions croisées, que la descendance mâle présentait des changements différents dans leur sensibilité à l’insuline à l’âge adulte selon que la descendance avait été allaitée par des rates maintenues en sous- ou sur-nutrition calorique durant la période périnatale. Ces changements étaient associés à des compositions spécifiques des laits maternels. Ce projet vise donc à caractériser : 1) la composition du lait maternel dans un modèle rongeur d’hyperglycémie maternelle durant la gestation suite à une manipulation nutritionnelle (mimant le DG chez la femme avec un retour post-partum à la glycémie pré-gravide), en lien avec les adaptations métaboliques des 3 organes clés du contrôle hormonal de la lactation que sont le placenta, le pancréas et la glande mammaire, 2) le devenir métabolique (insulino-sensibilité) de la descendance mâle et femelle jeune et adulte en réponse à des compositions de lait de mères DG ou normo-glycémiques (adoptions croisées) ou encore à des supplémentations postnatales en composés bioactifs du lait maternel identifiés dans le lait humain DG. La contribution du DG dans la prévalence des pathologies cardio-vasculaires à l’âge adulte, et neurodéveloppementales pendant l’enfance sera également explorée dans ce projet.
Bénéfices attendus
L’enjeu global de ce projet est d’évaluer l’impact de l’allaitement maternel sur le devenir métabolique de l’enfant soumis in utero à un DG. Le modèle expérimental nutritionnel de DG avec adoptions croisées va permettre d’étudier le rôle de la composition du lait maternel dans la programmation endocrino-métabolique de la descendance. L’objectif in fine est de tester la capacité de composants bioactifs du lait humain à (re)programmer la sensibilité à l’insuline de la descendance soumise in utero à une hyperglycémie. Cette étude permettrait de prendre en compte ces biomarqueurs dans l’élaboration des formulations infantiles et des recommandations nutritionnelles destinées aux femmes enceintes et allaitantes, dans un contexte de diabète.
Procédures
Les rates seront soumises à une manipulation nutritionnelle durant la gestation et la lactation, à 4 prélèvements manuels de lait (30 minutes) et/ou 4 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes) selon les lots de rates (procédures expérimentales 1 ou 2). Leur descendance sera soumise à 4 tests de comportement (3 tests avec séquence de 10-15 minutes et 1 test avec une séquence de 1 heure), des prélèvements sanguins, une mesure de masse grasse par ostéodensitométrie (1 heure), 2 tests de tolérance orale au glucose (120 minutes), une intervention chirurgicale (un clamp euglycémique/hyperinsulinémique avec pose d’un cathéter à la jugulaire et des prélèvements de sang à la veine caudale, durée 180 minutes) sur 260 jours de vie.
Impact sur les animaux
Les prélèvements de sang répétés à la queue peuvent occasionner une douleur de classe légère due l'apparition d'une croûte. La cicatrisation qui fait suite à la pose d'un cathéter dans la veine jugulaire peut être gênante pour l'animal. La traite régulière de lait chez les mères peut engendrer une irritation des mamelles. Le gavage oral peut induire très exceptionnellement une fausse route.
Devenir
Les animaux sont gardés en vie d'une procédure à l'autre ou sont mis à mort à différents stades de développement (de J8 à J260) afin de prélèver les organes d'intérêt.
Remplacement
Tous les animaux utilisés pour ce projet proviennent d’élevages reconnus et sont nés en captivité. Il n’existe pas encore de méthode alternative (modélisations, modèles in vitro) permettant de rendre compte de la complexité des mécanismes physiologiques dans la mise en place du diabète de type 2 chez la descendance en lien avec un diabète gestationnel (DG) et ceci, d’autant plus, que ce projet requiert un modèle d’étude de supplémentation nutritionnelle postnatale avec adoptions croisées pour mieux comprendre l’impact de la fenêtre de lactation sur cette programmation.
Réduction
Pour répondre au principe de réduction sans compromettre l’obtention de résultats statistiquement significatifs, nous utiliserons autant que possible le même animal (suivi longitudinal de la glycémie et l’insulinémie). L’effectif retenu de n=8 mâles et 8 femelles par groupe d’adoption représente un minimum nécessaire pour évaluer statistiquement une intervention nutritionnelle, prenant en compte le facteur sexe, avec une variabilité interindividuelle importante. Ce projet prévoit donc l’utilisation au maximum de 1332 individus sur une durée de 5 ans avec 372 rates Sprague-Dawley gestantes et allaitantes, 960 petits, mâles et femelles. Selon les résultats obtenus dans la première procédure expérimentale, le nombre de mères gestantes pourra être réduit dans la suivante. De même, si une différence d'effets selon le sexe est observée dans le suivi des descendants, la supplémenation postnatale ne sera mise en œuvre que sur la moitié des effectifs de ratons prévus.
Raffinement
Dans un souci de raffinement les animaux seront hébergés au moins 2 par cage pour le suivi de la descendance DG (sauf pour les périodes de gestation et de lactation des mères, où les mères seront seules avec leur portée après la mise-bas jusqu’au sevrage). Leur milieu de vie sera enrichi avec un tunnel et des frisottis leur permettant de faire leur nid, et de jouer. Aucune souffrance n’est attendue lors des manipulations nutritionnelles prévues : les rates en régime hypercalorique 1 semaine avant la conception et jusqu’à la fin de la gestation (4 semaines) ou jusqu’à la fin de la lactation (7 semaines) ne présentent pas d’obésité. Les animaux seront suivis par un personnel compétent dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et manipulés quotidiennement (jeux, manipulations, caresses…) afin de réduire au maximum douleur et détresse et leur assurer un bien-être, en particulier après les chirurgies pour s’assurer de leur parfaite récupération. Les prélèvements de sang seront réalisés avec l’usage d’analgésiques afin de contrôler la douleur et dans des conditions d’asepsie nécessaires pour assurer des résultats reproductibles. Lors des prélèvements de lait, les rates seront anesthésiées et disposées sur un tapis chauffant. Pour les animaux, l’évaluation de la douleur sera faite à l’aide d’observations physiologiques (poids), comportementales (consommation de nourriture, fuite ou défense de l’animal à la manipulation, activité) et en fonction de l’apparence de l’animal (poil, posture). Lors des interventions chirurgicales, les animaux seront anesthésiés après avoir reçu un antalgique qui agira pendant et après l’opération. Jusqu’au réveil et au-delà, les animaux seront surveillés et une grille comportementale pour chaque animal sera complétée avec des points limites à partir desquels les animaux seront pris en charges pour supprimer leur souffrance avec des injections d’antalgiques ou seront mis à mort si cette souffrance est trop importante.
Choix des espèces
Le rat est un excellent modèle d’étude de la nutrition périnatale en raison de sa petite taille (permettant d'augmenter les effectifs et donc de diminuer la variance des mesures), et de sa rapidité de croissance et de reproduction, permettant de réaliser des protocoles expérimentaux en beaucoup moins de temps. Contrairement à l’espèce souris, l’espèce rat (en particulier la souche Sprague Dawley choisie) présente des grandes qualités maternelles, permettant de mener à bien cette stratégie expérimentale avec des adoptions croisées en limitant notamment les risques de cannibalisme et d’abandon lors des adoptions, et limite sa prise de poids sous régime calorique, permettant de s’affranchir du paramètre obésité dans cette étude. Enfin, le volume de lait collecté par rate fournira un matériel suffisant pour réaliser nos analyses individuelles de phénotypage du lait maternel de rate contrairement à la souris. Des femelles gestantes âgés de 8 semaines et de souche Sprague Dawley seront commandées. Ces femelles auront été soumises à un régime chow (CTL) ou HFHS, 1 semaine avant l’accouplement, chez le fournisseur d’animaux à qui nous aurons fourni l’aliment. A leur arrivée, les femelles seront en cage individuelle pendant la gestation et la lactation. Les rates utilisées pour les prélèvements de lait seront mises à mort en fin de procédure expérimentale N°1. Dans la procédure expérimentale N°2, 96 portées de 8 ratons (4 mâles et 4 femelles par mère adoptive, issus de mères biologiques différentes) seront constituées afin d’avoir au final 16 ratons (8 mâles et 8 femelles) par groupe d’adoption et par âge (6 temps). Ces groupes seront suivies durant la lactation (J8, J14), au sevrage à J21), au stade jeune (2 mois) et à long terme (âge adulte, 4 mois, sous régime standard et sous challenge hyper-énergétique durant 20 semaines).
Mise au point et caractérisation de greffes de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour la mise en place de nouveaux modèles d’études précliniques
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie de trente minutes sous anesthésie pour l'injection de cellules tumorales dans l'hypophyse, puis des prélèvements sanguins hebdomadaires et un prélèvement terminal. Le porteur indique que les tumeurs peuvent, comme chez l'humain, provoquer une compression intracrânienne, des maux de tête et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision, mais estime que le suivi hormonal évitera ces stades avancés. Il affirme ne pas pouvoir remplacer le modèle murin par des approches in vitro et présente cette greffe intra-hypophysaire comme plus représentative que la greffe sous-cutanée.
Objectifs
Les tumeurs hypophysaires humaines ont une incidence élevée (1 personne/1500). Ces tumeurs bien que bénignes provoquent des maux de tête, des troubles visuels et peuvent être invasives dans certains cas. Elles répondent mal aux traitements thérapeutiques, il est donc indispensable de trouver de nouvelles molécules pouvant limiter leur développement. Malgré leur fréquence importante chez l’homme, il existe peu d’outils d’étude pour caractériser le comportement de ces tumeurs, identifier de nouvelles cibles thérapeutiques et tester de nouveaux traitements cliniques. Leur étude est donc tributaire de modèles précliniques qui soient représentatifs des tumeurs hypophysaires humaines. Bien que le nombre de lignées tumorales soit limité et la mise en culture de cellules dérivées de tumeur soit délicate, la greffe de ces différents modèles sous la peau des souris constitue actuellement la seule possibilité de modèle préclinique pour mettre au point et valider de nouveaux traitements thérapeutiques. Les greffes sous-cutanées sont toutefois peu représentatives du contexte intracrânien dans lequel se développent et évoluent ces lésions tumorales chez l’Homme. Notre projet vise donc à tester la faisabilité et à développer un modèle expérimental de greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse de souris pour disposer de modèles précliniques relevant qui permettront : i) d’étudier le comportement et la biologie de différentes lignées et cellules tumorales hypophysaires dans leur environnement naturel de développement et ii) de valider de nouveaux modèles précliniques pour évaluer l’effet de drogues thérapeutiques qui sont actuellement uniquement testées in vitro. La mise en place et la validation de ces nouveaux modèles de greffes intra-hypophysaires seront réalisées par le biais d’une micro-injection automatisée dans l’hypophyse de souris sur des animaux profondément endormis. Nous avons identifié les coordonnées d’injection dans l’hypophyse sur une cohortes d’animaux de réforme déjà morts. Notre projet visera à confirmer que ces coordonnées sont adaptées et ne varient pas si elles sont utilisées pour des injections sur animaux anesthésiés. Nous testerons ensuite l’efficacité de prise de greffe des 5 lignées tumorales hypophysaires de rongeurs disponible mais également de 20 suspensions cellulaires issues de tumeurs humaines issues de 2 sous types tumoraux. Les tumeurs seront collectées pour étude et mises en culture pour établir de nouveaux outils cellulaires
Bénéfices attendus
Notre projet vise à développer de nouveaux modèles précliniques pour l’étude biologique et le développement d’outils thérapeutiques dédiés aux atteintes tumorales de la glande hypophysaire. Il devrait permettre de mieux comprendre la complexité de ces tumeurs particulièrement fréquentes dans la population (1 cas / 1500) et mieux saisir l’impact de leur niche environnementale naturelle (i.e. l’hypophyse antérieure) sur leur comportement et leur évolution. Notre projet devrait également permettre d’engendrer de nouvelles lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche et ainsi limiter à long terme l’usage de modèles animaux.
Procédures
Lors de l’injection des cellules tumorales dans leur hypophyse, les animaux subiront une chirurgie de 30 minutes maximum sous anesthésie générale et sous analgésie. Cette acte n’aura lieu qu’une fois. Un prélèvement de sang sera ensuite réalisé sur ces animaux chaque semaine afin d’identifier toute augmentation d’hormone qui pourrait suggérer un développement tumoral. Une variation trop importante (supérieur à 35% ) des concentrations circulantes d’hormones mesurées avant la greffe conduirait alors à un arrêt immédiat de l’expérimentation. Un prélèvement terminal de sang sera réalisé à la fin de chaque procédure, il sera cependant réalisé sous anesthésie profonde avant leur mise à mort finale.
Impact sur les animaux
Un acte chirurgical sera réalisé sous anesthésie pour injecter les cellules dans l’hypophyse. La greffe de cellules tumorales dans l’hypophyse entrainera le développement de lésions tumorales intracrânienne. Ces lésions pourront comme chez l’homme entrainer une compression intracrânienne, conduisant à des maux de têtes et une pression sur les nerfs optiques altérant la vision. Grâce au suivi des hormones produites par ces tumeurs, les souris ne devraient toutefois jamais atteindre ces stades tumoraux avancés qui sont fréquemment retrouvés chez l’homme et sont déclencheurs d’une chirurgie. Après injection, un prélèvement sanguin de 50 à 100uL sera également réalisé chaque semaine par une ponction à la veine caudale sous contention chez les animaux greffés afin d’assurer le suivi de la progression tumorale par un dosage hormonal. L’utilisation d’un ciment biologique pour colmater le site d’injection ne devrait pas entrainer de gêne.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procedures experiemntales réalisées. Nous procéderons à un prélèvement sanguin final qui servira à réaliser des dosages d’hormones et de molécules secrétées par les lésions cancéreuses. Nous procéderons également à de nombreuses analyses sur les tumeurs collectées post-mortem, Des analyses histologiques et moléculaires complémentaires permettront d’exploiter au mieux nos résultats. Les tumeurs collectées derivé de patients seront également mise en culture pour générer de nouveaux outils cellulaires qui nous permettront de travailler in vitro et limiter ainsi nos besoins d’expérimentation sur l’animal.
Remplacement
Les modèles de greffes tumorales dans les tissus où se développent naturellement les tumeurs greffées représentent actuellement les modèles précliniques les plus convaincants, car ils permettent d’étudier le comportement des cellules tumorales (pousse tumorale, remodelage du microenvironnement, réponse à certains traitements, …) dans leur environnement cellulaire natif. En raison de la nature complexe de la recherche proposée, qui vise à évaluer la prise de greffe et l’impact de l’environnement hypophysaire sain sur la progression tumorale de cellules injectées, nous ne pouvons malheureusement pas remplacer l’utilisation de modèles murins par des outils cellulaires ou des approches in vitro.
Réduction
Afin de nous conformer à la règle de réduction, le nombre de souris nécessaire à nos travaux a été réduit au minimum sans compromettre le taux de succès de nos greffes et l’obtention d’un nombre suffisant de tumeurs dont nous pourrions étudier les caractéristiques moléculaires. Afin de limiter l’utilisation d’animaux, nous avons au préalable mis au point toute notre procédure d’injections sur des animaux morts de réforme. Dans le cadre des travaux proposés, 9 souris par sexe devraient nous permettre d’aboutir à l’obtention de 7 tumeurs dont les traits moléculaires pourront être étudiés et comparés entre eux. Nous ne réaliserons pas de répétition expérimentale ni de test statistique, notre procédure se limitant à la mise au point d’un nouveau modèle préclinique. La greffe de 400 souris au maximum sur 5 ans nous permettra de confirmer la faisabilité et la reproductibilité de nos modèles de greffes de lignées cellulaires et étudier la prise éventuelle de plusieurs greffes humaines parmi les injections des cellules issues des 20 tumeurs humaines qui seront utilisées.
Raffinement
Nous mettrons en place une surveillance adaptée et individuelle des animaux afin d’assurer que les animaux expérimentaux ne subissent aucune souffrance inutile. Ce suivi individuel permettra d’identifier l’apparition de signes évocateurs de mal-être ou de souffrance (prostration, comportement erratique, altération des constantes hormonales, …). L’identification de ces signes entrainerait alors une fin d’expérimentation immédiate et une mise à mort des animaux concernés. Le suivi individuel des animaux permettra également de mieux saisir : i) la reproductibilité des greffes réalisées et ii) d’évaluer le nombre d’animaux statistiquement nécessaires qui devront être étudiés en cas de test de molécules thérapeutiques à venir. Les analyses post-mortem que nous réaliserons sur le matériel biologique collecté nous permettrons de valider l’intérêt de ce modèle en comparaison des greffes sous-cutanées et de dériver d’éventuels nouveaux modèles cellulaires de lignées tumorales humaines qui font actuellement défaut dans le champ de recherche.
Choix des espèces
Le modèle de souris Rag2KO, possède un système immunitaire appauvri. Il s’agit d’un modèle indispensable pour greffer du tissu humain ou des lignées rongeurs de fonds génétiques mixtes afin qu'il n'y ait pas de rejet du greffon. Le modèle Rag2KO est de plus un modèle réceptif aux lignées choisies et aux tumeurs humaines hypophysaires que nous avons déjà pu greffer avec succès en sous-cutané. Nous y avons mis au point les coordonnées stéréotaxiques pour cibler l’hypophyse. Il est donc idéal pour les greffes dans l’hypophyse que nous souhaitons faire et il nous permettra également l’étude du microenvironnement et de l’interaction entre la tumeur et son environnement. Les protocoles d’injection seront réalisés sur des souris âgées de 12 à 16 semaines. Ce sont à ces âges que nous avons validé nos 70% d’efficacité d’injection avec les coordonnées définies.
Effets d’une exposition maternelle et/ou développementale à de faibles doses d’un pesticide contenant du manganèse, chez la souris C57bl6J mâle et femelle. Caractérisation des altérations métaboliques dans le foie et le tissu hématopoïétique.
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
342 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Exposées via leur mère au maneb, un pesticide contenant du manganèse, puis pour certaines à un régime gras et sucré, elles subissent perçage des oreilles, gavages d'huile, injections de glucose ou d'insuline et prélèvements de sang à la queue, avant un prélèvement terminal à l'œil. Le porteur affirme que ces actes ne développent pas d'anxiété chez l'animal. Il revendique l'étude sur l'"animal entier" et présente le projet comme apportant des preuves pour réduire l'usage des pesticides.
Objectifs
L’exposition des travailleurs agricoles aux fongicides utilisés pour lutter contre la présence des champignons parasites des fruits et légumes a des effets négatifs en santé humaine. Ainsi, des études préliminaires indirectes suggèrent que le foie et la moelle osseuse (site de production des cellules du sang) sont des tissus cibles en particulier des fongicides contenant du manganèse comme le maneb à des doses compatibles avec une exposition environnementale. Or, en fin de vie fœtale, le foie qui est initialement un organe hématopoïétique (site de fabrication des globules rouges) va acquérir les fonctions retrouvées à l’âge adulte comme des fonctions nutritionnelles (régulations du métabolisme des glucides, des lipides) et antitoxiques (polluants, médicaments). Ces fonctions sont essentielles à la vie. Elles permettent la régulation de la glycémie (taux de sucre dans le sang), la détoxification des polluants et médicaments et elles s’opposent au stockage de lipides appelé stéatose hépatique. Les objectifs sont de démontrer par des preuves directes sur l’animal entier (1) si le foie est une cible du maneb tout au long du développement depuis la vie fœtale jusqu’au stade adulte ; (2) si une exposition à doses faibles pendant la vie fœtale va modifier la fonction hématopoïétique du foie fœtal et l’acquisition des fonctions dites « adultes »; (3) si une exposition au maneb prédispose à la prise de poids et aggrave la stéatose hépatique lorsque les souris sont nourries avec un régime riche en graisses et en sucre à l’âge adulte pour mimer le régime appelé « Western-diet »; (4) Ces études seront réalisées sur des souris mâles et femelles afin de déterminer s’il existe des effets dépendants du sexe. Un total de 342 souris seront nécessaires pour ce projet. Chaque souris sera suivie individuellement afin de collecter un maximum de données biologiques et limiter la quantité totale de souris pour l’obtention de données statistiques fiables et interprétables.
Bénéfices attendus
Cette étude permettra d’identifier si l’obésité, les maladies hépatiques liées à l’obésité ou si certaines maladies du sang pourraient être la conséquence d’une exposition au maneb en particulier pendant la vie fœtale. En effet, les doses utilisées dans ce projet sont compatibles avec une exposition environnementale. La réalisation de ce projet pourra avoir de fortes implications en termes de recommandations notamment pour les femmes en âge de procréer et pour la sécurité des marchés alimentaires. Ce projet fournira des arguments et des preuves scientifiques aux autorités politiques pour soutenir la réduction de l'utilisation massive des pesticides contenant du manganèse comme le maneb, dans le monde, et notamment dans les mélanges extemporanés de pesticides appelés « bouillies » qui font l’objet d’une règlementation.
Procédures
Les interventions sont nutritionnelles (exposition au maneb par l’alimentation et exposition à un régime riche en graisses et en sucres, classiquement appelé Western diet). Les interventions incluent des prélèvements sur des animaux vigiles (éveillés) après une mise à jeun de courte durée (6 heures). Il s’agit de prélèvements de sang à la queue et du prélèvement terminal à l’œil (après dépôt d’un analgésique). Cela permet de suivre l’état métabolique de la souris comme le taux de sucre dans le sang ou d’insuline ou des lipides en réponse à une injection soit de glucose (sucre), d’insuline ou un gavage d’huile alimentaire ait été réalisé. La durée totale des tests est de moins de 90 minutes (5 prélèvements pour dosage de la glycémie ou du taux d’insuline) et de moins de 4 heures (4 prélèvements pour dosage des lipides). Chaque prélèvement en lui-même dure quelques secondes.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables sont de classe légère (procédure 3) ou modérée (procédures 1 et 2). La présence de maneb dans le régime alimentaire est très faible et ne devrait pas perturber la prise alimentaire. La quantité de nourriture contaminée proposée aux souris correspond à la dose sans effet toxique. De même, le régime riche en graisses et en sucres est bien accepté des souris. La souris étant un animal nocturne, la mise à jeun (limitée à 6 heures entre 7h30 et 1 3h30) n’a pas de conséquence sur l'état général, les biberons d’eau n’étant pas enlevés. Les autres nuisances incluent le perçage des oreilles, les gavages d’huile, les injections de glucose ou d’insuline et l'incision très fine au niveau de la queue à l’aide d’un scalpel, ou le prélèvement rétro-orbital après dépôt d’un analgésique. Enfin, les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort. Ces actes sont pratiqués par du personnel compétent et ne développent pas d’anxiété chez l’animal.
Devenir
Tous mis à mort en raison des prélèvements d’organes réalisés sur tous les animaux expérimentés
Remplacement
La réalisation de ce projet vise à étudier les conséquences d’une exposition maternelle au fongicide maneb sur le développement des souris jusqu’à l’âge adulte. Ce projet vise aussi à étudier l’effet aggravant d’une exposition maternelle au maneb sur le développement des maladies liées à l’obésité. Enfin, ce projet vise à étudier la transition fonctionnelle du foie dans le fœtus exposé via la mère au maneb en comparaison de fœtus issus de mères non exposées. En conséquence, ce projet implique trop de mécanismes susceptibles d’interagir en même temps, les conséquences sont très nombreuses et ne peuvent donc pas être étudiées autrement que sur l’animal entier. Enfin, la dépendance avec le sexe est un paramètre également difficilement analysable autrement que sur l’animal entier.
Réduction
Le projet est original au sens où il n’a encore jamais été mené. Le nombre de souris est calculé au plus juste pour obtenir des résultats exploitables et tirer des conclusions qui puissent faire poids auprès des évaluateurs du risque pour diminuer l’utilisation des pesticides en France et en dehors de la France. Au total sur les 5 années, le nombre d’animaux sera de 342 animaux
Raffinement
Pendant toute la durée des études, les souris sont surveillées individuellement 3 fois par semaine pour les souris adultes et au moins 5 fois lissés sur la semaine entière au moment de la gestation, la mise-bas et l’allaitement. Du coton est déposé dans la cage pour que la femelle puisse faire son nid et maintenir au chaud sa portée. Les études sont réalisées dans une pièce au calme. Une surveillance accrue sera réalisée chez les mères allaitantes n’ayant pas développé un comportement maternel. Dans ce cas, les petits de la cage seront déplacés dans des cages d’adoption après les avoir mouillés avec de l’urine des petits de la cage naturelle pour qu’ils soient acceptés par la mère d’adoption. Le test métabolique de sensibilité à l’insuline consiste à vérifier que le taux de sucre dans le sang diminue bien après une injection d'insuline; sinon , on parle de résistance à l'insuline. Lors de la réalisation de ce test, il peut arriver qu’une souris soit en hypoglycémie (baisse trop importante du taux de sucre dans le sang). Dans ces conditions, une injection de glucose est immédiatement réalisée et la souris est installée dans du coton supplémentaire pour éviter l’hypothermie (froid). Un analgésique (anti-douleur) est utilisé pour permettre le prélèvement sanguin à l’œil sans souffrance et les animaux sont anesthésiés avant la mise à mort.
Choix des espèces
La souris a de nombreuses caractéristiques « proches » de celles de l’homme. Le projet vise à étudier les effets nocifs liés à l’exposition au maneb dans un modèle souris, en particulier lorsque l’exposition a lieu pendant la période maternelle, une période de haute sensibilité aux polluants. Cela nécessite d’étudier à la fois les fœtus en réponse précoce à l’exposition et les individus une fois devenus adultes, à la fois les mâles et les femelles. Les souris utilisées répondent très bien aux régimes dits obésogènes qui sont riches en graisses et en sucres au sens où les souris vont prendre du poids en les consommant et présenter un certain nombre de désordres métaboliques retrouvés chez l’homme et liés à l’obésité comme le stockage de lipides dans le foie (stéatose hépatique). Or, obésité et stéatose touchent aujourd’hui 20% de la population en France (plus de 35% aux US) ; ce qui en fait aujourd’hui des problèmes majeurs de Santé Publique.
Effet d’un régime cétogène sur le métabolisme cérébral chez le rat EU1/2 (porteur)
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
100 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Chaque semaine, un prélèvement d'urine les isole une nuit de 14 à 16 heures dans une cage sans litière ni enrichissement, situation que le porteur décrit lui-même comme probablement aversive. Après six semaines de régime cétogène, ils sont anesthésiés pour un prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour un enregistrement intracérébral de 4 à 6 heures, sans réveil. Le porteur affirme qu'il est "nécessaire" de recourir à l'animal vivant, le remplacement in vitro étant selon lui impossible actuellement.
Objectifs
Le métabolisme cérébral s’adapte à la nutrition, ce qui peut avoir des conséquences considérables sur la santé mentale et les maladies neurologiques. Par exemple, les effets bénéfiques du jeûne ont été reconnus dès l’antiquité, notamment sur l’épilepsie. Le jeûne peut être remplacé par des régimes moins contraignants comme le régime cétogène, riche en graisses et appauvri en protéines et en sucres. Ce régime est caractérisé par un apport calorique diminué et une augmentation plasmatique de corps cétoniques, un état interne appelé cétose. Les effets bénéfiques de la cétose s’étendent au-delà de l’épilepsie, à un large ensemble de problématiques comme un meilleur vieillissement, une augmentation de l’espérance de vie et une protection contre les maladies neuro-dégénératives comme les maladies de Parkinson ou d’Alzheimer. Ce projet testera l’hypothèse selon laquelle l’administration de corps cétonique chez des patients ou chez des animaux pourrait constituer une stratégie neuroprotectrice, notamment après un accident vasculaire cérébral ou un traumatisme crânien. Plusieurs mécanismes ont été proposés pour expliquer l’effet neuroprotecteur du régime cétogène. D’abord, une modulation de la fonction mitochondriale combinée à une augmentation d’enzymes antioxydantes qui pourraient diminuer le stress oxydant des neurones et des cellules gliales. Ensuite un changement de l’équilibre entre neurotransmetteurs excitateurs et inhibiteurs en faveur de l’inhibition pourrait expliquer une diminution de l’excitabilité des réseaux neuronaux et une amélioration de la fréquence et de la sévérité des crises d’épilepsie.
Bénéfices attendus
L’ensemble de ce projet permettra de mieux comprendre les effets métaboliques du régime cétogène à la fois sous l’angle des concentrations basales de métabolites, et de façon dynamique, au cours d’une épreuve métabolique modélisée par une dépolarisation corticale envahissante. Cette approche permettra de comprendre dans quelle mesure le régime cétogène affecte le fonctionnement basal du cerveau ainsi que sa capacité à répondre à une stimulation. Elle permettra aussi de tester pour la première fois in vivo l’hypothèse selon laquelle le régime cétogène diminue la disponibilité des neurotransmetteurs excitateurs comme le glutamate et le stress oxydant, représenté ici par le monoxyde d’azote. L’ensemble des connaissances obtenues au cours de ce projet permettra de d’évaluer si le régime cétogène ou la cétose en général peut représenter un état neuroprotecteur et dans quelle mesure induire cet état chez des patients cérébrolésés peut améliorer leur évolution clinique.
Procédures
Les animaux seront soumis à des prélèvements d'urine une fois par semaine pendant sept semaines. Ce prélèvement dure une nuit au cours de laquelle l'animal est isolé sans enrichissement. A la fin des six semaines de régime alimentaire contrôlé, les animaux seront anesthésiés pour prélèvement de liquide céphalorachidien et d'organes ou pour une expérience de monitorage intracérébral durant entre 4h et 6h.
Impact sur les animaux
Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à six semaines de régime cétogène. Ce régime permet d’induire un état de cétose sans restreindre l’accès à la nourriture et ses effets indésirables sont limités. Toutes les semaines, un prélèvement d’urine sera réalisé. Pour cela, les animaux seront placés seuls dans une cage à métabolisme. Ce dispositif ne comporte pas de litière ni d’enrichissement et permet de récupérer l’urine par un système de gouttière. Le recueil d’urine se fera au cours de la nuit, ce qui représente une période d’isolement de 14-16h qui sera probablement perçue par l’animal comme une situation aversive. A la fin des six semaines de régime cétogène, les animaux seront anesthésiés par inhalation d’isoflurane après administration de buprénorphine pour l’analgésie dans le but de prélever le liquide céphalorachidien ou pour effectuer une expérience de monitorage intracérébral pendant 4h à 6h. Les animaux n’étant pas réveillés, les effets indésirables des expériences sont minimes.
Devenir
La survie de l'animal n'est pas compatible avec le prélèvement d'organes ou avec les enregistrements intracérébraux sous anesthésie prévus dans le projet.
Remplacement
Le régime cétogène induit des adaptations lentes du métabolisme au cours des six semaines suivant le changement de régime alimentaire. Ces adaptations impliquent l’ensemble de l’organisme : intestins, foies, pancreas, circulation sanguine, reins, cerveau. Il est donc nécessaire d’avoir recours à l’animal vivant pour étudier ce phénomène. Le remplacement par des approches in vitro n’est pas possible actuellement.
Réduction
Le nombre d’animaux est réduit au minimum pour permettre des analyses statistiques fiables. Au cours de ce projet, les analyses statistiques consisteront à comparer les données obtenues dans le groupe d’animaux soumis au régime cétogène à celles obtenues chez des animaux nourris normalement. Des tests de t de Student seront appliqués après une analyse de normalité par le test de shapiro-Wilk. Dans le cas d’échantillons de données non normales, des tests de Mann-Whitney seront pratiqués. Les effectifs sont calculés sur la base de 8 animaux par groupe. Pour les expériences de monitoring intracérébral, des analyses statistiques seront pratiqués dès que six animaux auront été enregistrés. S’ils sont significatifs ou si des calculs de taille d’échantillon par des test beta révèlent qu’aucune différence claire n’apparaît, les expériences seront interrompues sans utiliser l’effectif annoncé au départ, ce qui peut réduire l’effectif.
Raffinement
Tout au long de ce projet, les animaux seront hébergés par paires dans des cages enrichies avec des matériaux de nidification et des baguettes de bois à ronger, afin d’améliorer leur bien-être général. La période d’isolement nécessaire aux prélèvements d’urine est restreinte à une nuit par semaine pendant six semaines et une nuit d’habituation, ce qui minimisera l’inconfort lié à la procédure. De plus, les animaux auront été entrainés à rester dans les cages à métabolisme une fois avant le début du régime cétogène. Toute la phase de prélèvement et d’enregistrements intracérébraux est prévue sous anesthésie après analgésie par la buprénorphine, ce qui réduit le stress ou la douleur à un niveau minimal. Tout au long du projet, l'état général de l'animal sera évalué grâce à une grille de score et des interactions régulières avec la cellule bien-être et la vétérinaire référente permettront éventuellement d’intégrer des mesures supplémentaires permettant d’améliorer le confort des animaux, par exemple l'administration d'analgésique (carprofène, ou Rimadyl 5 mg/kg) en cas de douleur avérée, ou adminsitration de nourriture ramollie en cas de perte de poids.
Choix des espèces
La plupart des études sur les effets du régime cétogène ont été effectuées chez le rongeur, qui représente le modèle animal de prédilection dans ce domaine. Par rapport à la souris, le rat présente une taille plus importante et un volume cérébral plus grand. Les volumes de liquide céphalorachidien et d'urine seront plus facilement récoltés chez le rat que chez la souris.
Étude du thalamus paraventriculaire dans les processus d’homéostasie énergétique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
930 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies avec pose de fibres optiques et de cathéter gastrique, puis des tests de comportement, de métabolisme du glucose et de calorimétrie, pour étudier le rôle d'une structure du cerveau dans la régulation de l'appétit. Le porteur indique que le port des fibres et du cathéter induit un stress initial et une mobilité réduite, et qu'une fuite gastrique entraîne la mise à mort immédiate. Il affirme que l'étude, fondée sur la physiologie intégrée, ne peut être menée in vitro ni sur des invertébrés.
Objectifs
La régulation de l’homéostasie énergétique est un processus physiologique capitale et extrêmement conservé. Le contrôle de cette régulation repose sur la capacité du cerveau à intégrer de multiples signaux indiquant les états nutritionnels/énergétiques de l'organisme, et à mettre en place des réponses appropriées. Les dysfonctionnements de ce contrôle peuvent conduire à une pléthore de troubles alimentaires (surpoids, obésité). Même si l'hypothalamus a été désigné comme le régulateur principal de l'équilibre énergétique, d'autres circuits ont été récemment identifiés. Parmi les structures extra-hypothalamiques, le noyau paraventriculaire du thalamus (PVT) apparaît comme un centre critique car il joue un rôle essentiel dans le relais bidirectionnel des informations du tronc cérébral vers des structures telles que l'amygdale, le striatum ventral, le cortex préfrontal et l'hypothalamus. Le PVT est principalement composé de neurones glutamatergiques. Un nombre croissant d’évidences indique un rôle clé des neurones PVT dans le contrôle des comportements liés à la nourriture. Cependant, ces études se sont principalement concentrées sur l'alimentation sans tenir compte des composantes énergétiques et métaboliques de ce comportement complexe ni de l'hétérogénéité des types cellulaires des neurones PVT. Il est intéressant de noter qu'une sous-population neuronale du PVT exprime les récepteurs D2 de la dopamine, fournissant un outil pour discriminer les sous-types cellulaires du PVT. On ignore encore si et comment les neurones exprimant les D2R peuvent moduler les adaptations homéostatiques, l'équilibre énergétique et les comportements liés à la prise alimentaire. Les objectifs de ce projet sont : 1. Disséquer la contribution des neurones PVTD2R dans la régulation de la prise alimentaire et le métabolisme énergétique. 2. Étudier les propriétés électrophysiologiques des neurones PVTD2R 3. Étudier le rôle des projections des neurones PVTD2R 4. Comprendre la dynamique de l’activité des neurones PVTD2R
Bénéfices attendus
Les dernières estimations de l'Organisation mondiale de la santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela représente également un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés et largement étudiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes des maladaptations physiopathologiques. Malgré les progrès et les efforts, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. La prise alimentaire et la régulation de l’homéostasie énergétique ont souvent été étudiées sous l’angle d’une implication et dysfonctionnement de l’hypothalamus. Cependant, d’autres structures extra-hypothalamiques jouent aussi un rôle clé dans ces processus. Nos résultats préliminaires indiquent que le noyau paraventriculaire du thalamus PVT aurait un rôle central dans la régulation de la prise alimentaire et du métabolisme énergétique. Le projet ThalHOME vise à établir un nouveau cadre conceptuel qui voit dans les neurones D2R du PVT une population centrale pour la régulation des processus physiologiques et physiopathologiques sous-jacents au développement du syndrome métabolique. Nous sommes convaincus que la mise en lumière des aspects intégratifs de la physiopathologie du PVT dans la surconsommation alimentaire sera essentielle pour élaborer et accélérer les stratégies préventives et thérapeutiques. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées par ThalHOME pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).
Procédures
Les animaux seront soumis : -pour 7 lots à une chirurgie (1j), puis après une période de repos, à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots. -pour 2 lots à deux chirurgies qui se feront en une ou deux fois en fonction du bien être de la souris et de sa capacité à supporter une anesthésie longue. Si cela doit se faire en deux fois les souris auront une phase de repos de 10-15j minimum avant la deuxième anesthésie. Après une période de repos de deux semaines minimum, les lots seront soumis à des tests de comportements, de métabolisme du glucose et/ou de mesure de calorimétrie indirecte. Des prélèvements sanguin sur animaux vigiles seront fait sur un de ces deux lots.
Impact sur les animaux
Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress; de même pour le cathéter gastrique. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres/cathéters étant légèrs, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrements et de perfusions. Le cathéter peut également se déloger de l'estomac, se qui provoque une fuite gastrique en intrapéritonéale. L'animal sera mis à mort immédiatement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet , nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et la régulation de la récompense alimentaire.
Réduction
Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles). Selon les dessins expérimentaux et les nombres de variables (groupes; temps; régimes; comportements) nos effectifs seront déterminés et nos résultats analysés avec des tests statistiques adaptés. Par rapport aux nombres d'échantillons nous utiliserons principalement des tests paramétriques et si nécessaire des tests nonparamétriques.
Raffinement
Le soin apporté aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, batons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale qui sont peu développées ou absentes dans d’autres modèles. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.
Caractérisation du circuit cérébral permettant les effets d’une hormone intestinale sur l’homéostasie glucidique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris, rendue obèse par un régime hypercalorique, subit l'implantation chirurgicale de canules dans le bulbe olfactif et l'hypothalamus, opération d'une quarantaine de minutes qui peut provoquer un saignement du crâne, puis des prélèvements sanguins sur animal vigile. Le porteur reconnaît que certaines souris supportent mal l'anesthésie et que la chirurgie peut entraîner douleur et difficultés de récupération. Il affirme que ces expériences ne peuvent se faire in vitro car elles requièrent l'observation de paramètres sanguins.
Objectifs
>>>Contexte. La prévalence de l’obésité est en constante augmentation au niveau mondial. Elle résulte d’un déséquilibre entre les apports (alimentation) et les dépenses (exercice physique) d’énergie. Une des complications majeures dans l'obésité est l'apparition d'un diabète de type 2 qui conduit à un taux de glucose dans le sang (glycémie) trop important, ou hyperglycémie chronique, par une altération de la secrétion et/ou de l'effet de l'hormone pancréatique hypoglycémiante, l'insuline. Le GLP-1 (pour glucagon-like peptide-1) est une incrétine, une hormone intestinale qui stimule la sécrétion d'insuline pancréatique lorsque la glycémie est élevée, après un repas notamment. Les analogues du GLP-1 sont commercialisés afin d'aider les patients diabétiques à réguler leur glycémie. Cependant, les mécanismes d'action du GLP-1 sur le cerveau sont très mal connus. Au laboratoire, nous avons montré que l'action du GLP-1 sur son récepteur dans le BO a pour conséquence d’améliorer la tolérance au glucose de souris rendues obèses par une alimentation hyperlipidique. Il s'agit donc d'un effet protecteur très prometteur à étudier. Ceci est d'autant plus intéressant que le BO est une structure cérébrale qui permet de donner des indications sensorielles sur la toxicité ou l'aspect agréable des aliments et qu'un mauvais fonctionnement du BO a été décrit chez le patient obèse. >>>Objectifs. Dans ce projet, nous voulons donc caractériser le rôle de la voie neuronale entre le BO et l'hypothalamus dans la régulation bénéfique de la glycémie chez les souris obèses. L'hypothalamus est une structure-clé de la régulation du métabolisme énergétique, qui permettrait l'augmentation d'insuline plasmatique en périphérie par l’activation de la voie GLP-1 dans le BO. Pour vérifier l'hypothèse d'un passage du signal engendré par le GLP-1 dans le BO vers le pancréas via l'hypothalamus, nous proposons d'injecter de la bicuculline par une canule placée à demeure dans le noyau paraventriculaire et ainsi en empêcher l'activation. Le PVN est le noyau de sortie de l'hypothalamus et module les neurones sympathiques prégangliaux de la moëlle épinière qui projettent sur le pancréas. Si la bicuculline bloque l'action bénéfique de l'injection du GLP-1 dans le BO, alors nous aurons démontré que l'hypothalamus est la structure cérébrale intermédiaire permettant un relais avec la périphérie dans la régulation de l'insuline. >> Nombre total de souris: 48 (24 souris obèses et 24 témoins).
Bénéfices attendus
Jusqu'à présent, les expériences publiées afin de démontrer que les mécanismes d'action bénéfique du GLP-1 sur les problèmes de régulation glycémie et de la prise alimentaire chez les souris obèses et diabétiques passeraient uniquement par une action sur l'hypothalamus n'ont pas été concluantes et les recherches sont portées sur l'identification de nouvelles structures cérébrales permettant cet effet. Il est en fait apparu qu'il existe un réseau de structures cérébrales complexes sensibles au GLP-1 et qui permet cette régulation de la glycémie. Nous avons précédemment exploré et montré la possiblité de la participation du BO dans ce réseau, une structure impliquée à la fois dans le codage cérébral des informations olfactives et la régulation de l'homéostasie glucidique. Ce projet permettra de mieux comprendre les effets du GLP-1 et de ses analogues sur le système nerveux central, et notamment sur le système olfactif. Il est tout à fait possible que dans le futur le GLP-1 puisse être délivré au patient par voie intranasale, de façon totalement non invasive contrairement aux piqures répétées, comme l'insuline, qui est depuis récemment utilisée par cette nouvelle voie d'injection.
Procédures
Le cumul des cinq expériences qui sont effectuées dans chaque procédure les classent toutes en une classe de sévérité modérée. En particulier, trois expériences requièrent une procédure chirrugicale et des prélévements sur animaux vigiles >>> Expérience 2 (toutes procédures): chirurgie. Les 48 souris seront implantées avec des canules dans le bulbe olfactif et l'hypothalamus. Chaque chirurgie dure une quarantaine de minutes. >>> Expérience 4 (procédure 1 et 2, 24 souris): prélévements sanguins mineurs chez la souris vigile en vue d'un test de tolérance au glucose. Le prélévement se fait en quelques secondes après avoir effectué une petite coupure sur le bout de la queue. >>> Expérience 5 (toutes procédures, 48 souris): Réponse insulinémique de la phase céphalique (Cephalic phase insulin release: CPIR). Pour mesurer le taux d'insuline dans le sang, deux prélévements sanguins de faible volume seront effectués au bout de la queue.
Impact sur les animaux
Pour chaque procédure, des nuisances sont possibles et une approche bioéthique est adaptée pour les prévenir, les diminuer et les éliminer si possibles. Pour l'expérience 1 (procédure 1 et 3) de régime hypercalorique, nous n'avons pas de nuisance attendue. Nous n'avons jamais observé de problèmes de souris ne voulant pas se nourrir avec une nourriture hyperlipidique. De plus, le surpoids induit chez les souris sous régime hyperlipidique n'entrave pas leur locomotion. Pour l'expérience 2 dans toutes les préocédures, qui consiste en une chirurgie pour installer les canules d'injection dans le BO et le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus, des souris peuvent mal supporter l'anesthésie et la chirurgie peut entrainer un saignement important au niveau du crâne de l'animal et entrainer douleur et problème de récupération. Pour les tests métaboliques, OGTT (expérience 4, procédure 1 et 2) et ITT (expérience 4, procédure 3 et 4) des problèmes de volume sanguin prélevé peuvent survenir et pertuber l'animal dans sa récupération.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les souris seront mises à mort. 3 souris de chaque procédure seront perfusées au paraformaldéhyde 4% après une injection de pentobarbital en overdose afin de vérifier l'emplacement des canules par immunohistochimie de coupes cérébrales.
Remplacement
Dans le cadre de notre projet visant à étudier le rôle de l'incrétine GLP-1 sur le cerveau et sur la glycémie, nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres sanguins. De plus, les invértébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de la glycémie et de la prise alimentaire. Même si chez les poissons il existe des équivalents de certains groupes de neurones des mammifères, nous ne disposons pas de modèle d'obésité dans cette espèce, qui se nourrit de façon très différente par rapport aux mammifères. Enfin, nos modèles murins, à savoir les souris C57BL6 mâles rendues obèses par régime hypercalorique, sont très bien caractérisées au niveau métabolique depuis plusieurs dizaines d'années dans plusieurs laboratoires, dont le nôtre.
Réduction
La réduction du nombre d'animaux utilisés est fortement liée à la puissance statistique qui pourra montrer l'effet recherché, ici si nous pouvons bloquer l'effet du GLP-1 bulbaire par l'injection de bicuculline dans l'hypothalamus. Ceci nous permettra de définir la voie cérébrale impliquée dans la régulation de la glycémie à partir du bulbe olfactif. L'ensemble des expériences réalisées au laboratoire ont montré qu'un nombre maximal 12 individus doit être engagé par groupe. Ce nombre permet de compenser des exclusions éventuelles de souris qui ne répondent pas aux tests pharmacologiques ou métaboliques. Nous aboutissons ainsi toujours à un nombre minimum de 8 souris nécessaires à la puissance statistique de nos comparaisons. De plus, ce projet bénéficiera du développement de 2 projets antécédents qui nous ont permis de déterminer les doses de GLP-1 dans le bulbe et de bicuculline dans l'hypothalamus. Il n'y aura donc pas d'animaux engagés dans la recherche d'un effet dose/réponse de ces agents pharmacologiques. De plus, l'implantation de canules à demeure pour injecter le GLP-1 dans le bulbe olfactif et la bicuculline dans le noyau paraventriculaire de l'hypothalamus chez la souris vigile permet d'utiliser chaque souris comme sa propre témoin et de réduire grandement le nombre de souris qui aurait été nécessaire par une approche pharmacologique aigüe: nous effectuerons différentes expérimentations sur des mêmes groupes de souris tant que celles-ci se révèlent non invasives, non douloureuses, non stressantes pour l’animal. Tests statistiques: vérification de la normalité de la distribution par un test de Shapiro-Milk. Si la distribution suit la loi normale, comparaison intragroupe sous différentes injections par un test d'ANOVA, sinon par un test de Kruskal-Wallis (et tests posthoc adaptés si nécessaires).
Raffinement
Le soin apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Les animaux seront examinés individuellement tous les jours par le personnel de l'animalerie. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé: notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.
Choix des espèces
La souris C57BL6 représente une souche murine adéquate comme modèle d'étude du récepteur du GLP-1 dans le bulbe olfactif chez les souris obèses versus des souris contrôles. Elle a notamment été utilisée pour les études précédentes sur l'action des incrétines dans le système nerveux central. De plus, elle a un système olfactif développé propice à l'étude du bulbe olfactif. Enfin, nous avons l'expertise depuis plusieurs années i) du régime hypercalorique rendant les souris progressivement obèses ii) de l'implantation de canule dans le BO chez la souris anesthésiée et de la surveillance postchirurgicale iii) du suivi du bien-être de l'animal après injection. Pour rendre les souris obèses, une alimentation hypercalorique leur est fournie: à partir de 3 mois de cette alimentation, elles présentent un poids allant jusqu'à 10 ou 15 grammes supérieures aux souris sous régime standard. Comme le régime commence à 6 semaines d'âge, les souris qui seront injectées et testés métaboliquement auront donc au moins 4 mois, ce qui correspond à un âge adulte chez la souris.
Effets de la perturbation du rythme circadien sur le fonctionnement de l’axe reproducteur chez la souris femelle
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
- Système urogénital
217 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, et les femelles peuvent subir jusqu'à deux frottis vaginaux par jour pendant treize semaines au plus, ainsi que neuf prélèvements de sang par jour à la queue pendant une quinzaine de jours. Elles sont aussi soumises à trois semaines de décalage horaire chronique, des avances et des retards successifs de la phase d'obscurité qui perturbent leur sommeil, pour imiter le travail posté. Le porteur prévoit le stress de l'isolement pour les femelles gestantes, une irritation modérée du vagin due aux frottis répétés et une douleur modérée due à l'incision du bout de la queue, et indique que 170 souris seront tuées, les 47 autres étant gardées en vie pour d'autres expériences ou tuées à défaut. Les retombées pour les femmes en travail posté sont renvoyées au "plus long terme", sous la forme de recommandations auxquelles l'étude doit seulement "ouvrir la voie".
Objectifs
La rythmicité journalière est très importante dans la régulation des fonctions biologiques. Cette rythmicité est dépendante d'une horloge endogène principale, essentiellement synchronisée par l'alternance lumière/obscurité. Chez les mammifères femelles, la fonction de reproduction présente des cycles dont la régularité repose sur ce système circadien. Ainsi, le pic préovulatoire de l'hormone lutéinisante (LH), qui déclenche l'ovulation, dépend du signal journalier généré par l’horloge endogène, en plus du rétrocontrôle positif de l’estrogène produit par les follicules ovariens matures, ce qui permet à l'ovulation d'avoir lieu au moment le plus favorable au succès reproducteur. Dans ce contexte, la désynchronisation de l’horloge biologique, induite par des altérations chroniques du cycle lumière/obscurité, a un impact négatif sur la fonction de reproduction. Il a été récemment mis en évidence qu’un protocole de décalage horaire chronique sur plusieurs semaines, mimant les horaires d’une personne en travail posté, conduit à une altération de l’occurrence du pic préovulatoire de LH et à une diminution de la fertilité chez les souris femelles. Ce projet a pour objectif de comprendre comment un décalage horaire chronique comme celui observé chez les femmes en travail posté, perturbe la transmission de l'information journalière de l'horloge principale vers l’axe hypothalamo-hypophyso-gonadique, conduisant alors à une altération de la fonction de reproduction et de la fertilité.
Bénéfices attendus
A court terme, les conclusions de ce projet permettront de mieux comprendre les mécanismes neuroendocriniens impliqués dans la régulation de la fonction de reproduction par le système circadien et comment ils sont altérés par une perturbation du cycle lumière/obscurité chez la souris femelle. A plus long terme, cette étude permettra d'ouvrir la voie à l'élaboration de recommandations pour limiter les effets néfastes de la perturbation du rythme circadien sur la fertilité des femmes dans le cadre du travail posté.
Procédures
Les animaux pourront être soumis à un décalage horaire chronique pendant 3 semaines, à un ou deux frottis vaginaux par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, au maximum pendant 13 semaines et à 9 microprélèvements sanguins à la queue par jour, d'une durée d'environ 30 secondes chacun, pendant une quinzaine de jours.
Impact sur les animaux
Un des effets indésirables pouvant être attendu sur les animaux est un stress dû à la perturbation du cycle lumière/obscurité et donc veille/sommeil induite par des avances et des retards successifs de la phase obscure, ayant pour but de mimer un décalage horaire chronique. Un stress peut aussi être induit par la manipulation des animaux au cours de la réalisation des frottis vaginaux et des microprélèvements sanguins à la queue. L'isolement des femelles gestantes peut également être une source de stress. Une irritation modérée de l'orifice vaginale due au frottis vaginaux répétés, ainsi qu'une douleur modérée due à l'incision de l'extrémité distale de la queue pour réaliser des microprélèvements de sang sont d'autres effets indésirables pouvant être attendus sur les animaux.
Devenir
Pour répondre aux questions scientifiques posées, il est nécessaire de mettre à mort 170 animaux. 47 animaux seront gardés en vie pour être réutilisés dans d'autres procédures expérimentales, sinon ils seront mis à mort.
Remplacement
Ce projet est une étude de physiologie intégrée per se. La régulation de l'activité de reproduction est un mécanisme qui fait intervenir plusieurs structures nerveuses et endocrines. L'étude des relations entre ces différents acteurs nécessite l'utilisation d'organismes entiers vivants et ne peut pas se faire sur des organes ou des cellules isolés.
Réduction
Pour chaque procédure expérimentale, le nombre d'animaux par groupe a été réduit au maximum en tenant compte des variabilités interindividuelles et des règles statistiques en vigueur, nous permettant d'obtenir des résultats fiables et robustes. Ces résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques appropriés. De plus, dès que l'expérience s'y prête, un suivi longitudinal de la variable étudié a été privilégié. C'est-à-dire que le même animal sera suivi pour cette variable sur plusieurs jours voir plusieurs semaines, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux nécessaire.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupes sociaux ou seront isolées, en fonction des contraintes des protocoles expérimentaux. Pour limiter le stress des animaux, les cages seront enrichies avec un bâton à ronger, du matériel pour la nidification (morceaux de coton) et un tunnel. Ce même tunnel sera utilisé pour déplacer la souris lors du change ou pour la capturer afin d’éviter la préhension par la queue. Après leur arrivée à l'animalerie, les souris auront une semaine pour s'habituer à leur nouvel environnement, sans manipulation. Puis, elles seront manipulées quotidiennement pendant 2 semaines avant le début des procédures expérimentales. Des points limites ont également été établis pour identifier les animaux en souffrance et pouvoir les soustraire à cette souffrance.
Choix des espèces
Le modèle animal choisi pour ce projet est la souris car le fonctionnement de son axe reproducteur est bien connu et présente un cycle régulier d’ovulation spontanée comparable à celui de la femme. Pour répondre aux questions scientifiques posées, nous utiliserons des jeunes adultes afin d’étudier le fonctionnement de l'axe reproducteur mature et non sénescent ainsi que des souris nouveau-nées afin d'étudier le développement de l’axe reproducteur et métabolique.