Multisystémique
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
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- Système cardiaque
- Système endocrinien
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- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Comorbidités des rhumatismes inflammatoires chroniques : physiopathologie et traitements.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles respiratoires
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
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- Système immunitaire
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- Système nerveux
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Rats : 1750
1 750 rats et 750 souris vont être utilisés, tous tués à l'issue, dont 1 650 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une arthrite leur est provoquée, avec érythème et gonflement des pattes, perte de poids, écoulements des yeux et du nez, mobilité réduite et vocalises que le porteur lit comme les signes d'un état de souffrance plus marqué. S'y ajoutent, selon les groupes, une marche rapide de trente minutes par jour sur tapis roulant pendant plusieurs semaines, des séances de rotarod, un spray froid appliqué sur les pattes, des gavages et un cathétérisme de la carotide sous anesthésie suivi de la mise à mort. Le projet porte sur les maladies concomitantes de la polyarthrite rhumatoïde, et le porteur justifie l'usage de deux espèces par le fait que les cultures cellulaires, les organoïdes et les approches in silico ne permettraient pas d'évaluer l'influence du sexe biologique, qu'il juge "indispensable" à la valeur prédictive des résultats.
Objectifs
Notre projet est un projet de recherche fondamentale, préclinique, qui vise à identifier des nouveaux traitements pour les patients atteints de rhumatismes inflammatoires chroniques (RIC). Ces maladies, dont les plus fréquentes sont la polyarthrite rhumatoïde et les spondyloarthrites, sont des maladies inflammatoires causées par un dérèglement du système immunitaire. Les patients souffrent de douleurs et de déformations de leurs articulations qui entraînent un handicap et a des conséquences socio-professionnelles importantes. Il est moins connu que ces patients développent également des pathologies concomitantes à leur maladie rhumatismale (comorbidités), qui réduisent l’espérance de vie, telles les comorbidités cardiovasculaires (infarctus du myocarde, accident vasculaire cérébral, insuffisance cardiaque) ou altèrent encore plus leur qualité de vie, comme les comorbidités cognitives (troubles de la mémoire, dépression) et les comorbidités intestinales (inflammation intestinale). Alors que beaucoup de données scientifiques sont disponibles sur les mécanismes et traitements du problème articulaire de ces patients, très peu d’études ont été consacrées à la prise en charge spécifique de ces comorbidités. Les effets des traitements antirhumatismaux sur ces comorbidités sont inconnus ou controversés, et aucun traitement spécifique de ces comorbidités n’a été pour l’instant identifié. Pour ces raisons, ce projet a pour objectif de comprendre les mécanismes impliqués dans les comorbidités associées aux RIC et d’identifier d’autres options thérapeutiques innovantes. Il mettra en œuvre plusieurs modèles animaux d’arthrite, chez le Rat ou la Souris, qui sont complémentaires les uns des autres vis-à-vis des comorbidités à étudier. Sur la base des données de la littérature, et selon les mécanismes que nous aurons identifiés, différentes approches thérapeutiques seront évaluées chez les animaux souffrant d’arthrite : approches médicamenteuses (voie orale ou voie injectable) et approches non médicamenteuses (cryothérapie appliquée sur les pattes, ou activité physique à un temps de l’arthrite compatible avec cette pratique). Il est attendu que toutes les approches qui seront testées n’aient soit pas d’effet aggravant de l’arthrite, soit réduisent l’intensité de l’inflammation articulaire.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront d’envisager une meilleure prise en charge des patients atteints de rhumatismes inflammatoires chroniques, de réduire la surmortalité associée à leur maladie et d’améliorer leur qualité de vie.
Procédures
Interventions non-invasives. Cette catégorie d’intervention est réalisée soit sur un animal vigile, soit sur un animal anesthésié. Elle n’engendre pas de douleur, mais uniquement une gêne à la nouveauté de l’expérience. La durée varie selon l’intervention, voir le tableau suivant. En cas d’intervention qui demande une contention des animaux, une phase d’habituation est programmée au préalable. Par exemple : - Mesure de pression artérielle à la base de la queue : habituation, en condition vigile, quelques minutes à chaque mesure. - Marche rapide sur tapis roulant : habituation, en condition vigile, 30 minutes /jour, pendant plusieurs semaines - Rotarod (coordination sur tige tournante) : habituation, en condition vigile, 5 à 10 minutes /jour, pendant plusieurs jours - ECG : sous anesthésie gazeuse, pendant quelques minutes, le réveil s’effectue 2 à 3 minutes après l’arrêt de l’exposition à l’anesthésique Application ou administration de traitements Si le traitement est administré par voie parentérale, une douleur similaire à la douleur d’une piqûre d’une aiguille est engendrée. Autrement, les conditions d'applications dépendent du type de traitement. Par exemple : -Cryothérapie par spray froid sur les pattes après contention manuelle en condition vigile pendant quelques minutes. - Injection sous-cutanée, intra-péritonéale, intradermique après contention manuelle vigile en moins d’une minute, - Gavage après contention manuelle en condition vigile en moins d’une minute - Administration orale par eau de boisson : dans la cage, en condition vigile avec accès à volonté au biberon -Administration orale dans la nourriture : dans la cage vigile avec ccès à volonté à la mangeoire. Pour les modèles d’arthrite générant une douleur et une atteinte articulaire, un soin particulier sera apporté aux animaux lors de la manipulation. Un système de points limites définit au préalable le seuil de souffrance à ne pas dépasser. Sa détermination quotidienne permet de suivre le bien-être de l’animal et d’envisager sa mise à mort, le cas échéant. Procédures chirurgicales : cathétérisation carotidienne, mesure de la courbe pression-volume cardiaque. Ces procédures doivent respecter les aspects réglementaires définis : sous anesthésie générale, après analgésie, avec température contrôlée, et respiration vérifiée, par un expérimentateur habilité à la chirurgie expérimentale. L’animal est mis à mort à la fin de la procédure.
Impact sur les animaux
Dans la procédure 1 de gravité sévère, une perte de poids et des écoulements nasaux sont observés au moment du développement d’arthrite et associés à l’apparition d’érythème et de gonflements des pattes antérieures et postérieures. Une douleur est associée à l’arthrite, et la mobilité des animaux est réduite lors de la phase inflammatoire de la maladie. Des écoulements au niveau des yeux et l’expression de vocalises peuvent apparaitre traduisant un état de stress et de souffrance plus marqué. A une phase plus tardive, des croutes cutanées peuvent apparaitre au point d’injection au niveau de la queue. Cette procédure étant considérée « sévère » au cours des phases inflammatoires des modèles d’arthrite, un suivi journalier de points limites est appliqué pendant ces phases inflammatoires. Dans les procédures 2 et 3 de classe légère, les administrations multiples par voie sous-cutanée ou intrapéritonéale peuvent aussi engendrer un inconfort pour les animaux. Ainsi, les injections doivent se faire à différents points afin de ne pas sursolliciter une seule région. L'état des points d'injection doit être vérifié le lendemain de chaque administration.
Devenir
Notre démarche de recherche inclut des explorations fonctionnelles chez l’animal vigile ou anesthésié. Mais elle implique aussi des explorations biomoléculaires sur les tissus d’intérêt. Ainsi, à l’issue de chaque procédure nous avons besoin de collecter les organes/tissus afin de réaliser des analyses. Tous les animaux de ce projet sont donc mis à mort à l’issue des procédures.
Remplacement
L’utilisation du modèle animal est nécessaire car la compréhension de nouveaux mécanismes tissulaires/moléculaires et l’étude de nouvelles approches thérapeutiques ne peuvent pas être d’emblée réalisées chez les patients, et nécessite des explorations à des stades précliniques de la maladie, irréalisables chez le patient. Les méthodes d’analyses in vitro sur cellules ou organoïdes en culture, ou in silico, ne reproduisent pas intégralement les communications complexes inter-organes (nerveuses, endocrines, immunologiques) impliqués dans les RIC et ne permettent pas d’évaluer l’influence du sexe biologique, indispensable pour garantir la valeur prédictive des résultats chez l’humain.
Réduction
Le nombre d’animaux se base sur le nombre de modalités thérapeutiques qui seront testées, avec notamment la notion d’effet-dose pour les études pharmacologiques, le nombre requis d’animaux selon la procédure réalisée (qui tient compte de la variabilité de la technique de mesure et du test statistique utilisé), et la nécessité d’étudier la variabilité liée au sexe pour des paramètres qui n’ont jamais fait l’objet d’études antérieures de l’influence du sexe biologique en cas d’arthrite. Des effectifs plus réduits seront utilisés pour les expériences préliminaires de recherche de doses efficaces des nouveaux médicaments, ou pour l’apprentissage de techniques d’exploration fonctionnelles complexes. Dans la mesure du possible, les techniques non invasives d’évaluation de la comorbidité d’intérêt seront toujours privilégiées aux mesures invasives. Pour chaque expérience, une banque de tissus sera réalisée afin de ne pas répéter ultérieurement des expériences.
Raffinement
Un raffinement sera apporté à chaque procédure afin de limiter le stress des animaux. Les effets de l’arthrite et des traitements sur les différentes comorbidités seront évalués à l’aide de différents tests, dont certains seront réalisés chez l’animal anesthésié et analgésié. Les modèles d’arthrite pouvant générer une douleur, un soin particulier sera apporté aux animaux lors de leur manipulation, un suivi clinique sera effectué, l’accès à la nourriture sera facilité. Quotidiennement, la détermination de points limites est réalisée afin de limiter la souffrance animale, en procédant à la mise à mort de l’animal selon le niveau de souffrance atteint. Cette évaluation sera réalisée conjointement avec la structure du bien-être animal, et éventuellement après sollicitation du Vétérinaire, le cas échéant. Pour les procédures nécessitant une anesthésie de l’animal, un tapis chauffant sera utilisé pour prévenir l’hypothermie.
Choix des espèces
Nos travaux s’intéressent à deux types de maladies inflammatoires chroniques : polyarthrite rhumatoïde et spondylarthropathie. Le Rat et la Souris sont les espèces de référence pour modéliser ces pathologies et ses comorbidités. La Souris offre en plus l’avantage de créer des lignées transgéniques permettant d’étudier l’effet de l’altération ou de rajout partiel ou total d’un gène codant une protéine d’intérêt. Dans tous nos modèles, les animaux sont utilisés à l’âge adulte. Dans tous nos modèles, les animaux sont utilisés à l’âge adulte, entre 6 semaines et 5 mois.
Rôle des neurones du cœur dans les troubles cardiaques de la maladie de Parkinson
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
480 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacun subissant jusqu'à douze séances hebdomadaires d'enregistrement cardiaque d'une heure, deux chirurgies et jusqu'à six séries d'injections. La première opération, de soixante minutes, sert à administrer un produit qui provoque l'accumulation d'alpha-synucléine dans le cœur, et les injections répétées détruisent la fonction des nerfs vagues, ce dont le porteur affirme que cela reste sans impact sur l'état général des animaux dans les conditions de l'étude. La seconde chirurgie, de quatre-vingt-dix minutes, est menée sans réveil, tous les rats étant tués pour l'analyse histologique des cœurs et des cerveaux. L'effectif repose sur des groupes de 15 animaux, le porteur reconnaissant que la moitié pourrait suffire si aucune différence n'apparaît entre mâles et femelles à mi-parcours.
Objectifs
La maladie de Parkinson est liée à la dégénérescence de certains neurones dans le cerveau, associée à l’accumulation de la protéine alpha-synucléine. En plus des symptômes moteurs caractéristiques de la maladie, il existe de nombreux symptômes non-moteurs qui sont très invalidants. Parmi ces symptômes non-moteurs, l’hypotension orthostatique (baisse soudaine de la pression artérielle lors du passage d’une position couchée ou assise à une position debout) est fréquente chez les patients, provoquant des étourdissements et vertiges qui augmentent le risque de chute. On observe également une diminution de la variabilité de la fréquence cardiaque et d’autres troubles de la régulation du rythme cardiaque dont la fréquence et l’intensité varient d’un patient à l’autre. Cependant, il existe des preuves que l’accumulation d’alpha-synucléine ne se restreint pas au cerveau et touche également des organes périphériques dont le cœur. En effet, il existe des neurones situés dans le cœur qui constituent le système nerveux intracardiaque et qui jouent un rôle important dans la régulation de la fonction cardiaque. Les neurones cardiaques intègrent les informations en provenance des systèmes nerveux sympathique et parasympathique, permettant ainsi d’assurer le contrôle de l’activité du cœur. Ils pourraient être affectés dans la maladie de Parkinson et ainsi contribuer directement aux troubles cardiaques. Le rôle potentiel de ces neurones cardiaques dans la maladie de Parkinson reste inconnu à ce jour et c'est ce que nous cherchons à mettre en évidence dans ce projet.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mettre en évidence les effets cardiaques retrouvés dans la maladie de Parkinson en déterminant comment le système nerveux cardiaque est modulé par l'agrégation protéique pathologique d'alphasynucléine, quelle serait la vulnérabilité des neurones cardiaques et les dysfonctionnements cardiaques qui en découlent. L'évaluation des troubles cardiaques permettrait de mettre en évidence l'intérêt probable de modifier la prise en charge thérapeutique des patients en incluant de nouvelles molécules permettant de limiter ces dysfonctionnement.
Procédures
Tous les animaux (n=480) seront soumis à deux tests comportementaux moteurs (un spontané et un nécessitant une légère contention de quelques secondes) puis à une anesthésie gazeuse de moins de 10 minutes permettant de raser l'animal et de poser des électrodes au niveau du thorax pour mesurer pendant 1 heure l'activité cardiaque sur l'animal vigile. La mesure se fait par télémétrie ; l'animal est libre de ses mouvements pendant la mesure. Cette mesure est répétée une fois par semaine soit 6 fois pour la moitié des animaux et 12 fois pour les animaux restants. Une chirurgie d'une durée de 60 minutes sera réalisée sous anesthésie et couverture médicamenteuses anti-douleurs. Cette chirurgie permet d'administrer un produit qui provoque une accumulation d'alpha synucleine aun niveau cardiaque. Les animaux vigiles recevront une injection 1 fois par jour pendant 3 jours, à deux semaines d'intervalle (3 fois pour la moitié des animaux (n=240) et six fois pour la seconde moitié (n=240)) permettant la perte de fonction des nerfs vagues. Puis après six et/ou douze semaines, les animaux passeront de nouveau les deux tests comportementaux. 240 animaux seront soumis à une seconde chirurgie de 90 minutes permettant de faire des mesures de l'activité cardiaque et de la pression artérielle. Les animaux seront endormis et sous couverture médicamenteuses anti-douleurs à la suite de laquelle les animaux seront mis à mort sans réveil préalable (pour prélèvements). 240 animaux auront une seconde chirurgie sans réveil et sous couverture anesthésique et analgésique (pour d'autres prélèvements).
Impact sur les animaux
Léger stress transitoire lors des pesées, injections, inductions et réveil d'anesthésie, et tests comportementaux. Légère douleur transitoire lors des injections. Légère gêne pendant l'heure de port des électrodes. Léger inconfort transitoire lors du réveil après anesthésie. Pendant les jours suivant la chirurgie, douleur et inconfort minimisés par les antalgiques et légère perte de poids transitoire. Dans les conditions de vie des animaux dans ce projet, la perte de fonction des nerfs vagues n'a pas d'impact sur l'état général des animaux.
Devenir
Tous les animaux (n=480) seront mis à mort à la fin de l'étude de façon à obtenir des résultats de plusieurs paramètres physiologiques tels que l'activité électrique du coeur et la pression artérielle, ainsi que la réalisation des analyses histologiques des coeurs et cerveaux récupérés.
Remplacement
Des approches in silico ou in vitro ou des données obtenues chez les patients existent et donnent de l'information mais ces approches ont des limites et à ce stade d'avancée des connaissances, il est nécessaire de passer au modèle in vivo pour avoir un système entier et intégré.
Réduction
Le nombre d’animaux dans chaque lot expérimental a été obtenu grâce à des calculs de puissance statistique. Ces critères prenent en compte le risque de possibles décès expérimentaux ou d'origine non contrôlée et impliquent d’utiliser pour des groupes expérimentaux de 15 animaux par lot soit 480 rats mâles et femelles. Des analyses statistiques à plusieurs variables seront effectuées. Les deux sexes seront étudiés en parallèle. Après avoir expérimenté la moitié des animaux mâles et femelles, si une différence est mise en évidence, l'intégralité des animaux du projet seront nécessaires, en revanche si aucune différence n'apparait, nous pourrons grouper les résultats sur les deux sexes et ainsi n'utiliser que la moitié de l'effectif total des animaux de ce projet.
Raffinement
Les expérimentations sont réfléchies de façon à minimiser au maximum l’inconfort, la douleur, la détresse ou l’angoisse des animaux au cours des différentes procédures de ce projet (médicamentation définie avec le vétérinaire référent et tests comportementaux basés sur le comportement spontané des animaux ou très rapide et ne nécessitant qu'une légère contention). Lors de la chirurgie nous aurons recours à l’anesthésie générale (gazeuse, facilement modulable et permettant un réveil rapide et plus confortable) avec contrôle de la température corporelle, additionnée d’une analgésie locale en présence d’antalgique périphérique. Le traitement antalgique sera poursuivi en postopératoire. Des points limites gradés, précis et adaptés ont été définis de façon à obtenir un arbre décisionnel en fonction des observations faites et aboutir à une gestion optimale et sans délai de ceux-ci. Les rats sont hébergés deux par cage avec eau et nourriture ad libitum. Un enrichissement par bâton de bois est disposé dans les cages d'hébergement permettant aux rats d'assouvir leur besoin de ronger. Une phase d'habituation à l'animalerie et aux expérimentateurs est prévue en amont de l'étude. Le binôme d'expérimentateur reste le même tout au long de l'étude.
Choix des espèces
L'espece animale utilisée est le rat (Rattus norvegicus). Il sagit de l'espèce la plus utilisée pour l'étude de la maladie de Parkinson puisque les réseaux neuronaux sont similaires à ceux de l'Homme. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte (8 semaines au moment de la première chirurgie) puisque nous avons besoin d'avoir des circuits et systèmes entièrement développés.
miR-Gut | Rôle des microRNAs hépatiques et du microbiote intestinal dans les maladies métaboliques chez la souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
Une partie des souris utilisées est de lignée ob/ob, obèse par construction génétique, les autres étant rendues obèses par trois mois de régime à 60 % de matières grasses. 300 souris au total vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent des injections dans la queue trois fois par semaine pendant deux semaines, puis subissent trois tests métaboliques successifs, chacun exigeant une incision de la queue et jusqu'à huit prises de sang échelonnées sur deux heures, avec un risque d'hypoglycémie marquée pour les souris témoins. Toutes sont tuées pour le prélèvement de leurs organes, le porteur affirmant que le recours à l'animal est "irremplaçable" faute de modèle in vitro reproduisant l'effet du microbiote intestinal.
Objectifs
Ce projet a pour but de comprendre le rôle des miRs hépatiques dans les maladies métaboliques type obésité et diabète de type 2, surtout en ce qui concerne la physiopathologie hépatique, en relation avec le microbiote intestinal et ses altérations. En effet, aujourd'hui nous avons bien identifé le rôle clé du microbiote intestinal dans la physiopathologie des maladies métaboliques. De plus, les altérations du microbiote intestinal, dites dysbioses, induisent et aggravent la stéatose hépatique, qui caracterise obésité et diabète de type 2. Par contre les mécanismes moléculaires qui gouvernent la stéatose hépatique ne sont pas encore clairement identifiés. Les microRNAs ou miRs, sont des petites ARNs capable de reguler l'expression génique et leur expression est sous contrôle du microbiote intestinal. De plus, nous avons montré que les miRs hépatiques sont fortement corrélés au degree de stéatose hépatique et au microbiote intestinal. Pour cela, dans ce projet nous comptons moduler les miRs hépatiques et le microbiote intestinal, afin de moduler la stéatose hépatique.
Bénéfices attendus
Identification des miRs hépatiques qui controlent la physiopathologie du foie et qui sont sous contrôle du microbiote intestinal. Cela pourrait permettre la mise en place d'une thérapie basée sur la modulation des miRs hépatiques, comme c'est déjà le cas pour les thérapies qui modulent les miRs du pancrèas dans le cadre des cancers pancrèatiques.
Procédures
Injection intracaudale sur animaux vigiles de molécules anti-miRs, trois fois par semaine, sur deux semaines. Test intrapéritonéale de tolérance à l’insuline (IPITT) : une goutte de sang sera prélevée à la veine caudale aux temps 0, 10, 30 et 60 minutes après la première injection d’insuline ; une incision à la queue de moins de 0,5 mm sera réalisée pour la mesure de la glycémie. Test orale de tolérance au glucose (OGTT) : une goutte de sang sera prélevée à la veine caudale aux temps -30, 0, 15, 30, 60, 90 et 120 minutes après la première injection de glucose, une incision à la queue de moins de 0,5 mm sera réalisée pour la mesure de la glycémie. Test intrapéritonéale de tolérance au pyruvate (IPPTT) : Une goutte de sang sera prélevée à la veine caudale aux temps -30, 0, 15, 30, 45, 60, 90 et 120 minutes après la première injection de pyruvate, une incision à la queue de moins de 0,5 mm sera réalisée pour la mesure de la glycémie. Chaque test ci-dessus sera réalisé une seule fois par procédure.
Impact sur les animaux
Des éventuels effets indésirables lors de tests métaboliques pourraient être liées à une réponse trop importante lors du test de tolérance à l’insuline et donc à une hypoglycémie importante, surtout chez les souris contrôles sous régime normal. Pour cela, du glucose 5% sera éventuellement utilisé pour augmenter la glycémie rapidement. Pour les souris ob/ob, le risque est d'avoir une hyperglycémie trop importante (marquée HI sur le glucomètre) : dans ce cas, pas prevu avec la dose de glucose envisagée (0,5 mg/Kg), le plan d'action prevoit de surveiller l'animal, retest 30 min après, et eventuellement animal sorti du protocole et mis à mort par dislocation cervicale.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever les organes et réaliser les analyses moléculaires organe-spécifiques.
Remplacement
L’utilisation des méthodes alternatives in vitro a permis de mettre en évidence les effets de la modulation des miRs au niveau cellulaire. Cependant, le recours à l'animal est irremplaçable car aucun modèle in vitro ne permet de récapituler l’impact du microbiote intestinal dans ce type de modulation.
Réduction
Le n=10 prévu pour chaque groupe nous permettra d’attendre un seuil statistiquement valable et donc de pouvoir interpréter les résultats obtenus. Cela permettra de ne pas répéter les expérimentations tout en respectant la réduction du nombre d’animaux employés. Pour l'analyse d'un paramètre, par exemple la glycémie, entre deux groupes de souris, nous utiliserons un test non apparié. Pour l’analyse de deux ou plus paramètres comme la glycémie et le temps, par exemple lors d’un test de tolérance au glucose, nous utiliserons l’analyse 2-ANOVA. Une veille de la littérature est effectuée constamment afin de ne pas répéter des expériences déjà réalisée par d’autres travaux scientifiques. Les animaux contrôles ne pourront pas être mutualisés pour plusieurs expériences, car cela ne permettrait pas de comparer les microbiotes intestinaux au même temps.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en raison de 3 souris maximum par cage moyenne ou 6 souris maximum par grandes cages (adaptées à partir de cages de rats), à cause de leur état d'obésité. Des points limites adaptés sont prévus en fonction de l'évolution de l'état d'obésité des souris : hyperglycémies précoces (HI sur le glucomètre) à l’état nourri et /ou à jeun des souris sous régime gras ou des souris ob/ob.
Choix des espèces
Le microbiote intestinal chez la souris est désormais bien connu et sa structure ressemble à celle du microbiote intestinal chez l’Homme, surtout en condition pathologique. Pour cela, la translation des résultats obtenus chez la souris vers l’Homme pourrait être faite rapidement. Nous utiliserons des souris de 18 semaines d’âge au moment des traitements avec les sondes anti-miR d’intérêt. Cet âge tient compte du traitement par régime gras 60%HFD (3 mois). Dans ce dernier cas, les souris à traiter avec le régime gras diabétogène/obésogène arriveront à l’âge de 4 semaines et commenceront le traitement régime gras à 6 semaines. Cette âge permet une réponse optimale des souris au régime gras pour l’induction des maladies métaboliques. Dans les autres cas sans régime gras les souris arriveront en zootechnie à l’âge de 16 semaines.
Evaluation d’anticorps therapeutiques dans un modèle de choc septique
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système immunitaire
210 souris reçoivent une injection de composant bactérien qui reproduit un choc septique, puis chacune est observée pendant trente heures, d'abord toutes les trente minutes. Les procédures impliquent un niveau de souffrance sévère et s'achèvent par une prise de sang sous anesthésie générale puis la mise à mort, les organes étant prélevés pendant trente minutes pour mesurer les dommages tissulaires. Le porteur annonce une altération de l'état général, un risque d'hypothermie et un risque d'insuffisance respiratoire, comparables à ce qu'endurent les patients en sepsis sévère. Le bénéfice espéré tient dans une preuve de concept, formulée au conditionnel, pour un anticorps qui a déjà montré ses propriétés en culture et dans d'autres modèles murins.
Objectifs
L’objectif de ce projet est de faire la preuve de concept du bénéfice thérapeutique d’anticorps dirigés contre une protéine de la coagulation dans le traitement du sepsis sévère. Le sepsis est causé par une infection qui se repend dans le système vasculaire, entrainant une réponse inflammatoire généralisée et exacerbée. Il peut évoluer vers une forme grave, le sepsis sévère, caractérisée par des dysfonctions d’organes pouvant conduire au décès du patient (dans environ 30% des cas). Actuellement, les traitements disponibles sont surtout palliatifs (pour soulager les symptômes) et il n’existe aucun traitement curatif. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques du sepsis sévère est donc considéré comme un enjeux majeur. Les processus d’inflammation et de coagulation sont étroitement liés dans l’évolution du sepsis. L'activation de la coagulation, qui est provoquée par une réponse inflammatoire exacerbée, peut induire la formation de thrombus (caillots) qui obstruent la circulation sanguine, augmentant ainsi le risque de défaillance d’organe. De nombreuses études montrent un effet bénéfique de l’utilisation d’anticoagulants dans le traitement du sepsis, mais le risque hémorragique associé à de telles molécules reste un frein à leur utilisation. Notre équipe a récemment identifié un anticorps qui se lie à une protéine de la coagulation et qui présente des propriétés anticoagulantes, mais aussi anti-inflammatoires in-vitro. Nous avons montré, dans des modèles murins, que cet anticorps limite la formation de thrombose, sans augmenter le risque hémorragique. Ces propriétés font de cet anticorps un candidat médicament prometteur pour cette pathologie, ce que nous cherchons à démontrer avec ce projet.
Bénéfices attendus
Si ce projet permet de faire la preuve de concept d’un bénéfice thérapeutique de l’anticorps que nous avons identifié dans le traitement du sepsis sévère dans un modèle murin, cela ouvrirait de nouvelle perspectives toute à fait intéressantes pour le traitement de cette pathologie chez l’Homme.
Procédures
Dans ce projet les animaux seront traités avec un composant bactérien pour mimer les réponses immunitaires et inflammatoires observées chez l’homme lors d’un sepsis sévère. Ce composant bactérien sera administré pendant 1 minute une fois par voie intrapéritonéale à l'initiation du modèle. Puis certains animaux seront traités avec les anticorps à tester 30 minutes après l'injection du composant bactérien, administrés une fois par voie intraveineuse sous anesthésie . L’observation clinique des animaux durera 30 heures après induction du modèle. A l’issue de l’expérimentation, un prélèvement sanguin de 2 minutes sera réalisé sous anesthésie générale, puis les animaux seront euthanasiés, toujours sous anesthésie générale. Les organes seront alors prélevés pendant 30min pour procéder à une analyse des dommages tissulaires.
Impact sur les animaux
L’administration de composé bactérien permettant de mimer les réponses immunitaires et inflammatoires observées chez l’homme lors d’un sepsis sévère entrainera des effets cliniques comparables à ceux observés chez les patients atteints de sepsis sévère, avec notamment une altération de l’état général des animaux, un risque d’hypothermie et un risque d’insuffisance respiratoire.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à l'issue de l'expérimentation, soit 30 heures après l'induction du modèle. L’euthanasie des animaux est nécessaire pour le prélèvement du sang et des organes pour l'analyse biologique.
Remplacement
L'utilisation d'animaux, dans ce projet, est dictée par la complexité de la pathologie caractérisée par une réponse inflammatoire généralisée et une coagulation intravasculaire disséminée entrainant des défaillances d’organes. Les effets complexes provoqués par l'administration de composé bactérien et par les anticorps d’intérêts ne peuvent donc être considérés qu’à l’échelle d’un organisme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser pour obtenir des résultats robustes a été déterminé selon une analyse détaillée de la littérature scientifique, qui nous a ensuite permis de réaliser une analyse statistique pour assurer l'utilisation d'un nombre minimal de souris, sans compromettre la validité des résultats qui seront obtenus. L'analyse des résultats au fur et à mesure de l'avancée du projet ainsi qu'une stratégie décisionnelle ont été prévues pour minimiser le nombre d'animaux et essayer de ne pas utiliser tous les groupes préconisés.
Raffinement
Une attention particulière sera portée au bien-être animal à travers un suivi régulier des souris durant l’expérimentation afin de déceler tout excès de douleur. Un expérimentateur observera leur comportement/état toutes les 30 minutes durant les deux premières heures, puis toutes les heures entre 20 et 30 heures après l’induction du modèle. Pour limiter la souffrance des animaux, des points limites ont été établis selon une analyse de la littérature scientifique et seront strictement respectés. Les animaux représentatifs du modèle de sepsis sévère pouvant présenter une hypothermie, les souris seront placées dans une cage thermostatée, contenant un surplus de papier kraft, durant toute l’expérimentation. Elles auront accès à un gel hydrique spécialisé pour leur permettre de s’hydrater et de s’alimenter, même en cas d’affaiblissement général. Afin de limiter la douleur engendrée par les administrations/prélèvements, une anesthésie sera mise en place selon les procédures réalisées (anesthésie locale ou générale). Les rongeurs étant des animaux grégaires aucun animal ne sera laissé seul dans une cage.
Choix des espèces
Les modèles sepsis sévère chez la souris ont fait l'objet de nombreuses publications, facilitant la mise en perspective de nos résultats avec les données publiées. Ce modèle est connu pour être facile à mettre en place avec une bonne reproductibilité des effets cliniques et biologiques. Ce modèle réalisé chez la souris permet de reproduire les caractéristiques générales d’un sepsis sévère telles qu’elles sont observées chez l’homme, avec cependant une réponse inflammatoire accélérée par rapport à la pathologie humaine. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 9 semaines, âge de la maturité sexuelle pour cette espèce. Cet âge permet de s’affranchir des problèmes à la fois prépubères et de vieillissement qui induiraient des paramètres supplémentaires à analyser pour la compréhension des mécanismes mis en jeu.
Gestion de lignées de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Alimentation animale
- Autres troubles humains
- Bien-être animal
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies infectieuses
- Toxicologie (hors obligations réglementaires)
- Troubles cardiaques
- Troubles endocriniens
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles musculosquelettiques
- Troubles nerveux
- Troubles respiratoires
- Troubles sensoriels
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Rats : 30000
Créées sur place ou reçues d'autres établissements, des lignées de souris et de rats génétiquement modifiés sont élevées, tatouées et biopsiées pour vérifier qu'elles portent bien la mutation commandée. 320 000 souris et 30 000 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger à modéré, ceux qui ne partent pas vers un autre projet d'expérimentation étant tués, sans placement possible puisqu'ils appartiennent au scientifique commanditaire. Chaque animal peut subir jusqu'à quatre biopsies de l'oreille ou de la queue et quatre prélèvements sanguins par jour, et exprimer du seul fait de sa mutation un phénotype douloureux tel qu'une arthrite. Le porteur ajoute que la mise à mort peut être programmée à un âge précis pour éviter que l'animal n'exprime ce phénotype, et que les scientifiques "s'engagent par écrit" à ce qu'il n'existe pas de solution de remplacement à leur lignée.
Objectifs
Ce projet a pour premier objectif le maintien de lignée de rongeurs génétiquement modifiées qui développent des modifications/symptômes physiques ou cliniques (appelés phénotypes) dû à la mutation des gènes, et l’évaluation de l’impact de ces caractéristiques sur leur bien être ; comme deuxième objectif la réalisation d'une biopsie (prélévement d’un morceau d’oreille le plus souvent) en plus d’une identification par tatouage des animaux. Les animaux génétiquement modifiés sont utilisés comme modèle expérimental pour la recherche (compréhension de maladies d’origine génétique, par exemple la mucoviscidose, l’hémophilie ou encore la myopathie dans différents domaines : facteurs de risque, mécanismes physiopathologiques, essais thérapeutiques, ...) ou pour le développement de médicaments. A la réception ou à la création de lignées génétiquement modifiées, si nous ne connaissons pas l’impact de la mutation génétique sur l’animal, une caractérisation de la lignée sera réalisée afin d'évaluer le bien-être animal et permettre sa gestion optimale, sa prévention ou son traitement adéquat. Si l’impact de cette mutation est avéré et connu, la gestion de cette lignée y sera adaptée par la définition / surveillance des possibles signes cliniques ainsi que leur prévention et traitement. Pour toute lignée génétiquement modifiées, il est important de savoir si l’animal est porteur ou non de la mutation génétique, pour cela, une biopsie peut être réalisée qui permettra d’extraire l’ADN de l’animal et ensuite de vérifier si l’animal à la mutation dans son ADN. Ce test est important car dans l’élevage de lignée génétiquement modifiées, tous les animaux nés ne sont pas porteurs de la mutation, il est donc primordiale de le vérifier pour pouvoir utiliser les animaux d’interet uniquement et donner des résultats fiables. Enfin, certaines mutations génétiques ne font effet qu’après l’injection d’une hormone ou d’un antibiotique. Pour induire cette mutation d’interet et que l’animal exprime physiologiquement cette mutation, une injection de l’hormone pourra ainsi également être réalisée. Pour ce projet, nous comptons 350 000 animaux (ajout de 15% dû à l’augmentation de l’utilisation de ces modèles) répartis entre 500 et 600 projets différents. Entre 15- 20% de ces projets concerneront des lignées dont une partie des animaux pourront exprimer des phénotypes parfois pathologiques de leur mutation.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement modifiés (avec une analyse de la présence de la mutation validée) qui leur permettront de réaliser leurs études sur des organismes entiers et vivants. L’altération génétique de ces animaux permet de les rendre plus spécifique à une question scientifique posée, et ainsi réduire le nombre d’animaux qui aurait du être utilisé si on avait utilisé des lignées moins adaptée à la maladie étudiée. Ainsi, le bénéfice de ce projet sera de permettre une évaluation et une prise en charge des nuisances causées par la mutation génétique des lignées génétiquement modifiées et une standardisation et un raffinement des méthodes de prélèvement de tissus pour la cartographie génétique de ces lignées. Le tout permettra d’avoir une meilleure maitrise de la production, de l’élevage et de la qualité des animaux qui doivent être sains, sans agent pouvant induire des biais dans les études et porteur de la mutation génétique voulue afin de fournir aux scientifiques le bon modèle pour leurs expérimentations.
Procédures
Selon les besoins du projet, les animaux pourront être soumis par animal : - A maximum 4 biopsies (à l’oreille préférentiellement ; à la queue sur justification scientifique), acte d’une durée maximale d’une minute - A des prélèvements sanguins au volume et fréquence conformément à la réglementation en vigueur (maximum 4 prélèvements sanguins par jour) d’une durée maximale d’une minute Selon les besoins du projet, les animaux hébergés soumis aux nuisances énoncées pourront exprimer un phénotype ayant un impact négatif sur eux (ex : mutation induisant de l’arthrite). Dans de rare cas, l’administration de ligands peuvent être fait via des injections en intrapéritonéale ou en gavage (durée : moins de 5 minutes, fréquence peut varier d’une expérimentation à une autre, mais n’excédant pas une fois par jour pendant 7 jours, en cas de protocole nécessitant de dépasser ces limites, cela devra au préalable être valider par la SBEA) (durée et fréquences décrites dans la procédure 4, et recommandées par la littérature).
Impact sur les animaux
EExpression d’un phénotype ayant un impact négatif sur les animaux et des signes cliniques associés. Douleur, signes cliniques, mortalité inatendue ou stress exprimé pendant l’évaluation bien etre animal d’une nouvelle lignée. Douleur et stress léger de courte durée associés à une biopsie par méthode invasive (4 biopsies maximum) en plus d’une identification. Douleur et stress léger de courte durée associés à un prélèvement sanguin. Douleur, stress léger de courte durée dûs aux contentions. Douleur, stress léger de courte durée dûs à l'injection d’un produit.
Devenir
A la fin de la procédure, les animaux sont soit en utilisation continue dans des projets d’expérimentation, soit mis à mort (les animaux appartiennent au scientifique et ne peuvent être replacés).
Remplacement
Ce projet vise à fournir aux scientifiques des animaux génétiquement altérés qui leur permettront d’étudier dans des organismes entiers et vivants toutes les conséquences d’une altération génétique définie et/ou l’intérêt de molécules thérapeutiques pour lutter contre ces conséquences. Ceci implique l’étude de divers processus biologiques et systèmes physiologiques complexes et nombreux au fur et à mesure de la vie du modèle et nécessite de disposer d’organismes vivants et entiers afin de pouvoir observer l’impact de l’altération génétique ou d’une molécule thérapeutique dans l’ensemble des organes, tissus et fonctions physiologiques. La complexité des mécanismes mis en jeu ne permet donc pas de réaliser de nos jours de tels projets sur des modèles in vitro. Les scientifiques s’engagent par écrit à ce qu’il n’y ait pas de solution de remplacement à cette lignée.
Réduction
Le nombre d’animaux hébergé et mis en accouplement est calculé en fonction des besoins stricts de chaque scientifique. Les chercheurs sont sensibilisés à la nécessité de limiter le nombre d’animaux utilisés et nous mettons en œuvre des améliorations continues de nos méthodes de reproduction pour réduire le nombre d'animaux nécessaire pour obtenir un niveau d'élevage correspondant aux objectifs du projet. Par exemple : Adaptation du sexe du reproducteur transgénique quand il est accouplé avec des animaux non transgéniques afin de maximiser les chances de fertilités (phénotype impactant la reproduction) ; éviter les mères dont le phénotype réduit les comportements maternels ; fécondation in-vitro pour ne produire qu’une génération d’animaux d’intérêt et éviter le vieillissement ; cryoconservation des lignées non utilisée et arrêt des colonies respirantes si pas de besoin. Nous encourageons les scientifiques à utiliser les petits au génotype sauvage (non d’intérêt) en tant que contrôles. Pour l’évaluation du bien-être d’une nouvelle lignée, ne sont utilisé que le nombre d’animaux minimum requis. Nous ne faisons pas naître d’animaux spécifiquement pour cette évaluation. Pour le génotypage, nous encourageons les scientifiques à choisir des méthodes de prélèvement qui associent identification et génotypag. Nous les encourageons à choisir des schémas d’accouplement ne nécessitant pas de génotypage (homozygotes x homozygotes par exemple). Nous avons aussi réduit le nombre d’animaux utilisés pour l’évaluation du bien-être des nouvelles lignées en adaptant les anciens requis Suisses et Allemands (100 animaux sur 3 générations) aux recommandations européenes (au moins 7 animaux de chaque sexes et génotypes, sur 2 générations).
Raffinement
En cas de signe clinique particulier, un suivi adapté est mis en place par des techniciens qualifiés et compétents au suivi vétérinaire des animaux. Dans le cas de lignées pouvant présenter un phénotype dommageable, si le phénotype le requiére, des observations cliniques plus fréquentes et plus spécifiques avec des points limites et des raffinements précis seront mise en place. Afin de limiter la douleur pour l’animal, une euthanasie pourrait être demandé en automatique à un point limite ou âge précis afin d’éviter que l’animal n’exprime le phénotype. Ces observations sont facilitées par l’utilisation d’outils internes de suivi de type grille de score. En cas de détection d’un point limite terminal, l’animal est mis à mort.
Choix des espèces
Les rats et les souris sont les espèces pour lesquelles les manipulations génétiques sont développées, maitrisées et avec de nombreuses données scientifiques. De plus, ces espèces permettent d’élever rapidement un nombre d’animaux suffisamment important pour pouvoir avoir des données scientifiquement exploitables et permettent ainsi de mener de manière plus fiable des études en recherche et développement. Pour ce projet, nous devons caractériser et élever des animaux génétiquement modifiés qui peuvent développer des caractéristiques cliniques spécifiques à tout âge. Pour vérifier la présence de la modification génétique, une biopsie est réalisée le plus souvent (99% des cas) une semaine avant le sevrage ou au sevrage. Dans environ 1% des cas, une nouvelle biopsie à l’âge adulte peut être demandé pour vérification. Une analyse du sang peut également permettre de vérifier que l’animal présente les caractéristiques attendues, cette dernière se fait après 4 semaines d’âge minimum (adulte) Pour finir, la modification génétique peut être induite par l’injection d’une hormone, cette injection peut se faire à partir de 8.5jours après la fécondation.
Rôle des peptides natriurétiques et leurs récepteurs dans le contrôle de la thermogenèse et du métabolisme énergétique EU 2/2.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
4 200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 240 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, 3 520 un niveau modéré et 440 un niveau léger. Elles sont gavées une fois par jour pendant une semaine, subissent jusqu'à trois séries de dix prélèvements sanguins en deux heures, des injections rétro-orbitaires, une chirurgie, des séjours à 4 °C ou à 30 °C et des isolements pouvant durer cinq jours. L'exposition aiguë au froid peut provoquer une hypothermie modérée à sévère, et le porteur reconnaît une mortalité chirurgicale inférieure à 10 %. Il indique disposer de lignées cellulaires capables de remplacer l'animal pour produire des adipocytes bruns modifiés, avant de conclure qu'"aucun autre modèle n'est susceptible d'apporter les réponses aux questions posées".
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Une forte prévalence (ou activité) du tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des gavages pendant une semaine, une fois par jour ; des injections ne durant que quelques secondes chacunes, des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive. Selon les procédures les animaux subiront 3 séquences (espacées d’au moins 1 semaine) de 10 prélèvements au maximum sur une durée de 2 heures. Certains seront aussi soumis à une chirurgie une fois au cours de leur vie, des hébergements au froid (4°C) ou à thermoneutralité (30°C), des isolements temporaires (maximum 5 jours) et une alimentation enrichie (lipides ou adénine) durant maximum 4 semaines consécutives. Dans le second établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des injections ou des gavages ne durant que quelques secondes et des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive.
Impact sur les animaux
Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Une hypothermie modérée à sévère pourrait être observée lors de la procédure d’exposition aigue au froid. Cette procédure n°6 étant classée en sévère, nous porterons une attention renforcée au bien-être animal et nous évaluerons l’état général des animaux par une grille de score évaluant le degré de sévérité réel. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur, des expositions à 4°C ou 6°C, et des isolements pour des mesures des échanges gazeux (avec dérogation à l'hébergement). Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Inconfort lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. Certains groupes subiront un gavage de glucose unique lors de tests in vivo (à 2 semaines d’intervalle). - Stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie. - Inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline (une fois, durée max 15s). - Inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue (tests in vivo). - Isolement des souris pour la mesure d’échanges gazeux (5 jours) avec surveillance accrue lors du retour en cages d’origines pour détecter d'éventuelles bagarres. - Injections rétro-orbitaires sous anesthésie gazeuse, potentiellement douloureuses, effectuées une fois avec anesthésique local. - Les chirurgies, sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale, peuvent causer inconfort, douleur et rarement la mortalité (inférieure à 10%). Utilisation de tapis chauffants maintenant la température des animaux. - Les expositions au froid, jusqu'à 5 heures, peuvent causer inconfort et douleur, avec contrôle de la température pour prévenir l'atteinte des points limites. Prise en charge immédiate des animaux atteignant ces points limites pour rétablir leurs constantes physiologiques.
Devenir
Ceci est indiqué pour chaque procédure expérimentale. Les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation chronique thermique par exemple ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, la plupart du temps entre 2 et 6 mois d'âge (sauf pour les cohortes vieillissement entre 12 et 24 mois), ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépots adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.
Remplacement
Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogénèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.
Réduction
En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 20 animaux contrôles (mâles et femelles) et 20 animaux génétiquement modifiés (mâles et femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ».
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront uniquement regroupés au moment du sevrage. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuie-mains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées à sévères et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Dans le cas des procédures sévères une surveillance accrue sera opérée par les manipulateurs ou les zootechniciens et des actions d'enrichissement, par exemple, seront réalisées. Lors des procédures où la température d'hébergment est modifiée (4°C ou 30°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de divers régimes alimentaires et températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogénèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 7 semaines. Des analyses de suivi seront également effectuées sur un groupe d’animaux de nos différentes lignées allant jusqu’à 24 mois, ceci dans le but de déterminer sur le plus long terme les effets sur le développement du tissu adipeux brun et la physiologie de l’organisme de « nos » protéines d’intérêt de la thermogénèse.
Etude des mécanismes de rejet inné après transplantation d’organe et tissue
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
Prélèvement du cœur ou du rein sur les souris donneuses, puis greffe sur les receveuses au cours d'une opération de vingt à quatre-vingt-dix minutes selon l'organe, suivie de quatre injections de morphine et d'un suivi qui peut atteindre cent soixante-huit jours. 4 240 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les lignées d'élevage au phénotype dommageable subissent trois prélèvements sanguins par an au sinus rétro-orbitaire pendant cinq ans, et les receveuses de greffe d'îlots pancréatiques reçoivent d'abord une injection provoquant un diabète, puis deux contrôles de glycémie par semaine. Chaque chirurgie entraîne une gêne au réveil et une douleur malgré les analgésiques, et toutes les souris sont tuées en fin de procédure pour que soient prélevés leur sang, leurs organes lymphoïdes et les greffons.
Objectifs
La transplantation est souvent le traitement le plus efficace, voire le seul, pour les patients en insuffisance terminale d'organe. Ce processus permet de remplacer l’organe malade par celui d’un donneur génétiquement différent. Cependant, son efficacité à long terme est limitée par le rejet, principal facteur de perte de greffon. Ce rejet survient car le système immunitaire du receveur reconnaît le greffon comme un tissu étranger. Actuellement, le rejet est attribué à la reconnaissance du greffon par la réponse immunitaire adaptative. Nos recherches récentes explorent le rôle d’un autre bras du système immunitaire, l’immunité innée, révélant un potentiel thérapeutique inédit pour éviter et traiter le rejet du greffon. L’identification et la compréhension des mécanismes du rejet inné permettraient de mieux évaluer et suivre les patients, tout en ouvrant la voie à de nouveaux traitements innovants. Les objectifs du projet sont : i) analyser les réponses de l’immunité innée du receveur contre le greffon; ii) tester des molécules susceptibles de freiner les lésions de rejet et d’augmenter la durée de vie des greffons ; iii) étudier comment l’interaction entre les cellules innées et les lymphocytes. Cette approche optimiserait la sélection des donneurs et prolongerait la survie des greffons, tout en améliorant la qualité de vie des receveurs. Des études récentes montrent que le type de rejet varie selon les cellules immunitaires impliquées et le type de greffe. Nous utiliserons diffèrents modèles de greffes pour explorer la contribution des cellules de l’immunité innée dans le rejet de greffe chronique et aiguë. Le projet est structuré en 8 procédures, chaque modèle de greffe (moelle osseuse, greffe cardiaque, rénale, îlots) étant étudié avec deux objectifs : 1) caractériser les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe médié par les monocytes et tester des molécules visant à réduire le risque de rejet ; 2) analyser les mécanismes impliqués dans le rejet de greffe médié par les cellules innés NK avec les lymphocytes. D’une durée de 5 ans, le projet pourrait impliquer jusqu’à 4240 souris, avec des expériences réalisées en séquence et arrêtées en cas d’hypothèse invalidée.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'améliorer la compréhension du rôle du système immunitaire inné dans le rejet de greffe, ainsi que de ses interactions avec le système adaptatif. Cette meilleure connaissance pourra nous guider dans l'identification de traitements potentiels pour atténuer le rejet. L’effet thérapeutique de molécules candidates sera étudié, ce qui permettra de sélectionner et valider des candidats capables de moduler ces interactions, avec des études plus approfondies sur les mécanismes moléculaires in vitro.
Procédures
Elévages des souris du phénotype dommageable : prélèvement sanguin au sinus retro-orbital trois fois par an, maximum 5 secondes par prélèvement – durée 5 ans Souris receveuses des cellules moelle osseuse : Greffe des cellules moelle osseuse sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre 20 sec) – au niveau du rein - Incision au niveau du flanc latéral. (opération 20 minutes) Souris donneuses de greffon cardiaque : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 15 minutes Souris receveuses de greffon cardiaque : greffe cardiaque sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections 20 sec) – opération au niveau du cou (opération 60 minutes) Expérience de maximum 56 jours Souris donneuses de greffon rénale : prélèvement du coeur sous anesthésie (injection dans le ventre) + analgésie morphinique - durée 20 minutes Souris receveuses de greffon rénale : greffe rénale sous anesthésie (injection dans le ventre 5 sec) + analgésie morphinique (4 injections soucutanée 20 sec) – opération au niveau du ventre (opération 90 minutes) + + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre 20 sec) – opération au niveau du ventre (total opération 20 minutes) Expérience de maximum 168 jours Souris receveuses de greffon d’îlots pancréatiques : Injection dans le ventre pour une induction chimique de diabète (maximum 5 secondes). Greffe des cellules de pancréas sous anesthésie (injection dans le ventre de 5 secondes) + analgésie morphinique (4 injections dans le ventre de 20 secondes) – réalisée au niveau du rein via une incision sur le flanc latéral. (opération 20 minutes). Suivi de la glycémie par glucomètre (prélèvement sanguin de la queue deux fois par semaine, maximum 5 secondes par prélèvement). Expérience de maximum 56 jours
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales et les prélèvements de sang sont susceptibles d’entrainer un stress (contention) et une légère douleur. La greffe de cellules de moelle osseuse, cœur, rein et îlots pancréatiques sont des procédures bien documentées, les potentiels effets indésirables sont associés la plupart du temps à des soucis d’anesthésie lors de la chirurgie ou de suture des vaisseaux. Chacun des 4 types de chirurgie entrainera une gêne lors du réveil et douleur (malgré les analgésiques) et risque d’engendrer des difficultés de mouvements ou des démangeaisons lors de la cicatrisation. De manière générale, ces procédures peuvent donner lieu à des troubles des fonctions corporelles ou de l’état général des animaux.
Devenir
Les souris seront mises à mort en fin de procédure avec un prélèvement de sang et récupération des différents organes lymphoïdes et des greffons. Ces prélèvements d’organes et de sang sont nécessaires aux analyses biochimiques/biologiques.
Remplacement
Ce projet ne peut être mené sans l’utilisation d’animaux car le système immunitaire est un système biologique extrêmement complexe, et les interactions cellulaires qui aboutissent au rejet ne peuvent avoir lieu qu’au sein de l’architecture d’un ganglion ou de la rate, ce qui est impossible à reproduire in vitro. Les mécanismes de rejet d’organe ne peuvent pas être reproduits in vitro.
Réduction
Des calculs d’effectifs ont permis d’établir le nombre minimal d’animaux par groupe pour garantir des résultats pertinents, fixé à 8 animaux par groupe. Afin d’atteindre cet effectif malgré les taux de réussite variables des greffes rénales, des greffes d’îlots et de l’induction du diabète (80-90% et 70% respectivement), chaque groupe comprendra entre 10 et 14 individus au départ. Cette marge permet de s’assurer qu’au moins 8 animaux pourront être analysés par groupe. Au total, 4240 souris (Mus musculus) seront nécessaires pour ce projet. Le nombre d’animaux a été déterminé par une approche statistique afin d’assurer la robustesse des analyses. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, chaque étape étant conduite uniquement après l’obtention et l’analyse complète des résultats de la procédure précédente. Si les résultats obtenus ne permettent pas de valider l’hypothèse testée, les étapes suivantes ne seront pas engagées. Cette approche garantit que la poursuite des expériences repose sur des résultats concluants, limitant ainsi la réalisation d’expériences non nécessaires.
Raffinement
Le bien-être des animaux sera évalué et pris en compte tout au long du protocole grâce à un suivi rigoureux, incluant l’observation de leur poids, de leur comportement et de leur état général. Des points limites spécifiques à chaque chirurgie seront définis pour assurer une prise en charge adaptée. Des traitements anesthésiques et analgésiques seront administrés afin de garantir le confort des animaux lors des interventions chirurgicales et des prélèvements sanguins. Un suivi rapproché sera effectué après chaque chirurgie, avec une surveillance accrue en fonction des signes cliniques observés. Pour limiter le stress, les animaux seront maintenus en groupes sociaux. Les interventions chirurgicales seront réalisées par un professionnel formé à la chirurgie sur rongeurs, avec du matériel stérile et sous conditions optimales. Après la chirurgie, les animaux seront placés en armoire chauffante pour favoriser leur réveil.
Choix des espèces
La souris, grâce à sa similarité génétique et physiologique avec l’homme, est un modèle idéal pour étudier la réponse immunitaire allogénique. Notre projet utilise diverses lignées de souris génétiquement modifiées et de fonds génétiques variés pour simuler différents types de rejets, qu’ils soient allogéniques ou innés : 1. Souris receveuses et donneuses sans système adaptatif (immunité innée seule) pour étudier les monocytes : BRG (receveuses et donneuses contrôles), NSG (donneuses uniquement, SIRPA mismatch). 2. Souris receveuses sans système adaptatif pour l’étude des NK : Rag. 3. Souris donneuses de greffons pour l’études des NK: C57BL/6 (contrôle), B2MKO (absence de MHC-I, « missing-self »). 4. Pour les greffons exprimant l’antigène OVA : B6-OVA, B2MKO-OVA. 5. Pour les donneuses de cellules T spécifiques d’OVA : Rag OTII. Ces souches permettent une analyse précise des mécanismes de rejet de greffe. Des souris âgées de plus de 8 semaines seront utilisées (age de la maturité sexuelle) Age maximum 12 mois en fin de procédure.
Inhibition de la calcification vasculaire par la Canagliflozine
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
64 rats mâles vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une chirurgie de trente minutes réduit leur fonction rénale, puis un régime enrichi en phosphate et en vitamine D calcifie leurs artères, les traitements étant incorporés à la nourriture cinq jours sur sept pendant quatre semaines. L'incision ventrale est décrite comme une nuisance sévère avec mobilité réduite pendant vingt-quatre heures, suivie d'une perte de poids d'environ 10 %. Le porteur affirme que le modèle animal est "indispensable" et que l'interaction entre rein, cœur, vaisseaux et cerveau est "nécessaire", tout en indiquant que des résultats prometteurs sur la molécule ont déjà été obtenus sur des artères de souris et de patients cultivées hors de l'organisme.
Objectifs
Environ 850 millions de personnes sont atteintes d'insuffisance rénale chronique dans le monde (≈ 11 % de la population). La mortalité due à cette maladie augmente et devrait devenir la 5ème cause mondiale de décès d'ici 2040. Cela est en partie dû à une augmentation de la calcification vasculaire chez les patients. La calcification vasculaire est définie par l’accumulation de cristaux de phosphate de calcium dans les vaisseaux sanguins, ce qui les rend rigides, augmente la pression artérielle et fatigue le cœur. On manque encore de thérapies pour lutter contre la calcification vasculaire. Une nouvelle classe de médicaments, les gliflozines, a été utilisée pour lutter contre le diabète de type 2 ces dernières années. Il a été montré qu’en plus de leur action anti-diabète, ces composés induisent une protection des vaisseaux sanguins. Des résultats préliminaires suggèrent qu’une des gliflozines en particulier pourrait permettre de lutter contre la calcification vasculaire. Le projet a pour but de valider le potentiel thérapeutique de ce composé d’intérêt dans un modèle mimant fidèlement la maladie humaine : le rat avec réduction de fonction rénale et calcification vasculaire induite par un régime riche en phosphate et vitamine D. Ce modèle présente une hypertension artérielle et des atteintes cardiaques qui permettront d’évaluer la protection cardiovasculaire procurée par le composé. Le mode d’action du composé sera étudié en détail. On vérifiera également que ce composé agit en présence du principal médicament déjà utilisé chez les patients atteints d’insuffisance rénale.
Bénéfices attendus
Le bénéfice principal du projet est de démontrer à court terme que la molécule d’intérêt étudiée peut permettre le traitement des patients insuffisant rénaux présentant une calcification vasculaire. Les résultats doivent venir valider et approfondir ceux précédemment obtenus dans des modèles in vitro. Le mécanisme d’action du composé étudié est encore mal compris et il semble posséder des cibles non-identifiées. Explorer ces voies d’action alternatives dans un modèle proche de la maladie humaine permettra d’approfondir notre compréhension de l’action de ces composés. Le projet inclus un groupe traité avec un médicament déjà très couramment utilisé chez les patients pour être au plus proche des « conditions cliniques » et avoir de plus grandes chances que les résultats obtenus chez les rats puissent être reproduits chez l’humain. De plus, nous utiliserons une stratégie unique, basée sur l’analyse de certaines protéines urinaires similairement modifiées dans le modèle animal et chez les patients (dit marqueurs « humanisés »), pour mieux déterminer si le traitement peut fonctionner chez les patients.
Procédures
Les animaux seront soumis à une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse. La chirurgie dure environ 30 minutes et a pour but de réduire la fonction rénale pour mimer l'insuffisance rénale chronique humaine. Des analgésiques puissants seront utilisés pendant la chirurgie et la couverture analgésique sera maintenue pendant la période post-opératoire (48h minimum). Un prélèvement de sang aura lieu au cours du projet, 8 semaines après le début du protocole et avant les traitements. Ce prélèvement (0,5 ml) sera effectué à la veine de la queue suite à l’anesthésie gazeuse des animaux. La fonction rénale des animaux sera évaluée à la fin du projet à l’aide d’un dispositif miniature. Ce dernier permet de mesurer à travers la peau l’élimination par le rein d’une substance fluorescente injectée en intraveineux sous anesthésie gazeuse. Les mesures sont effectuées pendant 2h sur les rats éveillés, libres de leur mouvement. Les traitements seront administrés 5 jours sur 7 pendant 4 semaines dans la nourriture des animaux (boulettes contenant les produits à tester). L’induction de la calcification vasculaire sera aussi effectuée lors de cette étape par une supplémentation en vitamine D. Les rats sont placés dans des cages individuelles en présence de la boulette de nourriture (contenant la vitamine D et les traitements) et remis en groupe une fois qu’ils l’ont mangée (évite les gavages). A la fin du protocole, la pression artérielle des rats sera mesurée sous anesthésie générale gazeuse et couverture analgésie. Cette partie de la procédure est sans réveil et les rats anesthésiés seront ensuite euthanasiés chimiquement.
Impact sur les animaux
La chirurgie sur le rein peut induire de la douleur pour les animaux. L’incision ventrale lors de la chirurgie induit une nuisance sévère et une mobilité réduite des rats pendant 24h. Dans les jours suivants la chirurgie une perte de poids (environ 10 %) transitoire peut être observée (nuisance modérée). Un prélèvement de sang, effectué sur des rats anesthésiés, peut entrainer un léger stress. De même, lors de la mesure des fonctions rénales, l’injection intraveineuse d’un produit fluorescent sur les animaux anesthésiés représente une nuisance légère. L'utilisation de phosphate et de vitamine D peut arrêter la prise de poids chez les animaux ayant les plus faibles fonctions rénales (stress léger).
Devenir
les rats anesthésiés seront mis à mort pour prélèvement des organes
Remplacement
Le modèle animal est indispensable à cette étude pour induire une insuffisance rénale chronique et la calcification vasculaire qui est observée chez les patients. L'interaction entre différents organes (rein, cœur, vaisseaux sanguins, cerveau …) est nécessaire afin de représenter la maladie humaine. L’effet principal de la calcification vasculaire est l’augmentation de la pression artérielle qui va induire des atteintes cardiaques et rénales. Les artères sont soumises au flux sanguin les exposant à des composés toxiques lors de l’insuffisance rénale chronique et la calcification vasculaire s’accompagne d’un changement de la structure des artères. Cette situation ne peut être reproduite de façon réaliste que chez l’animal. Des résultats prometteurs concernant la molécule d’intérêt comme inhibiteur de la calcification vasculaire ont été obtenus dans plusieurs modèles in vitro et ex vivo (culture d'explants provenant d'artères de souris et de patients). Les expériences chez l’animal seront aussi complétées par des analyses sur culture cellulaire afin de mieux comprendre et décrire l’action de la molécule d’intérêt.
Réduction
Le nombre minimal d’animaux par groupe a été déterminé en prenant en compte la variance que l’on s’attend à observer lors de la mesure de la calcification vasculaire dans le modèle. Ce nombre doit nous permettre de mettre en évidence une différence statistique si l’effet protecteur du composé testé se confirme. Si une faible mortalité est observée au cours du projet, le nombre total d’animaux utilisés sera revu à la baisse. Il a été choisi de focaliser l’étude uniquement sur les rats mâles car le modèle est beaucoup mieux décrit chez ce sexe, alors que la femelle présente une résistance à l’insuffisance rénale et à la calcification vasculaire, suite à l’action des hormones féminines. Inclure les deux sexes dès le départ du projet aurait nécessité d’utiliser un plus grand nombre d’animaux. Les possibilités de transposer les résultats obtenus à l’humain seront maximisés grâce à la présence d’un groupe traité avec la thérapie classique utilisée en clinique et l’études de protéines urinaires communes au rat et à l’humain. De nombreuses données seront obtenues comme la mesure des fonctions rénales et l’analyse de protéines sanguines et urinaires à plusieurs moments de l’expérience. Le test de 5 groupes en parallèle permet d’éviter de devoir répéter les groupes non traités plusieurs fois. De nombreux tissus seront prélevés chez les animaux et utilisés dans le cadre de différents projets dans notre équipe et avec des équipes partenaires (rein, cœur, sang, artères, urine et fèces, muscles du mollet, tibias, cerveau, foie et gras). Au total, le projet nécessitera 64 rats au maximum.
Raffinement
La chirurgie de réduction de masse rénale est réalisée sous anesthésie générale gazeuse en une seule étape, ce qui évite d’avoir à opérer 2 fois les animaux (autre technique souvent utilisée). L’utilisation d’analgésiques puissants lors de la chirurgie et pendant 48h suite à l’opération permet de limiter le plus possible la douleur induite par cette procédure. Lors de cette étape et durant tout le projet, les effets indésirables sur le bien-être des animaux seront surveillés par l’utilisation d’une grille de score et la mise en place de points limites adaptés. Les instruments sont stérilisés entre chaque opération pour éviter les infections. Un protecteur oculaire (gel) sera utilisé pour prévenir la sécheresse des yeux des rats pendant la chirurgie. Les rats sont placés en cage individuelle brièvementt suite à la chirurgie afin de mieux les surveiller et favoriser leur récupération. Les animaux seront surveillés quotidiennement (activité, cicatrisation) pendant la semaine post-opération et de la nourriture hydratée sera placée dans le fond des cages afin de favoriser leur prise alimentaire. Les traitements seront incorporés dans la nourriture (après entrainement d’une semaine) ce qui permet d’éviter le stress et les possibles lésions de la trachée induites par la réalisation quotidienne de gavage. Cela évite aussi l’utilisation de solvants nécessaires à la dissolution de certains composés testés et pouvant présenter une toxicité.
Choix des espèces
Le rat est un animal dont la fonction rénale et les pathologies associées sont très proches de celles de l’humain. Par rapport à la souris, le rat permet de mieux mimer l’insuffisance rénale humaine et d’étudier des modifications cardiovasculaires de par sa plus grande taille. Le modèle chez le rat est bien connu, de nombreuses données sont disponibles ainsi que de nombreux outils pour analyser les tissus chez cette espèce. Les rats sont réceptionnés à l'âge de 7 semaines (200-225g) et leur fonction rénale est réduite à l’âge de 8 semaines. A cet âge les animaux viennent d’atteindre leur maturité sexuelle (stade jeune adulte). La réduction de fonction rénale à ce stade « jeune » permet d’obtenir une insuffisance rénale qui mime bien la maladie humaine. Les rats suivront ensuite des traitements en même temps que l’induction de la calcification entre leur 16ème et 20ème semaine de vie (stade adulte). Agés de 16 semaines après la chirurgie de réduction de masse rénale réalisée à 8 semaines, les rats présentent une pathologie bien installée et qui devrait être reproductible entre les animaux.
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Une biopsie d'oreille à l'emporte-pièce, l'amputation de l'extrémité de la queue ou un prélèvement de sang sur animal éveillé : 9 600 souris vont subir ces gestes de génotypage dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Ces gestes ne produisent aucune donnée expérimentale par eux-mêmes, ils servent à connaître les caractéristiques génétiques des lignées transgéniques entretenues par l'établissement pour ses équipes de recherche. Le porteur compare la douleur provoquée à celle d'une injection avec une aiguille. Les souris dont le génotype se révèle sans intérêt sont mises à mort, les autres restant en vie comme géniteurs ou pour être engagées dans des expériences ultérieures.
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste dans le cadre de l’élevage de lignées transgéniques murines présentes dans notre structure à prélever du tissu sur les animaux pour réaliser le génotypage (connaissance des modifications génétiques effectuées dans le matériel génétique de la souris) afin de connaître les caractéristiques génétiques propres à chaque souris
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes. La caractérisation des profils génétiques individuels est indispensable pour constituer les lots d’animaux utilisés dans le cadre des activités de recherche
Procédures
Le prélèvement de tissu à l’oreille est réalisé sur animal vigile avec un emporte-pièce en métal permettant un geste précis et une taille standardisée de prélèvement (durée du geste inférieure à 30 sec). Lorsque l’intégrité des pavillons des oreilles est requise, le prélèvement de tissu se fait par le prélèvement de l’extrémité de la queue de la souris vigile (durée du geste inférieure à 2 sec). Lorsque le génotypage doit être réalisé sur le sang, un prélèvement de sang unique est réalisé sur souris vigile (durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Les différents gestes techniques de prélèvements de tissus (biopsies d’oreille ou de queue et prélèvement sanguin) peuvent provoquer une douleur légère et temporaire au moment de l’acte, équivalente à celle d’une injection avec une aiguille.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, ou bien en raison d’un génotype sans intéret Les animaux gardés en vie ont été produits pour une utilisation continue en expérimentation ou bien en géniteur pour le maintien des lignées.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de bases de données (études in silico) et des modèles in-vitro (culture de cellules, organoïdes…). Les informations et réponses obtenues doivent parfois être complétées ou validées par des études sur des organismes intégrés qui permettent d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Une optimisation des schémas d’accouplement permet de produire un maximum d’animaux d’intérêt. Par ailleurs, la production des animaux est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Dans le cas où le génotype des parents est transmis à l’identique, les descendants ne sont plus génotypés de manière systématique, il n’est donc pas nécessaire de prélever de fragment de tissu. De même dans le cas où un seul sexe est utilisé pour les besoins expérimentaux, les animaux de l’autre sexe ne seront pas prélevés en vue de génotypage. D’autres méthodes de génotypage sont développés tels que le recours à la lampe UV pour les animaux ayant un gène fluorescent .
Raffinement
Le prélèvement de tissus est réalisé à l’aide d’instruments dédiés. Ce geste rapide et précis est réalisé par du personnel formé dont la compétence est validée par la SBEA. Le prélèvement de sang est rapide et réalisé par du personnel validé par la SBEA (Structure du bien-être animal). Une pression avec un coton est effectuée pour stopper le saignement et empêcher l’apparition d’un hématome, l’arrêt du saignement est vérifié avant de remettre l’animal en cage.
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 6-8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée. De plus, le modèle murin est reconnu comme pertinent pour les thématiques de recherche de l’établissement. 3 à 4 semaines au moment du sevrage. A cet âge, les animaux sont capables de se nourrir seuls et peuvent donc être séparés de leur mère.
Rôle des peptides natriurétiques et leurs récepteurs dans le contrôle de la thermogenèse et du métabolisme énergétique EU 1/2.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système immunitaire
Transportées entre deux établissements utilisateurs selon une charte de transport, 4 200 souris vont être utilisées dans ce projet sur la production de chaleur par le tissu adipeux brun. 3 520 d'entre elles subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré, 440 un niveau léger et 240 un niveau sévère, aucune n'étant réutilisée et toutes étant tuées pour le prélèvement des dépôts adipeux, du foie, des muscles, du pancréas, du cœur et des reins. Elles sont gavées une fois par jour pendant une semaine, subissent jusqu'à trois séries de dix prélèvements sanguins en deux heures, des injections rétro-orbitaires, des chirurgies, un isolement pouvant durer cinq jours et des hébergements à 4 °C ou 30 °C, l'exposition aiguë au froid pouvant provoquer une hypothermie sévère. Le porteur indique disposer de lignées cellulaires capables de remplacer les animaux pour une partie des questions posées, et conclut que les échanges entre le cœur et le tissu adipeux brun rendent le modèle murin "nécessaire".
Objectifs
L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
Une forte prévalence (ou activité) du tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des gavages pendant une semaine, une fois par jour ; des injections ne durant que quelques secondes chacunes, des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive. Selon les procédures les animaux subiront 3 séquences (espacées d’au moins 1 semaine) de 10 prélèvements au maximum sur une durée de 2 heures. Certains seront aussi soumis à une chirurgie une fois au cours de leur vie, des hébergements au froid (4°C) ou à thermoneutralité (30°C), des isolements temporaires (maximum 5 jours) et une alimentation enrichie (lipides ou adénine) durant maximum 4 semaines consécutives. Dans le second établissement utilisateur : les animaux seront soumis à des injections ou des gavages ne durant que quelques secondes et des prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutive.
Impact sur les animaux
Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Une hypothermie modérée à sévère pourrait être observée lors de la procédure d’exposition aigue au froid. Cette procédure n°6 étant classée en sévère, nous porterons une attention renforcée au bien-être animal et nous évaluerons l’état général des animaux par une grille de score évaluant le degré de sévérité réel. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur, des expositions à 4°C ou 6°C, et des isolements pour des mesures des échanges gazeux (avec dérogation à l'hébergement). Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Inconfort lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. Certains groupes subiront un gavage de glucose unique lors de tests in vivo (à 2 semaines d’intervalle). - Stress de jeûne limité à 2h avant les tests in vivo pour normaliser la glycémie. - Inconfort et douleur liés à l'injection d'insuline (une fois, durée max 15s). - Inconfort et douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémités de la queue (tests in vivo). - Isolement des souris pour la mesure d’échanges gazeux (5 jours) avec surveillance accrue lors du retour en cages d’origines pour détecter d'éventuelles bagarres. - Injections rétro-orbitaires sous anesthésie gazeuse, potentiellement douloureuses, effectuées une fois avec anesthésique local. - Les chirurgies, sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale, peuvent causer inconfort, douleur et rarement la mortalité (inférieure à 10%). Utilisation de tapis chauffants maintenant la température des animaux. - Les expositions au froid, jusqu'à 5 heures, peuvent causer inconfort et douleur, avec contrôle de la température pour prévenir l'atteinte des points limites. Prise en charge immédiate des animaux atteignant ces points limites pour rétablir leurs constantes physiologiques.
Devenir
Ceci est indiqué pour chaque procédure expérimentale. Les animaux seront nécropsiés en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation chronique thermique par exemple ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, la plupart du temps entre 2 et 6 mois d'âge (sauf pour les cohortes vieillissement entre 12 et 24 mois), ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépots adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.
Remplacement
Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogénèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.
Réduction
En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 20 animaux contrôles (mâles et femelles) et 20 animaux génétiquement modifiés (mâles et femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ».
Raffinement
Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souriceaux mâles seront uniquement regroupés au moment du sevrage. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuie-mains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception de leur utilisation aiguë dans certaines procédures de ce projet, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. Les classes de gravité des procédures utilisées dans le projet sont modérées à sévères et ne sont pas répertoriées comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Dans le cas des procédures sévères une surveillance accrue sera opérée par les manipulateurs ou les zootechniciens et des actions d'enrichissement, par exemple, seront réalisées. Lors des procédures où la température d'hébergment est modifiée (4°C ou 30°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).
Choix des espèces
L’espèce Mus musculus (souris), mammifère proche d’Homo sapiens, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de divers régimes alimentaires et températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogénèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris seront étudiées à partir de l’âge de 7 semaines. Des analyses de suivi seront également effectuées sur un groupe d’animaux de nos différentes lignées allant jusqu’à 24 mois, ceci dans le but de déterminer sur le plus long terme les effets sur le développement du tissu adipeux brun et la physiologie de l’organisme de « nos » protéines d’intérêt de la thermogénèse.
Etude par imagerie de l’épilepsie
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
138 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir jusqu'à six séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie gazeuse et quinze tests comportementaux. 75 d'entre elles reçoivent un composé qui déclenche une épilepsie, les 63 autres formant le groupe témoin. Les crises attendues sont focales et non convulsives, les souris cessant leur activité en cours, et les tests mesurent l'activité motrice, la dépression et l'anxiété. Toutes sont tuées à la fin pour prélever leurs organes et corréler l'imagerie aux analyses immunohistochimiques.
Objectifs
L'épilepsie, une maladie neurologique fréquente touchant environ 1% de la population et générant 100 nouveaux cas annuels pour 100 000 habitants, demeure une condition potentiellement sérieuse dont les mécanismes moléculaires et cellulaires restent encore mal compris. De fait, les traitements médicamenteux actuels se limitent principalement à des approches symptomatiques. Notre démarche vise à approfondir notre compréhension de l'épilepsie tout en identifiant de nouvelles voies thérapeutiques potentielles, en mettant particulièrement l'accent sur l'étude des mécanismes cellulaires et moléculaires cérébraux. L’imagerie fonctionnelle se présente comme un outil puissant pour explorer in vivo divers mécanismes cérébraux. Ainsi, la tomographie par émission de positons (TEP), largement utilisée en médecine nucléaire, permet de suivre au cours du temps différents paramètres dans les différentes régions du cerveau. Dans le cas de l’épilepsie, la TEP est particulièrement intéressante pour observer : • Le métabolisme des cellules du cerveau, un indicateur de leur activité ; • La concentration en synapses, ces zones de transmission d’information entre neurones ; • L’intégrité de la barrière hémato-encéphalique, la barrière naturelle qui protège le cerveau. Le choix du radiotraceur varie en fonction du paramètre que l’on souhaite suivre. L'objectif de ce travail consiste à appliquer cette méthode d'imagerie, déjà développée et appliquée dans notre laboratoire, y compris chez l'Homme, à un modèle rongeur d'épilepsie bien caractérisé. Cette approche permettra d'identifier les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie neurologique, ouvrant ainsi la voie à de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques. De plus, nous réaliserons des tests de comportement afin de corréler les données de l’imagerie à des symptômes cliniques. Les tests de comportement, tels que l'évaluation de l'anxiété, de la dépression et de l’activité motrice, sont essentiels pour comprendre les comorbidités neurocomportementales de l’épilepsie. Ils permettent de mesurer l'impact des crises sur le comportement et de développer des interventions thérapeutiques adaptées.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à élucider les mécanismes physiopathologiques à l'origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans l'épilepsie, en établissant une corrélation entre ces dysfonctionnements et les comportements manifestés par les animaux. De plus, cette approche permettra d'identifier la méthode d'imagerie la plus pertinente pour une poursuite du développement chez l'homme. À terme, cette étude ouvrira la voie à l'exploration in vivo de ces mécanismes chez des patients atteints d'épilepsie, avec l'objectif de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. Cette approche pourrait ainsi contribuer à l'avancement des traitements et à l'amélioration de la qualité de vie des personnes touchées par ces pathologies.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : - Administration (75 animaux, durée 25 minutes) d’un composé induisant une épilepsie pour le groupe épilepsie tandis que le groupe témoin (63 animaux, durée 25 minutes) ne recevra pas de composé induit une épilepsie. - Réalisation de sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum, 6 imageries maximales par animal) - Injection d’un radiotraceur (1 minute) - Les rongeurs seront soumis à plusieurs tests comportementaux afin de mesurer 1) l'activité motrice (durée du test = 10 minutes, 15 tests comportementaux maximales par animal), 2) la dépression (test de 6 minutes) et 3) l’anxiété (test de 5 minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux : - des crises épileptiques principalement focales et non convulsives (les souris cessent leur activité en cours) ; - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des analyses immunohistochimique permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Ce projet a pour objectif d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans l’épilepsie et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Les études in vivo sont essentielles pour comprendre pleinement les mécanismes d’un dysfonctionnement cérébral. Les modèles animaux permettent d'observer les effets des interventions dans un organisme entier, incluant la distribution, le métabolisme, et l'élimination des composés, ainsi que les interactions avec divers systèmes biologiques. Il n’existe pour l’instant pas de méthode alternative capable de faire ces observations.
Réduction
Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum), ce qui permet de limiter le nombre d’animaux. De plus, le nombre d'animaux par groupe a été déterminé pour qu’il soit le plus petit possible tout en ne compromettant pas une analyse statistique fiable des résultats.
Raffinement
Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergées par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, des bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Deux semaines d’acclimatation sont prévues après la livraison et avant de débuter le protocole. Un suivi régulier permettra de repérer une éventuelle souffrance animale et de prendre en charge l’animal concerné dans les plus brefs délais. Les animaux feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Des analgésiques seront également administrés avant et après la chirurgie. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale.
Choix des espèces
Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections neurologique. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP ainsi qu’à l’étude comportementale. Plus particulièrement : - les rongeurs sont particulièrement appropriés pour ce type d'étude en raison de leur taille, de leur facilité d'hébergement et de manipulation ; - il existe de nombreux tests comportementaux standardisés chez les rongeurs pour mesurer les comportements dépressifs et anxieux. Ces tests permettent de corréler efficacement les données d'imagerie avec les symptômes cliniques observés dans l'épilepsie, offrant ainsi une compréhension plus complète des mécanismes physiopathologiques et des comorbidités comportementales associées à cette maladie. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).
Prélèvements invasifs en routine pour la caractérisation génétique de souris génétiquement altérées
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Cancers
- Troubles gastrointestinaux
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système urogénital
Prélever un fragment d'oreille, un bout de queue ou du sang pour lire le patrimoine génétique de chaque animal : la finalité de ce projet est l'intendance d'un élevage de lignées transgéniques. 88 800 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les prélèvements se font sur animal vigile, à l'emporte-pièce métallique pour l'oreille, en moins de trente secondes. Une partie des souris est tuée pour analyses post-mortem ou parce que son génotype ne présente pas d'intérêt, les autres restent en vie pour d'autres expériences ou comme géniteurs, et le porteur qualifie ces lignées de modèles "indispensables".
Objectifs
Pour comprendre les maladies humaines et développer des traitements efficaces, les chercheurs utilisent des technologies de plus en plus performantes. Les études des processus biologiques sont ainsi effectuées grâce à l’utilisation de banques de données, de culture de cellules voire de culture de tissus in-vitro. En revanche, seul un organisme intégré permet aujourd’hui d’étudier et de comprendre les interactions entre cellules, tissus et organes. La souris est un modèle de choix pour l’étude de mécanismes biologiques au cours de processus physiologiques ou pathologiques tels que les cancers. Notre projet consiste dans le cadre de l’élevage de lignées transgéniques murines présentes dans notre structure à prélever du tissu sur les animaux pour réaliser le génotypage (connaissance des modifications génétiques effectuées dans le matériel génétique de la souris) afin de connaître les caractéristiques génétiques propres à chaque souris
Bénéfices attendus
Les souris transgéniques sont des modèles indispensables pour l’étude de la fonction et de la régulation de gènes au cours de processus biologiques physiologiques (développement embryonnaire, maintien de l’homéostasie tissulaire) et pathologiques (cancers, maladies immunitaires, maladies neurologiques…). Ces modèles sont aussi utilisés par la communauté scientifique pour le développement de thérapies innovantes. La caractérisation des profils génétiques individuels est indispensable pour constituer les lots d’animaux utilisés dans le cadre des activités de recherche
Procédures
Le prélèvement de tissu à l’oreille est réalisé sur animal vigile avec un emporte-pièce en métal permettant un geste précis et une taille standardisée de prélèvement (durée du geste inférieure à 30 sec). Lorsque l’intégrité des pavillons des oreilles est requise, le prélèvement de tissu se fait par le prélèvement de l’extrémité de la queue de la souris vigile (durée du geste inférieure à 2 sec). Lorsque le génotypage doit être réalisé sur le sang, un prélèvement de sang unique est réalisé sur souris vigile (durée du geste inférieure à 10 sec).
Impact sur les animaux
Les différents gestes techniques de prélèvements de tissus (biopsies d’oreille ou de queue et prélèvement sanguin) peuvent provoquer une douleur légère et temporaire au moment de l’acte, équivalente à celle d’une injection avec une aiguille.
Devenir
Les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem, ou bien en raison d’un génotype sans intéret Les animaux gardés en vie ont été produits pour une utilisation continue en expérimentation ou bien en géniteur pour le maintien des lignées.
Remplacement
Les chercheurs effectuent un travail préliminaire grâce à l’utilisation de bases de données (études in silico) et des modèles in-vitro (culture de cellules, organoïdes…). Les informations et réponses obtenues doivent parfois être complétées ou validées par des études sur des organismes intégrés qui permettent d’étudier et de comprendre les interactions entre les cellules dans les tissus et organes. Le recours à l’animal est justifié pour chacune des lignées utilisées (développement des projets des équipes de recherche)
Réduction
Une optimisation des schémas d’accouplement permet de produire un maximum d’animaux d’intérêt. Par ailleurs, la production des animaux est basée sur les besoins expérimentaux établis de façon statistique. Dans le cas où le génotype des parents est transmis à l’identique, les descendants ne sont plus génotypés de manière systématique, il n’est donc pas nécessaire de prélever de fragment de tissu. De même dans le cas où un seul sexe est utilisé pour les besoins expérimentaux, les animaux de l’autre sexe ne seront pas prélevés en vue de génotypage. D’autres méthodes de génotypage sont développés tels que le recours à la lampe UV pour les animaux ayant un gène fluorescent .
Raffinement
Le prélèvement de tissus est réalisé à l’aide d’instruments dédiés. Ce geste rapide et précis est réalisé par du personnel formé dont la compétence est validée par la SBEA. Le prélèvement de sang est rapide et réalisé par du personnel validé par la SBEA (Structure du bien-être animal). Une pression avec un coton est effectuée pour stopper le saignement et empêcher l’apparition d’un hématome, l’arrêt du saignement est vérifié avant de remettre l’animal en cage .
Choix des espèces
La souris est un excellent modèle pour réaliser des modèles génétiquement modifiés pour plusieurs raisons - il s’agit d’un mammifère avec un génome proche de celui de l’humain (99%) - reproduction rapide : 3 semaines de gestation puis les animaux sont matures sexuellement à 6-8 semaines - taille des portées conséquente : (entre 6 et 10 petits) - manipulation génétique aisée. De plus, le modèle murin est reconnu comme pertinent pour les thématiques de recherche de l’établissement. 3 à 4 semaines au moment du sevrage. A cet âge, les animaux sont capables de se nourrir seuls et peuvent donc être séparés de leur mère.