Multisystémique

Deux injections par jour, cinq jours par semaine, six semaines de suite: chaque souris de ce protocole reçoit une soixantaine d'injections destinées à lui faire développer une sclérodermie. 496 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir quels macrophages entretiennent la fibrose et à tester des vésicules issues de cellules stromales, une piste jamais essayée dans cette maladie. Le modèle a été retenu parce que la sclérodermie se déclenche chez 100 % des souris qui y sont soumises, et le porteur décrit les blessures cutanées obtenues comme réversibles à l'arrêt des injections.

Objectifs

La sclérodermie systémique (SSc) est une maladie rare où le corps attaque ses propres organes, comme la peau, les poumons et le cœur. Cela cause une cicatrisation excessive (fibrose), des problèmes de vaisseaux sanguins et un mauvais fonctionnement des défenses du corps (le système immunitaire). Même si des progrès ont été fait, on ne comprend pas encore bien ce qui déclenche ces problèmes ni pourquoi ils persistent. Les macrophages, qui sont des cellules du corps jouant un rôle important pour se défendre et réparer les tissus, semblent très impliqués dans cette maladie. Il existe plusieurs types de macrophages : certains vivent déjà dans les tissus (on les appelle "résidents"), et d'autres viennent du sang pour aider quand il y a un problème (on les appelle "recrutés"). On ne sait pas encore bien lequel de ces types de macrophages est le plus impliqué dans la maladie. Aujourd'hui, les traitements pour la sclérodermie ne sont pas très efficaces. Mais il existe des cellules appelées "cellules stromales mésenchymateuses" (CSM), qui produisent des vésicules contenant des substances utiles (elles sont appelées "vésicules extracellulaires" ou VE). Ces vésicules pourraient peut-être aider à réparer les macrophages et à réduire les cicatrices et l'inflammation, mais cela n'a pas encore été testé dans cette maladie. Notre projet a donc pour objectif : 1. De mieux comprendre les différents types de macrophages dans les organes touchés par la sclérodermie. 2. De savoir si ce sont les macrophages "résidents" ou "recrutés" qui jouent un rôle plus important dans la maladie. 3. De tester si les vésicules des CSM peuvent aider à réparer les macrophages malades. 4. Et de rendre ces vésicules encore plus efficaces pour traiter la maladie. Pour cela, nous allons utiliser un modèle de souris qui imite la sclérodermie humaine. Ce modèle nous permettra d’étudier les phases de la maladie, comme l’inflammation et la cicatrisation, et de tester les effets des vésicules sur les macrophages. Nous espérons ainsi mieux comprendre cette maladie et développer un traitement plus ciblé et efficace.

Bénéfices attendus

Ce projet pourrait apporter plusieurs bénéfices importants : 1. Mieux comprendre la maladie : La sclérodermie systémique est une maladie rare et grave dont on connaît encore mal les causes. Cette étude pourrait nous aider à mieux comprendre pourquoi elle apparaît et comment elle évolue. 2. Trouver un traitement : Actuellement, il n'existe pas de traitement efficace pour cette maladie, qui est mortelle. Ce projet pourrait permettre de développer un médicament capable d’aider les personnes atteintes à vivre mieux et plus longtemps. 3. Améliorer les connaissances scientifiques : En étudiant les macrophages et en utilisant des vésicules extracellulaires, les chercheurs pourraient découvrir une nouvelle façon de soigner non seulement cette maladie, mais peut-être aussi d’autres maladies.

Procédures

Pour mener ce projet, nous utilisons des souris afin d'étudier la maladie. Voici comment cela fonctionne : 1. Créer la maladie chez l'animal : Les souris vigiles reçoivent deux injections par jour, 5 jours par semaine pendant 6 semaines, cette injection dure 30 secondes. Cela permet de reproduire les symptômes de la sclérodermie pour les étudier. 2. Suivre les macrophages : Pour voir comment les macrophages se comportent, on injecte une molécule qui les rendent fluorescents. Cette injection d’une durée de 10 secondes est répétée à 3 reprises sur la souris vigile, elle permet de suivre les macrophages et de mieux comprendre leur rôle. 3. Tester le traitement : Une fois les vésicules extracellulaires prêtes, elles sont injectées dans la souris, cette injection unique est réalisé sur la souris vigile et dure 10sec. Cela permet de voir si le traitement peut réduire les symptômes de la maladie.

Impact sur les animaux

Pour réaliser cette étude, les souris reçoivent des injections permettant de reproduire la maladie. Voici comment cela se passe : 1. Injections rapides : Les souris sont contentionnées pour les injections, qui durent 30 secondes. Ces injections peuvent causer une douleur légère à modérée d’environ 1min, les souris ne montrent plus de signes d’inconfort après s’être habituées aux manipulations quotidiennes. 2. Effets sur la peau : Le modèle peut parfois provoquer des petites blessures sur la peau, mais celles-ci s’améliorent lorsque les injections sont arrêtées ou après avoir reçu le traitement. Si des blessures apparaissent et ne guérissent pas spontanément, les injections sont suspendues pour laisser le temps à la peau de cicatriser. Ces précautions permettent de limiter la douleur et d’assurer le bien-être des souris tout au long de l’étude. Cela est important pour obtenir des résultats fiables tout en respectant les animaux utilisés.

Devenir

À la fin de l’étude, toutes les souris seront euthanasiées. Cela est nécessaire pour permettre de récupérer les organes et d’analyser les effets du modèle expérimental et des traitements testés.

Remplacement

À ce jour, il n'existe aucune alternative non animale permettant d’étudier de manière complète l’origine et le rôle des macrophages dans les tissus malades. Également, avant de proposer un traitement pour les humains, il est crucial de prouver que les vésicules extracellulaires sont à la fois efficaces et sûres en utilisant un modèle pré-clinique qui ressemble le plus possible à la réalité. Bien que des tests en laboratoire (modèles in vitro) soient effectués en amont, ces tests ne suffisent pas à évaluer correctement l’efficacité des traitements dans un organisme vivant, où la situation est beaucoup plus complexe. En effet, les modèles in vitro actuels ne parviennent pas encore à recréer fidèlement les interactions complexes entre les organes et les systèmes biologiques d’un organisme vivant.

Réduction

Nous avons utilisé les résultats d'expériences précédentes menées au laboratoire et avons calculé que l'inclusion de 16 souris par groupe expérimental est suffisante pour obtenir des résultats fiables et significatifs tout en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés. Ce nombre de souris nous permet d’avoir confiance dans les résultats obtenus avec notre traitement pour le proposer par la suite chez les patients.

Raffinement

Les souris sont examinées quotidiennement pour détecter d’éventuelles lésions cutanées et s’assurer qu’il n’y a pas d’infections. On cherche aussi des signes de douleur ou de souffrance, en utilisant des méthodes validées d’évaluation de la douleur. Par exemple en surveillant la perte de poids ou les changements dans leur comportement. Si les lésions cutanées ne guérissent pas, les injections seront arrêtées jusqu'à ce que la cicatrisation soit complète, et des médicaments contre la douleur seront administrés pour soulager les animaux. En cas de perte de poids, les injections seront arrêtées et de la nourriture enrichie sera donnée.

Choix des espèces

Le modèle de souris utilisé pour la sclérodermie systémique a été choisi parce qu'il reproduit de manière très fidèle les caractéristiques de la maladie observées chez l’être humain et est largement reconnu comme une référence pour étudier cette pathologie. Les souris utilisées dans l’étude ont entre 8 et 12 semaines, c'est-à-dire qu'elles ont atteint leur maturité sexuelle. Les tests de mise en place du modèle ont montré que la sclérodermie se développe chez 100 % des animaux utilisés.

2 500 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant recevoir jusqu'à trente injections espacées de huit heures et subir dix micro-prélèvements de sang après section de la pointe de la queue. Toutes sont tuées en fin de procédure pour le recueil des échantillons. L'objet est de vérifier l'innocuité de composés en développement, le porteur estimant que 200 composés seront testés en cinq ans sur ces 2 500 souris. Il indique que ces candidats-médicaments peuvent induire une mort cellulaire, la défaillance d'un ou plusieurs organes et des douleurs locales ou systémiques, tout en présentant l'opération comme un moyen de définir une posologie ne portant pas atteinte au bien-être des animaux non-humains.

Objectifs

Dans le cadre du développement de nouveaux médicaments ou de nouveaux outils pharmacologiques, il est nécessaire d’étudier l’activité pharmacologique de la substance active chez l’animal. Avant ces études pharmacologiques, il est indispensable d’évaluer l’innocuité des produits pharmacologiques (sondes…) et candidats-médicaments en cours de développement dans le but d’identifier les effets indésirables liés à l’administration de ces composés. Cette étape clé doit permettre de mettre en évidence toutes atteintes au bien-être animal et de définir les conditions d’utilisation optimale des composés avant leur utilisation future dans des modèles complexes chez la souris. Cette étape permet aussi d’éliminer les composés présentant une toxicité incompatible avec l’utilisation souhaitée.

Bénéfices attendus

La mesure de l’innocuité des composés permettra d’éliminer les plus toxiques et de définir les conditions d’utilisation les plus adaptées et notamment une posologie (voie, dose et fréquence d’administration) ne portant pas atteint au bien-être des animaux. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament ou un outil pharmacologique efficace et sûr.

Procédures

Les animaux vigiles seront soumis à des injections (quelques secondes) pour l'administrer les composés étudiés. Les composés étudiés seront administrés 1 à 30 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et certaines administrations. Afin de suivre la concentration sanguine du composé et/ou contrôler les constantes biologiques et les biomarqueurs au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une période minimale de 72h. Un prelèvement de sang terminal sera effectué sous anesthésie.

Impact sur les animaux

La manipulation et la contention des animaux entrainent un stress léger et de courte durée. Les injections entraînent une douleur légère de courte durée et peuvent être répétée durant 30 jours consécutifs. La section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre des prélèvements sanguins de qualité, rapidement et sans contention entraine également une douleur légère de courte durée. Les candidats médicaments testés sont susceptibles d’exprimer leur activité biologique et tout autre effets indésirables. Ils sont susceptibles de perturber les fonctions biologiques, d’induire une mort cellulaire, d’entrainer la défaillance d’un ou plusieurs organes, de provoquer des douleurs locales ou systémiques se traduisant par une modification du comportement des animaux.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments et les produits pharmacologiques auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire l’innocuité d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire les fonctions mécaniques vitales et l’ensemble des phénomènes biologiques nécessaire à la vie et impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les composés les plus prometteurs et éliminer les plus dangereux avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure permet la mise en évidence des effets indésirables dès 2 animaux par condition testée en l’absence d’analyses biologiques. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de suivre l’évolution des constantes biologiques. Pour ces analyses, 5 à 8 animaux par groupe permettent une analyse statistique efficace des résultats . D’après notre expérience antérieure et l’évolution des pratiques, nous estimons que l’innocuité de 200 composés sera mesurée sur une période de 5 ans pour un maximum de 2500 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification », d’un igloo, d’une roue, d’une balançoire et de bâtonnets à ronger. Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations et seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Un renforcement positif est mis en place après chaque administration par l’ajout de récompenses alimentaires dans la cage (« Mini-gâteries »). Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des composés. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort et/ou une perte ou absence de prise de poids significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La mesure de l’innocuité est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée dans le cadre du développement des candidats-médicaments et des produits pharmacologiques. De plus, certains composés sont très difficiles à synthétiser et la petite taille de la souris requiert beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’innocuité d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.

Deux gavages, jusqu'à onze injections et quatre séries de huit à neuf prélèvements de sang à la queue, après douze semaines de régime enrichi en lipides. 1 080 souris vont être utilisées dans ce second établissement du même projet, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur ramène pourtant l'ensemble à "des inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées". Toutes seront tuées puis nécropsiées pour analyser leur sang et plusieurs de leurs organes.

Objectifs

L’obésité est caractérisée par un excès de tissu adipeux et s’accompagne de complications métaboliques. L’excès de tissu adipeux est corrélé au degré d’insulino-résistance qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit au développement d’un diabète de type 2. Le tissu adipeux est un organe central du métabolisme par sa fonction de stockage des lipides. Il produit également de nombreux facteurs, dont des adipokines bénéfiques ou délétères vis-à-vis de l’action de l’insuline ; ces adipokines peuvent agir au sein même du tissu ou à distance dans l’organisme. Une meilleure connaissance des adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l’obésité. Nous avons mis en évidence chez l’Homme une nouvelle adipokine dont le niveau d’expression dans le tissu adipeux est faible chez des personnes atteintes de syndrome métabolique ou de diabète de type 2. Son taux sanguin est un déterminant négatif de la résistance à l’action de l’insuline. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de cette adipokine par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une insulino-résistance. Nous voulons tester si sa surexpression dans le tissu adipeux peut permettre de retarder, voire d’empêcher, le développement d’une résistance à l’action de l’insuline induite par l’obésité. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’apport de nouvelles connaissances sur les acteurs de la sensibilité à l’insuline, dans un contexte de prise de poids et de dégradation de la signalisation insulinique. La compréhension du rôle de certaines adipokines dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline au cours de l’obésité, permettra de cibler de nouveaux mécanismes cellulaires. L’apport de l’expérimentation animale est majeur dans l’étude de la dérégulation de ces voies, en offrant un point de vue à corps entier de la physiopathologie de l’obésité et du diabète.

Procédures

Dans l’EU1, les animaux auront une alimentation enrichie en lipides durant 12 semaines et un hébergement à thermoneutralité. Tous les animaux seront soumis à 2 gavages, 3 à 11 injections et 4 séries de 8 à 9 prélèvements de sang à la queue au cours de leur vie ; chaque acte sur animaux vigiles n’excédant pas 15 secondes consécutives. Tous les animaux pourront subir une intervention chirurgicale (de 10 à 15 minutes maximum) sous anesthésie générale avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire. Dans l’EU2, les animaux seront soumis à 1 gavage, 1 série de 5 prélèvements de sang à la queue n’excédant pas 15 secondes consécutives, puis nécropsiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourraient survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min), lors des 12 semaines de régime enrichi en lipides, lors des gavages (environ 15 sec) ou encore lors des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 5 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors de prises de sang ou encore lors d’injections. Dans l’éventualité où l’option chirurgicale serait retenue pour induire la surexpression de l'adipokine étudiée, les souris pourraient ressentir une douleur légère pendant 1 à 2 jours malgré l’utilisation d’antalgique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et nécropsiés en vue de l'analyse de leur sang et de plusieurs organes.

Remplacement

Les modèles in vitro d’adipocytes humains et murins existent et l’équipe en cultive couramment. Cependant, en raison de la capacité de prolifération quasi-inexistante des adipocytes, ces lignées sont cultivées sous forme de préadipocytes puis différenciées en adipocytes matures grâce à un milieu de culture spécifique. Ces conditions de culture rendent les cellules artificiellement résistantes à l’action de l’insuline et il est impossible d’étudier l’effet de certaines molécules sur la sensibilité à l’insuline. De plus, les tissus adipeux sont constitués d’une grande diversité de cellules, outre les adipocytes, qui participent à la dysrégulation de la sensibilité à l’insuline. C’est le cas des cellules immunitaires qui, selon leurs sécrétions de cytokines et chimiokines, influencent le signal insulinique à l’échelle du tissu. Ainsi, le modèle in vivo sur l’animal, utilisé à des fins expérimentales, est indispensable à l’étude de ces dialogues intercellulaires au niveau du tissu, puis à l’étude des dialogues inter-organes au niveau systémique.

Réduction

Grâce à nos études préliminaires, nous savons qu’un minimum de 10 animaux nourris avec un régime enrichi en graisses par condition testée est nécessaire pour observer un effet sur la sensibilité à l’insuline. Ces travaux n’avaient cependant été réalisés que sur des mâles de fond génétique sauvage. A cause d’une hétérogénéité interindividuelle significative dans les paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront dans ce projet d’utiliser 15 animaux contrôles par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard) et 15 animaux génétiquement déficient pour une adipokine par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard), pour chaque condition expérimentale et température d’hébergement. Ce nombre minimal permettra d’obtenir des résultats robustes et basés sur une puissance statistique suffisante, en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Nous estimons que pour établir une différence éventuelle entre les groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus par groupe : soit 15 mâles non déficients, 15 mâles déficients, 15 femelles non déficientes et 15 femelles déficientes par condition expérimentale et température d’hébergement. L'utilisation de 3 cohortes au maximum, manipulées à des temps « indépendants », est justifiée par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Pour le bien-être animal, les souris seront en groupes sociaux de 4 à 5 individus constitués dès le sevrage de fratries, dans la majorité des cas. Les souris ne seront jamais isolées lors des protocoles. Un contrôle quotidien de l'alimentation, la boisson et l'état physique des animaux sera effectué. Des enrichissements (feuille d’essuie-tout, bâtonnet de bois, papier kraft « sizzle-nest ») seront placés dans les cages et remplacés lors du change hebdomadaire ou en cas de souillure excessive. Si les animaux montrent des signes d’agitation/nervosité lors des manipulations, des abris seront ajoutés aux cages (igloos, tubes…) afin de satisfaire leur besoin naturel de se cacher. Selon le développement technique et la disponibilité commerciale de certains produits à administrer, ces options moins invasives seront privilégiées à la chirurgie. Dans le cas contraire, les injections ou chirurgies se feront sous anesthésie avec antalgique et tapis chauffants. Dès l’apparition d’un comportement normal de réveil (étirements, ébrouement, toilettage…), il sera replacé avec ses congénères. Dans les jours suivants, la litière de copeaux de bois standard sera remplacée par une litière de cellulose ne produisant pas de poussière, évitant l’irritation des plaies chirurgicales. La cicatrisation de l’abdomen et l’absence de signes de douleurs (évaluée par la grille de scoring) sera un point essentiel de la surveillance quotidienne. Après mise sous régime riche en graisses, un suivi du poids hebdomadaire sera réalisé. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris) est le modèle animal expérimental le plus étudié notamment pour les études physiologiques et métaboliques. La lignée animale déficitaire pour le gène d’une adipokine a été développée chez la Souris et est utilisée par plusieurs équipes de recherche, ce qui permet une comparaison avec les données de la littérature. La transposition du modèle à l’Homme est améliorée par l’humanisation du modèle murin, par l’utilisation de vecteurs viraux permettant l’expression du gène humain de notre adipokine dans le tissu adipeux des animaux. Les animaux utilisés seront adultes et âgés de 8 semaines au début du protocole, 22 semaines à la fin du protocole.

1 080 souris vont être utilisées, toutes tuées puis nécropsiées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent douze semaines de régime enrichi en lipides, subissent deux gavages, trois à onze injections et quatre séries de huit à neuf prélèvements de sang à la queue, certaines une chirurgie sous anesthésie générale. Le projet teste si la surexpression d'une adipokine dans le tissu adipeux retarde la résistance à l'insuline liée à l'obésité. Le porteur écrit que le modèle in vivo est "indispensable" pour étudier ces dialogues entre cellules, après avoir précisé que son équipe cultive couramment des adipocytes humains et murins.

Objectifs

L’obésité est caractérisée par un excès de tissu adipeux et s’accompagne de complications métaboliques. L’excès de tissu adipeux est corrélé au degré d’insulino-résistance qui, s’il n’est pas contrôlé, aboutit au développement d’un diabète de type 2. Le tissu adipeux est un organe central du métabolisme par sa fonction de stockage des lipides. Il produit également de nombreux facteurs, dont des adipokines bénéfiques ou délétères vis-à-vis de l’action de l’insuline ; ces adipokines peuvent agir au sein même du tissu ou à distance dans l’organisme. Une meilleure connaissance des adipokines participe à la compréhension des complications métaboliques associées à l’obésité. Nous avons mis en évidence chez l’Homme une nouvelle adipokine dont le niveau d’expression dans le tissu adipeux est faible chez des personnes atteintes de syndrome métabolique ou de diabète de type 2. Son taux sanguin est un déterminant négatif de la résistance à l’action de l’insuline. Nous émettons l’hypothèse qu’une altération de la production de cette adipokine par le tissu adipeux pourrait contribuer au développement d’une insulino-résistance. Nous voulons tester si sa surexpression dans le tissu adipeux peut permettre de retarder, voire d’empêcher, le développement d’une résistance à l’action de l’insuline induite par l’obésité. Ce projet est multisites, il sera réalisé dans deux établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra l’apport de nouvelles connaissances sur les acteurs de la sensibilité à l’insuline, dans un contexte de prise de poids et de dégradation de la signalisation insulinique. La compréhension du rôle de certaines adipokines dans la prévention de la perte de la sensibilité à l’insuline au cours de l’obésité, permettra de cibler de nouveaux mécanismes cellulaires. L’apport de l’expérimentation animale est majeur dans l’étude de la dérégulation de ces voies, en offrant un point de vue à corps entier de la physiopathologie de l’obésité et du diabète.

Procédures

Dans l’EU1, les animaux auront une alimentation enrichie en lipides durant 12 semaines et un hébergement à thermoneutralité. Tous les animaux seront soumis à 2 gavages, 3 à 11 injections et 4 séries de 8 à 9 prélèvements de sang à la queue au cours de leur vie ; chaque acte sur animaux vigiles n’excédant pas 15 secondes consécutives. Tous les animaux pourront subir une intervention chirurgicale (de 10 à 15 minutes maximum) sous anesthésie générale avec utilisation d’antalgique pour limiter la douleur post-opératoire. Dans l’EU2, les animaux seront soumis à 1 gavage, 1 série de 5 prélèvements de sang à la queue n’excédant pas 15 secondes consécutives, puis nécropsiés.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront plusieurs nuisances ou effets indésirables au cours de leur vie allant d’inconforts à des douleurs légères sur de courtes durées. L’inconfort et/ou le stress pourraient survenir lors des mesures de poids (temps inférieur à 1 min), lors des 12 semaines de régime enrichi en lipides, lors des gavages (environ 15 sec) ou encore lors des transports entre différents établissements utilisateurs (durée inférieure à 5 min). Des douleurs légères n’excédant pas quelques secondes pourraient survenir lors de prises de sang ou encore lors d’injections. Dans l’éventualité où l’option chirurgicale serait retenue pour induire la surexpression de l'adipokine étudiée, les souris pourraient ressentir une douleur légère pendant 1 à 2 jours malgré l’utilisation d’antalgique.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure et nécropsiés en vue de l'analyse de leur sang et de plusieurs organes.

Remplacement

Les modèles in vitro d’adipocytes humains et murins existent et l’équipe en cultive couramment. Cependant, en raison de la capacité de prolifération quasi-inexistante des adipocytes, ces lignées sont cultivées sous forme de préadipocytes puis différenciées en adipocytes matures grâce à un milieu de culture spécifique. Ces conditions de culture rendent les cellules artificiellement résistantes à l’action de l’insuline et il est impossible d’étudier l’effet de certaines molécules sur la sensibilité à l’insuline. De plus, les tissus adipeux sont constitués d’une grande diversité de cellules, outre les adipocytes, qui participent à la dysrégulation de la sensibilité à l’insuline. C’est le cas des cellules immunitaires qui, selon leurs sécrétions de cytokines et chimiokines, influencent le signal insulinique à l’échelle du tissu. Ainsi, le modèle in vivo sur l’animal, utilisé à des fins expérimentales, est indispensable à l’étude de ces dialogues intercellulaires au niveau du tissu, puis à l’étude des dialogues inter-organes au niveau systémique.

Réduction

Grâce à nos études préliminaires, nous savons qu’un minimum de 10 animaux nourris avec un régime enrichi en graisses par condition testée est nécessaire pour observer un effet sur la sensibilité à l’insuline. Ces travaux n’avaient cependant été réalisés que sur des mâles de fond génétique sauvage. A cause d’une hétérogénéité interindividuelle significative dans les paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront dans ce projet d’utiliser 15 animaux contrôles par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard) et 15 animaux génétiquement déficient pour une adipokine par sexe (dont 10 sous régime enrichi en lipides et 5 sous régime standard), pour chaque condition expérimentale et température d’hébergement. Ce nombre minimal permettra d’obtenir des résultats robustes et basés sur une puissance statistique suffisante, en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Nous estimons que pour établir une différence éventuelle entre les groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus par groupe : soit 15 mâles non déficients, 15 mâles déficients, 15 femelles non déficientes et 15 femelles déficientes par condition expérimentale et température d’hébergement. L'utilisation de 3 cohortes au maximum, manipulées à des temps « indépendants », est justifiée par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Pour le bien-être animal, les souris seront en groupes sociaux de 4 à 5 individus constitués dès le sevrage de fratries, dans la majorité des cas. Les souris ne seront jamais isolées lors des protocoles. Un contrôle quotidien de l'alimentation, la boisson et l'état physique des animaux sera effectué. Des enrichissements (feuille d’essuie-tout, bâtonnet de bois, papier kraft « sizzle-nest ») seront placés dans les cages et remplacés lors du change hebdomadaire ou en cas de souillure excessive. Si les animaux montrent des signes d’agitation/nervosité lors des manipulations, des abris seront ajoutés aux cages (igloos, tubes…) afin de satisfaire leur besoin naturel de se cacher. Selon le développement technique et la disponibilité commerciale de certains produits à administrer, ces options moins invasives seront privilégiées à la chirurgie. Dans le cas contraire, les injections ou chirurgies se feront sous anesthésie avec antalgique et tapis chauffants. Dès l’apparition d’un comportement normal de réveil (étirements, ébrouement, toilettage…), il sera replacé avec ses congénères. Dans les jours suivants, la litière de copeaux de bois standard sera remplacée par une litière de cellulose ne produisant pas de poussière, évitant l’irritation des plaies chirurgicales. La cicatrisation de l’abdomen et l’absence de signes de douleurs (évaluée par la grille de scoring) sera un point essentiel de la surveillance quotidienne. Après mise sous régime riche en graisses, un suivi du poids hebdomadaire sera réalisé. Les animaux seront suivis toute leur vie avec une grille de scoring permettant d’évaluer, par l’attribution de points, l’état de santé de chaque animal. En fonction du total de points obtenus (score), le RMO sera capable de déterminer si des points limites adaptés à chaque procédure sont atteints et les actions à réaliser pour soulager ou mettre fin aux souffrances relevées. Pour l’expérimentation terminale dans l’EU2, les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les cages sont placées dans des valises de transport adaptées à 2 cages permettant un isolement de la lumière et des conditions météorologiques extérieures. Le trajet se fait à pied (inférieur à 5 min), est pré-déterminé et évite la rencontre avec le public.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (Souris) est le modèle animal expérimental le plus étudié notamment pour les études physiologiques et métaboliques. La lignée animale déficitaire pour le gène d’une adipokine a été développée chez la Souris et est utilisée par plusieurs équipes de recherche, ce qui permet une comparaison avec les données de la littérature. La transposition du modèle à l’Homme est améliorée par l’humanisation du modèle murin, par l’utilisation de vecteurs viraux permettant l’expression du gène humain de notre adipokine dans le tissu adipeux des animaux. Les animaux utilisés seront adultes et âgés de 8 semaines au début du protocole, 22 semaines à la fin du protocole.

78 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent dans le derme une injection de Borrelia afzelii, la bactérie de la maladie de Lyme, puis passent cinq anesthésies, une par semaine, pour suivre en imagerie la dissémination des bactéries. La dernière anesthésie ne se termine pas par un réveil : les souris sont tuées pour que soient prélevés peau, articulations, cœur, cerveau, rate et sang. Les retombées annoncées, des molécules ciblant le gène étudié, sont renvoyées au plus long terme, et le porteur indique qu'aucun modèle in silico ne permet aujourd'hui de reproduire ces interactions.

Objectifs

En 10 ans, l'incidence de la borréliose de Lyme en France a pratiquement doublé, constituant ainsi un problème majeur de santé publique. Cette maladie infectieuse est causée par une bactérie du genre Borrelia, transmises par les tiques, ces dernières agissant comme de véritables vecteurs de ces agents pathogènes en infectant l'homme ou les animaux domestiques lors de leur repas sanguin. En France et en Europe, l'espèce Borrelia afzelii est très fréquente et s'étend. L'objectif principal de ce projet est d'étudier in vivo le rôle d’un gène particulier de Borrelia afzelii dans la dissémination des bactéries chez la souris et la réponse inflammatoire qui en découle. Ce gène de la bactérie Borrelia permet la production d’une molécule qui leur sert à communiquer entre-elles impactant ainsi leur virulence et leur résistance aux antimicrobiens. Dans notre projet, des souris seront infectées par voie intradermique, pour mimer la voie de pénétration chez l’homme, par Borrelia afzelii qui aura été ou non préalablement modifiées génétiquement pour supprimer l’expression du gène du gène d’intérêt. Les bactéries ayant le gène d'intérêt normal sont appelées sauvage alors que les bactéries où le gène d'intérêt a été supprimé sont dites mutées. A partir de ce point de départ cutané, l’infection sera suivie chez l’animal pendant 28 jours à l’aide d’un système d’imagerie in vivo pour étudier la dissémination des bactéries dans les différents organes et tissus cibles. Au terme de ce suivi, ces tissus cibles de l’infection par Borrelia seront collectés (peau, articulations, tissu cardiaque, système nerveux central, rate, sang) dans le but de quantifier la charge bactérienne ainsi que l’expression des médiateurs de la réponse inflammatoire. La contribution du gène d’intérêt à la dissémination bactérienne et à la réponse inflammatoire développée par les animaux infectés sera mise en évidence par la comparaison des infections entre les souches sauvages et mutées.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous permettront de faire progresser les connaissances sur le rôle d’un gène particulier de Borrelia afzelii dans la dissémination de la bactérie lors de l’infection d’un organisme hôte, sa virulence et la réponse inflammatoire de ce dernier. Ils permettront à plus long terme d’envisager l’utilisation de molécules ciblant le gène d’intérêt pour le traitement de la borréliose de Lyme. Ce champ d’investigation présente un intérêt manifeste, étant donné que l’Homme et les animaux domestiques sont de plus en plus exposés aux tiques et susceptibles d’être infectés par Borrelia afzelli, une espèce qui s’étend en France et en Europe.

Procédures

Tous les animaux (78) seront anesthésiés 5 fois à raison d'une fois par semaine pour faire le suivi de la dissémination bactérienne par imagerie. Lors de la première anesthésie d'une durée de 30 min maximum, les animaux seront rasés au point d'injection et une injection de bactéries dans le derme sera pratiquée avant l'imagerie. Les anesthésies suivantes dureront 10 min environ. Lors de la dernière anesthésie, après l'imagerie, les animaux encore anesthésiés seront mis à mort pour des prélèvements.

Impact sur les animaux

- L’injection pour induire l’anesthésie au début et à la fin du protocole crée une douleur légère et transitoire. - L'induction de l'anesthésie gazeuse et le réveil après anesthésie provoque un stress léger et transitoire des animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort de manière à collecter les différents tissus cibles au sein desquels la bactérie Borrelia est susceptible de se propager à partir du point d'injection cutané. Pour chaque échantillon biologique collecté, la charge bactérienne sera déterminée et les marqueurs de la réponse inflammatoire seront également analysés.

Remplacement

Des expériences in vitro ont été réalisées au préalable pour étudier l’impact de la mutation du gène d’intérêt de Borrelia afzelii sur la croissance bactérienne. Cependant, il est nécessaire d’effectuer des expériences in vivo chez l’animal afin d’étudier l’impact de cette délétion du gène d’intérêt sur la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte, ainsi que sur la réponse inflammatoire de l’organisme en réponse à l’infection, qu’il est impossible d’étudier in vitro, compte-tenu de la complexité des mécanismes mis en jeu. De plus, il n'existe pas encore de modèle in silico pour mimer ces interactions complexes.

Réduction

A partir des données de la littérature scientifique, nous avons pu calculer un effectif de souris minimum nécessaire pour assurer une validation statistique de l’étude, à l’aide d'une formule mathématique appropriée. Ainsi, nous proposons d’utiliser 18 animaux par lot en effectuant 3 expériences indépendantes avec 6 souris par lot. Ce découpage en 3 expériences indépendantes permettra d’envisager une démarche de réduction par analyse de tendance en cours de projet, dans le cas où des différences statistiques significatives seraient observées.

Raffinement

Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupes de 3 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées répondant à leur besoin naturel de ronger (buchettes de peuplier) et leur permettant de se cacher (nid). Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés lors des phases d’expérimentation les plus longues (rasage, injection de bactéries, imagerie) avec contrôle de la température par tapis chauffant. Des points limites gradés, précis et adaptés sont listés dans une grille et feront l’objet d’une surveillance quotidienne des animaux. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en œuvre précocement en cas de besoin.

Choix des espèces

Les modèles murins d’infection bactérienne par la bactérie Borrelia sont fréquemment utilisés pour étudier in vivo la dissémination de la bactérie dans l’organisme hôte et la réponse inflammatoire induite. La réponse inflammatoire de la souris est par ailleurs décrite et étudiée depuis des décennies et autorise des comparaisons avec la réponse inflammatoire humaine. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier la réponse inflammatoire de l’hôte en réponse à l’infection et évitent d’avoir recours à des espèces animales plus proches de l’Homme. Les animaux seront inclus dans le projet à partir de l’âge de 8 semaines, lorsque leur système inflammatoire est bien développé.

Douze rats vont être utilisés pour mettre au point au laboratoire une méthode d'isolement et d'analyse des microparticules sanguines, sans question scientifique posée sur l'accident de décompression lui-même. Ils sont soumis à des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tous tués à l'issue, pour prélever leur sang et leurs tissus. Chacun subit une contention et un prélèvement sanguin sous anesthésie, puis, un mois plus tard, 135 minutes en caisson hyperbare qui simulent une plongée. Le porteur range parmi les effets attendus la douleur provoquée par les symptômes d'accident de décompression, et indique que l'effectif de douze repose sur des expériences précédentes sans qu'aucun test statistique ait été réalisé.

Objectifs

Il est communément admis que le facteur déclencheur de l’Accident de Décompression est la formation de bulles subséquente à la réduction de la pression ambiante. Les microparticules sont des vésicules extracellulaires circulantes libérées par les cellules sanguines (plaquettes, leucocytes, cellules endothéliales). Par les protéines qu’elles arborent à leur surface mais aussi par les molécules (protéines, microARN, …) qu’elles renferment, les microparticules jouent un rôle important dans la transmission d’information et, notamment, l’inflammation. Ainsi, par exemple, leur nombre et leurs caractéristiques sont modifiés dans les pathologies vasculaires. Il a été montré (i) : que leur nombre augmente après la décompression et (ii) : qu’elles sont capables d’induire certains symptômes de l’accident de décompression. De plus, certaines d’entre elles contiennent du gaz et pourraient constituer un site de formation des bulles circulantes pendant la décompression. L’objectif principal de ce projet est de mettre en place, dans notre laboratoire, une méthode d’isolement, d’analyse et de caractérisation des microparticules dans le cadre d’études sur l’accident de décompression. Pour ce faire, nous avons besoin dans un premier temps, de récupérer chez des rats, des échantillons sanguins afin de valider le protocole d’isolement des microparticules à l’état de base et après l’exposition hyperbare. Dans un deuxième temps, la méthode d’analyse de ces microparticules nécessite de déterminer la concentration d’anticorps optimale pour le marquage des cibles d’intérêt, indispensable à leur détection et à leur analyse.

Bénéfices attendus

A court terme, le bon fonctionnement du protocole d’isolement des microparticules et de leur analyse permettra la mise en place d’une nouvelle expertise au laboratoire. A moyen terme, cette méthode sera utilisée pour la réalisation de projets nécessitant l’analyse de microparticules circulantes chez le rat. A plus long terme, cette méthode pourra être utilisée dans d’autres projets relatifs à l’accident de décompression dans notre laboratoire mais également dans des projets liés à l’inflammation ou à la dysfonction vasculaire.

Procédures

Les rats seront contentionnés une fois pour être anesthésiés/analgésiés (durée 1 min) afin de subir un prélèvement sanguin unique (durée 1 à 2 min). Un mois après, ils seront placés dans le caisson hyperbare pendant 135 min (30 min d’acclimatation + 105 min de plongée simulée).

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sont : (1) : le stress lié à la pesée hebdomadaire (acte de gravité légère, d’une durée de 5 min/pesée) ; (2) : le stress lié à la contention et à l’anesthésie (acte de gravité légère, d’une durée estimée à 5 minutes, et réalisé 1 fois) pour la réalisation des prélèvements sanguins ; (3) : le stress et l’angoisse liés à la plongée (acte de gravité modérée, d’une durée totale de 2h30) ; (4) : La douleur induite par l’apparition de symptômes d’accident de décompression lors de la période d’observation (ces nuisances seront modérées, d’une durée moins de 1 minute).

Devenir

Les 12 animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure afin de procéder aux prélèvements de sang et de tissus pour les analyses prévues dans le projet.

Remplacement

Notre travail porte sur l’étude des mécanismes à l’origine de l’accident de décompression. Les connaissances actuelles ne nous permettent pas de travailler sur un modèle cellulaire car il n’existe pas encore de biomarqueur fiable permettant de définir une sensibilité accrue à l’accident.

Réduction

Le nombre d’animaux utilisés dans cette étude a été déterminé sur la base des expériences précédentes et aucun test statistique n’a été réalisé. Les effectifs demandés vont nous permettre de réaliser toutes les mises au point nécessaires à la mise en place de cette nouvelle méthode d’analyse. Les animaux seront intégrés progressivement par lot de 4. Nous commencerons par un premier lot de 4 animaux, puis, si besoin, nous passerons à un deuxième lot, puis à un troisième. Si les mises au point sont terminées avant d'utiliser tous les lots, le projet peut être arrêté, ce qui permet de réduire le nombre d’animaux utilisés par rapport aux estimations initiales. Nous estimons à 12 le nombre d’animaux nécessaire au vu de la faible quantité de sang que nous pouvons prélever pour réaliser ces mises au point.

Raffinement

Une habituation au dispositif expérimentale (caisson hyperbare) sera réalisée avant l’entrée dans l’étude afin d’habituer les rats à l’environnement et de réduire le stress. Tout au long du projet, un suivi quotidien des animaux est réalisé avec une grille de score adaptée.

Choix des espèces

Le rat est un modèle très utilisé pour l’étude des mécanismes de l’accident de décompression. De fait, nous disposons d’un important corpus de données pour ce type d’étude. Nous possédons de nombreuses données biologiques concernant les effets de l’exposition hyperbare et une bonne connaissance des symptômes de l’accident de décompression. Cette expertise acquise au cours des projets précédents permettra une meilleure gestion du projet et de ses résultats. Nos travaux précédents ont été effectués sur des animaux matures sexuellement. Nous souhaitons donc utiliser des animaux au stade de « jeunes adultes », matures sexuellement.