Multisystémique

1 460 killifish turquoise d'Afrique vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, hébergés seuls dans des bacs de trois litres. Ils sont nourris un jour sur deux pendant quatre semaines, placés dans une eau refroidie de 3 °C, traités par des molécules dont le porteur reconnaît la toxicité possible, et une partie subit une amputation de la nageoire caudale pour génotypage. Un lot est laissé vieillir jusqu'à la mort naturelle ou jusqu'à une mise à mort sur signes cliniques. Les autres sont tués pour prélever leur sang et leurs organes, l'espèce ayant été choisie parce qu'elle est le vertébré à la durée de vie la plus courte en captivité, six mois. Le porteur conclut que ce poisson est un modèle "unique et indispensable" à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Une problématique importante inhérente à la recherche sur les maladies associées au vieillissement est le temps nécessaire pour laisser les animaux développer naturellement certaines caractéristiques trés symptomatiques du vieillissement. En effet, les animaux modèles vertébrés utilisés couramment dans la recherche biomédicale comme la souris ou le poisson-zèbre ont des durées de vie pouvant dépasser les 3 ans. Ce temps incompressible ralentit énormément les avancées de la recherche visant à diminuer les effets négatifs associés à l’âge. Afin de bénéficier de modèles de vieillissement accélérés permettant d’augmenter considérablement l’efficacité de la recherche, nous proposons d'utiliser le modèle de vieillissement accéléré, l'African Turquoise Killifish, et d'étudier l'efficacité (i) de modulations nutritionnelles, (ii) de traitements chroniques avec des substances naturelles ou synthétiques, ou (iii) l'impact d'une manipulation génétique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de l'âge. Nous pourrons évaluer quels événements biologiques sont à l'origine de la diminution de la locomotion ou du déclin cognitif par exemple. Ceci permettra d'identifier de nouveaux gènes candidats et/ou de mettre en place de nouvelles approches thérapeutiques comme les modulations nutritionnelles afin de mieux prendre en charge les pathologies liées à l'âge.

Procédures

Les seules interventions prévues au cours de ce protocole, sont des interventions de type nutritionnelle, avec la mise à jeûn intermittent qui consiste à nourrir les poissons un jour sur deux sur une durée de 4 semaines, intervention qui chez le poisson Killifish a par ailleurs donné lieu a une publication qui montre les effets bénéfiques sur l'animal avec un allongement de la durée de vie. En plus de cette intervention, certains groupes d'animaux auront une alimentation supplémentée avec des metabolites d'intêret suspectés de jouer un rolé majeur dans les flux métaboliques au cours du viellissement. Un génotypage par amputation de nageoire caudale est également prévu. Celle-ci sera réalisée une seule fois au cours de la vie des poissons concernés et seulement dans le cas où la transmission ne peut être détecter par la présence de sondes fluorescentes. D'autre part, pour activer le metabolisme des poissons, nous utiliserons une exposition "au froid", comme déja employé et publié par une équipe de recherche, qui a eu pour conséquences majeures d'allonger la durée de vie des poissons Killifish incubés dans une eau dont la temperature est reduite de 3°C.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement naturellement rapide chez l'African Turquoise Killifish. Les autres effets à évaluer concernent les conséquences du traitement avec des molécules naturelles ou synthétiques (avec des effets toxiques possibles). Les individus peuvent présenter une réduction de la pigmentation de la peau, une perte de poids, ou émaciation, accompagnées de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Amputation de la nageoire caudale : Les effets indésirables potentiels se produisent généralement immédiatement après la blessure et comprennent l'hyperventilation et des changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Celles-ci ne durent généralement que quelques minutes.

Devenir

Au terme de la procédure 1 : - tous les animaux du lot 1 seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures. - les animaux du lot 2 mourront de manière naturelle ou seront mis à mort lorsqu'ils présenteront des signes cliniques le nécessitant. Au terme des procédures 2 et 3, tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer le sang et les organes d'intéret pour des analyses ultérieures. Si les expériences proposées sont concluantes (c’est-à-dire si les modifications génétiques sont effectivement obtenues et si un phénotype métabolique est observé), alors une nouvelle DAP sera soumise en vue de faire le suivi des élevages pour maintenir les lignées respirantes dans la zootechnie et établir les procédures en aval.

Remplacement

Dans le cadre de ce protocole nous comptons manipuler 4 gènes. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle Turquoise Killifish font de ce poisson un modèle unique et indispensable à l'échelle de l'organisme entier pour étudier de manière intégrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du vieillissement.

Réduction

Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 10 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques.

Raffinement

Les animaux inclus dans les procédures sont hébergés individuellement dans un bac de 3 litres dans l'eau osmosée dont les paramètres biologiques sont trés controlés avec notamment une température de 28°C, un pH de 7, 5 et une salinité de 1000uS. Les procédures seront réalisées dans le respect du bien-être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% conduira à l'arrêt du protocole expérimental.

Choix des espèces

Pour étudier les mécanismes en lien avec le viellissement, l'African Turquoise killifish est l'espèce idoine, puisqu'il est le vertébré dont la durée de vie est la plus courte en captivité avec 6 mois. En tant que vertébré, il possède une anatomie comparable à celle du rongeur et de l'Homme. Une abondante littérature montre comment chez le mâle et la femelle, ce poisson présente un viellissement systémique, là aussi comparable aux rongeurs et à l'Homme (sarcopénie, déclin cognitif ou maladies métaboliques). Pour toutes ces raisons, l'African Turquoise Killifish est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans des laboratoires académiques, de plus en plus nombreux, pour modéliser un large spectre de pathologies liées à l'âge, avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration fonctionnelle in vivo et mécanistique post mortem. Toutes les explorations et expérimentations seront réalisées sur poissons adultes puisque l'ensemble de la physiopathologie que nous étudions se développe à l'âge adulte.

La plateforme fabrique des anticorps monoclonaux à la demande d'équipes académiques et industrielles, à raison de deux souris par antigène commandé. 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement de leur rate. Chacune reçoit trois à cinq injections d'une substance immunogène dans l'abdomen, à quinze jours d'intervalle, puis une prise de sang destinée à mesurer sa réponse immunitaire. Le porteur indique qu'un anticorps recombinant est produit in vitro quand c'est possible, juge les banques d'anticorps synthétiques limitées par leur sélection "artificielle et aléatoire", et note que la quasi-totalité des anticorps utilisés chez l'être humain proviennent de l'immunisation d'animaux non-humains.

Objectifs

La génération d'anticorps monoclonaux est la mission de notre plateforme "Ingénierie d'anticorps". Cette mission consiste à générer des anticorps monoclonaux par immunisation de la souris pour les équipes de recherche académiques et industrielles pour leur utilisation en recherche diagnostic et biotechnologie.

Bénéfices attendus

Le projet permet l'obtention d'anticorps monoclonaux hautement spécifiques qui sont des outils indispensables dans la recherche, la biotechnologie, le diagnostic et le développement de traitements thérapeutiques.

Procédures

L'immunisation consiste à injecter un petit volume de substance immunogène dans l'abdomen de souris 3 à 5 fois, à intervalle de deux semaines. Ensuite, un échantillon de sang est prélevé pour évaluer la réponse immunitaire. La souris est ensuite euthanasiée et un prélèvement de la rate est réalisé en vue de la préparation des lymphocytes. Les durées des interventions sur les souris (injections, prélèvement de sang) sont très courtes, de l'ordre de quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les injections répétées lors de l'immunisation peuvent provoquer du stress, de la douleur et de l'inconfort. Le prélèvement de sang peut entraîner une douleur et un stress.

Devenir

Les souris immunisées sont euthanasiées puis un prélèvement de la rate est réalisé pour la préparation des lymphocytes.

Remplacement

La génération d'anticorps chez la souris est envisagée lorsqu'il n'existe pas d'anticorps déjà disponible et pouvant répondre au besoin du demandeur. Lorsque cela est possible, un anticorps recombinant est produit in vitro. La production de l'anticorps in vivo chez la souris est remplacée par la production in vitro. Il n'est actuellement pas raisonnable de se passer totalement de l'utilisation des animaux pour la génération des anticorps. Bien que des banques d'anticorps synthétiques existent, la génération d'anticorps monoclonaux par immunisation de souris reste une approche privilégiée. La souris produit des anticorps naturellement optimisés via une réponse immunitaire complète, incluant la maturation d'affinité et la sélection par le système immunitaire. Les banques d’anticorps reposent sur une sélection artificielle et aléatoire ce qui limite la qualité des anticorps. Noter que la quasi-totalité des anticorps utilisés actuellement chez l'homme proviennent de l'immunisation des animaux.

Réduction

Nous réalisons une planification optimisée pour éviter de renouveler les procédures expérimentales. Nous limitons l'immunisation à 2 souris par antigène.

Raffinement

Nos procédures sont réalisées par un personnel expérimenté (plus de 20 ans d'expertise). Les injections et prélèvements moins traumatiques sont privilégiés. Une désinfection locale de la peau est réalisée avant chaque injection ou prélèvement. Les animaux sont suivis quotidiennement tout au long de la procédure et pour minimiser la douleur et l'inconfort, ils reçoivent un traitement analgésique. Les animaux présentant des signes de douleur dépassant le seuil fixé sont sortis du protocole expérimental et euthanasiés.

Choix des espèces

La méthode de génération d'anticorps monoclonaux repose sur la fusion de lymphocytes avec des cellules de myélome. Ces cellules de myélome sont originaires de la souris et n'existent quasiment que pour cette espèce, d'où le choix de la souris pour une question de compatibilité génétique lors la formation d'hybrides cellulaires. Pour l'immunisation, nous utilisons des souris jeunes qui ont un système immunitaire encore en développement, ce qui favorise une meilleure réponse immunitaire.

Mises à mort à l'issue de leur période d'analyse pour prélever dépôts adipeux, foie, muscles, pancréas, cœur et reins, 60 souris ne sont réutilisées dans aucune autre cohorte. Elles subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : tatouage des phalanges et biopsie d'oreille pour le génotypage, cinq gavages quotidiens pouvant irriter l'œsophage, six injections, sept prélèvements de sang à la queue en état vigile, une chirurgie de trente minutes dont le texte admet qu'elle entraîne rarement la mort, et jusqu'à cinq heures d'hébergement à 6 °C, seules, avec des isolements pouvant durer sept heures. L'objet du projet est de comprendre comment la graisse brune produit de la chaleur, piste envisagée contre l'obésité et le diabète de type 2. Le porteur écrit disposer de lignées cellulaires qui permettront de remplacer les animaux pour produire des adipocytes bruns modifiés, et affirme dans le même temps que les échanges entre le cœur et les organes métaboliques ne peuvent pas s'étudier en culture.

Objectifs

L’obésité est une maladie chronique, évolutive et multifactorielle, qui représente la cinquième cause de mortalité mondiale et se caractérise par un excès de poids causé par un excès de tissu adipeux. Ce dernier est composé de cellules adipeuses (adipocytes) dont il existe plusieurs types. On distingue ainsi le tissu adipeux blanc et le tissu adipeux brun ; le premier ayant plutôt un rôle de réserve d’énergie et le deuxième ayant plutôt un rôle de production de chaleur. Ce rôle thermogénique du tissu adipeux brun est consommateur de calories et pourrait être une piste intéressante dans le traitement de l’obésité. L’objectif principal de ce projet est de comprendre et identifier de nouveaux mécanismes et systèmes de régulation de l’activité thermogénique des adipocytes bruns/beiges dans un organisme complexe tel que le modèle murin.

Bénéfices attendus

Une forte prévalence (ou activité) de tissu adipeux brun (TAB) diminue fortement l’incidence des maladies cardiométaboliques comme le diabète de type 2 (DT2). Un enjeu majeur vise à comprendre les mécanismes de régulation du TAB et son rôle dans la gestion des flux de nutriments comme le glucose. Ces recherches pourraient mener à des pistes thérapeutiques potentielles dans le traitement des complications de l’obésité comme le DT2. Ce projet devrait nous apporter des connaissances théoriques nouvelles sur la biologie du TAB et pourrait nous permettre d’identifier de nouvelles cibles et stratégies de prise en charge de l’obésité et du DT2.

Procédures

Les animaux seront tatoués aux phalanges avec biopsie d’oreille pour génotypage. Ils seront soumis à des gavages une fois par jour pendant une semaine, soit 5 gavages au total (10 secondes/gavage). Ils recevront 6 injections au total (10 secondes/injection) et 7 prélèvements sanguins sur animal vigile à l'extrémité de la queue n'excédant pas 2 minutes consécutives. Ils seront aussi soumis à une chirurgie de 30 minutes une fois au cours de leur vie, un hébergements au froid (6°C) de 5 heures maximum et des isolements temporaires (maximum 7 heures).

Impact sur les animaux

Les manipulations génétiques envisagées ne devraient pas s’accompagner de souffrance animale particulières dans des conditions d’hébergement standard. Les animaux subiront divers stress, notamment des chirurgies surveillées avec gestion de la douleur et des expositions au froid en cages individuelles avec surveillance de la température corporelle. Effets indésirables potentiels liés aux expérimentations : - Stress et légère douleur lors du tatouage et biopsie d’oreille. - Inconfort lors des pesées (durée inférieure à 1 minute). - Inconfort et/ou stress lié au gavage et à la contention (durée inférieure à 15s), 1 fois/jour sur 5 jours, pouvant causer des irritations oesophagiennes. - Inconfort et/ou légère douleur lors des prélèvements sanguins à l’extrémité de la queue. - Inconfort, légères douleurs et rarement la mortalité (inférieure à 10%) lors des chirurgies sous anesthésie gazeuse et analgésie locale et centrale. - Stress, inconfort et douleur lors des expositions au froid (5 heures) avec isolement, jusqu'à 7 heures.

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de procédure pour récolter des tissus suite à une stimulation thermique et/ou un traitement pharmacologique. Pour toute cohorte de ce projet, les animaux ne seront pas ré-utilisés. Ils seront mis à mort à l'issue de leur période d'analyse, ceci dans le but de prélever tous les tissus d'intérêt à ce projet, notamment les différents dépôts adipeux de l'organisme, mais aussi le foie, les muscles, le pancréas, le cœur et les reins.

Remplacement

Une partie importante de ce projet réside dans l’étude approfondie des mécanismes permettant à certaines protéines et/ou substrats énergétiques de réguler la thermogenèse des animaux. Des études de biochimie et de biologie cellulaire peuvent être réalisées sur des lignées cellulaires établies récemment dans notre laboratoire. Ces cellules peuvent subir des modifications du génome, ce qui permettra de remplacer l’utilisation de modèles animaux pour générer des adipocytes bruns dont l’expression des protéines est modifiée. Par ailleurs, nous utilisons déjà des modèles cellulaires développés au laboratoire dans le but de réduire l’utilisation de modèles animaux. Cependant, les régulations physiologiques et communications endocrines entre le cœur et les organes métaboliques clés comme le tissu adipeux brun (TAB) ne peuvent pas être étudiées dans des cultures 2D ou 3D. Le tissu adipeux brun est composé de plusieurs autres types cellulaires différents des adipocytes bruns et en lien avec les autres organes pour le maintien de l’homéostasie métabolique de l’organisme considéré. C’est pourquoi l’utilisation de procédures d’expérimentation sur le modèle murin sont nécessaires. Aucun autre modèle n’est susceptible d’apporter les réponses aux questions posées. Les modèles murins décrits dans ce projet s’inscrivent dans un niveau préclinique préalable à un éventuel transfert à visée thérapeutique chez l’Homme. Nous utiliserons dans toute la mesure du possible les banques de données accessibles en ligne. Celles-ci permettront d’acquérir des informations sur la régulation de nos protéines d’intérêt sans avoir à reproduire certaines données déjà accessibles.

Réduction

En raison d’une hétérogénéité interindividuelle significative des paramètres physiologiques étudiés, les différentes procédures de phénotypage métabolique nécessiteront d’utiliser 15 animaux contrôles (femelles) et 15 animaux génétiquement modifiés (femelles) par cohorte expérimentale en moyenne. Ce nombre est le nombre minimal permettant d’obtenir des résultats robustes basés sur une puissance statistique suffisante et permettant de réduire le nombre de cohortes dans une même condition expérimentale , et ce en tenant compte de potentiels animaux non répondeurs ou « outliers ». Prenant en compte la plus petite différence biologique interprétable que nous pourrions avoir lors de nos procédures, ainsi que le fait que des études statistiques sont probantes à partir d'un nombre suffisant. Nous avons estimé que pour établir une différence éventuelle entre nos groupes il est nécessaire d'avoir au minimum 15 individus (tenant en compte les non répondeurs éventuels et les pertes possibles lors de la chirurgie), soit 15 femelles contrôles et 15 femelles génétiquement modifiées par cohorte. L'usage de 2 cohortes par procédure est justifié par l'éthique scientifique qui permet d'établir qu'un résultat est vrai quand il a été répété à plusieurs reprises dans les mêmes conditions expérimentales sur des lots différents.

Raffinement

Afin de maintenir le bien-être animal, les souris seront observées quotidiennement par les zootechniciens, ce qui permettra de déceler très rapidement toute souffrance. Un suivi du poids régulier (hebdomadaire) viendra compléter ces observations. Les souris seront placées, au maximum par 5, dans des cages comprenant des enrichissements (feuille d’essuiemains, bâtonnet de bois, bandes de papier KRAFT = sizzle-nest). Les animaux ne seront pas isolés, à l’exception des 5 jours post-chirurgie, ils resteront malgré tout en contact visuel et olfactif avec leurs congénères. La classe de gravité de la procédure utilisée dans ce projet est modérée et n’est pas répertoriée comme engendrant des pertes d’animaux. Les chirurgies seront réalisées sous anesthésie avec un traitement analgésique et des plaques chauffantes. Lors de la modification de la température d'hébergment (6°C), des contrôles tels que surveillance accrue ou prises de températures seront effectués afin de vérifier le bon état de santé des animaux.

Choix des espèces

La souris, mammifère proche de l'Homme, est le modèle animal expérimental le plus étudié dans la littérature notamment pour les études physiologiques et métaboliques, ce qui permet de meilleures comparaisons et une certaine pertinence des résultats. Cette pertinence est améliorée par l’humanisation des modèles murins au niveau génétique et environnemental, ce dont nous tenons compte de par l’utilisation de diverses températures d’hébergement. Nous étudions l’importance des protéines impliquées dans la régulation de la thermogenèse par les adipocytes bruns. A travers l’utilisation du modèle souris, nous pouvons travailler sur des modèles génétiquement modifiés qui présentent une invalidation pour le/les gène(s) d’intérêts ou des modifications géniques similaires à celles retrouvées chez des patients. Les souris débuteront la procédure entre 6 et 10 semaines correspondant au début de l'âge adulte, une période où l'organisme est mature tout en étant encore jeune. À ce stade, la délétion génique est stable, ce qui garantit la fiabilité des analyses phénotypiques et fonctionnelles.

560 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont irradiées puis greffées avec de la moelle osseuse modifiée, laissées plusieurs mois, avant huit à vingt-quatre semaines de régime enrichi en graisses, en cholestérol et en sucre destiné à provoquer obésité, résistance à l'insuline, maladie du foie et athérosclérose. Suivent des mises à jeun, cinq microprélèvements de sang à la queue par test, des tests de tolérance au glucose et aux lipides sur animal vigile, et pour une partie une échographie cardiaque sous anesthésie. Les retombées annoncées se limitent à envisager un lipide comme marqueur de risque et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques, quand l'obésité provoquée, elle, est immédiate. Le porteur affirme que le dialogue entre organes ne peut pas s'étudier en culture cellulaire et que le projet ne s'envisage qu'à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les maladies métaboliques telles que l’obésité sont caractérisées par des désordres touchant le métabolisme énergétique, et notamment des lipides. Elles sont fréquemment associées à des complications cardiaques et vasculaires. L’accumulation de lipides dans la paroi des artères est une conséquence fréquente qui peut conduire à des accidents vasculaires comme la crise cardiaque. Elle est associée à d’autres troubles comme l’obésité, le diabète, le cholestérol ou la maladie du foie gras. Ces maladies touchent plusieurs organes et doivent être étudiées de façon globale afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués. Parmi les mécanismes suggérés dans la littérature scientifique, une modification de certaines cellules immunitaires pourrait avoir un rôle important. Parmi ces éléments, un lipide essentiel pourrait être crucial. Cependant, le mécanisme d’action n’est pas compris pour le moment. Nous souhaitons donc dans ce projet bloquer la production de ce lipide essentiel uniquement dans les cellules immunitaires identifiées comme importantes afin d’identifier les mécanismes que ce lipide contrôle, notamment dans la progression des troubles qui sont associés à l’obésité.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en évidence les mécanismes associés à l’émergence des maladies liées à l’obésité et aux troubles métaboliques qui en découlent tels que l’athérosclérose ou l’insulino-résistance, et plus particulièrement d’identifier un lipide clé des macrophages dans ce processus. Cette étude nous permettra de comprendre l’importance de la dérégulation de l’homéostasie lipidique des macrophages dans le développement des maladies cardiométaboliques et d’explorer les dialogues inter-cellulaire et inter-organes. L’ensemble de ces données permettra d’envisager ce lipide comme un marqueur pertinent, et ainsi d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et finalement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les animaux impliqués dans ce projet seront soumis à une greffe de moelle osseuse qui implique une irradiation préalable (moins de 15 min) et une injection de cellules de moelle modifiées, sous anesthésie (5 min). Après plusieurs mois de repos pour que la greffe ait bien prise, les souris seront mises en présence d’un régime riche en graisses et en sucre pour une durée de 8-24 semaines. Avant et après régime, sur les souris vigiles nous évaluerons la masse grasse ce qui nécessite une courte contention (moins de 5 min), et elles seront testées par un faible prélèvement de sang sous anesthésie. A la suite du régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h). Les réponses des souris à une ingestion de sucre ou de graisse seront alors évaluées grâce à de très faibles prélèvements de sang à la queue (5) sur de courtes périodes (moins de 2h). De même, la réponse des souris à l’insuline, afin d’estimer un potentiel diabète, sera réalisé selon la même procédure (2h). Afin que les évaluations soient fiables, les animaux seront vigiles et libres de leurs mouvements. De même, les évaluations seront distribuées équitablement afin d’éviter toute fatigue. Le comportement des animaux sera mesuré sur plusieurs jours grâce à des cages munies de divers capteurs. Enfin, une partie des animaux sera évaluée sur le fonctionnement du cœur par une échographie et un électrocardiogramme. Ceci sera réalisé sous anesthésie afin de garantir l’immobilité des souris et la qualité des images sans stresser l’animal. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.

Impact sur les animaux

Les souris seront exposées à des régimes riches en graisses, en cholestérol, et en sucre pendant plusieurs semaines (8 à 24) afin d’induire une obésité et de provoquer les désordres métaboliques qui lui sont associée : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, maladies du foie non alcoolique, troubles du rythme, athérosclérose, troubles du rythme cardiaque…. Ces régimes pourraient induire un inconfort et une difficulté de déplacement dus à l’obésité développée. L’injection de progéniteurs de moelle-osseuse aux souris pourrait induire une douleur de courte durée et un risque d’hématome ou d’hémorragie. De plus, les souris seront soumises à un phénotypage métabolique qui inclus un jeûne non-strict de quelques heures ce qui peut engendrer une sensation de faim chez l’animal. Les injections pour le test de sensibilité à l’insuline et l'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose et un le suivi de glycémie (ou lipides) associé avec des prélèvements sanguins de faible volume pourront induire un stress et une douleur légère de courte durée. L'administration de solution de glucose pour le test de tolérance au glucose ou de lipide pour le test de tolérance aux lipides pourrait induire des microlésions et des irritations.

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins pour répondre à la question (ou aux objectifs) scientifique de ce projet.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (coeur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires. Ainsi l’impact induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, l’altération de la fonction des cellules immunitaires dans un organe peut avoir un écho profond dans des organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués

Réduction

Le projet impliquera 560 animaux au total. Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre d’évaluations à réaliser, et donc le nombre d’animaux requis. La composition et la durée du régime riche en graisse utilisé ici sera déterminée par les résultats d’une étude pilote en cours. Cette méthode nous permet ainsi d’assurer avec un faible nombre d’animaux le succès de ce projet et une utilisation rationnée et réduite au strict nécessaire.

Raffinement

Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (l’hébergement individuel ou à 30 degrés Celsius est limité au maximum) en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès ad libitum à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec deux enrichissements minimum. Le projet a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal. Les greffes et les explorations cardiaques seront réalisées sous anesthésie générale afin de limiter le stress des animaux. Les animaux seront vérifiés quotidiennement et un suivi régulier du poids sera effectué afin de s'assurer du bien-être des animaux. Pour faciliter l'alimentation, de la nourriture hydratée sera disposée au fond de la cage en cas de nécessité. Conformément à la réglementation, les actes techniques seront réalisés par du personnel formé et compétent pour respecter le bien-être animal et diminuer leur stress. Ainsi, la douleur et le stress sont limitées en apportant des soins adaptés ainsi qu’une surveillance attentive accompagnée de points limites suffisamment prédictifs et précoces.

Choix des espèces

La souris constitue le modèle privilégié pour l’étude des mécanismes impliqués dans la pathophysiologie des maladies métaboliques : la souris est le mammifère le moins évolué qui développe rapidement des maladies métaboliques similaires à l’Homme. L’analyse de l’athérosclérose requiert une modification du métabolisme lipidique et une altération de la communication inter-organes. Nous utiliserons une lignée de souris qui présente un métabolisme lipidique plus proche de ce que l’on peut observer chez l’Homme. Des souris âgées de 10 à 12 semaines, un âge auquel elles sont suffisamment matures pour supporter la transplantation, seront utilisées. Les régimes obésogènes seront mis en place à l'âge de 12 à 16 semaines, afin de laisser le temps aux souris de récupérer de leur transplantation.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant deux fois seize heures en cage métabolique individuelle, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit cinq injections quotidiennes de diurétique en état vigile, d'autres subissent une chirurgie sous anesthésie pour la pose d'une minipompe délivrant une molécule en continu, les souris témoins étant elles aussi ouvertes puis suturées pour rester comparables. Le protocole associe un régime pauvre en sel et une eau enrichie en oxalate afin de provoquer une atteinte rénale par cristaux, l'objectif déclaré étant de comprendre une néphropathie mal connue chez les patients déshydratés. Les critères d'arrêt sont la prostration ou la perte de 10 % du poids initial. Sur les atteintes, le porteur affirme que les souris ne seront pas impactées par la déshydratation grâce à la brièveté du protocole, tout en indiquant que l'ajout d'une autre molécule pourrait induire une insuffisance rénale modérée.

Objectifs

Notre projet porte sur l’étude de l’absorption digestive de l’oxalate dans le côlon en situation de déshydratation. L’oxalate est une petite molécule éliminée dans l’urine, qui précipite avec le calcium urinaire, formant des cristaux d’oxalate de calcium dans les reins et pouvant entrainer une insuffisance rénale aigue liée à une néphropathie oxalique dite « cristalline ». L’hyperoxalurie peut être génétique (production accrue d’oxalate par le foie) ou dgestive (absorption accrue de l’oxalate dans le côlon. Cependant, certains patients développent des insuffisances rénales aigües avec précipitation d’oxalate de calcium dans des circonstances de déshydratation extracellulaire (dû à des vomissements et/ou diarrhées, diurétiques...) sans que l’on identifie de cause classique d’hyperoxalurie. Le transporteur « DRA » au niveau colique permet le transport du chlore et de l'oxalate. Notre but est de montrer, lors d'un état de déshydratation, une augmentation de stimulation de ce transporteur, induisant ainsi une augmentation de l’absorption digestive de l’oxalate et par conséquent une augmentation de l’oxalate urinaire. L’objectif est de comprendre la physiopathologie d’une néphropathie cristalline encore mal connue, probablement plus fréquente que supposé, et de mieux comprendre la physiopathologie de l’hyperoxalurie suite à une déplétion sodée importante. Cette étude permettra également de déterminer la mise en place des mesures préventives spécifiques lors des épisodes de déshydratation extracellulaire chez les patients atteints de syndrome de grêles court ou autres conditions à risque de néphropathie oxalique.

Bénéfices attendus

Ce projet aura un impact clinique important si nos hypothèses se confirment. La néphropathie oxalique est caractérisée par la précipitation de cristaux d’oxalate et de calcium dans les tubules rénaux. Cette néphropathie peut entraîner une insuffisance rénale terminale dans 50 pourcents des cas. Sa fréquence est non négligeable. Cette prévalence augmente drastiquement dans les groupes de patients à risque, notamment les situations de malabsorption, qui concernent jusqu'à 50 pourcents des diagnostics de néphropathie oxalique. Ce projet permettrait de confirmer la voie innovante d'un potentiel effet propre de la déplétion sodée sur l'augmentation de l'activité de transport digestif de l'oxalate, menant ainsi à une hyperoxalurie digestive, tout en se passant de la voie physiopathologique classique malabsorptive (sus-mentionnée). En effet, les patients atteints de diarrhée chronique avec malabsorption (comme dans les situations de syndrome de grêle court, de maladie de Crohn...) sont affectés par une hyperoxalurie massive qui conduit au développement d'une insuffisance rénale. Si cette oxalurie est liée en partie à l'effet de l'angiotensine 2, cela permettra de prendre en compte la part liée à la déshydratation dans l’apparition de cette néphropathie, et de prévenir davantage le déclin de la fonction rénale en adaptant les apports hydro-sodés chez ces patients.

Procédures

Une partie des souris seront sous régime alimentaire pauvre en sel ou enrichie en oxalate (eau de boisson) pendant 5 jours ou 14 jours. Toutes les souris seront exposées à 2 reprises à un recueil urinaire en cages métaboliques en état vigiles au cours de chacune des procédures (15 jours avant le traitement et jour 5 ou jour 14 après le premier traitement) sur une durée de 16h impliquant un hébergement individuel. Certaines souris auront également des injections quotidiennes d'un diurétique pendant toute la procédure (5j), soit 5 injections au total sur souris vigile (durée de l’acte moins de 5 secondes). D'autres souris seront également soumises à une procédure chirurgicale sous anesthésie permettant la mise en place d'une pompe osmotique délivrant en continu une molécule (la mise en place de la pompe dure environ 5 minutes). Enfin, à l’issue de la période de maintien, tous les animaux seront soumis à un unique prélèvement sanguin (durée de cet acte 1 minutes) sous anesthésie et analgésie qui sera suivi d’une euthanasie par une méthode réglementaire sans réveil de l’animal.

Impact sur les animaux

Les souris seront injectées en diurétique ou en diluant seul administré quotidiennement. L’exposition à une alimentation pauvre en sel ne devrait pas avoir d'impact majeur sur les animaux qui seront en déshydratation extracellulaire modérée. Les souris ne seront pas impactées par cette déshydratation modérée grâce à la durée courte du protocole. En revanche, l'ajout de petites doses d’une autre molécule associé à ce régime pourrait induire une insuffisance rénale modérée, qui ne devrait pas avoir de retentissement pour les animaux grâce à une surveillance adaptée (mesure du poids). Les changements de régimes pourraient induire un léger stress chez les souris qui sont néophobes (peur de la nouveauté). Les injections sont nécessaires pour la mise en place du modèle pourraient induire un stress lors de la contention et une douleur légère et de courte durée au site d’injection (piqure de l’aiguille). Dans l’un des modèles, des mini pompes seront installées sous anesthésie générale/analgésie pour délivrer des molécules en continu ce qui nécessite une petite incision et un point de suture. Comme pour toute chirurgie, il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie (rare), elle peut induite des douleurs/irritations notamment au niveau de la suture, ou encore des complications liées à l'anesthésie (stress thermique, détresse respiratoire, arrêt cardio respiratoire). De même, les souris contrôles devront également être anesthésiées, ouvertes et suturées et recevront 2 injections d’une analgésie pour garantir le même traitement des souris et éviter un bais suite à la chirurgie et de l’injection. Le recueil d'urine en cage métabolique peut induire un stress social pour les animaux. Enfin, un prélèvement sanguin unique et terminal sera effectué en fin de période, sous anesthésie et analgésie sans autre contrainte que la piqure permettant l’anesthésie correspondant à un stress lié à la contention et une douleur légère et de courte durée au site d’injection (piqure de l’aiguille).

Devenir

Des prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par une méthode réglementaire.

Remplacement

Nous souhaitons étudier le mécanisme du système rénine angiotensine suite à une déplétion sodée avec ou sans apport d'oxalate sur les transporteurs rénaux et du tube digestif. Pour cela, nous souhaitons mettre en évidence la physiopathologie de plusieurs organes (reins, colon, foie) lors d'une déplétion sodée et l'expression des transporteurs d'oxalate ainsi que la réponse du système rénine angiotensine suite à ce stimulus. L'implication de plusieurs organes avec une supplémentation en oxalate (alimentation) et d'un traitement ne nous permet pas de réaliser ces procédures sur des cellules ou des organoïdes. Pour cela, le recours aux animaux est indispensable. Les essais thérapeutiques sur le modèle d'insuffisance rénale ne peuvent être réalisés que sur un organisme entier.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux par expérience a été calculé à partir des données déjà connues dans ce modèle. La taille des effectifs a été établis grâce à un calcul de puissance pour prendre en compte les risques afin de réduire au maximum d’animaux utilisés. Le nombre de 10 animaux par groupe est issu notamment de l’expérience dans le modèle connu de l’équipe. Un calcul de puissance nous a permis de déterminer un nombre minimal de 8 souris par groupe, auquel nous préférons ajouter un pourcentage de sureté expérimentale et pour pallier aux potentiels variabilités interindividuelles, soit 10 souris par groupe. Pour des raisons de reproductibilité, nous réaliserons une deuxième série, soit 20 souris par groupe. De plus, nous utiliserons des tests afin de prendre en compte l’effectif des souris par groupe et pourvoir obtenir des résultats fiables et les interpréter. Nous utiliserons également d’autres tests pour la comparaison de plusieurs groupes. Le nombre d'animaux prévu est de 240 souris à ratio égale de mâles et femelles de 3 mois.

Raffinement

La prise hydrique est contrôlée lors du change de biberons et si nous observons un groupe plus ou moins déshydraté, le personnel pourra ajouter de la nourriture hydratée directement dans la cage. Le bien-être des animaux est assuré par un enrichissement de leur environnement grâce à l'utilisation d'une litière à base de cellulose composée de plusieurs éléments, de tailles différentes (matière compacte initialement, décompactée par les animaux), d’un dôme en cellulose et de morceaux de bois à ronger. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation en vigueur pour l’espèce. Le bien-être des animaux sera également assuré par une surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter tout signe de douleur. Si une agressivité est observée, les souris seront placées en hébergement individuel pour une durée de 5 heures. Lors du regroupement au décours des 5 heures, les cages seront enrichies avec des cocoons et de la sizale en plus. Les critères d’arrêt sont la prostration, ou la perte de 10 pour cent du poids initial (les animaux seront pesés tous les jours). Le recueil d'urine n'est pas invasif et les animaux seront habitués aux cages métaboliques. Les points limites seront surveillés tout au long de la procédure par du personnel qualifié (écarts de poids, apparence physique externe, changement de comportement, évolution des signe cliniques, degré d’activité). Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et repérer tout saignement et/ou risque d'infections. Les gestes invasifs seront réalisés sous anesthésie/analgésie, et un suivi post-opératoire sera réalisé. Il y a un risque de surinfection lié à la chirurgie, mais qui est relativement rare car tous les instruments chirurgicaux sont nettoyés et stérilisés avant chaque intervention. Des mini-pompes osmotiques seront installées, sous anesthésie générale, sous la peau des souris ce qui nécessite une petite incision et un point de suture. Un analgésique sera donné aux souris 30 min avant le début de la chirurgie puis 5-6h après. Si des signes de douleurs persistent et sont détectés 20 heures après la chirurgie, l’analgésie pourra être injectée une troisième fois. Concernant la chirurgie, si au-delà de 48 heures post chirurgie, les souris présentent toujours des signes de douleur ou agitation, nous considèrerons que ce point limite nuit au bien-être animal et la souris sera euthanasié.

Choix des espèces

Le protocole ne peut pas être réalisé sur des cellules ou organoïdes, mais afin de pouvoir étudier la physiologie de plusieurs organes dans son ensemble, cela doit être réalisé sur un organisme entier. Le modèle murin permet d’avoir des résultats fiables en limitant au minimum le nombre d’animaux nécessaires ainsi que l’impact du protocole sur le bien-être des animaux. Pour les procédures, nous utiliserons des souris de 3 mois, âge à partir duquel les souris seront assez robustes pour supporter 16 heures dans une cage métabolique (cage individuelle avec grille avec un accès illimité à la boisson) et obtenir une quantité suffisante d'urine. Nous achèterons des souris qui auront 11 semaines et auront 1 semaine d’acclimatation avant les protocoles. Les souris auront donc 12 semaines au moment du protocole.

L'objet réel de ce projet est une lignée de souris créée par l'équipe elle-même : 120 souris mâles privées d'un récepteur du goût du gras au niveau de la langue vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Privées d'eau six heures, elles subissent une chirurgie de vingt minutes sous anesthésie profonde, un enregistrement de vingt minutes de l'activité de leurs nerfs autonomes, puis une ponction intracardiaque juste avant la mise à mort. Le porteur signale la peur liée à la contention et les douleurs causées par la chirurgie. Le bénéfice annoncé à court terme se limite à mieux connaître cette lignée pour qu'elle serve ensuite de modèle à l'étude de la préférence pour le gras, et le porteur juge ce modèle "indispensable" puisqu'il n'existe que chez la souris.

Objectifs

Le goût du gras représente une sixième saveur de base aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Les récepteurs gustatifs, sur les cellules des papilles gustatives, permettent la détection des saveurs. Pour les lipides, ce sont les récepteurs lipidiques qui sont responsables de la perception du goût du gras et du renforcement de la préférence pour le gras. Le signal gustatif est transmis de la langue au cerveau par les nerfs gustatifs puis le cerveau communique avec le système digestif pour préparer le système digestif à l'arrivée des aliments. On parle alors de l’axe langue (papilles gustatives) – cerveau – intestin. Pour étudier spécifiquement le rôle d’un des récepteurs lipidiques dans la perception du gras, nous avons développé un modèle de souris n’exprimant pas ce récepteur au niveau de la langue. Nous avons observé que ces souris perdent la préférence pour le gras. De plus, elles développent des troubles métaboliques tels que des augmentations de la glycémie, de l’insulinémie et de la glucagonémie. L’insuline et le glucagon, sont des hormones sécrétées par le pancréas, qui permettent de réguler la glycémie. Elles sont sous le contrôle du système nerveux autonome, qui assure la communication entre le cerveau et l’intestin. Ces observations nous suggèrent que l’absence de d’un récepteur lipidique dans les papilles gustatives perturbe la communication entre la langue, le cerveau et l’intestin. Afin d’explorer le rôle du système nerveux autonome dans les perturbations métaboliques observées chez ces souris, nous prévoyons de mesurer l’activation de ces nerfs en réponse au dépôt de lipides sur la langue. Ces mesures seront effectuées chez des souris normales ou n’exprimant pas un récepteur lipidique au niveau des papilles gustatives.

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de mieux comprendre une nouvelle souche de souris génétiquement modifiée, n’exprimant pas un des récepteurs lipidiques au niveau de la langue. Ces souris pourront donc servir de modèle animal pour étudier la préférence pour le gras.

Procédures

Toutes les souris (120 souris) sont concernées par les points suivants : - Privation d’eau uniquement pendant 6 heures avant le début de la procédure. - une seule intervention chirurgicale suivie d’un seul enregistrement d’activité nerveuse par souris (souris profondément anesthésiées) ; durée de la chirurgie 20 minutes au maximum et durée de l’enregistrement nerveux 20 min. - un seul prélèvement sanguin en intracardiaque par souris durée de 2 minutes maximum. Prélèvement sanguin sur souris profondément anesthésiées juste avant mise à mort.

Impact sur les animaux

Le projet requiert de mettre à jeun hydrique les souris pendant 6 heures (phase diurne) avant la procédure chirurgicale ce qui peut engendrer un stress pour les animaux. Les animaux peuvent subir une peur des suites de la contention nécessaires lors des manipulations. Les souris peuvent subir des douleurs causées par la chirurgie.

Devenir

A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort, pour étudier leurs organes et tissus.

Remplacement

L’activité nerveuse autonome ne peut s’étudier que sur des animaux vivants, ceci expliquant la nécessité de l’expérimentation in vivo. Aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer l’utilisation de modèles animaux.

Réduction

L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique, valable avec un test adapté aux petits échantillons. Ainsi, après estimation confirmée, la taille des groupes minimale est de 15 animaux.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. De plus, habituer les souris à la contention permettra de diminuer le stress induit par le geste. Pour maximiser l’asepsie, plusieurs précautions seront prises, notamment la tenue du manipulateur (le manipulateur portera une blouse propre jetable et des gants nettoyés avec l’alcool 70%), désinfection des surfaces, utilisation d'un champ stérile, stérilisation des outils de dissections, tonte de la zone d’incision et désinfection de la peau. La délimitation des points limites permet d’éviter au maximum les douleurs sévères ou souffrance chez la souris afin de favoriser un état stable dans le bien-être animal. La douleur de la souris est en amont, prise en charge via l’utilisation d’analgésiques,15 minutes avant l’anesthésie. Ceci permettra entre autres de calmer l’animal et de maximiser l’effet de l’anesthésie. Des aiguilles fines biseautées seront utilisées lors des injections et des prélèvements, pour minimiser la douleur.

Choix des espèces

Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix qui est assez documenté sur la régulation nerveuse du système gastrointestinal et du comportement alimentaire. Cette technique est plus difficile à réaliser chez la souris que chez le rat, mais notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils d’analyse biologique contribue au choix de modèle de souris. De plus, l’élevage et la modification de gènes s’exprimant au niveau de la langue étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix quant à notre étude. Les souris mâles utilisées auront minimum 2 mois car avant 8 semaines, les souris sont trop petites pour effectuer une chirurgie.