Multisystémique

Soumises à un régime hyperlipidique pendant quinze semaines, mises à jeun de façon répétée et passées vingt-cinq à trente fois dans un test d'apprentissage, 255 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées, le prélèvement de sang se faisant directement dans le cœur sous anesthésie. Le projet cherche le rôle du récepteur aux xénobiotiques AhR dans la détection des lipides par la bouche, dans un contexte d'obésité. Le porteur qualifie ces tests de non invasifs et de gravité légère, puis relève lui-même que la répétition des épreuves et les privations de nourriture justifient un classement en modéré, sans nommer un seul des tests employés.

Objectifs

Le récepteur nucléaire d’aryl hydrocarbone (AhR) est impliqué dans la toxicité des substances comme les dioxines, dans les maladies du foie et des reins, et sur le fonctionnement du système immunitaire. Des études ont également mis en évidence l'influence de l'AhR sur la perméabilité intestinale. Cependant, aucune étude n'a encore analysé son rôle dans la détection orale des lipides Or, une perturbation de ce système de détection lipidique peut avoir des conséquences néfastes sur le métabolisme et le comportement. Les individus en condition d’obésité présentent un dérèglement de ce système. Cette étude vise ainsi à décrypter le rôle de l'AhR dans la détection orale des lipides, notamment dans un contexte d’obésité. En menant cette recherche, nous espérons contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'obésité et ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les perspectives par rapport aux résultats obtenus devraient : - Etablir les rôles « physiologiques » de l’AhR au niveau de la sphère orale - Déterminer si les effets obésogènes des xénobiotiques environnementaux ligands de AhR, pourraient avoir pour origine des interactions sur la détection orale des lipides

Procédures

La composition corporelle des animaux sera évaluée 4 fois dans un dispositif non invasif durant 2 minutes. Les souris seront soumises à des tests comportementaux non invasifs : les souris sont placées dans les dispositifs puis replacées dans leur cage de vie. Un test permettant d'analyser le niveau d'anxiété et la mobilité des souris aura lieu durant 30 minutes et n'aura lieu qu'une fois. Un test permettant l'analyse de la perception orale aura lieu 4 fois durant 30 minutes. Un test qui permet l'analyse de la préférence alimentaire aura lieu durant 16h dans leur cage de vie, 2 fois. Un test qui évalue la motivation des souris à consommer un aliment appétissant aura lieu 4 fois durant 10 minutes maximum. Un test qui permet l'analyse de l'apprentissage aura lieu entre 25 et 30 fois durant 3 minutes maximum. Un prélèvement intracardiaque sera effectué sous anesthésie, de moins d’une minute.

Impact sur les animaux

La majorité des analyses sont des études du comportement alimentaire des animaux. N'étant pas invasifs, ces tests sont de gravité légère. En revanche, la gravité des procédures a été placée en modérée, à cause des mises à jeun et de la répétition des différents test qui peuvent stresser les animaux. En effet, les effets indésirables attendus sont un stress dû aux mises à jeun et la possibilité de bagarres qui nécessitera l’isolement des animaux pour la réalisation de ces tests qui seront minimisés aux durées d’expérimentation. Les autres nuisances possibles sont associées à l’utilisation d’un régime gras (hyperlipidique) qui entrainera un surpoids chez les animaux (sauf le modèle de souris spécifique utilisé dans ce projet, étant résistantes au développement de l’obésité). La durée du régime (15 semaines) qui sera appliquée permet de mettre en place une obésité mais sans aller jusqu’au développement d’une insulino-résistance ni d’un diabète. Les animaux en régime hyperlipidique peuvent également avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Toutefois, cela n’a jamais été observé sur la durée (15 semaines) du régime. Les animaux pourront également être stressés à cause des manipulations, un minimum de personnel, auquel les souris auront été habituées, réaliseront les protocoles.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée. Ce projet est couplé à des expériences réalisées in vitro dans l’objectif à terme de développer des études sur la détection des lipides dans ces modèles cellulaires sans nécessité d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Les effectifs ont été minimisés tout en garantissant une pertinence biologique et une solidité statistique afin d’obtenir des résultats fiables. De plus, les analyses seront réalisées rapidement, dans le but d’arrêter les expérimentations dès que l’effectif sera suffisant pour obtenir des résultats fiables et diminuer ainsi le nombre d’animaux utilisé à son minimum.

Raffinement

Hormis les périodes de tests de comportement les animaux seront hébergés trois par cages transparentes, pour garantir le maintien des interactions sociales. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Lors des procédures expérimentales, les actes susceptibles d’entrainer une souffrance ou une douleur seront réalisés soit sous anesthésie locale soit sous anesthésie générale pour le prélèvement sanguin intracardiaque, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3Rs. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet.

Choix des espèces

Beaucoup d’études sur la thématique associée au projet ont été réalisées chez la souris. La confrontation de nos résultats avec la littérature s’avèrera donc plus pertinente. En effet, la souris et notamment la lignée C57Bl/6 est un modèle couramment utilisé dans les études sur l’obésité et les organes associés. D’autre part, dans le cas présent, le modèle transgénique utilisé est également sous fond génétique C57Bl/6, ce qui permet d’éviter le passage sous un autre fond génétique et la génération d’animaux que cela engendre. Les animaux seront à l’âge adulte car tous les systèmes biologiques étudiés doivent être matures, hors phase de puberté et avant la phase de dégénérescences physiologiques liées à l’âge.

Des souris porteuses de mutations qui leur causent des douleurs, des difficultés à se déplacer et parfois la mort avant terme sont élevées ici pour d'autres projets. 7 500 d'entre elles sont concernées, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, la seule intervention décrite étant une biopsie de quelques secondes pour le génotypage. Le porteur affirme que l'élevage de ces lignées ne peut pas être remplacé, ces animaux constituant selon lui "le cœur même" des projets des utilisateurs. Celles dont le génotype n'intéresse aucun projet sont transférées vers un autre établissement quand c'est possible, tuées sinon, tandis que les autres partent en expérimentation ailleurs ou servent de reproducteurs.

Objectifs

Dans le cadre de la production de modèles murins génétiquement modifiés, l'objectif du projet est de décrire la prise en charge des pathologies induites par les mutations de ces modèles.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de raffiner la production de souris génétiquement modifiées et de gérer l'apparition de pathologies induites par ces modèles en anticipant leur prise en charge et en permettant ainsi une réaction immédiate et adaptée. Il y a également un bénéfice indirect, car les modèles précliniques génétiquement modifiés permettent de reproduire chez l’animal des pathologies humaines.

Procédures

Des mutations chez des souris génétiquement modifiées peuvent entrainer des nuisances (phénotype dommageable) durant l’élevage chez l’animal. La biopsie pour génotypage ne prend que quelques secondes.

Impact sur les animaux

En fonction du modèle de pathologie, les mutations entrainant un phénotype dommageable induisent en général et à des degrés divers des douleurs, de l’inconfort, des difficultés à se déplacer et pour certaines des mortalités selon le génotype. Le génotypage des animaux requiert un prélèvement qui peut occasionner une gêne de très courte durée.

Devenir

Les animaux d'intérêt sont utilisés dans des procédures epxérimentales dans d'autres établissements utilisateurs (utilisation continue) ou peuvent servir en tant que reproducteurs. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt pour les projets expérimentaux initiaux peuvent être soit utilisés pour d'autres projets expérimentaux dans d'autres établissements utilisateurs si c'est possible, soit euthanasiés s'l n'y a pas de possibilité de les utiliser dans d'autres procédures.

Remplacement

Différentes stratégies de remplacement peuvent être appliquées par les chercheurs en amont de l'élevage des souris (expériences préparatoires in vitro, modélisations, veille scientifique) ou en aval des expérimentations (modélisation, raffinement des méthodes statistiques). Pour ce projet précis, il n'est pas possible de remplacer l'élevage de lignées de souris car ces animaux correspondent au coeur même des projets des utilisateurs.

Réduction

La réduction en pratique d'élevage nécessite une optimisation de l'âge des animaux géniteurs afin d'obtenir la plus grande descendance avec un minimum de cages d'accouplement. Elle nécessite aussi un choix approprié des génotypes des géniteurs (choix du mâle vs femelle; utilisation hétéro/homozygote, etc). La production sera rationnalisée par l’établissement de programmes d’élevage afin de ne pas produire plus d'animaux que nécessaire pour la production de lots expérimentaux.

Raffinement

Le raffinement concernant l'évaluation et l'entretien de lignées à phénotype dommageable ou potentiellement dommageable est obtenu en appliquant scrupuleusement les consignes des chercheurs concernant l'apparition des points limite attendus ou supposés pour chaque lignée considérée. Le raffinement des conditions d'élevage se traduit par un enrichissement des cages de production et de stabulation des animaux (par exemple : batonnets de coton, maison en carton si besoin, frisottiss si besoin,mise à disposition de l'aliment et/ou de la source hydratée sur la litière si besoin , etc... adaptation du nombre d'animaux / Cage au phénotype). Les conditions environnementales sont très élevées afin de protéger les animaux d'infections.

Choix des espèces

La souris est un animal permettant un grande variété de techniques génétiques permettant d'établir des relations entre gènes, fonctions, comportements et pathologies. Tout âge : animaux jeunes à âgés selon le type de procédures expérimentales dans lesquelles ces animaux sont par la suite utilisés en utilisation continue.

Une sonde rectale introduite dix à quinze fois en trois à cinq heures, une hypothermie poussée jusqu'à 32 °C et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la queue attendent chaque souris de ce projet. 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole pour prélèvements de tissus et de sang. Le porteur décrit une technologie qu'il compare à un cheval de Troie, des molécules-médicaments détournant les mécanismes naturels de passage des barrières de l'organisme pour atteindre le cerveau. Il qualifie ces manipulations de précises et rapides et écrit que la procédure ne comporte "pas d'anesthésie, pas d'analgésie", tout en retenant comme point limite l'apparition d'une hypothermie irréversible.

Objectifs

Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administrations des conjugués : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations lors de l’euthanasie : 1 seul/individu. Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements n’excédant pas ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu) ou intrapéritonéale (dose unique), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individu, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 6 groupes par étude et 2 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 96 animaux par an (4 *6*2*2), soit un total de 384 souris sur 4 ans (96*4). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : Apparition d’une hypothermie irréversible (température

Choix des espèces

Nous réalisons en amont de nos procédures des tests in vitro. Ces tests permettent de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques qui conditionnent le succès de nos vecteurs. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons de réaliser nos expériences sur la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. La souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux et permettra une extrapolation plus pertinente au modèle humain. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Rendues obèses par une suralimentation organisée dès après leur naissance, les souris de ce projet doivent développer un trouble du rythme cardiaque. 324 vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit sous anesthésie un capteur d'électrocardiogramme implanté par trois incisions, quatre injections intraveineuses de microvésicules, et passe deux séjours en cage individuelle que le porteur reconnaît stressants. Vient ensuite une exploration électrophysiologique par l'œsophage, dont il indique que l'animal n'est pas réveillé, et il affirme que ces altérations ne s'observent que dans un "organisme entier", aucun modèle cellulaire ou in silico ne pouvant répondre à la question posée.

Objectifs

La fibrillation atriale est une trouble du rythme cardiaque, qui fait battre le coeur de manière irrégulière, c’est-à-dire de façon arythmique. Son apparition est favorisée par l’obésité et l’altération des vaisseaux sanguins. Dans ce projet, notre hypothèse est qu’une protéine sécrétée par ces vaisseaux, nommée brain-derived neurotrophic factor, généralement appelée BDNF est impliquée dans cette dysfonction du coeur. A partir de souris en surpoids à cause d’une suralimentation postnatale, invalidées ou non pour le gène du BDNF, nous allons vérifier en mesurant leur électrocardiogramme si cette protéine est vraiment impliquée dans ce trouble électrique du coeur.

Bénéfices attendus

L'un des principaux résultats du projet sera d'aborder le rôle du BDNF dans la FA métabolique d'un point de vue translationnel, ce qui ouvre la voie à la découverte de nouveaux mécanismes, cibles et médicaments grâce à la genèse d'un large éventail de données innovantes. Par exemple, certains résultats obtenus sur nos modèles expérimentaux pourraient être pris en compte dans des études cliniques à grande échelle afin de développer de nouveaux outils pharmacologiques pour traiter ou prévenir la FA. Ces résultats serviront à guider le volet clinique de ce projet. Ainsi, notre projet a des impacts scientifiques, socio-économiques et cliniques élevés. Les données obtenues dans ce projet seront régulièrement présentées à la communauté scientifique lors de conférences nationales et internationales. Les résultats seront publiés dans des revues d’audience internationale à comité de lecture.

Procédures

Les animaux des groupes ‘SAPN’ auront une prise de poids supérieure aux animaux non SAPN, conduisant ce groupe à un surpoids. Les animaux seront soumis sous anesthésie gazeuse et locale à une implantation chirurgicale d'un capteur permettant de mesurer l'électrocardiograme (durée 25 min). Les animaux seront soumis à une exploration électrophysiologique transoesophagienne sous anesthésie gazeuse (20 à 35 min). Les animaux auront 4 injections intraveineuses de microvésicules pour rétablir leur niveau circulant de BDNF sous anesthésie gazeuse. L’ensemble des animaux auront deux périodes d’hébergement individuel pouvant conduire à un stress.

Impact sur les animaux

Le projet repose sur une suralimentation conduisant à un surpoids des animaux. La caractérisation fonctionnelle repose d'une part sur l'enregistrement de l'électrocardiogramme par un système implanté qui envoie des données à distance par télémétrie. L'implantation du dispositif ECG est bien maitrisée et aucune nuisance supérieure à une sévérité légère n'est attendue par l'acte chirurgical en lui-même (implantation sous cutanée nécessitant 3 petites incisions de la peau). Ces animaux implantés devront être hébergés individuellement en cage unique à 2 reprises pour des raisons de suivi et techniques (post-implantation du capteur de télémétrie d’une durée supérieure à 24h et enregistrement de l’électrocardiogramme, durée égale à 24h). Cet hébergement individuel pouvant conduire à un stress sera pris en compte pour le suivi journalier de l'animal. L'exploration électrophysiologique transoesophagienne a été choisie car elle est réalisée sous anesthésie générale de l'animal et est non-invasive. L'animal n’est pas réveillé à la fin de la procédure. Pour l’ensemble des actes des procédures, cette DAP est classée comme sévérité modérée.

Devenir

L’ensemble des animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

La fibrillation atriale est l'arythmie cardiaque la plus fréquente et dont la prévalence chez l’humain augmente dans le monde. Cette arythmie est associée à des complications délétères majeures telles que les accidents vasculaires cérébraux, l'insuffisance cardiaque et la mortalité. L’ensemble de ces altérations sont observables chez l’animal uniquement dans un organisme entier et impliquent des interactions inter organes. Ainsi, les modèles cellulaires ne peuvent pas se substituer à un modèle animal impliquant des relations entre les organes et ne peuvent donc pas être utilisés dans ce projet. De même, auccun modèle in silico ne pourrait répondre à notre questionnement.

Réduction

Ne sera utilisé que le nombre d’animaux strictement nécessaire à la conduite du projet et à l’obtention de statistiques suffisantes afin d'en tirer des conclusions non biaisées. L'utilisation de plusieurs techniques sur le même animal permet de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les souris seront hébergées avec un enrichissement de leur milieu de vie (nid en cellulose et carré de cellulose, morceau de bois), dans une pièce calme et tempérée, avec régulation des cycles lumineux. Les animaux seront observés quotidiennement par du personnel qualifié et des soins per-opératoires et post-opératoires comprenant anesthésie générale et analgésie seront apportés tout au long de l’étude. Une grille d'évaluation clinique permettant l’établissement d’un score selon une échelle de douleur permettra leur suivi et le respect des points limites. Selon cette échelle, une décision sera prise dont, notamment, la mise à mort de l’animal si un point limite est atteint afin de prévenir ou arrêter les souffrances.

Choix des espèces

La souris nous permet d’envisager les effets de la suralimentation sur un modèle très étudié dans différents projets, au niveau national et international, et qui sert de témoin « sauvage » aux études sur animaux génétiquement modifiés. De surcroît, les mécanismes physiologiques du controle du rythme cardiaque et physiopathologiques conduisant à la genèse de la FA chez les souris sont semblables à ceux de l'Homme, ce qui nous permet de réaliser des études translationnelles. Les animaux seront âgés de 4, 6 et 12 mois afin de suivre l’évolution dans le temps des paramètres cardiaques des animaux en fonction du temps d'installation progressive des troubles métaboliques. Ces différents âges correspondent à la période jeune adulte à adulte vieillissant chez l’Homme.

Des composants de paroi bactérienne administrés dans les voies aériennes provoquent chez les souris un bronchospasme et une chute de température pendant cinq à huit heures. 880 souris vont être utilisées de cette façon, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par exsanguination intracardiaque sous anesthésie, plus de 60 % du volume sanguin étant prélevé. Elles reçoivent les candidats médicaments une à deux fois par jour pendant un à trois jours et subissent jusqu'à cinq prélèvements de sang à la queue. Le chiffre de 880 correspond à 20 candidats médicaments évalués sur cinq ans "selon l'hypothèse la plus défavorable", sans que le RNT précise de quelles molécules ni de quel commanditaire il s'agit.

Objectifs

Les lésions pulmonaires aigues surviennent chez les patients atteint d’une pneumonie et est l’une des causes de décès les plus fréquentes au monde. Une inflammation excessive en réponse à l’infection provoque une atteinte sévère des poumons (lésions vasculaires et bronchiques), qui peut se manifester sous forme d’un syndrome de détresse respiratoire identifié comme une dyspnée, habituellement accompagnée d’une respiration accélérée et superficielle. Des traitements préventifs et curatifs contre les origines des pneumonies (bactérienne, virale, fongiques…) sont disponibles, de même que des soins palliatifs (ventilation mécanique, oxygène) mais il n’existe pas à l’heure actuelle de traitement permettant de promouvoir une résolution efficace et rapide de l’inflammation dans le but de limiter les atteintes et le remodelage du tissu pulmonaire. Les anti-inflammatoires disponibles actuellement ont pour la plupart des effets immunosuppresseurs qui présentent un danger pour le traitement de l’infection. Il apparaît donc nécessaire de mettre au point des traitements capables de maintenir une immunité spécifique active tout en favorisant un contrôle local et une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires. Notre objectif est d’évaluer l’activité de produits pharmacologiques en cours de développement, candidats-médicaments, dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë induit par l’administration dans les voies aériennes de composants de la paroi bactérienne (lipopolysaccharides) chez la souris.

Bénéfices attendus

La mesure de l'activité de composé pharmacologique dans un modèle de lésion pulmonaire aiguë (ALI) permettra de sélectionner les plus efficaces, capables de contrôler l’inflammation locale et promouvoir une résolution de l’inflammation afin de limiter les atteintes des tissulaires sans perturber l’immunité spécifique. Ce projet permet de sélectionner les candidats médicaments les plus prometteurs afin de poursuivre leur développement pour le traitement des patients atteint de pneumonie.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour d'administrer les candidat-médicaments étudiés. Ces composés pourront être administrées sur animaux vigiles ou sur animaux anesthésiés (anesthésie de quelques minutes). Les candidats-médicaments pourront être administré de 1 à 3 jours consécutifs et de 1 à 2 fois par jour. Les traitements 2x/jour et/ou de longue durée ne seront effectués qu’avec des voies d’administration qui le permettent. Afin de suivre les paramètres inflammatoires (cellules, cytokines…) au cours du temps, un maximum de 5 micro-prélèvements de sang (35µl, sur animaux vigiles et non contraints), sur une durée minimum de 48h, seront réalisés à l’extrémité de la queue. A la fin de l’expérience, lorsque des prélèvements doivent être effectués, les animaux seront mis à mort par exsanguination par le prélèvement du sang par voie intracardiaque transthoracique (>60% du volume circulant) sous anesthésie. La combinaison entre la forte surdose d’anesthésique et la chute de la pression sanguine et l'hypovolémie extrême résultant du prélèvement précipite la mort de l'animal dans les secondes qui suivent le prélèvement.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins. L’administration dans les voies aériennes de composants de la paroi bactérienne (LPS, lipopolysaccharides) induit une baisse de l’activité de l’animal au réveil de l’anesthésie et est accompagnée d’un bronchospasme (ayant pour effet une baisse visible de la fréquence respiratoire) et une baisse de la température dans les 5 à 8 premières heures.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…) et pharmacocinétiques. Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l'activité d'un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans la distribution et l’activité des médicaments ou la complexité des réponses inflammatoires. De plus, les affections pulmonaires sont également fortement influencées par la respiration (mécanique) et les échanges gazeux qui impactent fortement les réponses cellulaires mais aussi l’organisme dans son entier. Une dysfonction de la respiration entraine irrémédiablement une atteinte de tous les organes et fonctions biologiques, elles-mêmes impliquées dans la réponse immunitaire et l’ADME d’un médicament. Pour ces raisons, une approche chez l’animale, reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. Les études seront réalisées chez la souris, car cette espèce est la mieux caractérisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments et permet le recourt à de très nombreux outils (animaux GM, pléthysmographie, produits et tests biologiques…) permettant de valider leur activité.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 (groupes contrôles) à 6 animaux par groupe. Ce nombre d'animaux permet une analyse statistique efficace des résultats pour la mise en évidence d'un effet anti-inflammatoire ≥30% avec une incertitude inférieure à 5%. Pour les études qui requiert la mesure du bronchospasme et/ou le suivi des populations leucocytaires dans le sang, 6 à 8 animaux pour chaque groupe sont nécessaires pour mettre en évidence des variations généralement plus faible. D’après notre expérience, nous estimons que 20 candidats-médicaments seront évalués sur une période de 5 ans, soit un maximum de 880 souris selon l’hypothèse la plus défavorable.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les animaux seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’une maisonnette, d’une roue d'activité (Fast-trac), d’une balançoire, d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles. Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur a compter de la récéption des animaux puis plusieurs fois par jour après le début de la procédure expérimentale. Les souris seront anesthésiées pour permettre les administrations intranasales et intratrachéales. Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie et jusqu’au réveil complet des animaux. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Malgré les précautions prises en amont des expérimentations et la séléction des candidats-médicaments ayant le meilleur rapport benefice/risque, les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue. Tout signes de douleur ne pourra être suivi de mesure corrective et les animaux seront mis à mort dès l’atteinte de l’un des points limites. Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement à leur bien-être.

Choix des espèces

La souris est un modèle de référence pour l’étude des réactions inflammatoires, avec de multiple modèles expérimentaux disponibles. De plus, de nombreux outils permettant de caractériser les réponses immunitaires et respiratoires sont disponibles pour cette espèce. Les souris seront âgées d’au minimum 7 semaines afin que le système immunitaire des animaux soit mature.