Multisystémique

5 202 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue parce qu'elles auront été en contact avec une bactérie pathogène pour l'humain. Chacune subit une biopsie d'oreille par semaine pendant 42 jours, une prise de sang hebdomadaire pendant 42 à 92 jours, jusqu'à sept injections sous-cutanées et deux intramusculaires, et des piqûres de tiques dont les nymphes restent accrochées cinq jours. 216 souris sont utilisées uniquement pour produire des tiques infectées. L'infection par Borrelia peut provoquer des arthrites aiguës, une démarche anormale, une perte de tonicité et une paralysie des pattes, et le porteur écrit par ailleurs que les piqûres de tiques sont indolores pour l'animal.

Objectifs

La borréliose de Lyme (BL), maladie à transmission vectorielle prédominante en Europe, est causée par les spirochètes du complexe Borrelia burgdorferi sensu lato (sl). Cette maladie peut affecter divers tissus tels que la peau, le système nerveux, les articulations, le cœur, et occasionnellement, d'autres organes. La transmission des bactéries se fait par la morsure de tiques dures du genre Ixodes, parasites de nombreux hôtes, y compris petits et grands mammifères, oiseaux et reptiles. Les manifestations chroniques de la maladie incluent des complications neurologiques rares liées à l'infection par B. burgdorferi s.l. La pathogenèse de la maladie dépend de la génétique bactérienne, de la capacité de l'hôte à contrôler l'infection et des facteurs liés à la tique. 1. Objectifs Principaux du Projet : o Comprendre en détail les mécanismes de transmission de la maladie de Lyme par les tiques. o Identifier de nouveaux modèles murins d'infection à Borrelia reproduisant la gamme complète des symptômes humains en tirant parti de la diversité génétique de lignées murines pour mieux comprendre les mécanismes pathologiques et tester de nouvelles stratégies thérapeutiques. o Améliorer les connaissances pour une meilleure prise en charge des patients et des stratégies préventives. 2. Procédures Expérimentales : o Dans une première procédure, évaluer la sensibilité de 13 lignées murines après injection sous-cutanée de trois espèces de Borrelia burgdorferi européennes, choisies pour leur infectiosité élevée chez la souris de référence. o Dans une deuxième procédure, tester la réponse des souris à une infection naturelle par des tiques infectées par trois souches de la bactérie Borrelia. o Dans une troisième procédure, évaluer l'effet d'antibiotiques couramment utilisés dans le traitement de la borréliose de Lyme, ainsi qu'une combinaison de molécules agissant sur les formes persistantes de la bactérie. o Enfin, dans une quatrième procédure, évaluer l'effet protecteur de préparations vaccinales vis-à-vis de l'infection par des tiques infectées. Signification et Impact : • Contribuer à une meilleure compréhension de la pathogenèse de la maladie de Lyme. • Proposer de nouveaux modèles murins reflétant davantage la diversité des symptômes humains. • Tester l'efficacité de nouvelles stratégies thérapeutiques et de prévention.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à combler les lacunes dans la compréhension de la borréliose de Lyme, en mettant l'accent sur des approches novatrices pour les modèles murins, les traitements et les préventions, avec un objectif ultime d'amélioration des soins aux patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à des biopsies d’oreille un fois par semaine pendant 42 jours. Cette procédure ne dure que quelques secondes. Des prélèvements de sang au niveau du sinus retro mandibulaire seront réalisés toutes les semaines (durée 30 secondes) pendant une période pouvant varier de 42 à 92 jours. Des injections par voie sous-cutanée (1 à 7 fois) et intramusculaire seront réalisées (2 fois). Chaque injection ne dure que quelques secondes. Les souris seront également soumises à des piqures de tiques. Les nymphes restent attachées pendant 5 jours et les larves 3 jours. Les piqûres de tiques sont indolores pour l’animal.

Impact sur les animaux

Douleur, lésion, maladie : arthrites aiguës (gonflement des articulations), atteintes neurologiques aiguës (mouvements limités, démarche anormale, manque de tonicité, paralysie des pattes) lors de l’infection par les bactéries Borrelia. Environnement non adapté. Il y aura isolement des animaux pendant la durée du gorgement des tiques, pour une durée inférieure à une semaine On peut observer une perte de poids éventuelle durant le gorgement des tiques.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils auront été en contact avec un agent pathogène pour l’homme.

Remplacement

La transmission vectorielle est un phénomène complexe. Elle nécessite de bien comprendre les interactions entre le vecteur : la tique, le virus et l’hôte vertébré. La tique transmet l’agent pathogène lors d’un repas de sang au cours duquel le virus, une fois amplifié dans les glandes salivaires se transmet dans la salive de la tique. Or cette salive possède de nombreux rôles dont certains permettent de moduler la réponse immunitaire de l’hôte vertébré. L’agent pathogène est alors moins bien reconnu par le système immunitaire et peut donc mieux se développer. Il est donc très difficile voire impossible de mimer cette interaction in vitro sur des cellules. Le modèle animal est donc beaucoup plus pertinent.

Réduction

Nous envisageons lors de la première procédure de travailler dans le cadre de l’expérience 1 sur un petit nombre d’animaux par groupe (8 animaux des deux sexes) afin de déterminer les lignées les plus sensibles aux trois souches de Borrelia. Les 8 individus seront répartis en 2 cages par groupe (4 individus de sexe différent par cage). Dans le cadre de l’expérience 2, nous aurons 20 souris par groupe. Dans le cadre de la procédure 2, lors de l’expérience 1, le nombre de souris utilisées (216) pour l’obtention de tiques infectées est strictement lié à la biologie des tiques dont nous avons une excellente connaissance. Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser 10 individus par groupe pour pouvoir faire des mises à mort à différents temps et disposer de 2 individus dans le cadre des analyses que nous souhaitons mener. Dans le cadre de la troisième procédure, nous utiliserons 12 souris par groupe. Ces trois procédures nécessiteront lors de leur analyse d’utiliser des tests statistiques non paramétriques. Dans le cadre de la quatrième procédure, nous avons choisi d’utiliser 20 souris par vaccins. Ce chiffre est issu d’expériences déjà menées et qui ont montré que la sensibilité des expériences qui seront menées afin de démontrer l’efficacité d’un vaccin nécessite ce nombre d’animaux. En supposant un effet cage d’un certain niveau, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, un risque à 5% et une puissance à 80% de détecter des effets marqués ou forts.

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Les atteintes neurologiques seront évaluées plus précisément par l’utilisation de tests comportementaux. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques. Dès que le score atteindra 1, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du gel hydrique sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement supérieur à 10% ou bien si leur mobilité diminue. Si un score égal à 2 est atteint, les animaux seront mis à mort. Un renforcement de l’enrichissement sera effectué notamment dans le cadre de la procédure 1 afin que les animaux soient dans une ambiance confortable. Dans le cadre des procédures au cours de laquelle les animaux seront infectés par des piqûres de tique, les souris devront être isolées et nous ajouterons dans la cage des objets pour les distraire : bâtonnets, balles, coton. Les cages étant totalement transparentes et filtrantes, un contact olfactif, visuel et acoustique sera possible entre les animaux.

Choix des espèces

La souris est reconnue comme une espèce qui développe au moins certains des symptômes de la maladie de Lyme. Nous avons mis au point chez la souris un modèle expérimental d'infection prenant en compte les différentes conditions qui seront testées ici (salive de tiques, infection par des tiques). C'est la seule espèce à posséder des lignées présentant une large diversité génétique telles que celles du Collaborative Cross. Les souris seront des femelles et des mâles âgés de 5 à 7 semaines. S’il s’avère que l’un des deux sexes est plus sensible que l’autre à l’infection, nous n’utiliserons alors qu’un sexe sur les deux. Nous souhaitons que le système immunitaire soit mature lors de l’infection. Par ailleurs, les souris seront observées pendant 42j et nous souhaitons que les souris aient au maximum un âge de 12 semaines à la fin de l’expérience pour pouvoir les comparer avec les données déjà obtenues sur d’autres souris.

Infectées par instillation directe dans la trachée sous anesthésie, 216 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Elles passent ensuite neuf à dix-sept fois en tube de contention pour une mesure de composition corporelle, et quatre à neuf tests de tolérance au glucose, chacun précédé de cinq heures sans nourriture et suivi de sept prélèvements de sang à la queue. L'objectif est de mesurer ce qu'une infection bronchique chronique de trente à quatre-vingt-dix jours fait aux os, aux muscles et au métabolisme du glucose. Le porteur écrit que la perte de poids n'excède jamais 5 % et que les souris reprennent une activité normale en deux jours, tout en indiquant que l'infection peut se compliquer du décès de l'animal dans moins de 5 % des cas.

Objectifs

Notre projet a pour but d’étudier les effets de l’infection bronchique chronique au niveau extra-pulmonaire. Les infections pulmonaires chroniques sont une complication fréquente des maladies bronchiques chroniques et ont un lourd impact pronostic. Elles sont responsables d’un déclin plus rapide et plus marqué de la fonction respiratoire et d’une augmentation du nombre d’exacerbations respiratoires (aggravation aigue de la maladie chronique). De plus, les maladies respiratoires chroniques s'accompagnent souvent de comorbidités ou de manifestations extra-respiratoires telles que l'ostéoporose, la perte de muscles, la dénutrition, le diabète, et les maladies cardiovasculaires. Le rôle de l’infection pulmonaire chronique dans la survenue de ces manifestations extra-respiratoires n’est à ce jour pas connu et n’a jamais fait l’objet d’études spécifiques dans le cadre de modèles animaux. Le modèle murin d’infection bronchopulmonaire chronique développé dans notre laboratoire est particulièrement adapté à la réalisation d'études longitudinales. L’objectif de ce projet est donc d’étudier les effets de l'infection bronchique chronique sur la composition corporelle et musculaire, l'architecture osseuse, l'inflammation sanguine, et le métabolisme du glucose.

Bénéfices attendus

Notre projet vise à faire progresser les connaissances scientifiques afin de générer des bénéfices substantiels en santé humaine. Les infections pulmonaires chroniques, complications fréquentes des maladies bronchiques chroniques, ont un lourd impact sur la santé des patients et sont souvent associées à des comorbidités graves comme l'ostéoporose, la sarcopénie, la dénutrition, le diabète et les maladies cardiovasculaires. Cependant, le lien entre ces manifestations extra-respiratoires et les infections pulmonaires chroniques demeure largement inexploité scientifiquement, notamment dans les modèles animaux. Les bénéfices attendus de cette recherche sont multiples. Premièrement, elle permettra d'élucider les mécanismes reliant les infections bronchiques chroniques aux anomalies musculo-squelettiques et métaboliques, ainsi qu'à l'inflammation systémique. Ces connaissances pourraient conduire à l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour traiter ou prévenir ces complications chez les patients atteints de maladies bronchiques chroniques. Une meilleure compréhension de l'interaction entre l'infection chronique et le métabolisme du glucose pourrait offrir des pistes pour des interventions visant à réduire le risque de diabète chez ces patients. Deuxièmement, cette étude pourrait modifier les pratiques cliniques en améliorant le suivi et la prise en charge des patients. L'identification de biomarqueurs spécifiques d'inflammation systémique et d'infection chronique permettrait une meilleure surveillance de la progression de la maladie et d'ajuster les traitements en conséquence, ralentissant ainsi la progression des comorbidités et améliorant la qualité de vie des patients. Enfin, ce projet a le potentiel d'enrichir la littérature scientifique en fournissant des données précises et inédites sur les effets systémiques des infections pulmonaires chroniques. En résumé, ce projet permettra d'approfondir notre compréhension des infections pulmonaires chroniques et de leurs effets systémiques, tout en fournissant des bases solides pour le développement de stratégies thérapeutiques innovantes, avec des bénéfices à long terme pour les patients et le système de santé.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d'interventions. Tout d'abord, ils seront anesthésiés (anesthésie gazeuse) puis infectés par vvoie intra-trachéale directe. Cette intervention sera réalisée une fois pour chaque animal et devrait durer quelques minutes (anesthésie + infection). Des mesures de la composition corporelle des souris seront réalisées de manière répétée tout au long de l'étude (9, 13 ou 17 mesures selon le temps d’infection qui sera de 30, 60 ou 90 jours). Cette procédure implique la pesée des souris suivie d'une analyse par scanner à résonance magnétique nucléaire pour évaluer la masse grasse et la masse maigre de chaque animal. Le scan se fait en contention dans un tube adapté pour les rongeurs pendant 3 minutes (animal vigile). Enfin, seront effectués des tests métaboliques tels que l'IPGTT (test de tolérance au glucose intrapéritonéal). Pour évaluer les profils glycémique et insulinémique après une charge en glucose (IPGTT), les souris subiront une restriction alimentaire de 5 heures (de 9h à 14h), puis recevront du glucose en fonction de leur poids. Les mesures de glycémie seront prises à t=0’, 5’, 10’, 15’, 30’, 60’ et 120’ (prélèvement sanguin de 5 microlitres). Des prélèvements sanguins (environ 40 microlitres) seront effectués à t=0’, 15’, 30’ et 60’ pour doser l’insuline. La glycémie est mesurée en premier pour éviter tout impact de stress sur la valeur initiale. Durant tout le test, les animaux ont accès uniquement à l’eau, et la nourriture leur est remise à la fin du test. Les animaux sont laissés au repos pendant au moins une semaine entre chaque test. Ce test sera réalisé 4, 6 ou 9 fois sur chaque animal selon le temps d’infection (30, 60 ou 90 jours). Enfin, au terme de l'infection, les animaux seront mis à mort selon un protocole établi, impliquant une injection intrapéritonéale de d'anesthésiques et d'analgésiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux dans le cadre de ce projet sont : 1° Stress et inconfort liés aux manipulations : Les animaux seront soumis à des mesures régulières de poids et de composition corporelle, ainsi qu'à des prélèvements sanguins, ce qui peut causer du stress et de l'inconfort. 2° L'infection bronchique peut causer un stress initial (manipulation, anesthésie) et des difficultés respiratoires temporaires (résolutives en moins de 30 minutes suivant l'instillation généralement). Dans de rares cas (

Devenir

Tous les animaux du projet seront mis à mort au terme des différents temps expérimentaux.

Remplacement

Dans le domaine de la recherche en santé respiratoire, les alternatives non animales les plus fréquemment utilisées sont les modèles in vitro (cultures cellulaires) et les organoïdes. Ces méthodes présentent cependant des limitations significatives lorsqu’il s’agit d’étudier des systèmes complexes comme par exemple les réponses physiopathologiques mises en jeu au niveau systémique en réponse à une infection pulmonaire chronique. En effet, les modèles in vitro et les organoïdes ne permettent pas de reproduire de manière fidèle les interactions entre différents systèmes corporels ni de simuler l'inflammation systémique et les réponses immunitaires globales de l'organisme. Par conséquent, l'utilisation d'animaux vivants, en l'occurrence des modèles murins d'infection bronchopulmonaire chronique, est essentielle pour atteindre les objectifs de ce projet. Les souris offrent un modèle biologique pertinent en raison de leurs similarités physiologiques et immunologiques avec les humains, ce qui permet une évaluation détaillée et intégrée des effets systémiques des infections chroniques. Cela inclut l'étude des interactions entre l'infection pulmonaire et les réponses musculo-squelettiques, métaboliques et inflammatoires à l'échelle de l'organisme entier. En utilisant des modèles murins, nous pourrons obtenir des données précises et transposables, cruciales pour comprendre les mécanismes physiopathologiques et développer des stratégies thérapeutiques efficaces pour les patients. Enfin, les règles de l’éthique médicale ne nous permettent pas de réaliser ces études sur l’homme.

Réduction

Grâce à nos expériences passées sur des modèles animaux similaires, nous avons déterminé qu'un groupe de 8 animaux est généralement suffisant pour obtenir des résultats statistiques robustes. Toutefois, en raison de la variabilité inhérente à la qualité des instillations et du risque de décès par insuffisance respiratoire aiguë lors de ces procédures, nous avons décidé d'augmenter la taille des groupes à 10 souris. Cette approche a été validée par des études antérieures. Les autres mesures prises pour appliquer le principe de réduction ont été les suivantes : 1. Optimisation des techniques d’instillation : Nous avons raffiné et standardisé nos techniques d’instillation endotrachéale pour maximiser la consistance et minimiser les pertes animales. Une formation rigoureuse et continue des opérateurs est mise en place pour garantir la qualité des procédures. 2. Optimisation et maximisation du nombre et des types de prélèvement afin de réduire au maximum le nombre d’animaux nécessaires aux différentes analyses du projet. 3. Analyse en temps réel : L’utilisation d’analyses statistiques en temps réel permettra d'arrêter l’expérience dès que les données suffisantes auront été recueillies, évitant l’utilisation de plus d'animaux que nécessaire. Analyses statistiques : • Études de survie : Les courbes de Kaplan-Meier seront utilisées pour analyser la survie des animaux, permettant une visualisation claire des différences potentielles entre les groupes. • Données quantitatives : Les données seront initialement analysées à l’aide du test de Kruskal-Wallis, qui est adapté aux échantillons non paramétriques et permet de détecter les différences globales entre les groupes. • Comparaisons multiples : Si le test de Kruskal-Wallis révèle une différence significative, des comparaisons multiples seront effectuées à l’aide du test de Dunns, pour identifier spécifiquement quelles paires de groupes diffèrent.

Raffinement

Toutes les procédures invasives seront effectuées par un expérimentateur entraîné. L’instillation des billes se fera sous anesthésie générale. Nous prévoyons une surveillance clinique quotidienne des animaux dans les 5 jours suivant l'instillation. Un score de douleur et de confort respiratoire sera établi en observant quotidiennement le comportement des animaux. Si nécessaire une analgésie sera mise en place ou si ce score est considéré comme trop important, l’animal sera mis à mort. Les souris seront hébergées à 5 par cages au maximum et du matériel d’enrichissement (nidification, jeux…) sera mis à disposition dans les cages. Elles bénéficieront d’une période d’adaptation minimale de 7 jours entre leur arrivée dans l’animalerie et le début des expérimentations. Tout animal présentant des signes de détresse respiratoire ou moribond sera mis à mort.

Choix des espèces

L'utilisation des souris dans ce projet présente plusieurs avantages significatifs. Leur petite taille facilite leur hébergement en animalerie, permettant de maintenir un grand nombre d'animaux dans un espace réduit tout en assurant leur bien-être. Les manipulations, y compris l'anesthésie, sont relativement simples à mettre en œuvre, ce qui minimise la souffrance et l'inconfort des animaux tout au long des procédures expérimentales. La physiopathologie de l'infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris est remarquablement similaire à celle observée chez l'homme. Cette similitude permet une transposition pertinente des résultats aux conditions humaines, ce qui est crucial pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. De plus, notre modèle d’infection broncho-pulmonaire chronique chez la souris a été validé par la communauté scientifique, en particulier dans le cadre de la recherche sur la mucoviscidose (Martin et al., European Respiratory Journal, 2011). L'utilisation continue de ce modèle nous permettra de fournir des données novatrices sur les infections respiratoires chroniques et leurs effets systémiques. En résumé, les souris représentent un modèle idéal pour notre étude en raison de leur gestion pratique, de la simplicité des procédures expérimentales, et de leur pertinence biologique pour comprendre les mécanismes des infections broncho-pulmonaires chroniques et leurs comorbidités associées.

8 650 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux subissent un tatouage des coussinets et une biopsie de la queue pour le génotypage, puis les jeunes de quatre à cinq semaines reçoivent des injections intrapéritonéales et sous-cutanées pendant un à quinze jours consécutifs selon le composé testé. Il s'agit de croiser deux lignées mutantes avec trois autres et de tester cinq molécules sur la formation de la gaine de myéline, les animaux atteints présentant des tremblements et une prostration qui les empêchent de se nourrir. Le porteur qualifie le recours au modèle animal d'"indispensable" pour comprendre le développement des cellules myélinisantes, et renvoie les retombées thérapeutiques annoncées à un terme qu'il ne précise pas.

Objectifs

Nous cherchons à déterminer le rôle d'un mécanisme moléculaire qui touche l'ARN pendant la formation et le maintien de la gaine de myéline qui entoure les nerfs chez la souris. Pour cela, nous avons généré deux modèles de souris. Le premier modèle permet d’étudier le rôle de ce mécanisme au cours du développement. Le deuxième permet une analyse chez les souris adultes. Nous souhaitons croiser ces 2 modèles avec 3 souris mutantes ou administrer par injection ou grâce à une alimentation modifiée 5 molécules différentes pour déterminer si cela permet de corriger les défauts observés. A terme, ces études permettront de proposer de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Le principal bénéfice attendu est de déterminer si les traitements de deux modèles souris à l’aide de différentes molécules impliquées dans les voies de signalisation du stress peuvent corriger les anomalies de myélinisation périphériques et centrales. A terme, ces études permettront d'améliorer la prise en charge des patients en proposant de nouvelles approches thérapeutiques.

Procédures

Les souriceaux des lignées subiront un tatouage des coussinets des phalanges et une biopsie à la queue qui engendrent un stress et une douleur de courte durée. Les mutants et les contrôles (issus de la même portée) de 4 à 5 semaines (poids >15g) subiront une injection intrapéritonéale et sous-cutanée d'une durée d'environ 15 secondes sur 1 à 15 jours consécutifs en fonction du composé.

Impact sur les animaux

Les étapes d’anesthésie, d’injection et contention peuvent également provoquer un stress chez l’animal. Les atteintes périphériques et centrales attendues se traduisent par des tremblements et des animaux prostrés qui se nourrissent mal, des nuisances qui seront également prises en compte dès apparition.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de la procédure pour prélèvement d'organes et analyses phénotypiques et génétiques.

Remplacement

Le recours à l’utilisation d’un modèle animal est indispensable afin de comprendre comment les mutations d’intérêts impactent le développement et le maintien des cellules myélinisantes du système nerveux central et périphérique. L’étude des anomalies du développement de ces cellules et celle des mécanismes impliqués dans le maintien de la myéline ne peuvent pas être réalisées uniquement in vitro car elles nécessitent des interactions entre les différents types cellulaires.

Réduction

Pour chaque tissu et à chaque stade, nous anticipons que 5 animaux pour le lot mutant et le même nombre pour le lot contrôle doivent permettre d'obtenir des résultats significatifs. Les effectifs ont été déterminés pour une puissance de 80% et une p-value

Raffinement

Les femelles et leurs petits seront maintenus dans des cages contenant des enrichissements. Les nouveaux nés mutants seront surveillés quotidiennement. L'identification du phénotype délétère sera réalisée le plus tôt possible au cours du développement de l'animal et les animaux seront mis à mort dès qu'une souffrance sera détectée (prostration, tremblements...). Des points limites et une grille de score ont été définis. Points limites généraux : Souris adultes : observation quotidienne par le personnel de l’animalerie et par l’expérimentateur de l’apparence des animaux et de leur comportement ; pesée une fois par semaine. Nouveaux nés : observation quotidienne par le personnel de l’animalerie et l’expérimentateur : absence de vitalité, isolement et absence de poche de lait. En cas d’observation de l’un de ces critères : mise à mort. Des souris de 4 semaines ou plus recevront un analgésique pré-opératoire et une dose d’anesthésique et antalgique et seront mises à mort.

Choix des espèces

Les mécanismes impliqués dans le développement des cellules myélinisées du système nerveux central et périphérique sont très conservés entre l'homme et la souris. En particulier, les phénotypes observés après délétion d’un grand nombre de gènes sont très similaires dans les deux espèces. Le modèle animal permet donc d'étudier la fonction de chacun des gènes d'intérêt au cours du développement et dans des organes de choix (nerf sciatique ou cerveau). De plus, il existe un ensemble d’outils (anticorps, culture organotypique, utilisation de lignées transgéniques permettant de tracer exclusivement le devenir des cellules de choix...) qui ont été développés quasiment exclusivement chez la souris. Nous étudierons des embryons à E18.5 mais aussi des nouveaux nés (P0, P4) et des animaux entre P30 et 4-10 semaines. Ces stades correspondent à des phases précises de développement des cellules d’intérêt que nous souhaitons étudier (E14.5/E18.5 correspond à la phase de développement des cellules d’intérêt ; P0/P4 correspond au début des processus de myélinisation périphérique ; Les analyses à P30-10 semaines et plus permettront de déterminer le rôle du gène d’intérêt sur le maintien de la myéline périphérique qui est mature à ces stades).

840 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune maintenue sept, huit, seize ou vingt-quatre semaines sous un régime enrichi en graisse, en cholestérol ou en fructose destiné à lui faire développer une obésité, une résistance à l'insuline, une stéatose du foie et une athérosclérose. Les femelles gestantes sont isolées cinq jours avant la mise bas et soumises au même régime, ce qui expose aussi les fœtus. Après une mise à jeun et deux tests métaboliques, les souris sont anesthésiées puis tuées pour le prélèvement de sang et d'organes. Ce projet pilote sert à choisir la lignée et le régime des études à venir, et le porteur annonce qu'il réduira le nombre d'animaux, sans qu'aucun calcul d'effectif ne soit donné pour ces 840 souris.

Objectifs

Ce projet est une étude pilote qui a pour objectifs de : 1) Déterminer le modèle murin génétiquement modifié le plus adapté dans le cadre de projets de recherche étudiant l’impact de l’altération du métabolisme des lipides dans les maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité : athérosclérose, troubles du rythme cardiaque, maladies du foie non alcoolique (stéatose, stéatohépatite et fibrose hépatique), résistance à l’insuline et diabète. En effet, les souris non génétiquement modifiées soumises à un régime riche en graisse ou en cholestérol ne développent pas l’ensemble du spectre des maladies observées chez l’Homme de manière spontanée. Pour cela il est nécessaire d’utiliser des souris dont le métabolisme des lipoprotéines, les transporteurs circulants de lipides, a été modifié pour se rapprocher de celui trouvé chez l’Homme. Cette étude pilote a pour but de valider quelle serait la meilleure lignée à utiliser pour permettre de répondre aux questions scientifiques du projet. 2) Déterminer le régime optimum qui permettrait d’étudier les différents aspects des maladies cardio-métaboliques associées à l’obésité pour ces modèles. Ceci permettra de valider le choix de la lignée à utiliser, mais également de faciliter les échanges de données et donc de diminuer le nombre total d’animaux requis pour les différents aspects du projet..

Bénéfices attendus

Ce projet pilote permettra de sélectionner l’association régime/ génotype la plus adaptée pour répondre à différents objectifs scientifiques. Il permettra d’harmoniser les régimes et le modèle murin et de réduire le nombre d’animaux in fine. A plus long terme, le projet d’étude qui pourra être lancé permettra d’étudier les mécanismes associés à l’émergence de l’athérosclérose liés aux troubles métaboliques. De plus, ce projet permettra également de conforter l’hypothèse d’une programmation périnatale du développement de l’athérosclérose à l’âge adulte. L’ensemble de ces données permettra d’identifier et de stratifier des populations humaines potentiellement à risque et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les animaux impliqués dans ce projet (cohorte adulte et cohorte « développement » avec femelles gestantes et allaitantes) seront mis sous un régime riche en graisse et ou en fructose, et ou en cholestérol pour des durées variables (7, 8, 16 ou 24 semaines). La cohorte de souris adulte sera soumise à un prélèvement faible de sang sous anesthésie (moins de 10 min) avant la mise sous régime riche. Après le régime riche en graisse, les souris seront mises à jeun et rapidement évaluées sur le plan métabolique (moins de 2 h), incluant un faible prélèvement de sang afin de mesurer le sucre dans le sang suite à une administration de glucose ou d’insuline. Les souris seront ensuite anesthésiées avant une euthanasie, afin de permettre les prélèvements de sang et d’organes nécessaires pour réaliser les analyses poussées requises pour ce projet.

Impact sur les animaux

Les femelles gestantes de la cohorte « développement » seront en hébergement individuel pendant 5 jours avant la mise-bas afin de préparer leur nid et assurer une alimentation comparable de leurs souriceaux, ce qui diminuera leurs interactions sociales pendant cette période. Elles seront exposées à un régime riche en graisse plus ou moins cholestérol plus ou moins fructose, ce qui pourrait générer un inconfort pour elles et le développement des fœtus. A partir de 8 semaines, les souris de la cohorte adulte seront exposées à des régimes riches en graisse plus ou moins cholestérol et plus ou moins fructose ou saccharose pendant 8,16 ou 24 semaines afin d’induire une obésité et les désordres métaboliques associés : altération du métabolisme lipidique, insulino-résistance, etc. Ceci pourrait induire un inconfort. De plus, les souris seront soumises à deux tests d’évaluation du métabolisme qui inclus une mise à jeun et de très petits volumes de prélèvement de sang.

Devenir

Les souris impliquées dans les expériences seront euthanasiées à la fin de la période de maintien prévue et les tissus récupérés. L’euthanasie est en effet requise afin de réaliser les dosages moléculaires et anatomiques fins, sans induire plus d’inconforts aux animaux.

Remplacement

Le dialogue inter-organes (cœur-foie, foie-vaisseaux sanguins, foie-tissus adipeux …) impliqué dans les maladies cardio-métaboliques, et entre les différents types cellulaires (macrophages/hépatocytes ou adipocytes) au sein d’un organe, est particulièrement complexe et ne permet pas leurs études in vitro dans des cultures cellulaires ou organotypiques. Ainsi l’impact global d’un stress lipidique induit par un régime peut être différent en fonction du tissu ou des cellules observées. D’autre part, il faut prendre en considération le concept que l’altération d’une fonction cellulaire (par exemple des macrophages) dans un environnement tissulaire spécifique peut avoir un écho profond dans des tissus/organes plus distants. La réalisation du projet ne peut donc s’envisager qu’à l’échelle de l’organisme entier afin d’avoir une approche globale et intégrée des mécanismes impliqués.

Réduction

Des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Les études bibliographiques préalables ont permis de réduire le nombre de lignées potentiellement intéressantes pour le projet à 2 lignées qui seront testées en séquentielle, la seconde n’étant produite qu’en cas d’échec avec la 1ère. De même, le choix préalable des régimes a pu être réduit au maximum afin d’induire les altérations cardio-métaboliques souhaitées tout en évitant les biais. La sensibilité à l’émergence des maladies métaboliques présente une différence sexuelle importante. Il convient donc de caractériser finement les animaux des deux sexes ainsi que les mécanismes impliqués, en accord avec les recommandations des sociétés savantes internationales et des comités éditoriaux des journaux scientifiques .

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Les animaux seront manipulés avec douceur, par du personnel formés et compétents, qui sera vigilant en cas de réaction comportementale excessive, ou de mal-être. Les animaux sont hébergés dans des conditions conformes à la réglementation. L’enrichissement des cages sera renforcé pour les femelles gestantes et allaitantes qui seront en hébergement individuel avec leurs petits, avec minimum de la frisure de papier kraft et un bâton à ronger.

Choix des espèces

L’objectif de ce projet est de valider les conditions nutritionnelles qui permettent de programmer le développement d’une athérosclérose suite à une exposition périnatale. L’étude chez l’adulte permettra de d’associer le développement de maladies cardiovasculaires au régime alimentaire périnatale, mais sans éliminer l’impact du vieillissement. L’étude chez les souriceaux âgés de 10 jours quand ceux-ci sont strictement nourris au lait maternel permettra d’estimer si ce lien existe dès ce stade précoce, et ainsi de valider l’hypothèse d’une transmission maternelle. Ceci a également une importance pour la santé humaine car des hausses sensibles de la pression artérielle ont été observées chez des pré-adolescents avec un historique fœtal (retard de croissance, prématurité).