Multisystémique

Une injection d'huile minérale dans le ventre déclenche chez les souris de ce projet un lupus qui se développe ensuite sur huit à vingt-quatre semaines. 1 940 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse de leurs organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Certaines reçoivent jusqu'à dix injections intrapéritonéales en quinze jours et un prélèvement sanguin sous anesthésie, l'objectif étant de savoir si la suppression d'une cellule immunitaire rare, le basophile, freine la maladie. Le porteur écrit que ni douleur chronique ni souffrance permanente ne sont attendues et qu'aucun médicament contre la douleur n'est donc "nécessaire", tout en décrivant une maladie inflammatoire chronique entretenue pendant six mois.

Objectifs

Le projet a pour but d'analyser l'implication de cellules immunitaires rares (les basophiles) dans l'amplification des facteurs responsables d’une maladie inflammatoire chronique, complexe et autoimmune (quand le système immunitaire se retourne contre l'organisme lui-même) : le lupus érythémateux systémique (LES). Les traitements actuellement utilisés dans cette maladie chez les patients ne sont pas spécifiques et ont de lourds effets secondaires. Il est donc important de mieux comprendre ces maladies et de développer des approches thérapeutiques innovantes. Dans ce but, des souris génétiquement modifiées au niveau des cellules d’intérêt seront utilisées pour évaluer l’importance de ces cellules et de leurs protéines dans le développement et le maintien de la maladie. Le projet a également pour objectif d’étudier l’efficacité thérapeutique de la suppression de ces cellules dans un modèle murin de la maladie afin de pouvoir développer l’approche chez l’humain.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension du développement du LES et les mécanismes de l’amplification de la maladie. Le deuxième niveau se situe au niveau de la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et la validation de nos cellules d'intérêt comme cible thérapeutique dans le lupus permettra de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes ciblant les basophiles et/ou les mécanismes décrits. Le but est d’améliorer la prise en charge des patients atteints de Lupus qui n’ont pas accès à des traitements spécifiques dénués d’effets secondaires.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales »), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et certains seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang (0.1 mL) une seule fois sous anesthésie générale. Chacun des gestes réalisés durent moins de 30 secondes. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale une seule fois dans le but d'induire la maladie étudiée. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale cinq fois sur une période de 8 ou 24 semaines: une fois dans le but de d'induire la maladie étudiée et 4 fois dans le but d'éliminer les cellules étudiées sur une période de 10 jours. Ces dernières souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale une seule fois avant d'éliminer les cellules d'intérêt la première fois. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins de la maladie avant et après élimination des cellules. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale de huit à dix fois sur une période de 15 jours dans le but d'étudier l'effet de l'élimination des cellules d'intérêt dans un modèle de vaccination.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables induits sur les animaux sont de deux catégories. La première catégorie concerne le stress et les douleurs brèves induites par la contention manuelle des animaux, les injections intrapéritonéales multiples et les prélèvements sanguins (une seule fois) sous anesthésie générale. La deuxième catégorie concerne l’induction d’une maladie inflammatoire chronique (le lupus) par l’injection d’une huile minérale (pristane) dans le péritoine (le ventre) des souris. Cette huile peut induire, chez un faible pourcentage de souris, une difficulté respiratoire sur 2-3 jours, 2 à 3 semaines après l’injection. Après ce stade, la gêne disparaît. Les souris seront suivies de très près pendant cette phase pour s’assurer qu’aucune ne développe une forme respiratoire grave. La maladie induite (lupus) se développe alors sur une période de 8 à 24 semaines.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort en fin de procédure afin d'en analyser différents organes. La mort sera confirmée par vérification de l'arrêt cardio-respiratoire.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro (dans des systèmes artificiels) ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes ni des maladies étudiées. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour les études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

L’étude de cellules humaines ex vivo (en dehors de l'organisme) et l’analyse des échantillons de patients a permis de réduire les hypothèses de travail et ainsi de limiter le recours aux modèles animaux. Les souris contrôles des procédures seront également utilisés pour réaliser des cultures cellulaires et des expériences in vitro après leur mise à mort. Les échantillons des souris chez lesquelles la maladie a été induite serviront de contrôles positifs pour des expériences ultérieures. Le but est de valider nos approches thérapeutiques afin de pouvoir les développer pour la pathologie humaine. Le nombre d’animaux qui seront utilisés est réduit au minimum mais est suffisant pour pouvoir obtenir des conclusions scientifiques solides.

Raffinement

Ni douleur chronique, ni souffrance permanente, ni environnement angoissant ne sont attendus dans les procédures du présent projet. Aucun médicament contre la douleur n'est donc nécessaire. Tous les animaux seront observés quotidiennement par le personnel compétent de l'animalerie. Afin de réduire au minimum le stress et la douleur qui pourraient être ressentis par les souris, nous prévoyons la mise en place de différentes actions : Les animaux sont élevés en conditions standardisées afin d'éviter qu'elles soient contaminées par des agents infectieux. L’enrichissement de l’environnement des souris dans les cages (cotons pour construire des nids, maisonnettes en plastiques pour se cacher…) permet d’optimiser le bien-être des animaux. Un suivi quotidien (par les animaliers et/ou les expérimentateurs) des animaux sera réalisé afin de détecter des signes de mal-être, en s’appuyant sur l’évaluation visuelle de différents paramètres (comportement, apparence physique, blessures). Les animaux devant être prélevés d'un peu de sang pour des analyses le seront après une brève anesthésie générale. Différentes actions seront mises en place allant de l’ajout de nourriture dans la cage à l’euthanasie anticipée de la souris. Les procédures dureront 24 semaines maximum pour notre modèle induit (souris âgées de 32 à 36 semaines au maximum en fin de procédure). Tous les animaux seront euthanasiés en fin de procédure pour analyse des paramètres de la pathologie. Aucun animal ne sera réutilisé dans des expériences ultérieures. L’état général des animaux chez qui la pathologie est induite sera suivi sur une grille de score permettant de s’assurer que l’état des animaux n’est pas altéré. En cas d’altération trop marquée, les animaux concernés seraient euthanasiés immédiatement.

Choix des espèces

L’espèce Mus musculus (souris) est le seul modèle de mammifères disposant des animaux modifiés génétiquement pertinents pour les objectifs scientifiques de notre projet ayant trait au lupus. Toutes les souris entreront en procédure à l’âge adulte (minimum 8 semaines d’âges) et seront analysées au maximum à 36 semaines d’âge.

Nées avec une mutation qui bloque la dégradation du céramide, les souris de ce projet ont une espérance de vie de 100 jours et développent dès trois semaines un retard de croissance, un gonflement du foie et de la rate et une faiblesse musculaire qui leur rend l'accès à la nourriture difficile. 1 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des vecteurs viraux censés apporter une copie fonctionnelle du gène ASAH1. Chaque mois, elles subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie au sinus rétro-orbital ou à la mandibule, une mesure de conduction nerveuse de vingt minutes et une heure trente d'observation de leur activité, avant un prélèvement terminal de muscles et une perfusion de fixateur par le flux sanguin. Les souris qui héritent de la mutation partent toutes en expérimentation puis sont tuées, celles qui n'en héritent pas sont mises à la reproduction pour entretenir l'élevage ou tuées faute d'usage.

Objectifs

La maladie de Farber et l’amyotrophie spinale associée à une forme d’épilepsie progressive myoclonique (SMA-PME) sont deux maladies génétiques rares causés par des mutations dans le gène ASAH1. Ce gène produit une enzyme appelée céramidase acide, qui décompose une substance appelée céramide dans les cellules. Lorsque ce gène est défectueux, l'enzyme ne fonctionne pas correctement, entraînant une accumulation toxique de céramide dans les cellules. Ces maladies affectent principalement le système nerveux et d'autres tissus du corps. Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif pour ces maladies. Notre projet vise à développer une thérapie génique pour traiter le déficit en céramidase acide. Pour cela, nous utilisons de virus modifiés appelées AAV comme transporteurs pour introduire une version correcte du gène ASAH1 dans les cellules des patients. Nous avons testé cette thérapie chez des souris modèles représentant la maladie de Farber. Deux méthodes d'injection ont été explorées : l'injection dans tout le corps et l'injection directement dans le cerveau. Les deux méthodes ont montré une amélioration de la survie des souris et une correction des symptômes de la maladie. Cependant, l'utilisation de ce vecteur à des fortes doses peut provoquer des altérations dans certains tissus après injection dans tout le corps. Par conséquence, l'objectif actuel de notre projet est de tester de nouveaux virus AAV qui ciblent plus efficacement les cellules malades. Cela nous permettrait de réduire la dose nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique après injection dans tous les corps, minimisant ainsi les risques d'inflammation. Enfin, pour l’injection directe dans le cerveau il est important de confirmer si une telle méthode d’administration pourrait représenter une stratégie efficace pour traiter les formes du déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’investiguer sur des défauts tissulaires dû à la maladie pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients qui aujourd’hui n’existe pas. D’abord nous allons investiguer sur la présence ou non d’une atteinte au niveau de la barrière hémato-encéphalique. Si cette hypothèse se révèle correcte, nous en tiendrons compte pour ajuster la conception des thérapies, y compris le choix du vecteur et la dose, afin de favoriser une distribution optimale du traitement. Par la suite, nous espérons choisir un vecteur AAV qui cible mieux les cellules affectées par la maladie. Cela nous permettrait d'utiliser une dose plus faible pour obtenir une correction complète, réduisant ainsi les coûts de production du produit et les effets secondaires liés aux doses élevées, comme observé lors des études précédentes. Enfin, nous aurons une vue plus claire sur l'efficacité de l'injection directe dans le cerveau comme méthode d’administration pour traiter les formes de déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Procédures

Le prélèvement d’un petit bout de queue (2/5 mm) sera effectué sur des souris à la naissance ou à 15 jours de vie (5sec). L’administration des vecteurs AAV sera réalisé par voie intraveineux (15sec si volume ≤100 µL/20g; jusqu’à 1min si volume ≤ 250µL/20g) et par voie intra-cérébro-ventriculaire (ICV) (15sec). Afin d’évaluer l’efficacité du traitement lors des études, des tests fonctionnels pourront être réalisés chez des animaux vigiles : évaluation de leur activité tous les mois pendant 1h30 et analyse de leur force musculaire toutes les semaines pendant 10min. La force spécifique d’un muscle sera étudié chez d’autres animaux anesthésiés pendant 1h15 par animal une seule fois lors de l’étude. L’analyse de la transmission électrique entre les nerfs et les muscles sera réalisée chez des animaux anesthésiés pendant 20min tous les mois lors de l’étude. Chaque mois afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique, tous les animaux seront anesthésiés pendant moins de 5min pour réaliser un prélèvement de sanguin. En fin d’étude, des prélèvements de muscles (5min) ainsi que l’injection d’un fixateur par perfusion via le flux sanguin (5min) seront réalisés sous anesthésie générale et sans réveil pour l’animal.

Impact sur les animaux

La mutation dans le gène Asah1 chez la souris entraîne une accumulation toxique de céramide dans plusieurs organes de l’animale en accord avec les manifestations cliniques aussi décrites chez l’homme. Les animaux ont une espérance de vie de 100 jours, avec des symptômes apparaissant dès 3 semaines de vie : retard de croissance, gonflement du foie et de la rate, et faiblesse musculaire généralisée, rendant les déplacements et l'accès à la nourriture difficiles. Le test d'échappement peut causer une légère nuisance avec un pincement de la queue, provoquant rarement un léger saignement. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Certaines souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les accouplements nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage. Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage seront euthanasiées. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales et seront euthanasiées à la fin de la procédure expérimentale ou en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.

Remplacement

Le modèle murin utilisé dans ce projet est le premier modèle pertinent publié dans la littérature qui récapitule les symptômes retrouvés chez les patients affectés par la maladie de Farber. Des modèles in vitro 2D existent, mais ils ne permettent pas d’étudier certains défauts majeurs de la pathologie, tels que l'infiltration de cellules immunitaires dans les organes cibles de la maladie. Les modèles in vitro 3D (ou organoïdes) ne possèdent pas à ce jour toutes les structures anatomiques spécifiques de chaque organe. De plus, on ne peut pas reproduire exactement la biodistribution du vecteur après administration dans le corps entier, ce qui limiterait les informations collectées pendant les études pour la transposabilité des résultats vers des études précliniques. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été déterminé à l’aide de calculs statistiques. Cela permet d’observer les différences entre les animaux sains et malades concernant la barrière hémato-encéphalique, d’étudier le potentiel thérapeutique de chaque vecteur testé et de maintenir les lignées tout au long du projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies avec du coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Concernant les souris porteuses de la mutation pour le gène Asah1, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. De plus, un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès à la nourriture des souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis pour chaque procédure et manipulation. En cours du suivi du traitement, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire ou rétro-orbitale, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et le prélèvement sera au maximum du 10% de volume sanguin total de la souris. La méthode de prélèvement sanguin sera adaptée et réalisée au sinus rétro-orbital dans le cas où un processus de cicatrisation serait en cours (présence de croute, hématome, rougeur ou gonflement). L’œil sur lequel le prélèvement est effectué sera noté sur la fiche de suivi de l’animal afin de privilégier l’autre côté pour un prélèvement le mois suivant. Raffinement pour analyses fonctionnelles et prélèvement des muscles : afin de réaliser une mesure de force musculaire, l’animal recevra une injection d’analgésique en sous-cutanée, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles, et sera anesthésié par voie intrapéritonéale. L’animal sera également disposé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.

Choix des espèces

Pour évaluer des stratégies thérapeutiques contre le déficit en céramidase acide, le modèle murin porteur d’une mutation dans le gène Asah1 a été choisi car il reproduit très fidèlement les symptômes de la maladie observées chez l’homme. Pour générer les animaux nécessaires à l’étude, les souris seront mises en reproduction entre l’âge de 8 semaines et 6 mois. Afin d’investiguer un défaut de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, les animaux contrôles et malades seront injectés à l’âge de 7 semaines et euthanasiés 8 jours après le traitement. À ce stade, la pathologie est suffisamment avancée pour déterminer si une altération existe et pour étudier les conséquences à court terme sur la capacité du vecteur à atteindre les régions touchées par la maladie. Lors de l’étude visant à identifier la combinaison vecteur-dose la plus efficace après injection via la veine de la queue, les souris seront traitées à l’âge de 7 semaines. Pour évaluer si l’injection directement dans le cerveau de vecteurs sélectionnés peut prévenir l’état inflammatoire dans le système nerveux central ainsi qu’au niveau des tissus périphériques pour les formes les plus sévères et précoces de la maladie, les animaux seront traités le jour de leur naissance.

Jusqu'à vingt et une administrations espacées de huit heures et dix micro-prélèvements de sang à l'extrémité de la queue, sur quarante-huit heures au minimum : 1 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour recueillir les échantillons. Le projet mesure la concentration sanguine de quatre-vingts candidats médicaments par an pendant cinq ans, à raison de trois souris par condition testée. Le porteur écrit renoncer à toute grille de score parce qu'un score obligerait à maintenir la souffrance de l'animal pour en suivre l'évolution, et prévoit la mise à mort dès 2 à 5 % d'écart de poids. Le choix de la souris tient à ce qu'elle est l'espèce la plus utilisée pour cette mesure et à ce que sa petite taille consomme moins de composé, certains candidats médicaments étant difficiles à synthétiser.

Objectifs

Pour le développement de nouveaux médicaments, il est nécessaire d'étudier le devenir de la substance active dans l'organisme, dans le but de déterminer : l’absorption, la distribution, le métabolisme et l’élimination du composé (ADME), des propriétés qui vont influencer la posologie du candidat-médicament (dose administrée et fréquence d'administration). L’objectif scientifique est de suivre la concentration sanguine de produits pharmacologiques en cours de développement chez la souris. Les produits pourront être de différentes natures (chimique, peptidique, oligo-nucléotidique) et/ou pour diverses applications : analgésie, anti-inflammatoire, antibiotique, immunodépresseur, anticancéreux, cardio-protecteur, anti-arthrosique, antidépresseurs, neuro-protecteur…

Bénéfices attendus

La mesure de la concentration sanguine au court du temps des candidats-médicaments permettra de sélectionner les plus adaptés et d’en affiner la posologie (dose et fréquence d’administration) selon les résultats de l’ADME. Ce projet s'inscrit pleinement dans les étapes indispensables au développement des candidats-médicaments. Il permet de réduire drastiquement le nombre de candidat-médicament à tester dans les études d’activité et le nombre d'études nécessaires pour mesurer ensuite l’activité des candidats-médicaments sélectionnés, tout en augmentant les probabilités d'obtenir un médicament.

Procédures

Les animaux seront soumis à des injections pour l'administrer les candidat-médicaments étudiés. Les candidat-médicaments et médicaments étudiés seront administrés 1 à 21 fois avec un minimum de 8h entre chaque administration. Une anesthésie de quelques minutes est nécessaire pour le rasage des animaux et pour les administrations ID, IN, IT. Afin de suivre la concentration sanguine du candidat médicament au cours du temps, un maximum de 10 micro-prélèvements de sang (environ 1min) seront réalisés à l’extrémité de la queue et sur une durée minimum de 48h.

Impact sur les animaux

Les injections entraînent une douleur légère de courte durée, de même que la section de la pointe de la queue (moins d’un demi millimètre) utilisée pour permettre les prélèvements sanguins.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure expérimentale afin de recueillir les échantillons nécessaires aux analyses

Remplacement

Les candidats-médicaments auront été sélectionnés préalablement pour leur activité et leur innocuité sur les modèles cellulaires, ainsi que pour leur caractéristiques pharmacochimiques (solubilité, stabilité plasmatique et microsomale…). Cependant, tous les essais réalisés ne peuvent prédire avec exactitude l’ADME d’un composé car aucun modèle alternatif (bio-informatique, moléculaire et/ou cellulaire) n’est suffisamment intégré et complexe pour reproduire l’ensemble des phénomènes biologiques impliqués dans l’absorption, la distribution, la dégradation et l’élimination des médicaments. Ces phénomènes biologiques sont liés à la circulation sanguine, aux barrières biologiques et aux voies d'élimination (dégradation par le foie, élimination biliaire et rénale...) et régulent l’activité des médicaments. Pour ces raisons, une approche chez l’animale reste indispensable pour sélectionner les candidats-médicaments les plus prometteurs avant de poursuivre leur développement. La mesure de la pharmacocinétique sera réalisée chez le souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments.

Réduction

La réalisation des procédures par un technicien rompu à ces manipulations garantit une bonne reproductibilité et permet de limiter le nombre d’animaux à engager dans les protocoles. La procédure expérimentale parfaitement maîtrisée permet une mesure efficace à l’aide de 3 souris par condition testée. La mise en place de micro-prélèvements répétés chez un même animal permet de réduire drastiquement le nombre d’animaux utilisés pour suivre la concentration sanguine des candidats médicaments. Les résultats sont exploités sous la forme de courbes cinétiques et aucune comparaison statistique n’est requise. Il est prévu de mesurer la pharmacocinétique de 80 composés chaque année sur une période de 5 ans soit un maximum de 1200 souris.

Raffinement

La procédure expérimentale est conçue pour garantir le bien-être de l’animal et réduire au maximum l’inconfort, le stress et la souffrance. La souris étant un animal social, les souris seront maintenues en groupes sociaux, dans des cages enrichies d’un tube de change et de matériaux de « nidification ». Une période d'acclimatation et d'habituation de 2 semaines sera respectée mais pourra exceptionnellement être ramenée à une semaine minimum en cas de contraintes temporelles (délai de livraison, délai trop court avant une période de travaux ou avant le vide sanitaire suivant…). Le bien-être des animaux sera pris en compte tout au long de l’étude, avec un suivi journalier de l’état des animaux par l’expérimentateur. Les souris seront anesthésiées pour permettre certaines administrations (intranasale, intratrachéale, intradermique, intramusculaire). Les souris seront alors placées sur un tapis chauffant afin de prévenir une hypothermie durant l’anesthésie. La douleur liée aux injections est une douleur ponctuelle réversible qui fera l’objet d’une surveillance de l’animal. Les animaux seront particulièrement surveillés après l’administration des candidats-médicaments ou des sondes, pour mettre en évidence tous signes de toxicité imprévue qui nécessiterait la mise à mort de l’animal. Aucun animal ne sera maintenu en vie s’il présente des signes de douleur ou d’inconfort. Pour cette même raison, aucun « scoring » n’est envisagé, car il nécessite de maintenir la souffrance de l’animal pour en évaluer l’évolution. Il arrive cependant qu’aucun signe extérieur de douleur ne puisse être observé, et que seule une perte ou absence de prise de poids soit mise en évidence. Dans ce cas, les animaux seront mis à mort dès la mise en évidence d’une différence significative (généralement dès 2 à 5% d’écart). Les micro-prélèvements de sang sont réalisés sur les animaux vigiles et non contraints (sans boite ou tube de contention), à même de signifier librement tout manquement

Choix des espèces

La mesure de la pharmacocinétique est réalisée chez la souris, car cette espèce est la plus utilisée pour cette approche dans le cadre du développement des candidats-médicaments. Certain candidat-médicament sont très difficile à synthétiser et la petite taille de la souris nécessite beaucoup moins de composé. Enfin, ce choix permet aussi de mesurer l’ADME d’un composé chez la même espèce que pour les futures études d’activités, elles-mêmes nécessitant le plus souvent le recourt à des animaux génétiquement modifiés, plus facile à trouver ou générer chez la souris. L’âge des souris sera déterminé en fonction de l’objectif scientifique et de la pathologie visée. Les souris seront âgées d’au minimum 4 semaines afin que la procédure puisse être réalisée sans remettre en cause le bien-être de l’animal.

Toutes tuées à l'issue de chaque procédure pour prélèvement d'organes, 3 900 souris vont être utilisées dans des travaux menés en prestation pour des laboratoires privés et publics, avec un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent du tamoxifène par gavage ou injection cinq à dix jours de suite, ou dans leur nourriture pendant un mois, puis un second composé dans l'eau de boisson qui leur provoque une inflammation aiguë de l'intestin, avec perte de poids et diarrhées. Le nombre, la durée et la voie d'administration des composés immunothérapeutiques sont fixés par le partenaire commercial. Ni analgésique ni anti-inflammatoire ne leur seront administrés, le porteur écrivant que cela biaiserait la réponse observée, et il justifie le recours aux souris par une évaluation à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Les différents laboratoires privés et publics pour lesquels nous réalisons des prestations cherchent à connaitre la fonction de gènes d’intérêts sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale et dans certain cas tester des traitements pour voir l’impact de ceux-ci sur le système immunitaire en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale lorsque la fonction d’un gène est modifiée. En utilisant un système moléculaire inductible à un traitement appelé tamoxifène, nous pouvons réguler l’expression de gènes d’intérêt en les supprimant, ou en les augmentant (surexpression). En effet, ce système permet de contrôler l’expression de gènes dans le temps et l’espace ouvrant ainsi de nouvelles possibilités pour l’étude de la fonction des gènes. Ainsi, nous traiterons avec du tamoxifène des souris génétiquement modifiées pour lesquelles le gène d’intérêt est modulable et nous évaluerons l’effet de sa suppression ou surexpression sur le système immunitaire à l’état basal. Nous évaluerons aussi l’effet de la modulation de ce gène en condition pathologique où nous induirons une inflammation intestinale. Enfin nous évaluerons également l’impact d’un traitement sur le système immunitaire lorsqu’un gène est supprimé ou surexprimé en condition normale ou lors d’une inflammation intestinale.

Bénéfices attendus

Ce projet est mis en œuvre dans le cadre général de la validation de modèles animaux génétiquement modifiés pour des études précliniques in vivo. Il vise donc à évaluer de façon qualitative et quantitative l’impact de la régulation de gène d’intérêt par induction au tamoxifène et/ou l’impact d’un traitement immunothérapeutique en présence ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin.

Procédures

La procédure expérimentale consiste en l’induction d’un gène cible, par administration d’un premier composé chimique, afin d’évaluer sa fonction sur le système immunitaire de la souris, dans les conditions ou non d’une inflammation aigüe de l’intestin qui sera elle induite par l’administration d’un second composé chimique 1) L’administration du 1er composé peut se faire de différentes manières en fonction du type de gène à moduler, du type cellulaire et/ou tissulaire ciblé et de la demande du partenaire et sur 5 jours minimum (sans jamais excéder 10 jours) par injection et gavage ou sur 1 mois maximum dans l’alimentation : -Par injection : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de réaliser l’injection (30 secondes par souris). Ou -Par gavage : sur souris vigile, la souris sera pesée puis une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le gavage à l’aide d’une aiguille de gavage (30 secondes par souris) . Ou -Par alimentation : Les souris seront soumises à un régime alimentaire avec des croquettes au tamoxifène. 2) Des pesées hebdomadaires : sur souris vigiles (10 secondes par souris). Deux collectes de sang : sur souris vigile, une contention sera réalisée afin de pouvoir réaliser le prélèvement (30 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons être dans les conditions d’une inflammation aigüe de l’intestin : 3) Suite à l’induction par le 1er composé, les souris seront traitées avec le second composé (sur une durée de 7 jours consécutifs). Le second composé est préparé dans de l’eau de boisson + des pesées quotidiennes sur souris vigiles (10 secondes par souris). Dans le cas où nous devrons traiter les individus avec un composé immunothérapeutique : 4) Les administrations des composés immunothérapeutiques (le nombre, la durée et la voie d’administration sera défini par le partenaire). Suivant la voie d’administration sélectionnée par le partenaire, celles-ci seront réalisés sur souris vigiles (30 secondes/souris) ou sur souris anesthésiées (anesthésie gazeuse courte : 1minute/souris).

Impact sur les animaux

Prérequis : Les tests de toxicité des composés immunothérapeutiques seront effectués en amont par les partenaires. Les doses injectées n'induiront donc aucun effet indésirable sur les animaux dans le cadre de ce projet. Les animaux seront soumis à plusieurs actes techniques nécessitant une contention pouvant engendrer du stress tel que : 1) Les administrations du composé n°1 soit par gavages oraux ou injections intrapéritonéales sur 5 jours consécutifs minimum (sans jamais excéder 10 jours) ; 2) Des pesées hebdomadaires ; 3) Deux prélèvements de sang (60 à 100μL), Une semaine d’écart entre les prélèvements sera impérativement respectée ; 4) En fonction du projet, un traitement par un second composé dans l’eau de boisson suite à l’administration du 1er composé afin de créer une inflammation aiguë de l’intestin pouvant amener à une perte de poids et des selles molles/diarrhées. 5) Injections de composés immunothérapeutiques par voie sous cutanée, intra péritonéale, intramusculaire, intraveineuse ou gavage.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort afin de procéder au prélèvement des organes et à leur analyse.

Remplacement

Dans ce type de projet, aucune méthode substitutive ou alternative ne nous permettrait de nous placer dans des conditions physiologiques similaires. En effet, l’étude du système immunitaire et le modèle inflammatoire testé dans le cadre de cette demande doit être évalué à l’échelle de l’organisme entier, permettant ainsi la mise en place de toutes les boucles de régulation impliquées dans ce type de réponse.

Réduction

Des expériences antérieures ont permis de déterminer la « variabilité de la mesure » afin de pouvoir calculer par un test de puissance le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre la significativité statistique selon la nature continue ou discontinue de la variable concernée. Le nombre utilisé pour ces expériences est de 6 animaux par génotype et par lot expérimental afin d’avoir des données statistiques robustes et de limiter le nombre d’expérience.

Raffinement

Les animaux en expérimentation seront hébergés en zone d’expérimentation, en groupe de 5 individus maximum par cage et de même sexe. L’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Dans chaque cage, le milieu sera enrichi par l’ajout de deux éléments : - une maison en carton pour leur procurer un abri, - un nid compact de lanières de papier Kraft. Les lots expérimentaux seront établis avant le début de l’expérimentation et un temps d’acclimatation d’une semaine sera respecté entre la réception des animaux et le début du protocole expérimental. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel de zootechnie formé et qualifié et des points limites seront préalablement établis. En ce sens, une grille de score sera utilisée prenant en compte le comportement naturel et provoqué de l’animal, la variation pondérale et la caractérisation. Des points limites seront établis pour chaque observation (valeur maximale de la grille de score) qui entraineront la mise à mort de l’animal s’ils sont atteints. Dans ce projet nous étudions le système immunitaire, toute administration d’analgésique entrainerait un biais de la réponse cellulaire observée. Ainsi, nous ne pouvons pas utiliser d’analgésique. De plus, dans le cas de l’inflammation aigüe de l’intestin, nous étudierons l’impact de la surexpression ou délétion d’un gène dans la modulation d’une inflammation, aucun anti-inflammatoire ne pourra être administré aux souris.

Choix des espèces

Mammifères dont 99% des gènes sont orthologues à l’homme, la souris est un animal de petite taille, à reproduction rapide et facile d’élevage. De plus, la communauté scientifique dispose de bonne connaissance anatomique, physiologique et biologique de ce modèle. La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude soit riche d’enseignements permettant d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire des 2 espèces, avec des applications cliniques potentielles pour l’homme. Nous utiliserons des souris adultes uniquement, à partir de 8 semaines pour une analyse du système immunitaire mature. L’étude d’un système immunitaire en développement ou vieillissant ne fait pas l’objet de ce projet.

Les tremblements sont retenus comme point limite déclenchant la mise à mort. 80 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélever leurs organes. Elles reçoivent une injection de Shiga-toxine qui reproduit un syndrome hémolytique et urémique, des injections intraveineuses, sous-cutanées et intrapéritonéales, et des prises de sang dans le sinus derrière l'œil sous anesthésie. Le porteur écrit que ces injections n'induisent "pas de traumatisme ou de douleur" tout en décrivant des yeux mi-clos, des diarrhées, un poil piqué et des tremblements, et présente l'utilisation des animaux comme "indispensable" pour comparer deux traitements.

Objectifs

La Shiga-toxine (STx2) est produite par une bactérie de la famille Escherichia coli et est la cause d’une maladie infectieuse grave (SHU) le plus souvent d’origine alimentaire. Le SHU appartient à une famille de maladies caractérisées par des obstructions vasculaires associées à la présence de fragments de globules rouges dans le sang et une baisse du taux de plaquettes. La STx2 entraîne d’une part l’inflammation et la mort cellulaire massive, et d’autre part l’activation du système du complément, qui participe aux mécanismes de défense naturels. Le traitement de ces pathologies comprend des traitements non spécifiques et des traitements spécifiques ciblant système du complément, comme l'anticorps anti-C5, le premier traitement approuvé pour le SHU chez les patients pédiatriques et adultes. La clusterine (CLU) est une molécule endogène centrale capable de réduire l’inflammation et de limiter les obstructions vasculaires dans les cellules et dans des modèles de souris infectées. L’objectif de ce projet est de comparer l’efficacité de la clusterine et de l’anticorps anti-C5a dans le SHU afin de valider l’utilisation de la CLU dans un modèle préclinique de SHU, l’utilisation des animaux est donc indispensable.

Bénéfices attendus

Ce travail ouvre des perspectives thérapeutiques pour le traitement des SHU, les complications associées, incluant l’anémie, la thrombocytopéine et l’insuffisance rénale. En effet, cette étude testera la capacité de la CLU à améliorer la survie. Ainsi, nous pourrons conclure sur l’intérêt à utiliser la CLU comme nouvel outil thérapeutique.

Procédures

1/ L’Injection intra péritonéale sera utilisée pour les 4 lots de souris. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ 1minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 2/ L’Injection intra veineuse sera utilisée pour 2 lots de souris. Elle concerne 40 au total, pour une durée d’environ 2minute/injection. Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal. 3/ La prise de sang rétro orbitaire est utilisée pour les 4 lots de souris. Elle sera effectuée sous anesthésie. Elle concerne tous les animaux, soit 80 au total, pour une durée d’environ1minute/prélèvement. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. 4/ L’Injection sous cutanée sera éventuellement utilisée pour les 4 lots de souris. Elle ne concernera pas forcément tous les animaux. Au maximum elle pourrait concerner les 80 animaux et serait réalisée si nécessaire (durée 1minute/injection). Il n’est donc pas possible de comptabiliser le nombre d’injections sous-cutanées qu’un animal pourra recevoir. Si besoin, les injections en sous-cutanée seront effectuées toutes les 6h dans la journée (2 injections maximum). Cet acte n’induit pas de traumatisme ou de douleur à l’animal.

Impact sur les animaux

L’injection de la toxine mime les caractéristiques du SHU. Les souris suivant la dose reçue pourront présenter (i) aucun signe clinique particulier (asymptomatique), (ii) certains signes cliniques et comportementaux traduisant une douleur potentielle. La souris pourra présenter une fermeture plus prononcée des yeux (asthénie), une diarrhée transitoire, une modification de comportement (nuisances légères) par l’absence de mobilité. Le poil pourra présenter un aspect piqué, des tremblements pourront être observés (nuisances modérées). Ces tremblements constitueront un point limite de l’expérimentation car traduisant une douleur plus importante. La douleur des animaux sera gérée en pré-injection de toxine par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l'injection de la toxine. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Après l'injection de la toxine, les souris seront suivies bi-quotidiennement. La prise de sang rétro orbitaire est utilisée dans les procédures du projet. Elle sera effectuée sous anesthésie gazeuse. Si un animal doit être prélevé à plusieurs reprises, une alternance des sinus prélevés sera respectée. Les différentes injections n’induisent pas d’inconfort de l’animal ni de modification de son état général du fait de l’absence de l’anesthésie.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement d'organes pour des analyses post mortem.

Remplacement

Des approches in vitro à partir de cellules murines et humaines ont mis en évidence les propriétés immunorégulatrices de la CLU et son effet ciblé. L’étude de l’effet thérapeutique de la CLU dans le SHU, une pathologie systémique, ne peut s’envisager que dans un organisme complet, et pas sur un modèle uniquement cellulaire, compartimenté. L’utilisation des animaux est indispensable avant de proposer un traitement facile à mettre en œuvre et dénué de toxicité pour améliorer le cadre clinique et la mortalité associés au SHU. En effet, seul un modèle in vivo nous assure de l’efficacité du traitement dans des conditions physiopathologiques proches de la réalité clinique. Le modèle murin proposé parait être le plus adapté à l’étude de ce traitement potentiel.

Réduction

Le projet sera réalisé sur un nombre nécessaire et suffisant d’animaux. Le nombre total d’animaux utilisés pour une étude a été défini en fonction du nombre de groupes et du nombre d’animaux par groupe nécessaire pour l’obtention de résultats statistiquement interprétables et fiables. Le calcul d’effectifs a été réalisé avec un logiciel spécifique. Ainsi, ces calculs justifient le nombre de souris total (80) nécessaires à ce projet, incluant des lots de souris contrôles nécessaires à l’interprétation des données.

Raffinement

Les souris seront hébergées dans des conditions adaptées à l’espèce (en cage en portoir ventilé) avec un enrichissement du milieu (cabanes, papier, tunnel, tubes en carton, morceau de bois). Les souris seront placées par nombre de 4 par cage. L’alimentation et l’abreuvement seront fournies ad libitum tout le long de l’hébergement. Le protocole expérimental comprend un suivi biquotidien des animaux, des indicateurs comportementaux (fuite ou défense a la manipulation) et physiques prédéfinis (état général, prostration, poil hérissé, terne, suivi pondéral de l’animal) qui seront évalués, et constitueront les points limites de l’expérience (euthanasie de l’animal). Afin d’éviter toute souffrance animale au cours du protocole expérimental, la douleur sera gérée par l’adjonction d’un antalgique dans l’eau de boisson 24h avant l’induction du SHU. L’antalgique sera présent constamment dans l’eau de boisson, suivant les signes cliniques observés, un antalgique plus puissant sera administré. Lors des prélèvements sanguins au niveau du sinus rétro- orbitaire, les souris seront anesthésiées par anesthésie gazeuse. Une fois l’animal endormi dans la boite d’induction, il sera placé sur le dos, sur un tapis chauffant, le museau recouvert par un masque délivrant d’anesthésique. Un collyre ophtalmique anesthésique sera utilisé avant les prélèvements en rétro-orbitaire. Les plasmas, organes et tissus prélevés post-mortem constituerons une tissuthèque pour des marquages tissulaires et des dosage biochimiques ultérieurs.

Choix des espèces

L’espèce animale choisie pour ces études est la souris de type sauvage, lignée de souris dans laquelle le modèle SHU est connu et validé. Les souris utilisées seront âgées de 6 à 10 semaines, plutôt jeunes en termes de système immunitaire car le SHU est une maladie grave affectant plutôt les jeunes enfants présentant un système immunitaire plus ou moins mature.