Multisystémique

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale d'un ou plusieurs dépôts de graisse (lipectomie) sous anesthésie et deux prises de sang, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur fixe comme point limite une perte de poids rapide de 20 %, seuil déclenchant la mise à mort des animaux qui se dégradent. Il qualifie le recours à l'animal d'"indispensable" pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau souscutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années dans l'équipe. Pour cette étude, nous utiliserons des souris C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.

180 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Souris SAMP8 modèles de la maladie d'Alzheimer, elles reçoivent une supplémentation en butyrate, des gavages, des prélèvements de sang à la queue et des mesures du transit digestif, puis des tests comportementaux de mémoire visuelle et de motricité. Le porteur signale une perte de poids propre à cette lignée et indique que gavages, prises de sang et tests peuvent générer stress et douleur. Il affirme que l'étude du lien intestin-cerveau au cours du vieillissement ne peut aujourd'hui se faire que sur un modèle animal, faute de reproduire cette complexité in vitro.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) touche plus de 40 millions de personnes dans le monde. Il n’existe aucun traitement efficace pour prévenir, ralentir ou guérir la maladie. Elle est invalidante et mortelle, entraînant une perte progressive des neurones au niveau du cerveau, notamment des régions impliquées dans la mémoire. Un des signes majeurs de la maladie d'Alzheimer est l’accumulation dans le cerveau d’un bout de protéine appelé Abeta qui à la longue empêche une bonne communication entre les neurones. Plusieurs études montrent que les patients atteints de la MA ont également des altérations digestives (eg. constipation) pouvant se manifester de façon très précoce, longtemps avant qu’apparaissent les premiers signes affectant le cerveau. Ces défauts de transit gastro-intestinal suggèrent que la MA toucherait aussi bien le cerveau que l’intestin. L’intestin est composé de neurones régulant les fonctions digestives. Par ailleurs, il a également été montré que les atteintes intestinales augmentent le risque de développer une forme sévère de la maladie. Il a aussi été mis en évidence que les patients atteints de la MA souffrent de manière fréquente d’une altération du tapis microbien tapissant l’intestin et d’une baisse associée de métabolites provenant de ces microbes tel que le butyrate. De plus, le butyrate a été montré comme étant bénéfique au bon fonctionnement des neurones de l’intestin et du cerveau. Dans ce contexte, améliorer le fonctionnement des neurones de l’intestin pourrait améliorer la fonction de transit intestinal et ainsi prévenir des formes graves de MA. De nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans les processus de mémoire. Au vu de tous ces éléments, améliorer le tapis microbien de l’intestin ou des métabolites qu’il produit, tel que le butyrate, peux avoir un impact positif sur les fonctions de l’intestin et la mémoire dans la MA.

Bénéfices attendus

Le déclin cognitif lié à l’âge représente un véritable enjeu pour améliorer la santé et la qualité de vie des personnes âgées. De plus, améliorer les capacités cognitives est reconnu comme une stratégie visant à réduire le risque de développer des pathologies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer. Favoriser la communication des neurones du cerveau par l’alimentation peut avoir des effets bénéfiques sur le vieillissement normal ou pathologique (Maladie d’Alzheimer) du cerveau. D’autre part, le vieillissement du cerveau est aussi associé à des altérations au niveau intestinal dont la cause pourrait être le vieillissement/ altération des neurones. Dans ce contexte, améliorer les mécanismes de communication neuronale dans le cerveau pourrait aussi impacter ceux de l’intestin et vice-versa. De plus, de nombreuses études ont mis en évidence le rôle important de la nutrition dans la régulation des performances cognitives (AGCCs : acides gras à courte chaine, acides aminés, vitamines). De manière intéressante, la flore intestinale et ses métabolites peuvent eux aussi impacter ces fonctions. Les AGCC sont naturellement synthétisés par le microbiote, principalement dans le colon et leur rôle central non seulement dans le métabolisme neuronal mais aussi la modulation de gènes impliqués dans la connectivité neuronale. De plus, d’autres études ont mis en évidence les effets bénéfiques du butyrate sur la communication des neurones du cerveau avec amélioration de la mémoire. Néanmoins, leur capacité à prévenir les altérations au niveau intestinal et leur mode d’action reste inconnu à ce jour et fait l’objet de cette étude.

Procédures

Après 4 mois et 6 mois de traitement, pour tous les animaux, nous effectuerons des études des fonctions digestives en évaluant le temps de transit colique (durée max 30 min) et total jusqu’à 6 heures avec addition d’eau (temps de transit total) , ainsi que la perméabilité intestinale in vivo et le nombre de fèces émises. L’objectif est de mesurer le temps de transit oro-anal et de calculer le nombre de fèces émises sur 2 heures. Ainsi les fèces émises seront collectées toutes les 15 minutes sur deux premières heures pour le temps de transit colique. Deux heures après gavage, un prélèvement d’un échantillon de sang à la queue (sur animal vigile) est réalisé (durée 30 sec). Après 6 mois, tous les animaux réaliseront des tests comportementaux (mémoire visuelle et motricité d’une durée de 10 à 30 min individuellement).

Impact sur les animaux

Aucune nuisance ou effets indésirables n’est reporté dans la littérature concernant la supplémentation alimentaire en butyrate ou l’Inuline. Il est cependant important de noter une perte de poids des souris SAMP8 par rapport aux contrôles qui est indépendant de la supplémentation envisagée. Cette perte serait liée à une altération du métabolisme chez ces souris et qui est observable dès la naissance. Stress et douleur peuvent être générés par différentes expérimentations (gavage, prélèvements de sang ou tests comportementaux).

Devenir

Mise à mort de toutes les souris à l’issue des procédures. Des prélèvements terminaux seront réalisés pour des études sur des protéines, des ARN et des marquages sur des tissus.

Remplacement

L’étude du lien entre les systèmes nerveux central et entérique, dans un contexte de vieillissement physiopathologique, nécessite une étude comportementale qui ne peut, à ce jour, se réaliser que sur un modèle animal. De plus, le vieillissement et le développement de la maladie d’Alzheimer mettent en jeu différents systèmes cellulaires (neurones de l’intestin, neurones du cerveau, flore microbienne intestinal, système immunitaire ...) dont la complexité d’interaction ne peut être modélisée par une approche in vitro et justifie l’utilisation de modèles animaux afin de disséquer cette complexité d’interaction des acteurs impliqués et d’identifier les mécanismes sous-jacents associés.

Réduction

Les travaux réalisés in vitro sur des cultures de neurones de l’intestin nous ont permis d’identifier le butyrate comme métabolite d’intérêt et de réduire significativement le nombre d’animaux qu’il aurait fallu pour examiner les effets potentiellement bénéfiques de plusieurs métabolites bactériens. Parallèlement, des expérimentations similaires menés chez des modèles animaux au cours de projets antérieurs nous ont permis de faire des calculs de puissance statistique et ainsi de sélectionner le nombre minimum d’animaux par groupe pour avoir une significativité avec une erreur de 0,05 et une puissance de 80%.

Raffinement

Les animaux seront hébergés collectivement dans des cages avec frisottis et tunnels ou dômes plastiques transparents rouges. Ils seront observés quotidiennement. Le poids et l’état d’hydratation seront surveillés 3 fois par semaine si le score reste inférieur à 1 Si, selon les tables des points limites, le score venait à augmenter, la surveillance du poids et de l’hydratation seraient quotidienne voir 2 fois par jour pour des scores de 1 à 2. Si le score devait être de 3, les souris recevraient un analgésique par voie sous-cutanée, 1 fois par jour. Pour un score de 4 les souris seraient mises à mort

Choix des espèces

Les souris SAMP8 sont un bon modèle de la maladie d’Alzheimer car ne présentant aucune introduction de nouveaux gènes pour induire des signes de la maladie. De plus, étant un modèle naturel/spontané sans surexpression de gènes, il se prête mieux à des expériences de traitement à but thérapeutique comme la supplémentation avec du butyrate et/Inuline envisagé dans le projet. Les travaux menés au sein du laboratoire ont également montré qu’il est pertinent pour l’étude du rôle de l’intestin dans la MA. Les souris SAMP8 et leur modèles contrôles (SAMR1) seront utilisées dès l’âge de 3 semaines et supplémentées de façon quotidienne avec de l’eau sans supplémentation ou de l’eau contenant du butyrate (supplémentée ou non avec de l’Inuline) jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus au vu de la littérature scientifique concernant la cinétique d’apparition des altérations au niveau de l’intestin ou du cerveau. Les souris SAMP8 et SAMR1 seront utilisées à l’âge de 3 semaines et hydratées de façon journalière avec de l’eau sans supplément (contrôle) ou de l’eau contenant du butyrate jusqu’à l’âge de 6 mois. Ces âges ont été retenus pour nos expériences car des études montrent que les symptômes intestinaux commencent vers 1-2 mois et les symptômes cérébraux vers l’âge de 6 mois. Etant donné que le projet vise à évaluer l’effet préventif du butyrate, les âges retenus permettent de baliser l’apparition de ces symptômes.

3 024 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, comme modèles du syndrome de Wolfram. Chaque animal subit un jeûne de 16 h, des injections intrapéritonéales et des incisions caudales répétées sur neuf mois, pour caractériser un diabète et tester cinq composés. Le porteur indique que le modèle Wolfram-like développe progressivement cécité, surdité et troubles vestibulaires, et que les animaux sont tués pour prélever leurs organes. Il affirme que ces modèles murins sont "indispensables", seul "recours mammifère autre que l'humain" à reproduire ces symptômes, alors que les retombées thérapeutiques restent une "preuve de concept" à venir.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par un diabète sucré de type 1, un diabète insipide, une surdité neurosensorielle, une atrophie optique bilatérale et des signes neurologiques. De même, le syndrome de Wolfram-like est caractérisé par un diabète sucré de type 1, une surdité neurosensorielle et une atrophie optique bilatérale. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de ces maladies n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de caractériser l'apparition du diabète dans deux modèles murins de ces maladies et déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur ce diabète.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans les syndromes de Wolfram et Wolfram-like sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, dans un premier temps, de caractériser le diabète des modèles murins de référence pour le syndrome de Wolfram et Wolfram-like. Il permettra ensuite d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur ces deux modèles.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : contrôle alimentaire (durée 16h) -identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale via créme anesthésiante). Chaque animal sera identifié une fois. Les animaux subiront 1 contrôle alimentaire (durée 16h), 2 injections en intrapéritonéal (1 min) à au moins 3 jours d’intervalle, 2 incisions caudales (première fois coupure puis retrait de la croute) à 1 mois. Ces interventions seront répétées à 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins, pour un total de 5 contrôles alimentaires, 10 injections en intrapéritonéal et 10 incisions caudales sur une période de 9 mois.

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Le contrôle alimentaire sur un durée de 16h peut également engendrer un stress. L'incision pour les prélèvements de goutte de sang est superficielle mais peut engendrer un léger stress . Pour limiter le stress, les animaux sont habitués à la manipulation au préalable. Le modèle murin du syndrome de Wolfram-like développe progressivement des troubles neurosensoriels (cécité, surdité et syndrome vestibulaire) à partir de 21 jours après la naissance.

Devenir

A la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort et les organes collectés pour procéder aux analyses de biologie moléculaire et d'immunohistochimie permettant la compréhension des mécanismes moléculaires mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèles murins des syndromes de Wolfram et Wolfram-like pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Nous avons basé la taille de notre lot sur les données bibliographiques de souris développant un diabète, non induit par un régime spécifique. Nous avons estimé que 12 animaux par groupe expérimental sont nécessaires et suffisants pour générer des données statistiquement robustes tout en prenant en compte une éventuelle variation inter-individuelle. De plus, des analyses statistiques adaptées aux données générées permettront de limiter le nombre d'animaux par groupe et ce nombre sera révisé au besoin. De même, les animaux utilisés pour la réalisation des tests métaboliques seront ensuite euthanasiés et leurs organes collectés afin de réduire le nombre d'animaux nécessaires à la réalisation de ce projet. Ces tissus seront utilisés pour lors de nombreuses analyses, morphologiques, histologiques, afin de disposer du plus large éventail de données possibles à l’issue d’une procédure expérimentale et ainsi réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. Des points limites ont été établis afin de surveiller au plus près les altérations dues aux procédures prévues dans le projet . Les animaux manifestant au moins un des points limites identifiés seront systématiquement euthanasiés. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations métaboliques dans un schéma physiologique global d'évolution de la pathologie et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. Les tests métaboliques seront réalisés sur les animaux à 1 mois, 3 mois, 5 mois, 6 mois et 9 mois pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique des modèles murins.

8 385 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Zika par injection, certaines par voie intracrânienne sous anesthésie, puis exposées sous anesthésie à des piqûres de moustiques, et peuvent perdre jusqu'à 30 % de leur poids avec apathie et paralysie partielle. L'objectif est d'étudier le rôle de la génétique de l'hôte dans l'infection et la transmission du virus, les souris étant tuées car porteuses d'un pathogène dangereux pour l'humain. Le porteur affirme que ces phénomènes se développent au niveau de l'"organisme entier" et que la souris permet des analyses génétiques "puissantes".

Objectifs

L’objectif global de ce projet est d’étudier le rôle de la composition génétique de l’individu dans sa sensibilité à l’infection par le virus Zika. En particulier, la transmission du virus de la mère au fœtus, l’apparition de troubles neurocomportementaux secondaires à l’infection et la transmission du virus Zika entre l’hôte et le moustique restent à élucider. Plus spécifiquement, ce projet prévu pour les 5 années à venir, a pour objectif de répondre aux questions scientifiques suivantes : 1. Quels sont les mécanismes responsables des différences de lésions cérébrales induites par l’infection par le virus Zika ? 2. Quels sont les mécanismes de transmission du virus Zika de la mère au fœtus ? 3. Quelles sont les conséquences neurocomportementales de l’infection par le virus Zika ? 4. Quelle est la variation de capacité à s’infecter (« infectabilité ») des souris en fonction de la souche de virus Zika ? 5. Quelle est la variation d’infectabilité des moustiques en fonction de la souche de virus Zika ? 6. Quelle est la variation d’infectabilité des souris en fonction de la souche de moustique ? 7. Quelle est l'influence du fond génétique des souris dans chacune des questions précédentes ? 8. Quels sont les variants génétiques de l’hôte responsables des différences de sensibilité chez la souris ?

Bénéfices attendus

A court terme, ce projet permettra de comprendre l’influence de la composition génétique de l’hôte dans la sensibilité à l’infection et dans l’infectivité par le virus Zika. La caractérisation poussée de l’infection par le virus Zika dans des lignées de souris sensibles ou résistantes permettra d’identifier de nouveaux gènes responsables de ces différences de sensibilité et d’infectivité. A plus long terme, ce projet permettra de faire progresser des connaissances fondamentales importantes pour comprendre le développement de la maladie et les mécanismes de transmission des maladies vectorielles. Il s'agit d'enjeux majeurs au regard du potentiel de réémergence du virus Zika au niveau mondial et des conséquences neurologiques dramatiques causées par cette infection.

Procédures

Des biopsies de queue seront effectuées sur certaines souris pour connaitre leur statut génétique, une fois au moment du sevrage pour une durée de quelques secondes. Les souris recevront une injection d’anticorps par voie intrapéritonéale une fois pour une durée de quelques secondes. La majeure partie des souris seront infectées avec le virus Zika par une injection (intrapéritonéale, intraveineuse, sous-cutanée ou intradermique) une fois pour une durée de quelques secondes. Certaines souris seront infectées avec le virus Zika par une injection intra-crâniale sous analgésie et anesthésie générale d’une durée de 15 minutes. Des prises de sang seront réalisées, au maximum 3 prélèvements sur 5 jours consécutifs. Chaque prise de sang durera environ 30 secondes. es tests d’évaluation du comportement non invasifs seront effectués sur certaines souris avec une durée de moins de 40 minutes et au maximum 2 fois par semaine (1 test par séance). Des repas sanguins de moustiques seront effectués sur certaines souris pour évaluer la transmission du virus entre la souris et le moustique et vice versa, sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes, au maximum 5 fois sur 7 jours consécutifs.

Impact sur les animaux

Le projet s'articule autour de 5 procédures de sévérité modérée. Dans la plupart des cas, l'infection aura un impact très modéré sur l'état de santé des souris, avec une perte de poids inférieure à 5% et transitoire (quelques jours). Dans d'autres cas, les souris pourront développer une perte de poids plus importante pouvant atteindre 30%, une apathie et des troubles neurologiques tels qu’une paralysie partielle. Des souris feront l’objet de tests d’évaluation du comportement non invasifs qui pourront générer un stress limité et transitoire (quelques heures). Des souris seront anesthésiées et soumises aux repas sanguins de moustiques durant la période de virémie qui est quasiment asymptomatique. Elles seront mises à mort avant l'apparition des symptômes induits par l'infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car ils seront infectés par un pathogène dangereux pour l’Homme et/ou feront l’objet de prélèvements de tissus post-mortem.

Remplacement

Les phénomènes biologiques que nous devons étudier se développent au niveau de l'organisme entier (développement de l'infection, réponse immunitaire, conséquences neurocomportementales) voire à l’interface entre deux organismes indépendants (transmission du virus entre la mère et le fœtus ou entre la souris et le moustique) et imposent donc de recourir à des modèles animaux vivants. De plus, notre expérience sur ce virus montre que les résultats obtenus avec des cultures de cellules ne prédisent pas intégralement ce qui se passe dans un organisme entier. Les modèles animaux utilisables sont peu nombreux (primates non-humains, cobayes, hamsters et souris). Ce projet utilisera des souris car cette espèce permet de réaliser des études génétiques puissantes à l'aide de lignées génétiquement modifiées ou de lignées génétiquement très variées.

Réduction

Le calcul du nombre d'animaux nécessaire dans chaque procédure dépendra de la nature des variables et de la question posée. La conception de chaque expérience reposera sur une analyse statistique préalable pour optimiser la nature et l'effectif de chaque groupe, et éviter les biais expérimentaux. Les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques appropriés. Aussi souvent que nécessaire, il sera fait appel à des experts en biostatistique. L'évaluation de la charge virale dans une lignée ne requiert pas plus de 5 souris du même sexe d'après notre expérience. L’évaluation du comportement des souris requiert des nombres d’animaux un peu plus grands (10 à 12 souris du même sexe) du fait d’une variabilité intra-groupe plus importante. Ces éléments nous ont permis de calculer les effectifs pour chaque procédure en conciliant réduction du nombre d'animaux et puissance statistique pour conclure. Les analyses incluront des groupes d’animaux des 2 sexes sauf lorsqu'on sait déjà qu'il n'y a pas de différence dans le modèle utilisé. Certaines expériences feront l'objet de réplication mais uniquement lorsque ce sera nécessaire pour conforter la validité des conclusions. Ceci est mentionné et justifié dans chaque procédure.

Raffinement

Les inoculations par voie systémique et les prélèvements de sang entraînent une douleur passagère et légère qui ne justifie pas d'anesthésie ou d'analgésie. L’inoculation par voie intra-crâniale sera réalisée sous anesthésie générale et sous analgésie générale. Les repas sanguins seront effectués sur des souris anesthésiées. Les souris seront exposées aux moustiques sur un flanc, en alternant flanc gauche et flanc droit d'un repas sanguin au suivant. Après chaque repas sanguin, les souris recevront une injection de soluté de réhydratation isotonique pour compenser la perte volémique. Dans la majorité des cas, l'infection par le virus Zika se traduira par un impact très modéré sur l'état de santé des souris. Les animaux infectés seront toutefois surveillés quotidiennement pendant la période symptomatologique critique (précisée dans chaque procédure) avec plusieurs points limites : i) score clinique sur la base de 5 critères, ii) suivi de poids. Un gel nutritif sera placé dans les cages des animaux présentant un affaiblissement ou une parésie/paralysie pouvant laisser craindre qu'ils peinent à atteindre la mangeoire et après les repas sanguins de moustiques.

Choix des espèces

1. Nous disposons de bons modèles d'infection par le virus Zika chez la souris, y compris pour étudier la transmission entre souris et moustique (espèce compatible avec des repas sanguins répétés). 2. La souris est la seule espèce permettant de réaliser des analyses génétiques du niveau requis. 3. Des résultats antérieurs avec le virus Zika montrent la pertinence de cette espèce comme modèle animal d'infection par les flavivirus transmis par des moustiques et pour les analyses génétiques. 4. La dangerosité du virus Zika impose d'héberger les animaux en isolateurs, ce qui est facilement réalisable dans cette espèce et beaucoup plus difficile dans d'autres espèces. Pour la plupart des procédures, nous utiliserons des jeunes adultes (5-6 semaines) ou adultes (6-12 semaines) en nous basant sur la littérature et sur notre propre expérience. Nous utiliserons (détails dans les procédures 1 et 3) des souris jeunes de 1-3 semaines qui permettront d’étudier les effets de l’infection par le virus Zika sur le développement post-natal du cerveau. Nous utiliserons (détails dans la procédure 1) des fœtus entre 15 et 17 jours de développement pour étudier le syndrome congénital causé par le virus Zika.

400 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une chirurgie d'ablation de dépôts de graisse sous anesthésie, des prises de sang à la queue et des mesures de composition corporelle, pour étudier le rôle du tissu adipeux dans le vieillissement musculaire. Le porteur indique que la chirurgie peut provoquer une perte de poids et une douleur à court terme, et fixe la mise à mort à une perte de 20 % du poids. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode sans animaux n'existe pour une étude à l'échelle de l'"organisme entier" et juge le recours à la souris "indispensable".

Objectifs

Avec l'augmentation de l'espérance de vie, améliorer ou préserver la santé et la qualité de vie des personnes âgées afin qu'elles puissent être autonomes le plus longtemps possible représente un enjeu majeur de santé publique. La sarcopénie, qui se caractérise par une perte de la masse et de la force musculaire avec l’âge, joue un rôle critique dans la perte de mobilité du sujet âgé. Si le vieillissement d’un tissu a une origine intrinsèque, il peut également résulter du vieillissement global de l’organisme, notamment via des altérations de la communication entre les organes. Ainsi, le tissu adipeux blanc (TA), dont les fonctions endocrines vis-à-vis du muscle squelettique sont déjà établies, est très précocement affecté au cours du vieillissement. Il subit un remodelage important avec l’âge et il a récemment été montré qu’un vieillissement accéléré spécifique à l’adipocyte (type cellulaire majoritaire du tissu adipeux) pouvait mener à une perte de fonction musculaire in vivo, soulevant l’intérêt de comprendre la communication TA-muscle au cours du vieillissement. Parmi les médiateurs de cette communication, très peu d’attention a été portée jusqu’ici aux métabolites, petites molécules organiques intermédiaires du métabolisme. Or, nos données préliminaires ont permis de mettre en évidence que ce sont plus d’une centaine de métabolites qui sont différentiellement produits par le TA avec l’âge. Compte tenu de leur rôle crucial - sur le métabolisme lui-même mais aussi sur des processus plus généraux tels que la sénescence ou le stress oxydant - une dérégulation des métabolites de l’axe TA-muscle avec l’âge pourrait participer au développement du processus sarcopénique. Dans ce contexte, l’objectif du projet proposé est de démontrer que le tissu adipeux blanc (TA) participe au maintien du métabolome (ensemble des métabolites) circulant et musculaire chez un sujet jeune et que la dérégulation de ce tissu au cours du vieillissement contribue à l’altération profonde du métabolome circulant et musculaire rapportée avec l’âge. Dans ce but, nous réaliserons des lipectomies (résection des dépôts adipeux situés au niveau sous-cutané et viscéral) chez des animaux jeunes et âgées afin d'étudier l’implication de ce tissu dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement.

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra de caractériser l’implication du tissu adipeux blanc (TA) dans le remodelage du métabolome circulant et musculaire observé au cours du vieillissement. Le vieillissement du TA ayant un impact négatif sur le fonctionnement musculaire, l’identification d’un pool de métabolites dérégulés avec l’âge appartenant à l’axe TA-muscle devrait nous permettre de mettre en évidence de nouvelles cibles thérapeutiques d’intérêt à exploiter pour lutter contre la sarcopénie liée à l’âge.

Procédures

Les souris seront soumises à des prises de sang à la veine de la queue (2 fois au total, durée approximative d'intervention : 10 minutes par souris), leur composition corporelle sera mesurée de façon non invasive grâce à un système RMN (temps de mesure moyen par souris : 90 secondes) et elles subiront une chirurgie (30 minutes d’intervention environ) sous anesthésie et traitement analgésique afin de leur retirer un ou plusieurs dépôts adipeux.

Impact sur les animaux

Plusieurs nuisances ou effets indésirables sont attendus au cours de ce projet : - stress des animaux au moment de leur réception (une période d’acclimatation d’au moins une semaine sera respectée) - perte de poids et douleur à court terme consécutives à la chirurgie (une administration d’analgésique sera effectuée lors de la chirurgie et un suivi post-opératoire quotidien sera mis en place pour s’assurer de la bonne récupération des animaux) - isolement/individualisation des animaux en cas d'agressivité (enrichissement des cages)

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de collecter leurs tissus et de procéder à des analyses métaboliques, biochimiques ou d'expression de gènes. Ces études permettront de mieux comprendre les mécanismes tissulaires et cellulaires mis en jeu dans les phénomènes observés.

Remplacement

Notre projet consiste à étudier la communication entre différents tissus (tissu adipeux et muscles squelettiques) via de petites molécules organiques, les métabolites. Bien qu'un volet de notre projet ait déjà été réalisé sur des cellules cultivées, aucune technique de remplacement du modèle animal n’existe à ce jour. Il s'agit d'une étude intégrée à l'échelle de l'organisme entier impliquant des échanges de métabolites entre différents tissus. Le recours à l’animal est donc indispensable pour ce projet de recherche.

Réduction

Au regard de la bibliographie et sur la base d'analyses statistiques, 10 souris par condition sont classiquement utilisées pour des études de métabolomique sur tissus de rongeurs. Les tissus prélevés seront utilisés non seulement pour étudier le métabolome au sein des tissus mais aussi pour des analyses d'expression de gènes, de protéines et des analyses biochimiques (mesures d’activités enzymatiques). Nous avons en effet mis au point des conditions de préparation des tissus (lyophilisation, pulvérisation) qui nous permettront, à partir de la même poudre, de faire plusieurs analyses en parallèle. Ceci permet d’optimiser et de réduire le nombre d’animaux utilisés dans notre projet.

Raffinement

La chirurgie sera réalisée sous anesthésie générale et un analgésique sera administré aux animaux afin d’éviter la perte de poids et les douleurs. Une surveillance des souris sera réalisée tous les jours pendant 7 jours suite à la chirurgie puis 2 fois par semaine par la suite, ce qui permettra de mettre à mort les animaux ou de les écarter du protocole en cas de comportements anormaux ou de souffrance. Les points limites sont : perte de poids rapide (20% en quelques jours), prostration, poil hirsute, dos rond, ou tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté, comme indiquant un état de souffrance. De plus le caractère grégaire des souris sera maintenu puisque les animaux ne seront jamais seuls en cage. Nous enrichirons également l’environnement de toutes les souris de façon à favoriser leur bien-être.

Choix des espèces

Nous avons décidé de travailler sur la souris car cette espèce est un modèle bien établi pour l’analyse des fonctions métaboliques et sa cinétique de vieillissement est elle aussi bien documentée. De plus, dans la mesure où nous travaillons sur la problématique du vieillissement, la souris nous permet de réduire le temps d'expérimentation car elle a une espérance de vie plus courte (1 à 3 ans) en comparaison au rat (2 à 3.5 ans) ou au cobaye (4 à 8 ans). De plus, c’est un modèle pour lequel nous avons une expertise depuis de nombreuses années. Pour cette étude, nous utiliserons des souris wild-type C57BL/6J de différents âges (3-6 mois pour les souris « jeunes » et 18-24 mois pour les souris « âgées ») afin de caractériser la contribution du TA dans la régulation du métabolome circulant et musculaire au cours du vieillissement.

140 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour étudier le pouvoir pathogène de bactéries E. coli productrices de shigatoxines. Après un jeûne hydrique, elles reçoivent une à deux inoculations orales de bactéries puis subissent prélèvements de fèces, prises de sang et injections, le groupe infecté par des bactéries pathogènes développant faiblesse, diarrhée et déshydratation. Le porteur décrit des points limites et une mise à mort pour prélever les organes, et indique que le projet est financé par l'Argentine, où le syndrome hémolytique et urémique est le plus fréquent. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative n'est "suffisamment sophistiquée" pour simuler un organisme à plusieurs organes.

Objectifs

Certaines bactéries, appelées STEC, produisent des toxines particulières, qui leur confèrent la capacité à provoquer des infections chez l’homme. Les symptômes liés à ces infections vont de la diarrhée bénigne à des symptômes très graves : hémorragie intestinale, syndrome hémolytique et urémique (SHU). Les principaux modes d’infection sont la consommation d’aliments contaminés, la transmission interhumaine, le contact avec des animaux porteurs. Les infections à STEC constituent un problème majeur en raison de l’extrême sévérité possible des symptômes. Le SHU est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. La mortalité est de 3-5% et plus d’un tiers des malades ont des séquelles rénales à long terme. L’Argentine a l’incidence la plus élevée au monde de ce syndrome. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique lié à ces bactéries. La toxine produite par les STEC est une protéine formée non par la bactérie mais par un virus qui infecte cette bactérie (phage). Expérimentalement, chez la souris, une STEC infectée par le phage est pathogène. A l’inverse, les STEC chez lesquelles le phage a été éliminé ne sont plus pathogènes. Lorsque les bactéries infectées par le phage se trouvent dans un organisme de mammifère et qu’un stress est induit, les phages sont libérés par la bactérie, peuvent atteindre les organes-cibles (ex : le rein), et produire la toxine qui induit des dommages. L’objectif de ce projet est de comprendre les mécanismes impliqués dans les infections causées par les bactéries STEC.

Bénéfices attendus

Les bénéfices obtenus sont une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC, en particulier dans la production de la toxine dans l’organisme. L’utilisation de souris dépourvues de microbiote intestinal (axéniques) permettra de s’affranchir des interférences avec les bactéries de ce microbiote à deux niveaux : en évitant la transmission possible du phage à des bactéries du microbiote intestinal ; en évitant un « effet barrière » du microbiote intestinal à l’égard des STEC, qui affaiblirait leur pouvoir pathogène. Les infections à STEC constituent un problème majeur de santé publique en raison de l’extrême sévérité de certains symptômes. La forme la plus grave, le syndrome hémolytique et urémique (SHU), est la principale cause d’insuffisance rénale aiguë chez l’enfant de moins de 3 ans. Si la dialyse a permis de réduire la mortalité, celle-ci reste non négligeable (3-5%) et beaucoup de ces jeunes malades conservent des séquelles rénales à long terme. Comprendre les mécanismes impliqués dans le pouvoir pathogène des STEC est indispensable pour évaluer le risque pour la santé publique, en particulier lors d’infection par des denrées alimentaires contaminées. Cette évaluation est très importante pour l’Argentine, qui a l’incidence de SHU la plus élevée au monde chez l’enfant, ce qui explique que le présent projet soit financé par ce pays.

Procédures

En début de procédure, les souris sont soumises à un jeûne hydrique de 4 heures, suivi d’une inoculation par voie orale. Les souris ont au maximum 2 inoculations orales à 30 min ou 24 heures d’intervalle. Puis des prélèvements de fèces sont effectués quotidiennement pendant 7 jours. Les animaux auront un prélèvement de sang qui dure 30 secondes environ. Les animaux recevront deux injections qui dureront moins de 30 secondes. Des organes et du sang seront prélevés après analgésie et anesthésie profonde (sans réveil).

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues chez les groupes recevant les bactéries sans phage sont réduites. L’inoculation par voie orale sera effectuée à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Les injections seront également réalisées par du personnel très expérimenté. Les nuisances attendues dans le groupe recevant les bactéries avec phage, donc pathogènes, sont : faiblesse ; possible diarrhée ; possible déshydratation consécutive à la diarrhée et aggravée par la difficulté des souris à s’abreuver du fait de leur faiblesse. Des contre-mesures seront mises en place : ramequins d’aliment gélifié déposés sur la litière pour leur permettre alimentation et abreuvement sans effort physique ; surveillance 3 fois par jour pour détecter l’apparition de symptômes. Des points limites ont été identifiés.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort. Ceci est nécessaire pour l’obtention des organes et tissus sur lesquels seront pratiquées différentes analyses.

Remplacement

L’analyse des mécanismes du pouvoir pathogène des STEC, qui se traduit par l’envahissement de différents organes par une toxine, n’est actuellement possible que chez des animaux vivants. Il n’existe en effet pas d’alternative suffisamment sophistiquée pour simuler un être constitué de plusieurs organes interagissant entre eux par de multiples voies.

Réduction

L’expérience argentine dans le domaine étudié permet de considérer que 10 souris par groupe sont un effectif suffisant pour comparer des résultats d’immunohistochimie de manière robuste entre groupes. Nous utiliserons donc 10 souris par groupe dans tous les groupes. Dans les groupes inoculés avec la bactérie pathogène, la survenue d’un syndrome infectieux pourra amener à mettre à mort des souris de manière anticipée, si les points limites définis à l’avance sont atteints. Les analyses de tissus seront tentées sur ces animaux. Mais, si l’euthanasie est trop précoce, les résultats pourraient ne pas être comparables à ceux des groupes témoins. Nous prévoyons donc 30 souris supplémentaires, qui seront utilisées si nécessaires. Au total, nous prévoyons d’utiliser 110+30=140 souris.

Raffinement

Les souris seront hébergées en groupes sociaux de 5 individus par cages, sur une litière de copeaux. Croquettes de nourriture de formulation standard et eau seront distribuées à volonté. Un enrichissement de milieu sera apporté : papier à déchiqueter, buchettes à ronger, tunnel dans lequel se cacher et hamac dans lequel se percher. Cet enrichissement est similaire à celui dont auront préalablement bénéficié les souris dans les cages d’élevage, elles y seront donc habituées. De plus, des ramequins d’aliment gélifié de formulation standard seront déposés sur la litière. Ce raffinement permettra aux souris de pouvoir s’alimenter plus facilement en cas de faiblesse et fatigue. De plus, du sérum physiologique stérile à 37°C pourra être injecté aux souris si elles montrent des signes de déshydratation. Les animaux seront visités 3 fois par jour après l’inoculation bactérienne pour détecter au plus vite de possibles symptômes et décider d’une euthanasie anticipée si les points limites sont atteints. Les bactéries seront administrées par voie orale à l’aide d’une sonde souple, peu traumatisante, par du personnel très expérimenté, chez des souris préalablement habituées à être prises en main par le manipulateur. Toutes les injections seront effectuées par du personnel expérimenté. Préalablement à l’euthanasie des souris, de puissants antalgiques et analgésiques seront administrés.

Choix des espèces

La souris est un modèle établi pour l’étude du pouvoir pathogène des STEC, avec une pertinence démontrée pour la situation humaine. Nous utiliserons des jeunes souris de 3 semaines (semaine suivant le sevrage). Chez l’être humain, les infections à STEC touchent principalement les très jeunes enfants. Nous utilisons en part égale des souris mâles et femelles car la maladie touche indifféremment les deux sexes.

21 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce dossier reprend le même protocole qu'une autre demande du lot, une injection virale dans le cerveau pour induire une maladie de type Parkinson, deux IRM de deux heures sous anesthésie, des gavages et des isolements de vingt-quatre heures, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur affirme que la chirurgie n'induit ni souffrance ni troubles hors de la maladie, tout en reconnaissant plus loin une douleur possible, une perte de poids et une hypothermie. Sur le remplacement, il affirme que l'étude du lien entre microbiote et système nerveux ne peut se faire que chez l'animal.

Objectifs

Les objectifs de ce projet sont : - de valider un modèle rat parkinsonien sur la souche axénique exclusivement employée dans notre établissement utilisateur, souche permettant de contrôler le microbiote des rats. - de caractériser finement les conséquences de la maladie tout au long de l’axe cerveau/intestin par différentes méthodes. - de connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie.

Bénéfices attendus

Les bénéfices sont : - de disposer d'un modèle rat parkinsonien sur la souche employée en conditions axéniques dans notre établissement utilisateur. - de caractériser finement les conséquences de la maladie par des méthodes multisytémiques. - choisir la technique d'IRM non invasive capable de détecter les signes de la maladie au niveau cérébral. - connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie. Si nous constatons une modification du microbiote en lien avec le développement de la maladie de Parkinson, nous proposerons de poursuivre cette étude en modifiant le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration du phénotype de la maladie (transplantation fécale issue de microbiotes de patients humains, introduction de prébiotiques dans l'alimentation). L’objectif à terme de ce projet serait de proposer de potentiels prébiotiques qui pourraient améliorer la qualité de vie des malades atteints de la maladie de Parkinson ou ralentir la progression de la maladie.

Procédures

- L’injection intracérébrale sera effectuée 1 fois pour chaque animal sous anesthésie, cette chirurgie dure environ 1h. - L’IRM du cerveau du rat est effectuée sur un équipement dédié aux investigations chez le rat sous anesthésie à l’isoflurane. Les rats sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Les explorations IRM seront réalisées 2 fois pour chaque animal à 9 semaines d’intervalle. - Les prélèvements de fèces pour l'analyse du microbiote et la mesure du temps de transit sont effectués dans les cages, sans intervention sur les animaux. - Le test appréciant le comportement moteur des rats est effectué toutes les 2 semaines (de la semaine 4 à la semaine 14), il dure environ 20 min. - La mesure du temps de transit par gavage de spores sera réalisée 2 fois, en semaine 7 et semaine 13, il nécessite un isolement durant 24 h en cage individuelle.

Impact sur les animaux

L’intervention chirurgicale a pour but d’induire une maladie chronique. En dehors de ce dommage durable, le geste chirurgical n’induit ni souffrance, ni altérations comportementales (en dehors de celles directement en rapport avec la maladie de Parkinson). Cependant, les rats peuvent présenter des effets indésirables liés à cette intervention chirurgicale, douleur, perte de poids, hypothermie. L’hébergement individuel des rats pendant 24 h toutes les 7 semaines pour les mesures de temps de transit induit un stress.

Devenir

A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques participant à la validation du modèle de maladie de Parkinson chez cette souche de rat.

Remplacement

L’étude du système nerveux, de par sa complexité d’organisation, de développement, de plasticité et de fonctionnement, demande à être effectuée au sein de l’organisme entier. Seules des approches menées in vivo chez un modèle animal peuvent améliorer la connaissance du cerveau et de son fonctionnement, et ainsi aboutir au traitement de ses pathologies humaines comme la maladie de Parkinson. L'objectif de ce projet est de modifier le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration de la maladie, aussi l’étude du couplage microbiote/système nerveux ne peut être réalisé que chez l’animal.

Réduction

Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour apporter des résultats statistiques à l’étude. L’imagerie par IRM est un outil non invasif et indolore qui permet le suivi du développement d’une pathologie sur un même animal.

Raffinement

Les animaux seront acclimatés pendant 7 jours à leur arrivée et lors du transfert entre les 2 animaleries, de l’enrichissement sera mis à disposition dans les cages. Au préalable à chaque procédure, les animaux seront amenés pendant 60 min dans la pièce de l’intervention afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Après chaque anesthésie, que ce soit pour la chirurgie ou l’IRM, les animaux seront placés dans une cage de réveil réchauffée par une plaque chauffante. Ils seront surveillés régulièrement par l’expérimentateur pendant les heures qui suivent l’intervention jusqu’à ce que l’animal ait pleinement récupéré. Pour analyser le temps de transit chez l’animal, une suspension de spores est administrée par gavage orogastrique, technique pour laquelle la douleur et le stress sont limités pour l'animal lorsque le geste est réalisé par des intervenants formés et expérimentés (mise en place d'un conditionnement "pré-contention" avec manipulation régulière des animaux). Toutefois, une surveillance accrue est mise en place à la suite de l'exécution de la technique pour détecter d'éventuels signes de mal être suite à l'intervention.

Choix des espèces

La littérature scientifique montre que le rat est une espèce de choix pour l'étude du fonctionnement cérébral dans la Maladie de Parkinson. Nous pourrons ainsi confronter les données de la littérature utilisant les modèles classiques avec les résultats obtenus grâce à notre nouveau modèle dans le cadre de ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes (environ 200 g en début d'étude), afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur les coordonnées des différentes structures cérébrales dans l’espace.