Multisystémique
- Autre recherche fondamentale
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Étude expérimentale du phénomène d’ischémie-reperfusion mésentérique chez la souris et le rat : caractérisation et recherche de marqueurs diagnostics.
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
Rats : 90
180 animaux non-humains, 90 souris et 90 rats, vont être utilisés dans des procédures menées sous anesthésie, les animaux étant tués avant tout réveil. Sous anesthésie générale, on ouvre l'abdomen et on ligature l'artère qui irrigue l'intestin pendant une heure avant de rétablir la circulation, ce qui provoque une mort des tissus intestinaux, avec chez le rat six prélèvements sanguins au cou. Le projet étudie l'ischémie-reperfusion mésentérique et cherche des marqueurs sanguins transposables à l'humain. Le porteur justifie souris et rats par la nécessité de conditions homogènes non réalisables chez l'humain et présente la mise à mort comme évitant la souffrance irréversible de l'intestin.
Objectifs
L’ischémie mésentérique est une pathologie sévère associant une insuffisance vasculaire et une souffrance digestive intestinale. Cette maladie résulte d’un débit sanguin et d’un apport en oxygène insuffisant pour répondre aux demandes physiologiques du tube digestif (intestin). Dans sa forme aiguë, c’est une urgence abdominale rare (< 1/1000 admissions à l’hôpital), avec une mortalité très élevée, de l’ordre de 60 à 80%, alors qu’elle est une maladie potentiellement réversible. La réoxygénation du tube digestif (intestin), essentielle à la préservation intestinale, peuvent paradoxalement accentuer les lésions vasculaires et tissulaires. Certaines études expérimentales sur animaux ont montré que les lésions muqueuses observées après 3h d’ischémie et 1 h de reperfusion étaient plus sévères que celles observées après 4h d’ischémie sans reperfusion. Cette observation implique des lésions initiées par le retour du sang oxygéné vers les tissus ischémiques. L'objectif principal est d'observer les interactions entre les cellules sanguines au sein des vaisseaux intestinaux de petit calibre lors d’arrêt de l'apport sanguin artériel au tube digestif puis lors de sa restitution. Nous souhaitons aussi étudier l'effet d'un traitement fluidifiant le sang (antithrombotique ou anticoagulant) sur ces intéractions. L’objectif secondaire est la recherche de marqueurs sanguins diagnostiques précoces et d’efficacité thérapeutique lors d'un arrêt de l'apport sanguin artériel au tube digestif puis lors de sa restitution, transposables à l’homme.
Bénéfices attendus
Ce travail nous permettra de mieux comprendre pourquoi il est difficile de restaurer une circulation sanguine efficace dans les petits vaisseaux mésentériques après une occlusion à l'origine de l'artère mésentérique supérieure (vascularisant le tube digestif), ainsi que l'intérêt de cibler rapidement les mécanismes inflammatoires et de coagulation pour obtenir de meilleurs résultats.
Procédures
Les animaux (souris et rats) seront opérés sur une table chauffante à 37°, après une anesthésie générale et un traitement antalgique. Après ouverture abdominale, l'artère mésentérique supérieure (branche de l’aorte abdominale vascularisant le tube digestif) sera ligaturée avec un fil chirurgical pendant maximum 1h puis déclampée pendant 1h. Chez la souris, les interactions cellulaires au sein des vaisseaux intestinaux de petit calibre seront observées grâce à un marqueur sanguin fluorescent, sous appareil optique, pendant l'ischémie (30 min ou 1h) puis pendant la reperfusion (1h) du tube digestif. Chez le rat, 6 prélèvements sanguins par un vaisseau du cou, seront réalisés afin de suivre différents biomarqueurs sanguins et évaluer l'efficacité du traitement anticoagulant administré au niveau de d’un vaisseau du cou sur un tiers des animaux (rat et souris) avant la ligature.
Impact sur les animaux
Chaque ischémie-reperfusion mésentérique conduit à des complications différentes pour chaque animal : ischémie des tissus intestinaux qui conduit à une mort des tissus intestinaux à des temps différents pour chaque animal (parfois à 30 min, parfois à 1h).
Devenir
Toutes les souris seront euthanasiées après la reperfusion intestinale afin d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil. Tous les rats seront euthanasiés après la reperfusion intestinale afin de prélever l’intestin grêle pour analyse histologique et d'éviter toute douleur liée à la souffrance irréversible de l'intestin et ses complications en cas de réveil.
Remplacement
L’ischémie-reperfusion mésentérique est une maladie grave, d'une mortalité extrême (70% chez l'Homme), avec des formes très hétérogènes, encore très mal connue, qui n’est pas reproductible in vitro. L’utilisation des modèles souris et rat est justifiée par la nécessité d’une étude dans des conditions parfaitement homogènes et standardisées, non réalisables chez l’Homme.
Réduction
Les analyses des divers marqueurs évalués seront regroupées pour chaque souris et chaque rat afin d'optimiser le nombre d’animaux et les volumes de plasma nécessaires. Des travaux préliminaires ont permis d’évaluer les différentes moyennes escomptées permettant le calcul du nombre de sujets nécessaires afin d’utiliser le minimum d’animaux tout en assurant l’obtention de résultats statistiquement significatifs.
Raffinement
L’anesthésie et l’analgésie seront monitorées visuellement (réflexes à la douleur) et adaptées, l’animal sera opéré sur une table opératoire chauffée à 37°C.
Choix des espèces
Notre laboratoire est habitué à travailler avec les souris et les rats, et cela à chaque étape de l’expérimentation : soins préalables, maniement et gestion du stress, matériel anesthésique, opératoire et de monitorage, analgésie et euthanasie. L'observation des interactions cellulaires au sein des vaisseaux de petit calibre est obtenue de façon optimale chez la souris femelle de petit poids (15/20 g, d'environ 7 semaines) pour sa faible teneur en graisse mésentérique. La souris mâle ou le rat ont une teneur mésentérique en graisse trop importante, rendant l’observation du flux sanguin mésentérique difficile. Pour l’étude des biomarqueurs, de nombreux tests biochimiques ne sont disponibles uniquement pour les rongeurs ou l’Homme. Le rat male de 9 semaines (environ 350 g) a un volume sanguin suffisant aux 6 prélévements permettant suivre les taux de marqueurs spécifiques. Le volume sanguin de la femelle est moindre.
La metformine peut elle promouvoir B. faecichinchillae, espèce commensale du microbiote intestinal humain possèdant des propriétés anti-diabétiques équivalentes
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
96 rats nés sans flore intestinale vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures classées de gravité légère. Ils reçoivent par gavage le microbiote d'un donneur humain puis une supplémentation quotidienne de metformine, subissent des prélèvements de selles hebdomadaires et des contentions en tube pour la mesure de composition corporelle, avant l'autopsie. Le projet cherche à savoir si la metformine favorise une bactérie intestinale aux propriétés antidiabétiques, en vue d'un probiotique chez l'humain. Le porteur affirme le "recours absolu" à un modèle animal, jugeant l'analyse impossible chez l'humain.
Objectifs
L’objectif du projet est de déterminer si la metformine, traitement thérapeutique du diabète de type II, peut promouvoir la population bactérienne d'intérêt, Bacteroides Faecichinchillae, possédant également des propriétés anti-diabétiques, dont les effets sur la santé seront évalués, en particulier au niveau tissulaire.
Bénéfices attendus
Si le traitement à la metformine permet de promouvoir l’espèce commensale d’intérêt, B. faecichinchillaeae, l’utilisation de cette bactérie sera proposée comme probiotique chez l’homme soit en remplacement de la metformine soit en association avec la metformine. L’administration de la souche permettrait en effet de limiter les effets secondaires observés chez l’homme suite à la prise de ce médicament.
Procédures
Les animaux seront soumis à 5 types d'interventions au cours du pojet : 1) gavage orogastrique permettant l'implantation du microbiote du volontaire chez les rats axéniques (animaux nés sans microflore bactérienne colique) : 1 seule intervention, en tout début de projet et d'une durée inférieure à la minute car elle est pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 2) prélèvements de selles : 1 intervention pas semaine et par animal, d'une durée inférieure à la minute, et enfin 3) une supplémentation quotidienne de Metformine par un gavage oro gastrique (200mg/kg de poids corporel) pratiquée par des zootechniciens formés et expérimentés 4) la composition corporelle est mesurée a l'aide d'un appareil analytique type RMN qui effectue les mesures en 3 min, pendant cette durée les animaux sont contentionnés dans un tube PVC afin qu'ils restent immobiles pour la précision des mesures.
Impact sur les animaux
Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Les donneurs étant, dans le cadre de projet des volontaires sains, aucun effet indésirable n'a été constaté lors du developpement et de l'utilisation de ce modèle, l'alimentation est, de plus, adaptée et n'entraine donc pas de troubles digestifs ou de croissance. Plus de 60 ans d'utilisation de la metformine en santé humaine ont démontré l'efficacité et l'inocuité de ce médicament, toutefois, selon les doses prescrites, des effets secondaires sont observés chez près de 25 % des patients en particuliers des intolérances gastrique et nausées. Si dans la bibliographie, ces symptômes ne sont pas mentionnés dans les éudes in vivo, une attention particulière sera, cependant, portée sur une apparition potentielle de ces symptômes lors de l'observation quotidienne des animaux. Le gavage orogastrique qui va permettre l'établissement du modèle peut être source de stress, lié à la contention de l'animal. C'est pourquoi les animaux sont préalablement conditionnés à la manipulation et que le geste technique est réalisé par des zootechniciens formés et expérimentés qui vont limiter significativement la durée de ce stress potentiel (moins d'une minute). De la même façon, le prélèvement de selles chez l'animal peut être source de stress lié, également, à sa contention nécessaire, toutefois considérant la fréquence (1 fois pas semaine) et de la rapidité du geste (moins d'une minute), les effets indésirables sont très limités.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort à l'issue de cette procédure puis autopsiés afin de récupérer l'ensemble des organes et fluides métaboliques nécessaires aux futures analyses biologiques, génomiques et histologiques.
Remplacement
L’évaluation de l’impact de la metformine sur le microbiote nécessite le recours absolu à un modèle animal pour atteindre notre objectif. Il est en effet très difficile voire impossible d’analyser l’effet potentiel de ce produit sur le rôle de la paroi intestinale (perméabilité, immunité) et sur les métabolismes hépatiques (céramides, voies métaboliques de l'insuline, etc...) chez l’homme. De plus, ceci nécessite une alimentation contrôlée et similaire pour tous les individus ainsi que des mesures et des prélèvements particulièrement difficiles à effectuer chez l’homme.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été réduit au strict nécessaire pour observer des effets statistiquement significatifs. De plus, les tissus prélevés seront soient analysés pour répondre au questionnements scientifiques proposés par le projet, soient conservés pour de futures analyses, non prélablement prévues dans le cadre du projet, et qui pourraient complémenter les résultats obtenus.
Raffinement
Les procédures, nécessitant un raffinement de leur exécution pour limiter leur impact sur les animaux, sont les gavages orogastriques, les prélèvements de selles Celles ci seront réalisées par des zootechniciens formés et expérimentés qui permettront de limiter la durée de la procédure par animal (moins d'une minute pour le gavage et les prélèvemets de selles). De plus, avant la première intervention, une habituation à la contention sera réalisée prélalablement par ces zootechniciens permettant ainsi de diminuer le stress suceptible d'être occasionné par ce geste technique. Les animaux font l'objet d'une surveillance quotidienne pour détecter, réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur, la détresse ou l'angoisse. la classification modérée lors du passage en chambre respiratoire est justifiée par le fait que les animaux doivent etre places seul dans ces equipements afin de mesurer individuellement les excretions de gaz. Quelle que soit la procédure appliquée, si un animal présentait les signes suivant : perte de poids, prostration, comportement agressif, léthargique, etc... (points limites notables) ou plaies, saignement nasaux ou fécaux, etc...(points limites graves), l'arbre de décision concernant l'application des point limites serait suivi immédiatement.
Choix des espèces
Les espèces animales choisies sont des rats mâles nés axéniques de la lignée Fischer âgés de 10 semaines. Il s’agit d’un modèle communément utilisé pour les études concernant le tube digestif, en particulier celles réalisées à partir d’animaux gnotobiotiques à microbiote humain. Le rat est en effet reconnu pour sa capacité à conserver un microbiote dont la composition est très proche de celle du microbiote humain du donneur. Il permet également le recueil d’une quantité plus importante de fèces et de contenus caecaux nécessaires aux études de la composition et de l’activité du microbiote intestinal que la souris. Les rats seront âgés de 10 semaines au moment de l'implantation du microbiote de volontaire par gavage oro gastrique. Cet âge correspond à un stade de développement optimal pour l'acceptation et la stabilisation dans le temps du microbiote transplanté.
Implication de la réponse aux glucocorticoïdes dans l’émergence des désordres cardio-métaboliques associés au vieillissement dans un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
2 528 souris vont être utilisées, tuées à l'issue ou mourant en cours d'étude pour les cohortes de longévité, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent injections, gavages, régimes gras sur plusieurs mois, tests métaboliques avec jeûne et prélèvements sanguins répétés, et passages en cage de calorimétrie. Le porteur reconnaît que régime gras, jeûnes, contention et transport sont des sources de stress. Il justifie l'espèce par l'espérance de vie courte de la souris, qui permet une étude de vieillissement en cinq ans, et présente le bénéfice thérapeutique comme lointain.
Objectifs
L’étude de la longévité et de l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu actuel majeur. En effet, de par leurs forts impacts sur la santé publique, le vieillissement et les maladies chroniques font parties des thématiques prioritaires en recherche. Réduire le vieillissement et étendre l’espérance de vie en bonne santé est un enjeu économique majeur, en diminuant les maladies chroniques associées à l’âge. Ce projet de recherche s’inscrit dans cette thématique, en décrivant de façon originale le rôle méconnu des glucocorticoïdes (hormones circulantes impliquées notamment dans le métabolisme glucidique) dans le vieillissement des tissus sensibles à l’insuline, en particulier le tissu adipeux et le muscle squelettique ; et dans le vieillissement physiologique. Notre projet vise donc à définir l’impact des glucocorticoïdes sur le vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce travail permettra in fine de proposer une approche thérapeutique ciblée afin de limiter l’impact métabolique néfaste des glucocorticoïdes et traiter les troubles métaboliques liés à l’âge pour étendre l’espérance de vie au global et/ou l’espérance de vie en bonne santé. De plus, ce projet déterminera si l’âge modifie la sensibilité aux glucocorticoïdes, notion importante sachant que les individus de plus de 65 ans sont surreprésentés dans la population traitée par les glucocorticoïdes.
Procédures
Au cours de ce projet les animaux seront exposés à différents gestes techniques afin de répondre aux objectifs scientifiques. Les interventions sont majoritairement peu invasives. Les différentes séries de gestes réalisés sur les souris pourront être au choix selon les questions scientifiques : 1-Injections intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours, 5 sec animal vigile), Administration de traitement dans l’eau de boisson (4 semaines maximum), Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte), 2h pour chaque tests, 2 tests espacé d’une semaine minimum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 2-Injections intrapéritonéale (1 fois par jour pendant 5 jours, 5 sec animal vigile), Administration de traitement dans l’eau de boisson (4 semaines maximum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 3-Utilisation de régimes spéciaux (20 semaines de régime maximum), Mesure de la pression artérielle (30 minutes pendant 5 jours, 2 fois au cours de la vie), transport optionnel vers un autre établissement, Mesure de la composition corporelle (5 à 10 minutes, animal vigile) et cages calorimétrie (5 jours maximum), Tests dynamiques d’exploration du métabolisme glucidique (mise à jeun de 5h, 1 injection intrapéritonéale ou 1 gavage unique, 6 prélèvements sanguins de très faible quantité (une goutte) (2h pour chaque tests, 2 tests espacé d’une semaine minimum), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 4-Deux prélèvements sanguins espacés de 7 jours (20 secondes par prélèvement, 2 fois au cours de la vie sur animal vigile), Injection intrapéritonéale unique (5 sec par animal sur animal vigile), Prélèvement sang sous anesthésie et analgésie suivi de l’euthanasie et des prélèvements post-mortem (5 minutes). 5-Etude de longévité incluant uniquement le maintien des animaux à long terme en conformité avec la réglementation et incluant un suivi avec établissement d’un score (5 min par animal, 1 fois toute les 6 semaines à partir de 18 mois et jusqu’à la fin de vie) Chaque point représente une trajectoire de vie pour un groupe d’animaux et donc le maximum d’actes effectués sur ce même groupe.
Impact sur les animaux
Dans le cadre de ce projet les animaux seront impliqués dans différents actes pouvant induire un stress ou une douleur qui sera systématiquement prise en compte. Pour la quasi-totalité des animaux du projet, les administrations/prélèvements entraineront une contrainte/stress liée à la contention, au gavage et/ou à la piqure de l’aiguille pour les injections qui sont légers et de courte durée. Certains animaux seront exposés à des traitements aux glucocorticoïdes ou seront exposés à un régime gras pouvant induire une obésité et/ou une insulino-résistance. Ils seront également amenés à suivre des challenges métaboliques pouvant entrainer un stress ou des effets physiologiques tels qu’une hypo- ou une hyperglycémie. Les animaux seront impliqués dans des mesures de la composition corporelle, de la pression artérielle et aux mesures de calorimétrie qui peuvent induire un stress de courte durée lié à leur placement en boites de contention ou de durée plus longue lors de l’isolement en cage de calorimétrie. De même, le transport possible des animaux vers un autre établissement qui pourra être mis en œuvre sera également source de stress pour les animaux. Enfin, les animaux inclus dans les cohortes de longévité pourront ressentir une contrainte/stress liée à la contention lors de l’évaluation de l’index de fragilité. Les animaux seront également exposés aux effets indésirables inhérent au vieillissement.
Devenir
L’ensemble des animaux impliqués dans ce projet seront euthanasiés à l’issus des actes mis en œuvre par une méthode réglementaire effectuée selon les bonnes pratiques. L’euthanasie des animaux est requise pour limiter la souffrance animale et pour l’étude histologique ou biochimique des tissus sensibles à l’insuline des animaux. Dans le cadre de l’étude de vieillissement certains animaux seront susceptibles de décédés naturellement au cours de cette procédure de longévité ou seront euthanasiés par une méthode règlementaire en cas d’atteinte des points limites définis.
Remplacement
Il s’agit d’un travail de physiologie intégrée qui permettra de comprendre les communications inter-organes et les régulations métaboliques entre différents tissus. Aucun modèle cellulaire ne permet de reproduire les interactions inter-organes et la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu. D’un point de vue évolutif, le récepteur aux glucocorticoïdes apparait chez les vertébrés terrestres et plus particulièrement chez les mammifères, justifiant l’utilisation d’un modèle mammifère dans ce projet. Enfin, l’utilisation d’un modèle rongeur tel que la souris, se justifie par l’espérance de vie relativement courte de ces animaux, permettant la réalisation du projet dans le temps imparti (5 ans).
Réduction
Le projet impliquera un total de 2528 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités inter-animales et intergroupes, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte-tenu des données de la littérature et des effets espérés, un test de puissance statistique a été utilisé pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour cette étude. Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l’utilisation inutile de souris. En effet, les procédures expérimentales et les tests statistiques ont été validées dans des études précédentes. L’effet de l’âge sur la mortalité des animaux et la variabilité des résultats a été pris en compte en augmentant le nombre d’animaux dans les groupes les plus âgés afin d’obtenir des résultats valides. Nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable des résultats dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, soins, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux tout au long de leur vie grâce à une surveillance attentive (scoring, points limites) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). Nous avons inclus dans les protocoles de longévité des grilles d’évaluation spécifique, incluant des observations cliniques détaillées et le suivi du poids des animaux. Les animaux fragiles identifiés seront suivis avec une vigilance accrue. En cas d’atteinte d’un point limite préalablement défini, cela entrainera l’euthanasie de l’animal dans les plus brefs délais afin de limiter la contrainte au maximum.
Choix des espèces
Justification de l’espèce : Le récepteur aux glucocorticoïdes, tel que présent chez l’homme, est spécifique des mammifères et ne permet pas l’utilisation d’autres organismes modèles plus simples. Les expériences de longévité justifient l’utilisation de petits mammifères présentant une espérance de vie courte, tels que la souris. Plusieurs modèles murins transgéniques seront utilisés au cours de notre projet afin de répondre aux différentes questions scientifiques. Justification des stades de développement : Des souris commerciales et transgéniques seront utilisées de 10 semaines à 60 semaines afin d’étudier les adaptations métaboliques des animaux en cours de vieillissement. De plus, des animaux « gériatriques » (24 mois et plus) seront utilisés afin d’évaluer l’espérance de vie maximale des individus et leur sensibilité aux glucocorticoïdes. Justification du sexe : Les glucocorticoïdes sont connus pour induire un dimorphisme sexuel. Nous étudierons donc dans ce projet des animaux des deux sexes afin de déterminer si le dimorphisme sexuel en réponse aux corticoïdes est présent aussi avec l’âge.
Evaluation de l’effet de composés des phéromones apaisantes maternelles sur l’anxiété et l’agressivité chez la souris (Mus musculus)
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
112 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 62 tuées pour prélèvements et 50 ramenées en élevage. La moitié est isolée pendant sept jours pour accroître leur agressivité avant un test où les animaux peuvent se battre et se blesser, l'autre test mesurant l'anxiété. Le porteur reconnaît le risque de blessures physiques et le stress social de l'isolement. Il justifie l'usage d'un "organisme entier" par la détection de phéromones, l'application visée étant une apaisine commercialisable pour l'élevage et les animaux de compagnie.
Objectifs
Les phéromones apaisantes maternelles sont des substances chimiques libérées par les glandes sébacées situées dans la région mammaire de la mère, peu après la mise-bas et durant la lactation. Il a été montré que ces phéromones ont des effets apaisants sur la progéniture, et également à l’âge adulte. Leur identification a permis une application pratique de ces « apaisines » en élevage ou chez les animaux de compagnie, pour faciliter la gestion de situations stressantes.. Préciser et comprendre comment ces phéromones agissent, notamment au niveau neurobiologique, immunologique, et de l’expression des gènes est un axe de recherche important dans lequel s’inscrit ce projet et qui nécessite le choix d’un modèle animal sur lequel plusieurs études fondamentales peuvent être facilement menées compte-tenu des outils d’analyse disponibles et des connaissances scientifiques actuelles. La souris est apparue comme le meilleur modèle au vu de l’existence de kits de dosages de neurohormones utilisables et validés, de kits de séquençage des gènes préconçus et la connaissance de plusieurs gènes de référence, et de l’anatomie fonctionnelle du cerveau et du système immunitaire de cette espèce. Au préalable, il est nécessaire d’évaluer/vérifier l’effet des substances chimiques composant la formule des apaisines sur le comportement des souris, notamment leur anxiété et agressivité. Si cette étude s’avère concluante et qu’un tel effet apaisant est confirmé, le projet devrait être poursuivi afin d’investiguer les impacts des apaisines sur la physiologie des souris et les mécanismes qui y sont liés. Outre les connaissances biologiques apportées par une telle recherche sur le plan fondamental, le projet a également un but applicatif plus direct. En effet, les souris comptabilisent près de 64% des animaux utilisés pour la recherche dans des conditions de vie potentiellement anxiogènes (milieu de vie relativement pauvre, stress dû aux manipulations…). Pour une meilleure fiabilité des données scientifiques et pour des raisons tout simplement éthiques, il est important de s'assurer de leur bien-être et de raffiner au mieux leur qualité de vie : l’installation de diffuseurs de phéromones apaisantes dans les animaleries expérimentales pourrait contribuer à l’amélioration de leur bien-être. L’utilisation des apaisines pourrait également être étendue à la sphère domestique pour les souris détenues comme animaux de compagnie.
Bénéfices attendus
Ils sont de 2 natures. Au niveau fondamental, cette étude permettra ensuite la réalisation d’autres études visant à investiguer le mécanisme d’action des apaisines et plus généralement de la communication chimique. Les mammifères terrestres s’appuyant sur la détection et l’interprétation des signaux chimiques de leur environnement pour guider leur comportement, notamment sociaux, cela est primordial pour leur survie et leur reproduction. Il est donc essentiel de connaître et comprendre les mécanismes d’action de la communication chimique. Cela est aussi nécessaire pour conforter l’utilisation actuelle des apaisines chez les animaux de compagnie et de rente. Au niveau appliqué, la confirmation de l’effet apaisant des substances testées permettra de développer une apaisine de souris qui pourra être ensuite directement utilisée dans les élevages à des fins scientifiques ou dans la sphère domestique pour les souris détenues comme animaux de compagnie. En effet, en France, 64% des animaux utilisés à des fins scientifiques sont des souris. S’intéresser au bien-être des individus hébergés dans ce cadre est essentiel : les raisons sont non seulement éthiques, mais elles concernent également la validité des résultats scientifiques – tout stress pouvant influer sur l’état mental et physique d’un individu et ainsi biaiser les résultats obtenus. De plus, assurer le bien-être des animaux utilisés à des fins de recherche est une exigence réglementaire. En fonction des recherches menées sur les animaux (limitant plus ou moins l’enrichissement du milieu de vie), diverses améliorations peuvent être mises en place ; c’est notamment dans ce cadre que s’inscrit la présente étude. En effet, si celle-ci confirme les effets apaisants de la formule de phéromone testée sur les souris (en diminuant leur anxiété et agressivité), le produit pourrait être diffusé dans les animaleries de recherche et ainsi contribuer au raffinement des conditions de vie. Il est également possible d’étendre l’utilisation des apaisines à la sphère domestique, par exemple lorsqu’un particulier adopte une nouvelle souris, afin de faciliter son adaptation à son nouvel environnement.
Procédures
La moitié des animaux (n=56) seront exposés au traitement apaisine, pendant toute la durée de l'étude (7 semaines), mais il n'est pas attendu de nuisances suite à cette exposition. Tous les animaux (n=112) subiront une fois chacun deux tests comportementaux (l’un durant 10 min et mesurant le niveau d’anxiété, l’autre durant 5 min mesurant le niveau d’agressivité) : ils peuvent être source d'angoisse/anxiété, stress psychologique, voire blessures, même si des dispositions sont prises pour éviter ces dernières. La moitié des animaux (n=56) subiront un isolement rapport à leur condition d'hébergement pendant 7 jours, qui peut être source de stress psychologique, mais qui est nécessaire en amont du test comportemental mesurant l’agressivité Une partie des animaux (n=62, 12 provenant de l'étude pilote et 50 provenant de l'étude principale) subiront une anesthésie générale par voie gazeuse au cours de laquelle sera effectué un prélèvement sanguin juste avant leur mise à mort. Cette intervention ne devrait pas durer plus d'une minute.
Impact sur les animaux
Durant la présente étude, les souris sont hébergées dans des conditions standards de laboratoire, ce qui peut engendrer plus ou moins de stress en fonction des individus dépendant de leur sensibilité et de la compatibilité des groupes formés. Certaines souris (n=56) font exception, étant isolées pendant sept jours pour les besoins du test comportemental mesurant l’agressivité dans des cages similaires mais plus grandes : cet isolement peut engendrer un stress social également, ces animaux étant sociaux et ayant toujours vécu en groupe. Cette durée a été choisie car conseillée dans la littérature afin d’accroître leur territorialité et donc leur agressivité envers un intrus. Ce test dure cinq minutes et constitue un stress social aigu. L’agressivité probable des souris faisant consensus dans une telle situation, les individus peuvent se battre plus ou moins violemment ; il y a donc un risque de blessures physiques. L’autre test comportemental a quant à lui été conçu pour évaluer l’anxiété des souris : celles-ci seront donc dans un état potentiellement anxieux durant les dix minutes du test, le fait que le dispositif soit surélevé avec deux branches non protégées par des murs constituant une source d’anxiété. Durant les essais, il y a également un stress de manipulation à prendre en compte, les souris appréciant peu le contact humain Le traitement lui-même, diffusé dans les salles, n’est pas sensé créer d’effet indésirable sur les souris, bien que cela soit surveillé tout au long de l'étude. La manipulation précédant l’anesthésie gazeuse pourrait être source de peur et représenter une nuisance, de courte durée cependant avant la perte de conscience de l’animal.
Devenir
Tous les animaux de l’étude pilote (n=12) sont immédiatement mis à mort à la suite du 2nd test comportemental pour les besoins de la suite du projet, c’est-à-dire la mise au point de méthodes de dosages à partir du volume de sang prélevé. Pour l’étude principale, les 50 souris qui auront subi un isolement rapport à leur condition d'hébergement pendant 7 jours sont mises à mort immédiatement à la suite du 2nd test comportemental, pour l’évaluation des paramètres du projet c’est-à-dire la réalisation des dosages de corticostérone et sérotonine. Les 50 souris ayant continué à être hébergées en conditions standard sont gardées en vie : elles seront ramenées en élevage après le 2nd test comportemental et seront utilisées ultérieurement pour de nouvelles mises au point méthodologiques, en fonction des résultats obtenus dans la présente étude.
Remplacement
Il s’agit notamment d’une étude de recherche fondamentale investiguant les mécanismes d'action physiologiques de la phéromone apaisante maternelle (apaisine). En tant qu'étude de physiologie, elle doit nécessairement porter sur des êtres vivants, qui représentent des systèmes biologiques intégrés, où de multiples organes/tissus fonctionnent de façon associée et coordonnée. En effet, l’utilisation de traitement phéromonal est une stimulation sensorielle par exposition à des phéromones qui nécessite l’utilisation d’organisme entier pouvant détecter et réagir aux composés testés. La détection de ces composés peut engendrer une cascade de réactions physiologiques pouvant mener à une modification du comportement ou de la physiologie de l’animal. Cela ne peut être obtenu et observé que sur animaux entiers pouvant pleinement exprimer leurs comportements et physiologies naturels. Il n'existe pas actuellement de méthodes de remplacement pouvant simuler ces changements suite à une stimulation sensorielle. Cela nécessite donc l’implication d’êtres vivants, dans ce cas des souris.
Réduction
L’effectif des animaux utilisés a été défini grâce à des tests statistiques de calcul de taille d’échantillons nécessaires, avec une puissance statistique de 90%, à partir de données issues d’études publiées. Selon ces calculs, en moyenne, en fonction des données mesurées, un effectif de 44 souris par traitement doit permettre d’observer une différence significative (si elle existe) entre les 2 groupes de l’étude principale (placebo vs. apaisine). 6 souris par condition ont été ensuite ajoutées pour pallier les pertes qui pourraient survenir pendant l’élevage, aboutissant à 50 animaux/groupe, soit 100 animaux au total pour l’étude principale. Une étude pilote est aussi prévue en amont, permettant l’entraînement et l’ajustement logistique et organisationnel des équipes sur un petit nombre d’animaux, qui vise à optimiser les chances de réaliser un essai probant scientifiquement : un effectif de 6 souris/groupe est estimé suffisant pour s’entrainer à la procédure, soit 12 souris au total pour l’étude pilote. Un effectif total de 112 souris est donc nécessaire. Aussi, du matériel biologique prélevé sur les souris de l’étude pilote étant utilisé pour mettre au point les méthodes d’analyse, cela maximise l’utilisation des animaux et contribue à la réduction du nombre d’animaux impliqués dans la recherche.
Raffinement
Concernant l’hébergement, les cages sont nettoyées 1 fois/semaine et aménagées pour répondre aux besoins de l’espèce, comprenant notamment de la litière (copeaux), eau et nourriture ad libitum, des enrichissements comme brique en bois pour ronger, tunnel et cabane en carton pour se cacher, fibres de kraft et coton pour nidifier, et des tapis anti-bruit dans les salles d’élevage. Grâce à une grille d’évaluation du bien-être, les animaux sont surveillés quotidiennement par du personnel qualifié afin de s’assurer d’un état clinique normal et de l’absence de signes de souffrance (par exemple : état du pelage, évaluation de la nidification, présence du comportement fouisseur, absence de comportement anormaux). Un arbre décisionnel basé sur les critères d'arrêt de souffrance est mis en place au cas où des signes de souffrance seraient constatés et les points limites adaptés atteints. Pour manipuler les souris, l’utilisation d’un tunnel de manipulation a été choisie pour limiter le stress. Toutes les manipulations ont lieu pendant la période d’activité des souris au laboratoire (après-midi), et sous lumière rouge (imperceptible) pour respecter leur activité nocturne. Une période d’habituation pré-test à la salle de 30min est réalisée. La présence physique des expérimentateurs dans les salles d’expérimentation sera réduite à son minimum au cours des observations comportementales qui seront vidéo-enregistrées. La ponction sanguine est réalisée sous anesthésie générale. La mise à mort est effectuée sur animal anesthésié en emmenant chaque souris dans une pièce dédiée du laboratoire, hors de la vue/ouïe/odorat de congénères pour éviter toute communication de stress entre individus.
Choix des espèces
L’objectif est de valider les effets comportementaux (anxiété et agressivité) des phéromones apaisantes maternelles (apaisines) sur les souris, pour étudier ensuite leur mode d’action, notamment au niveau neurobiologique, immunologique, et de l’expression des gènes. La souris est apparue comme le meilleur modèle au vu de l’existence de kits de dosages de neurohormones utilisables et validés, de kits de séquençage de gènes préconçus et de la connaissance de plusieurs gènes de référence, de l’anatomie fonctionnelle du cerveau et du système immunitaire de cette espèce. Développer des apaisines chez cette espèce revêt également un intérêt. La souche choisie est connue pour son caractère plus manipulable, moins anxieux et agressif pour limiter les risques de blessures lors des tests comportementaux. Elles ont un comportement maternel plus prononcé, ce qui, pour les apaisines, semble plus pertinent. Aussi, rapport aux études immunologiques envisagées ensuite, ces souris développent une réponse immunologique plus variée et représentative. Les souris impliquées dans l’étude sont des adultes. Elles ont 2 mois pour 56 d’entre elles et 3 mois pour les 56 autres. Le fait qu’une partie d’entre elles soient plus âgées devrait permettre à ces souris d’être plus grosses et plus dominantes envers les autres, et donc d’exprimer plus fortement le comportement agressif/territorial recherché. Le choix de sélectionner des adultes permet également d’étudier des souris susceptibles d’exprimer une diversité de comportements de leur espèce. De plus, ces animaux auront déjà une expérience sociale : ainsi, un isolement pour les besoins du test comportemental mesurant l’agressivité aura hypothétiquement moins d’effets délétères que sur des souris tout juste sevrées; cependant, les recherches sur l’impact d’un isolement à cet âge sur le bien-être des individus manquent à ce jour pour confirmer cette hypothèse.
Etude des mécanismes moléculaires et cellulaires de la sarcopénie chez le poisson zèbre
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
4 392 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 3 960 d'entre eux et sévère pour 432. Une partie subit un prélèvement de nageoire sous anesthésie pour le génotypage, et les lignées reproduisent un vieillissement musculaire pouvant entraîner amaigrissement et changements de comportement, pour étudier la sarcopénie. Le porteur indique qu'une perte de poids supérieure à 20 % déclenche l'arrêt du protocole. Il présente le poisson zèbre comme un modèle plus rapide et moins coûteux que le rongeur, et prévoit la mise à mort pour prélever le muscle.
Objectifs
La sarcopénie se définit comme une baisse progressive et généralisée de la masse musculaire, de la force et de la performance physique pour des patients en âge gériatrique. Cette pathologie est accompagnée d’une dépendance vis-à-vis d’autrui ainsi qu’un surcout des soins de santé. L’étiologie de cette pathologie est multifactorielle. La perte du maintien du pool de cellules satellites, une diminution de la vascularisation, l’altération de la balance entre la synthèse et la dégradation protéique, le dysfonctionnement mitochondrial ou encore la sénescence des cellules peuvent contribuer à l’apparition et/ou au développement de la sarcopénie. Dans ce contexte notre objectif est de déterminer, grâce à des approches génétiques chez le poisson zèbre, et de mieux comprendre les mecanismes cellulaires et moléculaires en jeu, au cours de l'atrophie musculaire au cours du vieillissement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires en jeu au cours de la perte de masse musculaire liée à l'age. Nous pourrons évaluer quels évènements biologiques sont à l'origine de la sarcopénie, identifier ce qui entre les vaisseaux, les mitochondries ou les cellules satellites ont le plus d'impact. Ceci permettra de designer de nouvelles approches thérapeutiques visant un compartiment biologique en particulier.
Procédures
Aucune procédure chrirugicale n'est prévue dans la DAP. La seule intervention prevue concerne le genotypage où quelques millimètres de la nageaoire caudale seront prélevés sous anesthesire afin d'en extraire l'ADN génomique et pouvoir identifier les individus porteurs des mutations recherchées. Le nombre d'individus génotypés sera de 2592. La durée de l'intervention sous anesthesie est de quelques secondes, et cette procédure n'est réalisée qu'une seule fois par individu.
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indesirables chez le poisson concernent principalement les conséquences du vieillissement, qu'il soit systémique chez le poissons TERT-/- ou musculaire chez le sarcofish. Autres effets à evaluer concernent les conséquences du traitement au tamoxifène (avec des effets toxiques possibles). Les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnés de changement comportementaux de type anixiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qu'il sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium).
Devenir
L'ensemble des poissons utilisés dans cette étude seront euthanasiés puisqu'il nous est nécessaire de prélever principalement le muscle squelettique (et d'autres tissus) pour étudier/évaluer les composantes moléculaires (attrition des télomères, cassures du double brin d'ADN, sénescence, séquençage ARN etc) qui necessitent de prélever le tissu musculaire et donc l'euthanasie préalable des poissons.
Remplacement
Dans le cadre de ce protocole nous comptons manipuler une quinzaine de gènes et générer au total 30 lignées transgéniques. Ces manipulations génétiques combinées à la puissance exploratoire du modèle poisson zèbre font de ces poissons un modèle unique pour étudier de manière integrée le rôle de nos cibles d'intérêts dans la progression du stress métabolique et du vieillissement (principe de remplacement).
Réduction
Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observée au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 9 animaux seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques (principe de réduction).
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres conduira à une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supèrieure à 20% conduira à l'arret du protocole expérimental (principe de raffinement).
Choix des espèces
Le poisson zèbre ou Brachydanio rerio est génétiquement modifiable et permet des études de grandes envergures de la même portée tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses, que celles menées chez le rongeur. De plus, un nombre quasi indéfini d’événements biologiques est quantifiable par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées transgéniques ont été générées et sont disponibles dans la communauté scientifique, et permettent de répondre à de vraies questions biomédicales. En tant que laboratoire académique nous pouvons facilement avoir accès à un très grand nombre de lignées transgéniques (peu onéreuses). Pour toutes ces raisons, le ZBF est à l’heure actuelle un modèle trés pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies.
Impact de la capture des cellules intestinales exprimant a4b7 dans le foie par l’induction intrahépatique de l’expression de MAdCAM-1 sur la croissance et l’immunité tumorale.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
1 584 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de tumeur, des prélèvements de sang hebdomadaires et l'injection d'une molécule d'ADN, pour étudier le lien entre microbiote intestinal et efficacité des immunothérapies anticancéreuses. Le porteur décrit une gêne modérée liée aux tumeurs sous la peau et affirme qu'un animal vivant et "entier" est "indispensable" faute de reproduire l'immunité antitumorale in vitro. Il présente un effet possible sur la survie des patients résistants comme une retombée majeure attendue.
Objectifs
Des études ont montré l’impact de la composition du microbiote intestinal sur la réponse aux traitements anticancéreux par immunothérapies. Ces traitements ont la capacité de restimuler le système immunitaire pour éliminer les cellules tumorales. La prise d’antibiotiques en amont de ces immunothérapies participe à la perte d’efficacité de ces traitements. Nous avons vérifié ce phénomène dans différents modèles murins. Ces études nous ont permis de découvrir le mécanisme biologique impliqué dans la perte d’efficacité des traitements au cours d’une dysbiose intestinale suite à la prise d'antibiotiques. Nous avons déterminé que cette prise ou la colonisation intestinale par certaines bactéries induit la perte de l’expression d'une protéine d'intérêt dans l’intestin. L’altération de l’expression de cette protéine conduit donc à une accumulation de ces cellules immunosuppressives dans la tumeur, ce qui empêche la réponse aux traitements. Afin de montrer le lien de causalité entre la présence des cellules impliquées et la perte d’efficacité des traitement d'immunothérapie, nous souhaitons dans un contexte traitement antibiotiqueou par la colonisation intestinale par certaines bactéries être en mesure d’induire une forte expression de la protéine d'intérêt à distance de la tumeur afin de capter certaines cellules d'importance. Nous envisageons donc d’administrer une molécule induisant l’expression la protéine d'intérêt dans le foie. Le rationnel de ce projet est de confirmer l’effet délétère de ces cellules importantes recirculantes au cours d’une modification du microbiote intestinal en forçant leur rétention dans le foie plutôt que dans la tumeur.
Bénéfices attendus
Nous souhaitons montrer qu’en l’absence de ces cellules d'intérêt d'origine intestinales dans la tumeur, nous sommes en mesure de restaurer l’efficacité des traitements par immunothérapie, malgré le contexte de changement de microbiote intestinal. Cela aurait donc un impact très important sur la survie des patients résistants aux traitements par immunothérapies.
Procédures
Greffes de tumeur: une injection sous anesthésie locale, durée 1 minute. Prélèvements de sang sous anesthésie générale (1 fois/semaine, durée 3 minutes) - Injection du produit (molécule d'ADN d'intérêt) sous anesthésie générale (1 fois, durée 3 minutes), prostration de courte durée suite à l'injection.
Impact sur les animaux
Les contraintes principales pour les animaux seront pour certaines procédures l'implantation de tumeurs, d’administration orale de bactéries et l’injection du plasmide, ainsi qu'une gêne modérée du fait de la présence de tumeurs sous la peau.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés pour prélèvements d'organes (tumeur, foie, intestins, ganglions, rate, ...) pour analyser les tissus, doser des protéines ou de l'ADN. Le maximum de prélèvements sera réalisé pour obtenir le plus de résultats au cours d'une seule expérimentation.
Remplacement
Pour la réalisation de ce projet, l’utilisation d’animaux vivants est indispensable car seul un animal vivant, entier, peut permettre d’étudier dans leur globalité, l’immunité antitumorale et l’effet des immunothérapies sur la réponse antitumorale dans un contexte de dysbiose intestinale, avec toutes les interactions nécessaires, impossibles à reproduire in vitro ou ex vivo.
Réduction
Pour la réalisation de cette étude, nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. Par la suite, l’étude est divisée en plusieurs procédures séquentielles et sera arrêtée si une des procédures invalide l’hypothèse de travail ; le nombre de souris sera ainsi diminué. Le nombre d’animaux est scrupuleusement contrôlé afin de respecter la règle des 3R. D'après nos études antérieures avec des lignées tumorales, nous avons définis un nombre maximal théorique de 18 animaux par groupe. Nous utiliserons des tests statistiques pour comparer les groupes entre eux. Le nombre d'animaux par groupe pourra être diminué à 12 (analyses en cours de procédure) si nous obtenons une résultat statistique. Ce résultat statistique sera basé sur la réduction du nombre de cellules a4b7 dans la tumeur ou leur augmentation dans le foie en présence du plasmide. Enfin, les dernières procédures envisagées se seront réalisées que si les premières procédures donnent les résultats attendus.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans le respect de leur bien-être, avec enrichissement adapté. Les animaux seront acclimatés pendant une semaine avant le début de l’expérimentation. La surveillance régulière permettra le suivi du comportement (prostration, auto-agressions, etc). Toutes les injections seront faites sous anesthésie locale . Les souris auront un examen clinique quotidien avec pesées. Les points limite précoces ont été définis et seront strictement appliqués et des soins seront prodigués en cas de besoin en accord avec le vétérinaire.
Choix des espèces
Le choix de la souris pour la réalisation de ce projet se justifie par des raisons d’ordres scientifiques, pratiques et éthiques. - Génétique proche de celle de l’Homme et bien connue - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’animaleries, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est l’animal de laboratoire le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. - Les modèles de tumeur existants sont issus de lignées cellulaires murines et leur implantation dans la souris est indispensable pour étudier l’immunité, l’effet des traitements sur la réponse antitumorale dans leur globalité et les effets des antibiotiques ou bactéries associées à ces antibiotiques sur le microbiote et l’immunité intestinales. Animaux à maturité sexuelle, entre 6 et 12 semaines.
Évaluation du potentiel thérapeutique de la stimulation d’une modification protéique, la O-GlcNAcylation, dans le choc hémorragique chez le rat Wistar de 10 – 13 semaines
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
1 128 rats Wistar vont être utilisés, tous tués à l'issue, la moitié sous anesthésie sans réveil et la moitié dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Ils subissent une chirurgie d'environ deux heures trente provoquant un choc hémorragique, un prélèvement de sang à la queue, puis une seconde chirurgie suivie de la mise à mort pour prélever sang et organes. Le porteur décrit un état de choc avec mobilité fortement réduite et absence de réaction aux stimuli, et indique que les rats trop douloureux sont sacrifiés en cours de protocole. Il conclut que ces réactions systémiques complexes rendent l'animal indispensable faute de méthode alternative.
Objectifs
Les buts du projet sont de 1) valider l’innocuité des molécules 2) valider une cinétique d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 3) valider une dose d’administration de molécules plus spécifiques et stables, 4) valider une voie d’administration et enfin, de manière plus transversale, mieux comprendre les mécanismes dans lesquels est impliquée l’O-GlcNAcylation via l’identification de protéines cibles. Ce projet permettra de mieux comprendre le rôle de l’O-GlcNAcylation dans l’état de choc hémorragique et potentiellement de développer une nouvelle stratégie thérapeutique.
Bénéfices attendus
Avec les différents résultats précédemment obtenus par l’équipe et celle de John C. Chatham, les résultats attendus sont une amélioration de la réponse inflammatoire, une amélioration de la fonction cardiovasculaire et des différents marqueurs de stress et ceux à différents temps d’administration, à différentes doses et selon les différentes voies d’injection. Ces résultats seront objectivés par l’étude in vivo de la fonction et du stress cardiovasculaire (pression artérielle, fréquence cardiaque), rénaux et hépatiques mais également par des tests biochimiques (RT-qPCR, Western blot) validant l’effet des molécules testées. Un bénéfice à très long terme peut être le développement d’une nouvelle approche thérapeutique dans la prise en charge du choc hémorragique.
Procédures
Les animaux seront soumis à 3 interventions. La première intervention consiste à la chirurgie permettant de développer le choc hémorragique (juste la chirurgie pour le groupe contrôle). Cette chirurgie durera environ 2h30 (sur la base des études précédemment menées). La seconde intervention consiste en un prélèvement d’une goutte de sang au bout de la queue sur un animal vigile. Cette intervention ne durera que quelques secondes. La troisième et dernière intervention consiste à la chirurgie permettant d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques de l’animal 24h après l’induction du choc. Cette chirurgie durera environ 10 minutes et sera suivi du sacrifice de l’animal pour prélèvement du sang et des organes de l’animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de choc hémorragique est un modèle sévère. Au cours de ce protocole, l’état de santé des animaux va s’aggraver du fait du développement du choc hémorragique avec une mobilité fortement réduite, une absence de réaction aux stimuli sonores et toucher mais également une diminution de la prise alimentaire, sans toutefois de réel impact sur le poids, le protocole n’ayant une durée que de 24h. Enfin, une douleur peut être associée à la chirurgie réalisée sur l’animal. L’apparition de ces effets indésirables est environ 2 à 3h après l’induction du choc et jusqu’au sacrifice.
Devenir
En fin de procédure 1 (développement du choc hémorragique), les animaux présentant des signes de douleur trop importants seront sacrifiés. Seuls les animaux ne présentant pas des signes de douleur trop importants seront conservés pour la procédure 2. En fin de procédure 2, l’ensemble des animaux seront mis à mort pour prélever le sang et les organes pour effectuer des analyses.
Remplacement
Le choc hémorragique est une pathologie sans traitement et faisant intervenir des mécanismes complexes et intégrés, nécessitant impérativement l'utilisation de modèles animaux, en effet, les réactions systémiques complexes de l'organisme ne peuvent pas être reproduites in vitro sur des modèles cellulaires, rendant l'utilisation d'animaux indispensables pour mieux comprendre les mécanismes associés et explorer de nouvelles pistes thérapeutiques. Ainsi, il n’existe pas de méthode alternative pour reproduire notre modèle et évaluer l’efficacité de nouvelles thérapies.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude) qui ne nécessiteront pas l’utilisation de nouveaux animaux. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les différentes procédures expérimentales de la première étape (mise au point) seront réalisées sur des effectifs réduits afin de déterminer les conditions d’utilisation optimales. Dans un second temps, lorsque les conditions d'utilisation optimales auront été déterminées, les procédures seront réalisées sur un plus grand nombre d’animaux avec seulement les conditions sélectionnées dans la première étape. Afin de raffiner le modèle, des mesures seront mises en place afin de maximiser le confort des animaux par exemple avec la mise en place de scores et de points limites comprenant des critères morphologiques (aspect, comportement) et physiologiques (température, fréquence respiratoire, lactates), l’administration d‘un antidouleur en début de procédure (lidocaïne 2%, gouttes sur les zones d’incision (maximum de 0,49mL pour un rat de 350g), en fin de procédure (buprénorphine à 0,05 mg/kg) et à 8 heures post-chirurgie (buprénorphine à 0,05 mg/kg) est prévue et la réinjection d’une dose supplémentaire peut être considérée en cas de signe de douleur. Tout au long de l’étude, les animaux seront hébergés par 2, dans des cages avec enrichissement, sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Après chirurgie, afin d’éviter au maximum le stress, les animaux seront placés dans la même cage. Un respect strict des cycles jour/nuit sera observé.
Choix des espèces
Ce modèle est, historiquement et actuellement, le plus utilisé et le mieux décrit. Sa proximité avec la symptomatologie du choc hémorragique chez l’Homme et sa très bonne reproductibilité font un modèle efficace pour cribler et valider l’efficacité des traitements. De plus l’ensemble des travaux et des résultats précédemment obtenus par l’équipe de JC Chatham sur l’étude du choc hémorragique ont été réalisé sur ce modèle, preuve de son utilisation et donc de la connaissance de ce modèle. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 10 à 13 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont choisis pour avoir une puissance statistique suffisante pour conclure sur nos résultats. Ils sont choisis sur la base des tests statistiques utilisés et de l'expérience de ce modèle, permettant de réduire le nombre d'animaux. 10-13 semaines – c’est un âge standard pour ce genre de manipulations.
Impact de différents anesthésiants sur l’homéostasie et sur les niveaux d’une modification protéique : l’O-GlcNAcylation, sur des rats WISTAR de 12 semaines.
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
60 rats Wistar mâles vont être utilisés, opérés sous anesthésie et tués avant tout réveil. Chacun subit une cathétérisation de l'artère carotide d'une dizaine de minutes pour relever des valeurs hémodynamiques, avant un prélèvement de sang et d'organes. Le projet compare l'effet de différents anesthésiants sur l'homéostasie et sur une modification protéique, l'O-GlcNAcylation, avec pour horizon annoncé l'amélioration des conditions d'anesthésie. Le porteur affirme que l'usage de modèles in vitro "n'est pas envisageable", rendant selon lui l'animal "indispensable".
Objectifs
Les objectifs du projet sont de 1) comprendre l’impact de l’anesthésie sur l’homéostasie et sur les niveaux d’O-GlcNAcylation mais également 2) comprendre l’impact de l’O-GlcNAcylation sur l’homéostasie. Tout ceci s’intègre dans le but d’améliorer les conditions d’anesthésie.
Bénéfices attendus
Les résultats attendus sont que les anesthésiants n’impact pas tous de la même façon l’homéostasie et les niveaux d’O-GlcNAcylation et que la modification post traductionnelle limite la chute de pression artérielle associée à l’anesthésie. Ces éléments permettraient d’améliorer les connaissances scientifiques mais pourraient également être une avancée dans le domaine clinique.
Procédures
Les animaux subissent 1 unique procédure chirurgicale. Cette procédure permet d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques de l’animal via cathétérisation de l’artère carotide. Cette procédure dure environ 10 minutes (sur la base des expériences précédemment menées).
Impact sur les animaux
Aucun geste douloureux ne sera réalisé au cours de cette étude. Tout au long de l’étude, les animaux seront sous couvertures anesthésiques. La procédure chirurgicale sera effectuée sous couverture anesthésique et analgésique et durera au maximum 10 minutes. Elle sera suivie du sacrifice de l’animal.
Devenir
A la fin de la procédure (procédure sans réveil), l’ensemble des animaux seront sacrifiés. En effet, à la fin de cette procédure, le sang et les organes seront prélevés pour effectuer des analyses.
Remplacement
L’anesthésie est une procédure utilisée couramment dans le milieu hospitalier. Afin de représenter au mieux les impacts de l’anesthésie, l’usage de modèles in vitro n’est pas envisageable, rendant l’utilisation d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre anesthésie, homéostasie et O-GlcNAcylation.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque c’est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires.
Raffinement
Afin de raffiner le modèle, les animaux seront sous constante surveillance par les manipulateurs sur toute la durée de l’étude et des points limites adaptés seront établis. Les animaux seront constamment anesthésiés et sous surveillance des manipulateurs. Aucun geste douloureux ne sera réalisé. En fin de procédure, l’artère carotide de l’animal sera cannulée afin d’avoir accès aux valeurs hémodynamiques (pression artérielle, fréquence cardiaque). Ce geste, rapide et maîtrisé par les manipulateurs ne sera pas prolongée (maximum de 10 minutes) et aura lieu avant le sacrifice de l’animal. Cependant, plusieurs points limites adaptés sont applicables : - si la respiration de l’animal est anormale (rythme respiratoire trop faible ou trop fort, anomalies dans la respiration, « convulsion »), l’anesthésie sera immédiatement stoppée, l’animal replacé dans sa cage et utilisé ultérieurement pour le projet dans un délai minimal de 2 jours. - si l’animal présente des signes de douleur lors de la cannulation, l’anesthésie sera immédiatement renforcée comme suit : le sévoflurane sera augmenté de 4% à 4,5% voire 5% si les signes de douleur persistent. Aucune modification du débit. L’isoflurane sera augmenté 2,5% à 3% voire 3,5% si les signes de douleur persistent. Aucune modification du débit. Ajout d’une demi dose de kétamine/xylazine (50mg/kg-5mg/kg-1mL/kg). - si l’animal présente des signes de douleur lors des prélèvements (notamment pour le freeze-clampage du cœur), l’anesthésie sera immédiatement renforcée comme suit : le sévoflurane sera augmenté de 4% à 4,5% voire 5% si les signes de douleur persistent. Aucune modification du débit. L’isoflurane sera augmenté 2,5% à 3% voire 3,5% si les signes de douleur persistent. Aucune modification du débit. Ajout d’une demi dose de kétamine/xylazine (50mg/kg-5mg/kg-1mL/kg).
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal et sur l’ensemble des procédures associées. Les rats utilisés sont des Wistar mâles âgés de 12 semaines, âge standard pour ces manipulations. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de limiter le nombre d’animaux utilisés. Les effectifs sont choisis pour avoir une puissance statistique suffisante pour conclure sur nos résultats. Ils sont choisis sur la base des tests statistiques utilisés et de l'expérience de ce modèle, permettant de réduire le nombre d'animaux. 12 semaines, c’est un âge standard pour ce genre de manipulation.
Impact de l’obésité sur les vaisseaux lymphatiques dans les différents territoires adipeux et métaboliques.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
1 944 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures déclarées de gravité légère. Selon les groupes, elles reçoivent des injections, un gavage ou une application cutanée quotidiens, puis sont soumises ou non à un régime gras, avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le porteur indique qu'une dysfonction lymphatique intestinale peut provoquer un amaigrissement, surtout chez les nouveau-nés, et prévoit d'abandonner cette procédure le cas échéant. Il affirme qu'aucun système in vitro ne préserve l'intégrité des vaisseaux et présente le poisson zèbre comme un remplacement seulement partiel, faute d'un nombre suffisant de valves lymphatiques.
Objectifs
Le système lymphatique joue aussi un rôle important dans l’initiation de la réponse immunitaire en transportant les cellules immunes vers les ganglions lymphatiques. Or, une altération de ce réseau lymphatique induit des désordres au niveau métabolique (expansion du tissu adipeux, lipides inflammatoires) et inflammatoires (inflammation chronique des tissus). Par ailleurs, l'obésité est connue comme un facteur de risque à l'altération du système lymphatique. L’architecture du système lymphatique et sa fonction sont étroitement dépendantes du tissu dans lequel il se trouve. C’est pour cela, que ce projet vise à cibler le système lymphatique de manière tissu-spécifique. Nous souhaitons dans un premier temps, visualiser l’architecture du système lymphatique in vivo, et comprendre les modifications et l'adaptation des cellules endotheliales lymphatiques dans les modèles d'obésité. Dans un deuxième temps, nous souhaitons établir le rôle de nouveaux gènes impliqués dans le développement et/ou le maintien du système lymphatique dans des contextes physiologiques et pathologiques. Ces études nous permettront de déterminer in vivo les conséquences d’une altération de ce gène sur le système lymphatique et sur le tissu environnant.
Bénéfices attendus
Une altération du système lymphatique est connue pour engendrer une pathologie, le lymphœdème. Par ailleurs, cette maladie est aggravée par l'obésité. Or, les mécanismes moléculaires et cellulaires ne sont pas compris, et il n’existe à ce jour aucun traitement pour limiter une dysfonction lymphatique. Ces modèles permettront une approche intégrée permettant l’étude du système lymphatique et ses communications avec le microenvironnement. En combinant nos approches in vitro et in vivo, nous souhaitons déchiffrer finement les mécanismes moléculaires et cellulaires mis en jeu dans la communication des cellules endothéliales lymphatiques avec les cellules du microenvironnent (cellules de l'immunité, pre-adipocytes ou adipocytes...) dans les différents territoires adipeux et métaboliques (foie, intestin). Le but est d’identifier de potentielles cibles thérapeutiques visant à restaurer la fonction lymphatique et/ou limiter les aspects inflammatoires et métaboliques, qui sont délétères dans des contextes pathologiques.
Procédures
selon les groupes d'animaux, les types d'interventions seront soit des injections intrapéritoneales (1 fois par jour pendant 4 jours) ou un gavage oral (1 fois par jour pendant 5 jours) ou une application locale sur la peau (1 fois par jour pendant 5 jours). Les animaux seront ensuite ou non mis sous régime alimentaire riche en lipides.
Impact sur les animaux
Une dysfonction importante du système lymphatique au niveau intestinal peut altérer la prise alimentaire des lipides au niveau intestinal entrainant un amaigrissement des animaux, notamment au niveau postnatal dans la procédure 1. Dans ce cas, nous abandonnerons la procedure 1 et nous retarderons l'invalidation du gène après le sevrage ou chez l'adulte. Les autres procédures ne devraient pas entrainer d'effet indésirables.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour prélévements d'organes/tissus à la fin du projet.
Remplacement
Nous étudions le système vasculaire et lymphatique dans plusieurs organes dont notamment la peau, le tissu adipeux, l'intestin et le foie. A ce jour, il n'existe pas de système 3D, d'organoïdes ou d'explants permettant de garder l'intégrité et la fonctionnalité des vaisseaux. Une des alternatives qui est envisagée pour des questions relatives au développement des vaisseaux est d'utiliser le modèle du zébrafish. Ce modèle est à l'étude afin de déterminer si ce modèle répond de manière identique à nos hypothèses nous permettant de transposer nos résultats de la souris vers le zébrafish. Cependant ce remplacement ne sera que partiel car le nombre de valves lymphatiques chez le zebrafish est tres limitant.
Réduction
Le modele d'obésité entraine une variabilité des résultats qui est aussi augmentée par la différence des sexes femelles/mâles. Nous avons donc compté n=12 pour avoir des résultats statistiques pour chaque groupe d'animaux c'est à dire pour chaque génotype (contrôle ou gene invalidé), par sexe, et par traitement (Normal diet/high fat diet). Cependant, certaines expérimentations nous demandent de regrouper le nombre de tissus pour faire l'analyse, notamment les analyses par Tri cellulaire ou single cells. Afin de minimiser le nombre d'animaux, plusieurs organes seront prélevés pour chaque experimentation.
Raffinement
Critères d'arrêt par rapport à la souffrance: dans le cas où l’animal ne répond plus à des besoins physiologiques énoncés ci-dessus, l’arrêt de l’expérimentation sera préconisé par l’expérimentateur ou toute personne en charge du suivi des animaux. Les animaux seront observés par le chercheur ou les personnels de l’animalerie tous les jours pendant 1 semaine puis 3 fois par semaine pendant le reste de l’expérimentation. Ce suivi aura pour but de détecter la douleur (signes tels que le dos encourbé, poils hérissés, isolement...), détecter la capacité de s'alimenter, de boire, de se déplacer selon une grille de lecture par score. Dans le cas où l’animal ne répondrait plus à ses besoins physiologiques, l'animal sera anesthésié par anesthésie chimique (mélange kétamine/xylazine 150 mg/kg et 10 mg/kg respectivement) et après perte de conscience, les animaux seront euthanasiés. Une observation quotidienne sera réalisée pendant la durée du projet. Dans nos connaissances actuelles, les procédures ne doivent pas changer le comportement des animaux et leur bien-être, même si les animaux sont gardés jusqu’à l’âge adulte.
Choix des espèces
L'étude des souris génétiquement modifiées est largement répandue et partagée dans la communauté scientifique internationale ce qui est un avantage en termes de transmission et de validité de nos résultats. Nous avons choisi les stades de développement au niveau postnatal et adulte afin de comprendre le rôle et la fonction du système lymphatique dans les pathologies cardiovasculaires liées à l'obésité.
Etude de l’inflammation rénale chez la souris par imagerie photoacoustique
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système urogénital
80 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées sévères. Elles reçoivent une injection déclenchant une inflammation rénale, puis la pose d'un cathéter sous anesthésie profonde et une imagerie photoacoustique avec agent de contraste, avant d'être tuées pour prélever les reins. Le porteur indique que le produit inflammatoire peut provoquer une inflammation généralisée, une insuffisance rénale et des lésions de plusieurs organes pouvant mener à la mort, tout en affirmant avoir choisi une dose qui n'entraîne pas de mortalité. Il conclut que l'imagerie in vivo ne peut pas être remplacée par des méthodes sans animaux et qualifie ces procédures de "stricte nécessité", pour tester un nouvel agent de contraste.
Objectifs
L'objectif de ce projet est de tester in vivo l'imagerie photoacoustique pour le diagnostic précoce de l'inflammation rénale en utilisant un nouvel agent de contraste ciblant certaines molécules d’adhésion. Celles-ci sont exprimées à la surface des cellules lors d’un épisode inflammatoire aigu ou chronique comme une inflammation systémique, une atteinte rénale ou une maladie rénale chronique. Une étude plus récente a d'ailleurs démontré dans un modèle murin d'atteinte rénale aiguë que cet agent de contraste est capable de cibler l'inflammation dans la moelle rénale. Des tests préliminaires sur ces microparticules en imagerie photoacoustique ont montré que ces microparticules possèdent une absorption et une fluorescence considérable dans la région des longueurs d'onde utilisées en imagerie photoacoustique (proche InfraRouge). L'utilisation de ce nouvel agent de contraste semble donc être un outil prometteur pour la détection en pré-clinique de l'inflammation rénale. Enfin, des études in vitro et in vivo ont montré les propriétés biocompatibles et biodégradables de ces microparticules et il a été également démontré que cette stratégie était efficace pour cibler les cellules endothéliales activées humaines, ouvrant la voie à une potentielle translation en clinique.
Bénéfices attendus
Il est attendu de la technique d'imagerie photoacoustique utilisant ce nouvel agent de contraste biocompatible qu'elle puisse permettre d'imager de manière ultra-sensible, spécifique et précoce l'inflammation rénales.
Procédures
Les animaux seront soumis aux interventions suivantes : o Induction du modèle inflammatoire par une unique injection d’un produit induisant l’inflammation (durée : inférieure à 10min) o Pesée lors des manipulations (durée : inférieure à 5 min) o Pose d’un cathéter sous anesthésie profonde (durée : environ 15min) o Imagerie photoacoustique avec injection de produit de contraste (durée : environ 20min).
Impact sur les animaux
D'après les études pilotes précédentes, les deux modèles présentés peuvent en effet induire des effets indésirables sur les animaux. Pour notre 1er modèle, l'injection du produit inflammatoire peut induire une inflammation généralisée, une insuffisance rénale et des lésions touchant plusieurs organes ce qui peut mener à la mort des animaux. Il est important de noter que la concentration choisie pour ce projet n'induit pas de mortalité chez les souris. Pour notre 2ème modèle, ce modèle d'inflammation différent du premier induit la mort des cellules rénales conduisant dans certains cas une insuffisance rénale aigue. Dans ces deux modèles, les animaux peuvent être en mal-être qui peut alors être repéré par un état d'épuisement, une inactivité dans la cage, un arrêt de la prise alimentaire et de boisson suivie d'une perte de poids. Lors du protocole d'imagerie, celui-ci se déroulera sous anesthésie générale des animaux mais la pose du cathéter veineux (la "sonde veineuse" qui permet l'administration de l'agent de contraste) peut provoquer un bleu sur la queue des animaux.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de récupérer les différents organes d'intérêt des animaux (reins), permettant ainsi de compléter les résultats obtenus in vivo par des résultats post-mortem (biodistribution, caractérisations immunohistologiques). De plus, les caractérisations histologiques sont très souvent demandées pour justifier les résultats obtenus lorsqu'une nouvelle technique d'imagerie pré-clinique est étudiée.
Remplacement
Des tests in vitro ont été réalisées sur des microparticules utilisées en imagerie photoacoustique et ont permis de montrer que ces microparticules possède une absorption et une fluorescence considérable dans la région des longueurs d'onde utilisées en photoacoustique (proche InfraRouge). Toutefois, les expériences in vivo ne peuvent pas être totalement remplacées par des études in vitro car il est nécessaire d'estimer l'affinité de ces microparticules pour les molécules d'adhésion exprimées en conditions inflammatoires ainsi que les temps de ciblage et de détectabilité de ces microparticules en imagerie photoacoustique lorsqu'elles sont injectées dans un organisme. D'après les études pilotes, on sait que les microparticules utilisées ciblent efficacement l'inflammation rénale dans les deux modèles cités et l'on souhaite savoir si ce ciblage sera détectable en imagerie photoacoustique. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été évalué au regard de nos données antérieures par rapport à nos précédents projets ayant utilisé les mêmes modèles animaux et les mêmes types de microparticules. Dans ces deux études précédentes il a été montré que 5 animaux par modèle étaient suffisants pour obtenir une différence significative du signal en imagerie par résonance magnétique. Ces effectifs ont été confirmés par un calcul de taille d'échantillons.
Raffinement
Pendant les différents temps que dureront l'étude, la douleur des animaux sera réduite au maximum en veillant à couvrir ces temps d'étude par une analgésie. De plus en amont de ce projet, pour limiter la douleur engendrée par l'injection de produit inflammatoire, nous avons choisi de n'utiliser qu'une dose, connue pour ne pas induire de mortalité chez les souris. Enfin, les animaux ne seront pas gardés pour des études sur le long terme pour ne pas les laisser en souffrance au-delà des 24 et 48 heures que durent les modèles.
Choix des espèces
La souris est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des pathologies de type inflammatoire. L’anatomie et la physiologie de la circulation sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’Homme. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les pathologies inflammatoires. Nous utiliserons des souris mâles et femelles adultes (8 semaines), en rapport avec l’âge des animaux utilisés dans les études pilotes précédentes.
Impact cardiaque des altérations du tissu adipeux induites par l’hypoxie intermittente chez la souris (1/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont exposées à un manque d'oxygène huit heures par jour pendant deux à seize semaines pour reproduire l'apnée du sommeil, 84 d'entre elles subissant en plus une chirurgie d'ablation du tissu graisseux, et l'ensemble un test de tolérance à l'insuline avec jeûne et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress, et que la chirurgie entraîne une douleur au réveil traitée par analgésique. Il affirme que la culture cellulaire ne peut remplacer un "organe entier" ni permettre l'analyse des facteurs circulants entre tissu graisseux et cœur, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une des pathologies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, et ayant des conséquences cardiovasculaires et métaboliques très délétères. Le SAOS correspond à des épisodes répétitifs d’apnées pendant le sommeil, résultant en une diminution cyclique du niveau d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de lésions multi-organes, contribuant aux complications cardiaques et métaboliques. Afin de proposer une meilleure prise en charge des patients atteint de SAOS et de limiter ses complications, nos travaux de recherche visent à mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’hypoxie. Les objectifs de ce projet sont de comprendre précisément le lien entre les atteintes du tissu graisseux induites par l’hypoxie et la dysfonction cardiaque associée. Nous faisons l’hypothèse que l’hypoxie pourrait affecter de façon précoce le tissu graisseux, qui libérerait alors des facteurs néfastes dans la circulation sanguine et participerait ainsi aux altérations cardiaques. Afin de répondre à nos hypothèses, nous envisageons d’utiliser différents modèles de rongeurs (souris génétiquement modifiées) exposés à l’hypoxie, chez lesquels nous réaliserons des chirurgies visant à retirer le tissu graisseux, ou des traitements médicamenteux visant spécifiquement le tissu graisseux. Ce projet nécessitera l’utilisation de 308 souris.
Bénéfices attendus
Le syndrome d’apnée obstructives du sommeil est un problème de santé publique en raison des complications cardiovasculaires associées, principalement dues au manque d’oxygène transitoire sur le long terme (nommé hypoxie). Il existe de nombreuses interconnections entre le tissu graisseux et le coeur. En particulier, le vieillissement du tissus graisseux, via la libération dans le sang de différents médiateurs, contribue au développement de la fibrose cardiaque, mécanisme qui contribue à diminuer la fonction normale du coeur. L’hypoxie induit de profondes altérations du tissus graisseux, ainsi que du coeur, mais l’interaction entre ces deux organes dans ce contexte est méconnue. Ainsi, nous proposons de démontrer que l’hypoxie induit un vieillissement plus rapide du tissus graisseux, responsable des complications cardiaques. Le but ultime de ce projet est de démontrer que cibler de façon spécifique le vieillissement du tissus graisseux est bénéfique pour limiter les atteintes cardiaques induites par l’hypoxie et d’identifier des marqueurs biologiques circulants spécifiques.
Procédures
Une partie des animaux sera soumis à une chirurgie unique visant à supprimer une grande partie du tissu graisseux. Cette procédure dure environ 15 minutes et sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront traités contre la douleur avant la chirurgie et à leur réveil. Cette procédure concerne 84 souris. Tous les animaux (308 souris) sont soumis à un manque d’oxygène (hypoxie) ou non à l’air ambiant, pendant 2 ou 16 semaines. Cette exposition dure chaque jour et 8h/j. Des prélèvements sanguins seront réalisés afin d'évaluer le taux de sucre dans le sang des animaux dans les différents groupes, ainsi que leur sensibilité à l'insuline. Pour ce faire, ce test de tolérance à l’insuline consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60, 75 et 90 minutes après l’injection. Cette procédure concerne tous les animaux du projet. La procédure d’imagerie échographique est réalisée sous anesthésie et sur tapis chauffant, avant le début de l’exposition à l’hypoxie et 3 jours avant la fin du protocole. Chaque échographie dure environ 15 minutes par souris et concerne le groupe 2a, soit 84 souris. Le traitement médicamenteux est réalisé uniquement sur le groupe 2c (56 souris). Il consiste à administrer le traitement par gavage, 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines pendant 2 à 16 semaines d’exposition.
Impact sur les animaux
L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à l’hypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. La chirurgie de suppression du tissu adipeux peut induire au réveil une douleur, qui est traitée par administration d’analgésique et qui nécessite un suivi particulier des animaux dans les jours qui suivent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal éveillé nécessite une injection d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal. Le traitement est administré 1 fois/j, sur 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines, par gavage, tout au long de l’exposition à l’hypoxie. Pour limiter le stress des animaux, les gavages sont réalisés par une personne maitrisant cette technique. Un transport d’animaux est nécessaire pour réaliser les échographies, ce qui peut stresser les animaux. Pour limiter le stress, les animaux sont amenés en amont dans la pièce d’échographie pour qu’ils s’habituent à l’environnement et sont anesthésiés pour l’échographie.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et les différents organes d’intérêt seront prélevés pour analyses ultérieures.
Remplacement
Le présent projet est basé sur l’hypothèse d’une communication inter-organes (tissu adipeux-cœur), à la fois en réponse à l’hypoxie, mais également lors du processus de vieillissement. Le remplacement partiel des animaux peut être atteint en utilisant des approches de cultures cellulaires, mais cette alternative ne permet pas de répondre aux objectifs spécifiques du projet. 1) Un dispositif de manque d’oxygène appliqué aux cellules permet d’étudier les réponses spécifiques de différents types cellulaires (adipocytes, fibroblastes cardiaques, cardiomyocytes). Ce dispositif permet d’isoler un type cellulaire précis et de déterminer les réponses spécifiques à l’hypoxie. Des co-cultures sont également envisageables, mais ne peuvent en aucun cas remplacer la complexité d’un organe « entier » dans lequel coexiste une grande variété de cellules. Enfin, un des objectifs majeurs de notre projet est d’identifier des facteurs circulants, qui seraient sécrétés par le tissu adipeux, relargués dans la circulation sanguine, et impacteraient ensuite le cœur. L’utilisation de modèle animal est donc la seule alternative permettant une analyse systémique, multi-organes, ainsi que le recueil de plasma et l’analyse de facteurs circulants. 2) Il est également très difficile d’étudier les effets du vieillissement sur des modèles in vitro. Dans ce projet, nous utiliserons des souris jeunes ainsi que des souris adultes, et déterminerons si la cinétique des effets de l’hypoxie (durée de 2 à 16 semaines) est différente selon l’âge (hypothèse d’effets synergiques du vieillissement et de l’hypoxie), à la fois sur le remodelage et le vieillissement du tissu adipeux, mais également sur le remodelage cardiaque. De plus, nous utiliserons une approche chirurgicale de suppression du tissu adipeux, qui nous permettra d’établir la preuve de concept d’une communication inter-organe en réponse à l’hypoxie, dans un organisme entier.
Réduction
Le calcul de nos effectifs est réalisé de manière à utiliser le moins d'animaux possible sans altérer la puissance et la fiabilité de nos tests statistiques. Nous utiliserons un logiciel statistique (GraphPad Prism) pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Les tests statistiques utilisés seront des t-test ou des ANOVA à deux voies suivis de tests post-hoc. Une valeur P
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes, dans un environnement enrichi (sauf pendant l’exposition à l’hypoxie ou à la normoxie) et leur bien-être sera vérifié quotidiennement. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie. Les mesures d'échographies cardiaques et la lipectomie (suppression du tissus graisseux) seront réalisées sur animaux anesthésiés. Pour la lipectomie, les animaux recevront un traitement analgésique avant et après la chirurgie. Globalement et tout au long des différentes procédures du présent projet, les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être appliquées à l’homme, notamment dans le cadre d’études sur l’organisme entier. Ceci permet ainsi de comprendre les mécanismes qui se produisent dans l’organisme des souris avant d’entreprendre des études chez l’humain. Les souris font également naître un nombre important de souriceaux par portée ce qui n’est pas le cas de tous les mammifères. Cela nous permet donc d’avoir un grand nombre d’animaux du même lot. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 à 12 mois) afin de ne pas utiliser des souris trop jeunes, encore en pleine croissance, et qui pourrait être résistantes aux phénomènes de vieillissement. Les souris à phénotype dommageable développent spontanément des cellules tumorales (lymphomes et sarcomes) à partir de l'âge de 4 à 6 mois mais ces souris seront utilisées et mises à mort avant le développement spontané de ces tumeurs.
Impact cardiaque des altérations du tissu adipeux induites par l’hypoxie intermittente chez la souris (2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
308 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont exposées à un manque d'oxygène huit heures par jour pendant deux à seize semaines pour reproduire l'apnée du sommeil, 84 d'entre elles subissant en plus une chirurgie d'ablation du tissu graisseux, et l'ensemble un test de tolérance à l'insuline avec jeûne et prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que l'hypoxie provoque une accélération de la respiration, une perte de poids et un stress, et que la chirurgie entraîne une douleur au réveil traitée par analgésique. Il affirme que la culture cellulaire ne peut remplacer un "organe entier" ni permettre l'analyse des facteurs circulants entre tissu graisseux et cœur, et prévoit la mise à mort de toutes les souris pour prélever leurs organes.
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une des pathologies chroniques les plus répandues touchant près d'un milliard de personnes dans le monde, et ayant des conséquences cardiovasculaires et métaboliques très délétères. Le SAOS correspond à des épisodes répétitifs d’apnées pendant le sommeil, résultant en une diminution cyclique du niveau d’oxygène dans le sang, appelée hypoxie. Cette hypoxie est responsable de lésions multi-organes, contribuant aux complications cardiaques et métaboliques. Afin de proposer une meilleure prise en charge des patients atteint de SAOS et de limiter ses complications, nos travaux de recherche visent à mieux comprendre les mécanismes mis en jeu lors de l’hypoxie. Les objectifs de ce projet sont de comprendre précisément le lien entre les atteintes du tissu graisseux induites par l’hypoxie et la dysfonction cardiaque associée. Nous faisons l’hypothèse que l’hypoxie pourrait affecter de façon précoce le tissu graisseux, qui libérerait alors des facteurs néfastes dans la circulation sanguine et participerait ainsi aux altérations cardiaques. Afin de répondre à nos hypothèses, nous envisageons d’utiliser différents modèles de rongeurs (souris génétiquement modifiées) exposés à l’hypoxie, chez lesquels nous réaliserons des chirurgies visant à retirer le tissu graisseux, ou des traitements médicamenteux visant spécifiquement le tissu graisseux. Ce projet nécessitera l’utilisation de 308 souris.
Bénéfices attendus
Le syndrome d’apnée obstructives du sommeil est un problème de santé publique en raison des complications cardiovasculaires associées, principalement dues au manque d’oxygène transitoire sur le long terme (nommé hypoxie). Il existe de nombreuses interconnections entre le tissu graisseux et le coeur. En particulier, le vieillissement du tissu graisseux, via la libération dans le sang de différents médiateurs, contribue au développement de la fibrose cardiaque, mécanisme qui contribue à diminuer la fonction normale du coeur. L’hypoxie induit de profondes altérations du tissu graisseux, ainsi que du coeur, mais l’interaction entre ces deux organes dans ce contexte est méconnue. Ainsi, nous proposons de démontrer que l’hypoxie induit un vieillissement plus rapide du tissu graisseux, responsable des complications cardiaques. Le but ultime de ce projet est de démontrer que cibler de façon spécifique le vieillissement du tissu graisseux est bénéfique pour limiter les atteintes cardiaques induites par l’hypoxie et d’identifier des marqueurs biologiques circulants spécifiques.
Procédures
Une partie des animaux sera soumis à une chirurgie unique visant à supprimer une grande partie du tissu graisseux. Cette procédure dure environ 15 minutes et sera réalisée sous anesthésie et les animaux seront traités contre la douleur avant la chirurgie et à leur réveil. Cette procédure concerne 84 souris. Tous les animaux (308 souris) sont soumis à un manque d’oxygène (hypoxie) ou non à l’air ambiant, pendant 2 ou 16 semaines. Cette exposition dure chaque jour et 8h/j. Des prélèvements sanguins seront réalisés afin d'évaluer le taux de sucre dans le sang des animaux dans les différents groupes, ainsi que leur sensibilité à l'insuline. Pour ce faire, ce test de tolérance à l’insuline consiste à injecter de l’insuline chez l’animal éveillé et à suivre l’évolution du taux de sucre dans le sang pendant 90 minutes. Les animaux sont mis à jeun 6 heures avant le test, et une 1 goutte de sang est prélevée à la queue à 0, 15, 30, 45, 60, 75 et 90 minutes après l’injection. Cette procédure concerne tous les animaux du projet. La procédure d’imagerie échographique est réalisée sous anesthésie et sur tapis chauffant, avant le début de l’exposition à l’hypoxie et 3 jours avant la fin du protocole. Chaque échographie dure environ 15 minutes par souris et concerne le groupe 2a, soit 84 souris. Le traitement médicamenteux est réalisé uniquement sur le groupe 2c (56 souris). Il consiste à administrer le traitement par gavage, 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines pendant 2 à 16 semaines d’exposition.
Impact sur les animaux
L’hébergement des souris dans l’animalerie entraine une exposition à une nuisance sonore dû au fonctionnement de la machine permettant la mise en place de l’hypoxie. De plus l’animalerie est susceptible d’accueillir des rats et des souris simultanément. Cette présence peut induire un stress chez les souris. L’exposition à l’hypoxie induit une accélération de la respiration, une légère perte de poids, un stress et une diminution de l’activité lors des premiers jours, puis la souris s’adapte rapidement et ces signes disparaissent. La chirurgie de suppression du tissu adipeux peut induire au réveil une douleur, qui est traitée par administration d’analgésique et qui nécessite un suivi particulier des animaux dans les jours qui suivent. Le test de tolérance à l’insuline chez l’animal éveillé nécessite une injection d’insuline, suivie de plusieurs prélèvements sanguins à la queue (1 goutte de sang répété 6 fois) ce qui peut induire un stress à l’animal. Le traitement est administré 1 fois/j, sur 3 jours consécutifs toutes les 2 semaines, par gavage, tout au long de l’exposition à l’hypoxie. Pour limiter le stress des animaux, les gavages sont réalisés par une personne maitrisant cette technique. Un transport d’animaux est nécessaire pour réaliser les échographies, ce qui peut stresser les animaux. Pour limiter le stress, les animaux sont amenés en amont dans la pièce d’échographie pour qu’ils s’habituent à l’environnement et sont anesthésiés pour l’échographie.
Devenir
A l'issue de toutes les procédures, tous les animaux seront mis à mort et les différents organes d’intérêt seront prélevés pour analyses ultérieures.
Remplacement
Le présent projet est basé sur l’hypothèse d’une communication inter-organes (tissu adipeux-cœur), à la fois en réponse à l’hypoxie, mais également lors du processus de vieillissement. Le remplacement partiel des animaux peut être atteint en utilisant des approches de cultures cellulaires, mais cette alternative ne permet pas de répondre aux objectifs spécifiques du projet. 1) Un dispositif de manque d’oxygène appliqué aux cellules permet d’étudier les réponses spécifiques de différents types cellulaires (adipocytes, fibroblastes cardiaques, cardiomyocytes). Ce dispositif permet d’isoler un type cellulaire précis et de déterminer les réponses spécifiques à l’hypoxie. Des co-cultures sont également envisageables, mais ne peuvent en aucun cas remplacer la complexité d’un organe « entier » dans lequel coexiste une grande variété de cellules. Enfin, un des objectifs majeurs de notre projet est d’identifier des facteurs circulants, qui seraient sécrétés par le tissu adipeux, relargués dans la circulation sanguine, et impacteraient ensuite le cœur. L’utilisation de modèle animal est donc la seule alternative permettant une analyse systémique, multi-organes, ainsi que le recueil de plasma et l’analyse de facteurs circulants. 2) Il est également très difficile d’étudier les effets du vieillissement sur des modèles in vitro. Dans ce projet, nous utiliserons des souris jeunes ainsi que des souris adultes, et déterminerons si la cinétique des effets de l’hypoxie (durée de 2 à 16 semaines) est différente selon l’âge (hypothèse d’effets synergiques du vieillissement et de l’hypoxie), à la fois sur le remodelage et le vieillissement du tissu adipeux, mais également sur le remodelage cardiaque. De plus, nous utiliserons une approche chirurgicale de suppression du tissu adipeux, qui nous permettra d’établir la preuve de concept d’une communication inter-organe en réponse à l’hypoxie, dans un organisme entier.
Réduction
Le calcul de nos effectifs est réalisé de manière à utiliser le moins d'animaux possible sans altérer la puissance et la fiabilité de nos tests statistiques. Nous utiliserons un logiciel statistique (GraphPad Prism) pour réaliser des tests adaptés aux paramètres à évaluer. Les tests statistiques utilisés seront des t-test ou des ANOVA à deux voies suivis de tests post-hoc. Une valeur P
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes, dans un environnement enrichi (sauf pendant l’exposition à l’hypoxie ou à la normoxie) et leur bien-être sera vérifié quotidiennement. Les animaux s'adaptent rapidement à l'exposition à l'hypoxie intermittente. Les mesures d'échographies cardiaques et la lipectomie (suppression du tissus graisseux) seront réalisées sur animaux anesthésiés. Pour la lipectomie, les animaux recevront un traitement analgésique avant et après la chirurgie. Globalement et tout au long des différentes procédures du présent projet, les animaux seront surveillés quotidiennement, pesés au moins une fois par semaine, pour veiller à leur bien-être, à leur état de santé et à l’atteinte des points limites ; les critères d’arrêt et la décision d’exclure un animal d’une procédure sera prise par le responsable du projet.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont certaines caractéristiques biologiques peuvent être appliquées à l’homme, notamment dans le cadre d’études sur l’organisme entier. Ceci permet ainsi de comprendre les mécanismes qui se produisent dans l’organisme des souris avant d’entreprendre des études chez l’humain. Les souris font également naître un nombre important de souriceaux par portée ce qui n’est pas le cas de tous les mammifères. Cela nous permet donc d’avoir un grand nombre d’animaux du même lot. Enfin, la pertinence du choix de cette espèce animale repose sur le fait de la comparabilité des études scientifiques. En effet, c’est le modèle de référence dans les publications. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (3 à 12 mois) afin de ne pas utiliser des souris trop jeunes, encore en pleine croissance, et qui pourrait être résistantes aux phénomènes de vieillissement. Les souris à phénotype dommageable développent spontanément des cellules tumorales (lymphomes et sarcomes) à partir de l'âge de 4 à 6 mois mais ces souris seront utilisées et mises à mort avant le développement spontané de ces tumeurs.