Multisystémique
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Validation d’un modèle de la maladie de Parkinson chez le rat par injection d’un vecteur viral
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
21 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit une injection dans le cerveau sous anesthésie pour induire une maladie chronique de type Parkinson, puis deux séances d'IRM de deux heures et des gavages, avec des isolements de vingt-quatre heures, avant mise à mort et prélèvement du cerveau. Le porteur reconnaît des effets liés à la chirurgie, douleur, perte de poids et hypothermie, et un stress lié à l'isolement, tout en décrivant par ailleurs le geste comme sans souffrance en dehors de la maladie induite. Sur le remplacement, il affirme que l'étude du couplage entre microbiote et système nerveux ne peut se faire que chez l'animal.
Objectifs
Les objectifs de ce projet sont : - de valider un modèle rat parkinsonien sur la souche axénique exclusivement employée dans notre établissement utilisateur, souche permettant de contrôler le microbiote des rats. - de caractériser finement les conséquences de la maladie tout au long de l’axe cerveau/intestin par différentes méthodes. - de connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie.
Bénéfices attendus
Les bénéfices sont : - de disposer d'un modèle rat parkinsonien sur la souche employée en conditions axéniques dans notre établissement utilisateur. - de caractériser finement les conséquences de la maladie par des méthodes multisytémiques. - choisir la technique d'IRM non invasive capable de détecter les signes de la maladie au niveau cérébral. - connaitre le profil du microbiote intestinal de ce modèle et identifier un éventuel impact de la maladie. Si nous constatons une modification du microbiote en lien avec le développement de la maladie de Parkinson, nous proposerons de poursuivre cette étude en modifiant le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration du phénotype de la maladie (transplantation fécale issue de microbiotes de patients humains, introduction de prébiotiques dans l'alimentation). L’objectif à terme de ce projet serait de proposer de potentiels prébiotiques qui pourraient améliorer la qualité de vie des malades atteints de la maladie de Parkinson ou ralentir la progression de la maladie.
Procédures
- L’injection intracérébrale sera effectuée 1 fois pour chaque animal sous anesthésie, cette chirurgie dure environ 1h. - L’IRM du cerveau du rat est effectuée sur un équipement dédié aux investigations chez le rat sous anesthésie à l’isoflurane. Les rats sont placés dans un système permettant de les réchauffer et de suivre leurs constantes physiologiques (température, fréquence respiratoire) pendant les 2h que dure l’IRM. Les explorations IRM seront réalisées 2 fois pour chaque animal à 9 semaines d’intervalle. - Les prélèvements de fèces pour l'analyse du microbiote et la mesure du temps de transit sont effectués dans les cages, sans intervention sur les animaux. - Le test appréciant le comportement moteur des rats est effectué toutes les 2 semaines (de la semaine 4 à la semaine 14), il dure environ 20 min. - - La mesure du temps de transit par gavage de spores sera réalisé 2 fois, en semaine et semaine 13, il nécessite un isolement durant 24 h en cage individuelle.
Impact sur les animaux
L’intervention chirurgicale a pour but d’induire une maladie chronique. En dehors de ce dommage durable, le geste chirurgical n’induit ni souffrance, ni altérations comportementales (en dehors de celles directement en rapport avec la maladie de Parkinson). Cependant, les rats peuvent présenter des effets indésirables liés à cette intervention chirurgicale, douleur, perte de poids, hypothermie. L’hébergement individuel des rats pendant 24 h toutes les 7 semaines pour les mesures de temps de transit induit un stress.
Devenir
A la fin de la procédure tous les animaux seront mis à mort et leurs cerveaux prélevés afin de réaliser des analyses immunohistologiques participant à la validation du modèle de maladie de Parkinson chez cette souche de rat.
Remplacement
L’étude du système nerveux, de par sa complexité d’organisation, de développement, de plasticité et de fonctionnement, demande à être effectuée au sein de l’organisme entier. Seules des approches menées in vivo chez un modèle animal peuvent améliorer la connaissance du cerveau et de son fonctionnement, et ainsi aboutir au traitement de ses pathologies humaines comme la maladie de Parkinson. L'objectif de ce projet est de modifier le microbiote pour étudier l'aggravation ou l'amélioration de la maladie, aussi l’étude du couplage microbiote/système nerveux ne peut être réalisée que chez l’animal.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum nécessaire pour apporter des résultats statistiques à l’étude. L’imagerie par IRM est un outil non invasif et indolore qui permet le suivi du développement d’une pathologie sur un même animal.
Raffinement
Les animaux seront acclimatés pendant 7 jours à leur arrivée et lors du transfert entre les 2 animaleries, de l’enrichissement sera mis à disposition dans les cages. Au préalable à chaque procédure, les animaux seront amenés pendant 60 min dans la pièce de l’intervention afin de s’acclimater à ce nouvel environnement. Après chaque anesthésie, que ce soit pour la chirurgie ou l’IRM, les animaux seront placés dans une cage de réveil réchauffée par une plaque chauffante. Ils seront surveillés régulièrement par l’expérimentateur pendant les heures qui suivent l’intervention jusqu’à ce que l’animal ait pleinement récupéré. Pour analyser le temps de transit chez l’animal, une suspension de spores est administrée par gavage orogastrique, technique pour laquelle la douleur et le stress sont limités pour l'animal lorsque le geste est réalisé par des intervenants formés et expérimentés (mise en place d'un conditionnement "pré-contention" avec manipulation régulière des animaux). Toutefois, une surveillance accrue est mise en place à la suite de l'exécution de la technique pour détecter d'éventuels signes de mal être suite à l'intervention.
Choix des espèces
La littérature scientifique montre que le rat est une espèce de choix pour l'étude du fonctionnement cérébral dans la Maladie de Parkinson. Nous pourrons ainsi confronter les données de la littérature utilisant les modèles classiques avec les résultats obtenus grâce à notre nouveau modèle dans le cadre de ce projet. Nous utiliserons des rats jeunes adultes (environ 200 g en début d'étude), afin de pouvoir utiliser les données de la littérature sur les coordonnées des différentes structures cérébrales dans l’espace.
Etude des conséquences sur le métabolisme et le vieillissement de mutations dans les canaux ioniques
- Recherche appliquée
- Troubles endocriniens
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Quatre souris sont recensées dans le tableau des dommages attendus, une sans réveil et trois en souffrance sévère, alors que le résumé annonce par ailleurs 480 animaux. Le porteur décrit l'induction d'une migraine chronique par injections répétées, une douleur qui ne sera soulagée ni par analgésique ni par anesthésique puisque ce sont ses conséquences qui sont étudiées, les animaux étant tués en fin de procédure pour prélèvement des tissus. Il indique surveiller des points limites et euthanasier tout animal atteignant un score de douleur élevé ou perdant du poids. Sur le remplacement, il affirme que les effets métaboliques à long terme et le vieillissement exigent un "organisme vivant" impossible à modéliser in vitro.
Objectifs
La migraine est un trouble neurologique invalidant, d'origine génétique, environnementale et/ou hormonale, avec une prévalence estimée à 15% de la population. Elle se caractérise par des maux de tête sévères, généralement unilatéraux et lancinants qui peuvent être accompagnés de nausées, vomissements et de photophobie. Par ailleurs, la douleur chronique représente un stress pour l'organisme dont les conséquences à long terme sont encore peu connues. Des études cliniques ont corrélé une augmentation de l'incidence des pathologies cardio-vasculaires et des cancers et une diminution de la durée de vie chez des patients qui présentent des niveaux chroniques de douleur. Ce projet vise à étudier les conséquences cellulaires et moléculaires de la douleur migraineuse chronique sur le métabolisme, et en particulier à déterminer si des canaux ioniques potassiques à deux domaines pores (famille des K2P), qui régulent la transmission de la douleur et dont des mutations chez l'homme induisent la migraine, exercent un contrôle sur les paramètres métaboliques impliqués dans le vieillissement. Ce projet nécessitera 480 animaux.
Bénéfices attendus
La migraine est considérée comme l'une des maladies les plus invalidantes au monde, affectant environ 15 % de la population mondiale. Elle se manifeste par une céphalée lancinante unilatérale et s'accompagne de multiples symptômes tels que nausées, vomissements, photophobie, phonophobie ou allodynie cutanée. En parallèle, différentes études cliniques ont permis de corréler une augmentation de l’incidence des pathologies cardio-vasculaires, des cancers et une diminution de la durée de vie, à des niveaux chroniques de douleur chez des patients humains. De plus, les souris déficientes pour TRPV1, un canal ionique impliqué dans la perception de la douleur thermique, sont caractérisées par une meilleure espérance de vie. Enfin, des mutations génétiques chez C. elegans et chez D. melanogaster modifiant la transduction des signaux sensoriels augmentent également la longévité des individus. Il est admis que les crises de migraine commencent par l'activation des neurones sensoriels dans les ganglions trigéminaux (TG). L'hyperexcitabilité des fibres TG innervant les méninges induit la libération de neuropeptides (par exemple la substance P et le peptide CGRP) qui déclenche la vasodilatation des vaisseaux sanguins environnants et une inflammation locale, conduisant à la migraine. De plus, les fibres C exprimant les canaux TREK1, TREK2 et TRESK innervent le le pancréas et leur stimulation induit la sécrétion de CGRP, provoquant l’inflammation et inhibant le relargage d’insuline. Ces données suggèrent fortement que l’activité des canaux ioniques et en particulier de TREK1, TREK2 et TRESK a un impact sur le métabolisme et le niveau général de santé de l’individu. Les bénéfices susceptibles de découler de ce projet sont de nouvelles perspectives thérapeutiques dans la prise en charge de la migraine et plus généralement de la douleur chronique de manière à limiter son impact sur le métabolisme en collaboration avec la Fédération Hospitalo-Universitaire.
Procédures
Dans chacune des procédures, un phénotype migraineux sera induit chez les animaux à 2 stades de leur vie : à 3 mois et à 12 mois. Ce modèle de migraine classiquement utilisé en études pré-cliniques et cliniques consiste à induire des symptômes chroniques migraineux par injection systémique intra-péritonéale d'un "donneur de NO", l'isosorbide dinitrate (ISDN, Risordan ©, Sanofi) pendant 4 jours, à raison de 1 injection/jour. Chez la souris, une injection quotidienne d'ISDN pendant 4 jours induit une hypersensibilité mécanique douloureuse chronique quantifiée quotidiennement avec un appareil de von Frey dynamique qui consiste à appliquer une rampe croissante de pression sur la paume de la patte arrière avec un filament automatique et à mesurer la pression (en grammes) induisant le retrait volontaire de la patte par la souris qui témoigne d’une douleur mécanique. Ces mesures sont peu douloureuses puisqu’elles déterminent un seuil avec possibilité d’échappement. Une allodynie chronique se développe progressivement, mise en évidence par une diminution des valeurs de force nécessaires (seuils) pour induire le retrait réflexe (volontaire) de la patte. L’hypersensibilité douloureuse mécanique (4 tests dans la vie de l'animal) et thermique (4 tests) des souris sera quantifiée par les tests de von Frey et de Hargreaves respectivement sur des groupes de souris indépendants. Les tests de tolérance au glucose et à l'insuline seront mesurés par prélèvement d'une goutte de sang (4 tests) sur des groupes de souris indépendants. Les mesures d'exercice spontané et de motricité seront réalisés 4 fois dans la vie de l'animal, sur 2 groupes de souris indépendants. Chacun de ces tests dure environ 3h excepté la mesure de l'exercice volontaire qui est évaluée après une semaine.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables prévus sur les animaux sont associés à la douleur migraineuse qui sera induite et qui ne pourra être soulagée ni par des analgésiques ni par des anesthésiques puisque ce sont ses conséquences que nous étudierons. Pour cette raison, nous évaluons à un niveau sévère la gravité de nos procédures et nous compenserons par l’observation stricte de points limites spécifiques et adaptés. Dès l'entrée en procédure, les animaux seront soumis à un contrôle quotidien par le principal expérimentateur de façon à relever tout changement d'aspect (dos voûté, pelage non entretenu) et de comportement (apathie, souris à l'écart), à mener leur habituation aux différents tests et à réaliser des injections intrapéritonéales si nécessaire. Ce suivi quotidien permettra aussi un contrôle visuel et expérimental (niveau de sensibilité douloureuse) de l'état de l'animal et de ses sites d'injection. Ainsi, tout animal qui présenterait des signes d'infection au site d'injection, de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement basal anormal (prostration, apathie..) ou d‘une pathologie quelconque (plaie...) serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans notre étude des conséquences de la douleur. Un suivi du poids corporel sera également effectué toutes les semaines par pesée. Une perte de poids comprise entre 10 et 15 % du poids de la semaine précédente conduira à une surveillance accrue de l'animal. Celui-ci sera euthanasié si son état ne s'est pas amélioré la semaine suivante. Un suivi tous les 2 jours sera aussi organisé après les tests de tolérance au glucose et à l’insuline (pendant 6 jours). En plus du suivi par les expérimentateurs, les animaux seront suivis quotidiennement par l’équipe de l’animalerie de l’institut afin de détecter le plus rapidement tout signe de mal-être. Un formulaire permettant l'évaluation de la douleur sera rempli systématiquement. Les animaux seront sacrifiés à un score égal ou supérieur à 3 dans le tableau de l'évaluation de la douleur en annexe.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à l'issu de chacune des procédures. Dans le cadre des procédures 1 et 2, les animaux seront euthanasiés par dislocation cervicale. Dans le cadre des procédures 3 et 4, les animaux seront anesthésiés (procédure sans réveil) et une perfusion intracardiaque sera réalisée afin de prélever des tissus de qualité optimale pour les analyses histologiques post mortem.
Remplacement
Nos études préalables menées sur des neurones en culture et chez les rongeurs ont permis de caractériser le phénotype migraineux des animaux mutants pour les K2P d’intérêt. De plus, les effets métaboliques analysés sur le long terme et le suivi du vieillissement des animaux requièrent un système biologique intégré tel qu’un organisme vivant. Les pathologies associées au vieillissement (diabète, néoplasmes, etc) sont d’origine multifactorielle (y compris environnementale). Leur apparition et leur gravité résultent donc de l’intégration de plusieurs défauts et les études sur l’animal intact sont essentielles et ne peuvent être remplacées. Ceci ne peut malheureusement pas être modélisé in vitro. De plus, nos résultats préliminaires sont très encourageants et justifient le développement de la partie in vivo de ce projet.
Réduction
Le nombre d‘animaux correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (calculé par le logiciel GPower). Il sera réduit chaque fois que possible, et toute expérience rendue inutile par des résultats précédents obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique permanente) ne sera pas réalisée. Nous utiliserons un nombre d’animaux aussi faible que possible. L’évaluation des données obtenues se fera en appliquant un test statistique paramétrique (student t-test ou ANOVA si plus de deux groupes) ou non paramétrique afin de pouvoir réduire le nombre d’animaux au minimum nécessaire à l’obtention de résultats exploitables. Pour évaluer le nombre d'animaux utilisés, nous avons utilisé le programme GPower 3.1 : F-tests ANOVA 2 ways : Fixed effects, special, main effects and interactions. Effects size (medium) : 0.25 alpha err prob : 0.05 Power (1-beta err prob) : 0.8. Nos prédictions suggèrent que des lots de 10 animaux par condition permettront une analyse statistique valide permettant d’exclure toute répétition additionnelle. Nous anticipons et choisissons a priori d’inclure 15 animaux/groupe par précaution, et nous réduirons ce nombre dès lors que les résultats seront statistiquement significatifs.
Raffinement
Notre expertise dans le domaine de la douleur nous permet de mettre en place des conditions de raffinement adaptées et nous porterons une attention particulière à limiter toute forme de stress de nos animaux (habituation en amont de chaque procédure). Aucun des animaux élevés pour ce projet ne présente de phénotype dommageable. En cours de procédure, nous suivrons les animaux en nous appuyant sur une grille de score permettant d’évaluer la douleur et de mettre en oeuvre des points limites précoces. Les animaux seront hébergés dans les conditions habituelles d’animalerie avec un environnent enrichi, sans isolement et en accord avec la réglementation en vigueur.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris (Mus musculus) comme modèle d'étude, en raison de ses similarités génétiques et physiologiques avec l'humain, et de la facilité avec laquelle son génome peut être manipulé et analysé. Nous avons à notre disposition tous les outils déjà mis au point et validés pour pouvoir étudier les modèles génétiques des canaux ioniques TREK1, TREK2 et TRESK dans la souris. 2 âges seront étudiés: 3 et 12 mois. Ces âges sont choisis de manière à représenter les différentes périodes de la vie adulte : jeunes adultes (matures) et individus âgés. En effet, l’un de nos objectifs est de déterminer si l’âge/le vieillissement pourraient impacter le phénotype observé dans ces animaux. Chaque animal sera utilisé à 3 et 12 mois pour réduire le nombre total d’animaux, et parce que chaque animal sera son propre contrôle interne.
Evaluation de l’efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques administrées en continu chez le rongeur
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
Rats : 200
320 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe est implantée chirurgicalement sous anesthésie pour administrer en continu des molécules candidates, avec des prélèvements de sang à la jugulaire sous anesthésie, dans le cadre du développement de médicaments. Le porteur présente cette pompe comme un "raffinement" évitant les injections répétées, tout en reconnaissant des douleurs post-opératoires pendant 48 heures et un risque d'infection au site d'incision. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reflète l'absorption et le métabolisme d'une molécule dans un organisme vivant.
Objectifs
La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal que ce soit dans des études de pharmacocinétique ou d'efficacité. La réalisation de ces tests nécessite parfois d'effectuer des administrations répétées de la molécule à étudier. Les pompes osmotiques sont des pompes miniatures pouvant être implantées chez la souris, le rat ou d'autres animaux de laboratoire lors de protocoles de recherche expérimentale. Ces mini-pompes permettent d’administrer des médicaments, des hormones et d'autres substances à l’étude à des débits continus et contrôlés sur une période allant d'un jour à six semaines, sans recours à des branchements externes, ni à des manipulations fréquentes. Leur fonctionnement automatisé libère le personnel de laboratoire des astreintes liées aux injections répétées durant la nuit ou pendant le week-end et permet de raffiner les techniques d'administration des molécules. Ce projet a donc pour objectif de raffiner ces administrations grâce à la pose d'une pompe Alzet®, cette dernière permettra l'administration en continue de la molécule chez les animaux en évitant par la suite des contentions et des injections répétées, ce qui n'affectera pas leur bien-être.
Bénéfices attendus
L'ajout d'un dispositif à administration lente en continu permettra de raffiner les modèles animaux en réduisant les manipulations / contentions chez l'animal, ainsi que les éventuelles administrations répétées de molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.
Procédures
Pour la pose de la pompe Alzet® les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 10 minutes pour les procédures 1 & 3 et 20 minutes pour la procédure 2). Les animaux seront anesthésiés pour effectuer les prélèvements de sang plusieurs fois au cours des procédures, l'animal sera alors endormi puis prélevé à la veine jugulaire (durée d'intervention 5 minutes).
Impact sur les animaux
L'installation de la pompe chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée.
Devenir
Tous les animaux des procédures seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental. De plus, pour la plupart des tissus seront prélevés afin d'analyses complémentaires.
Remplacement
La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la tolérance des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire dans chaque lot a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.
Raffinement
La pose d'une pompe va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la pompe sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré, per et post opératoire. Le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le poteniel de souffrance et /ou de détresse chez les animaux, des points limites précis et spécifiques ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en oeuvre tout au long du projet.
Choix des espèces
Les multiples homologies de séquences entre le rat, la souris et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ces espèces présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Evaluation pharmacocinétique et pharmacodynamique de molécules pharmacologiquement actives chez le hamster
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
570 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger, pour 480 d'entre eux, et modéré, pour 90. Ils reçoivent des molécules par voies orale, intrapéritonéale ou intraveineuse et subissent des prélèvements sanguins sous anesthésie, pour caractériser le comportement pharmacocinétique de candidats médicaments. Le porteur reconnaît que des modèles cellulaires permettent un premier criblage, mais affirme qu'aucun "ne peut remplacer complètement un organisme vivant" et juge ces analyses "incontournables" avant les études de toxicologie. Tous les animaux sont mis à mort après administration, jugés inutilisables dans un nouveau protocole.
Objectifs
La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal. En effet, il est indispensable d'évaluer les paramètres pharmacocinétiques (PK), pharmacodynamiques (PD) et d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination (ADME) des molécules car ce sont des éléments cruciaux pour la sélection de candidats médicaments. Les analyses de PK, PD et de métabolisme ont considérablement amélioré le taux de succès de la recherche et du développement de médicaments ces vingt dernières années pour trois raisons principales : (i) ces études ont été incorporées en routine dès les phases précoces de découverte de nouvelles molécules, (ii) les scientifiques ont une meilleure connaissance des enzymes et des transporteurs impliqués dans le métabolisme des médicaments ainsi que des différences entre les espèces et individus, (iii) des stratégies d'optimisation des propriétés métaboliques et pharmacocinétiques des molécules ont été établies et appliquées à la recherche et au développement de médicaments.
Bénéfices attendus
Ces analyses, qui aident à la détermination de la dose à administrer, sont incontournables et doivent être réalisées avant de passer aux études de toxicologie et d'efficacité des molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.
Procédures
Les adminstrations par voie intra-péritonéale ou orale se feront sur animal vigile (durée d'intervention 1min). Les animaux seront anesthésiés pour effectuer l'administration intra-veineuse des molécules pharmaceutique (durée d'intervention 10min). Le sang des animaux sera prélevé sous anesthésie (durée d'intervention 5min).
Impact sur les animaux
Une mauvaise tolérance voire une toxicité des produits administrés pourra être observée. Une observation des animaux sera mise en place directement suite à l'administration des produits et quotidiennement en cas d'étude sur plusieurs jours afin d'évaluer l'état général des animaux.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort car ils auront subi une administration d emolécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental.
Remplacement
Il existe des modèles cellulaires permettant d'évaluer l'absorption des molécules et des hépatocytes peuvent être utilisés pour évaluer leur métabolisme in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules ; cependant, aucun modèle in vitro ne peut remplacer complètement un organisme vivant. Il est indispensable de mener ces études dans un modèle animal reflétant l'intégralité des paramètres métaboliques et pharmacocinétiques des molécules testées. Il s'agit notamment d'évaluer des paramètres essentiels comme la clairance, la biodisponibilité, l'exposition, la demi-vie et le volume de distribution d'une molécule suite à son administration chez l'animal. Ces analyses, qui aident à la détermination de la dose à administrer, sont incontournables et doivent être réalisées avant de passer aux études de toxicologie et d'efficacité des molécules.
Réduction
Le design de l'étude étant un plan d'expérience contrôlé, le nombre d'animaux est réduit à son minimum pour chaque groupe. La stratégie d’expérimentation permettra alors d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permettra d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. L'évaluation pharmacocinétique d'un composé est faite par analyse du sang, du plasma ou des organes à l'aide de techniques analytiques type HPLC/MS/MS ou immunodosages (ELISA). Ces techniques d'analyse nécessitent des volumes d'échantillons définis souvent faibles (
Raffinement
Un enrichissement (tunnel, buchettes, cotons pour nidification...) sera ajouté dans les cages afin d'améliorer l'environnement et le confort des animaux. Afin de minimiser le potentiel de souffrance et/ou de détresse chez les animaux, une évaluation régulière de points limites sera réalisée. Ces points limites, établis en concertation avec la Structure du Bien-Etre Animal (SBEA), sont les suivants : défaut d'alimentation et/ou de boisson sur une période de 24 à 48h se traduisant par un amaigrissement et une déshydratation; perte de poids >20% du poids normal maintenue sur 72h; hypothermie persistante, décelée par un animal froid au toucher et réticent à bouger; difficultés respiratoires, avec augmentation du rythme respiratoire; Plaie nécrosée, purulente ou exsudative; faiblesse ou paralysie des membres, se traduisant par des défauts de locomotion. Si l'un de ces points limite est atteint, les animaux seront euthanasiés immédiatement.
Choix des espèces
L'espèce animale utilisée dans ce projet (hamster) est recommandée par les agences de réglementation pour les études de métabolisme, de pharmacocinétique et de toxicologie. Il existe de nombreuses références bibliographiques scientifiques relatives aux études dans cette espèce. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.
Mise en évidence des effets du LSD sur l’activité comportementale et cérébrale chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
1 700 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Issues d'un modèle de trouble obsessionnel-compulsif au toilettage poussé jusqu'à la lésion cutanée, elles sont isolées dans des cages automatisées pour apprendre des tâches jusqu'à quatre mois, reçoivent une injection de LSD et subissent pour certaines une chirurgie de deux à trois heures, pour cartographier les régions cérébrales activées par la molécule. Le porteur indique que le LSD provoque des mouvements rapides de la tête et que de rares souris peuvent montrer une souffrance prolongée. Sur le remplacement, il affirme que la neuromodulation "ne peut être remplacée" par une approche ex vivo.
Objectifs
Ce projet, qui vise à enrichir les connaissances sur les mécanismes d'action de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) grâce à un ensemble d'expériences chez la souris, comporte trois axes: 1) Caractériser l'ensemble des régions cérébrales mis en jeu lors de l'administration de l'acide lysergique diéthylamide (LSD), grâce à des approches immunohistochimiques et de clarification du cerveau. 2) Étudier l'effet de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) sur le comportement des animaux. 3) Étudier plus en détail et à long-terme les modifications d'activités au niveau du cortex orbitofrontal, en lien avec la tâche d'apprentissage et l'administration de l'acide lysergique diéthylamide (LSD).
Bénéfices attendus
Ce projet vise à enrichir les connaissances sur les mécanismes généraux d'action de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) grâce à un ensemble d'expériences chez la souris. Notre objectif est de cartographier les modifications d'activités cérébrales induites par l'acide lysergique diéthylamide (LSD) et pouvant sous-tendre ses effets thérapeutiques en psychiatrie.
Procédures
Dans le cadre de ce projet, nous prévoyons d'étudier un modèle murin de trouble obsessionnel-compulsif (TOC) qui ont la particularité d’engager des actions de toilettage de manière compulsive. Ce phénotype peut conduire à des lésions cutanées au niveau de la face et du corps, qui est observable à partir de l’âge de 3 mois, seulement chez certains individus. Les souris seront isolées et placer dans des cages opérantes automatisées dans laquelle elles apprendront des tâches comportementales. Ces systèmes de cages fournissent un environnement enrichi pour les animaux où ils peuvent entreprendre des tâches comportementales à leur propre rythme. Les souris resteront dans ces boîtes en fonction du temps nécessaire à l'animal pour obtenir de bonnes performances dans la tâche, pour une période pouvant aller jusqu'à 4 mois. De plus, tout animal présentant des symptômes de stress élevé ou un manque de motivation lors de la tâche comportementale sera exclu du protocole et laissé en stabulation sous observation. Dans le cadre du projet proposé, les animaux vigiles recevront une dose faible ou élevée de l'acide lysergique diéthylamide (LSD). Nous retiendrons et manipulerons les animaux de manière douce et appropriée pour une injection rapide et réussie. Nous vérifierons également la zone injectée avant de remettre l'animal dans sa cage. L'ensemble de la procédure ne dure que quelques secondes. Nous prévoyons de ne faire qu'une seule injection par animal. Cependant, en raison de son métabolisme rapide, il pourrait être nécessaire d'administrer des doses répétées pour obtenir les mêmes effets que ceux observés chez l'homme. Les animaux qui atteindront un bon niveau de performance dans la tâche envisagée auront une seule intervention chirurgicale. L'opération dure généralement 2-3 heures pendant lesquelles les animaux sont anesthésiés et sous analgésie appropriée. Comme des prélèvements et des analyses post-mortem sont nécessaires, nous devons euthanasier tous les animaux impliqués dans notre projet.
Impact sur les animaux
Étant donné que l'objectif principal de ce projet est d'étudier les effets de l'acide lysergique diéthylamide (LSD) sur le comportement et l'activité cérébrale de souris, nous utilisons le modèle murin de trouble obsessionnel-compulsif (TOC) qui ont la particularité d’engager des actions de toilettage de manière compulsive. Ce phénotype peut conduire à des lésions cutanées au niveau de la face et du corps, qui est observable à partir de l’âge de 3 mois, seulement chez certains individus. Les souris seront isolées pour être entraînées à des tâches comportementales. Cependant, elles seront logées dans des boîtes opérantes homecage automatisées, qui constituent un environnement enrichi. Dans le cadre du projet proposé, les animaux recevront une dose faible ou élevée de l'acide lysergique diéthylamide (LSD), qui induit transitoirement (quelques minutes) chez les souris des mouvements rapides de la tête d'un côté à l'autre. Rarement, les animaux peuvent montrer des signes de souffrance prolongée malgré les injections d'analgésiques. Tout animal présentant de tels symptômes sera exclu du protocole et euthanasié.
Devenir
Comme des prélèvements et des analyses post-mortem sont nécessaires, nous devons euthanasier tous les animaux impliqués dans notre projet.
Remplacement
Les méthodes utilisées nécessitent l’utilisation de modèle murin, notamment pour la neuromodulation qui ne peut être remplacé par une autre approche ex vivo pour répondre aux objectifs du projet.
Réduction
En réalisant des tâches comportementales ciblées utilisant des boites opérantes automatisées, nous pouvons récolter des milliers d’essais par animaux en une période courte, sans intervention de l’expérimentateur. Cette méthodologie permet de diminuer la variance comportementale par animal, obtenir des résultats très constants entre animaux et ainsi de réduire le nombre d’animaux à utiliser. Les tests statistiques que nous utiliserons nous permettront d'obtenir des résultats fiables avec un nombre réduit d'animaux. Sur la base des calculs de puissance et de notre expertise, pour obtenir des résultats fiables dans le cadre de ce projet de 5 ans, nous devrons élever 1700 animaux.
Raffinement
Dans le cadre du projet proposé, pour chaque mesure expérimentale, des points limites sont établis pour éviter la souffrance et garantir le bien-être de l’animal. En plus, si les animaux, n’atteignent pas de point limites définis, ils seront tous conservés jusqu’à 240 jours au maximum. Les animaux soumis aux procédures comportementales vivront dans des boîtes automatisées qui nous permettent de mieux répondre aux critères des 3R en minimisant l'inconfort des animaux et en réduisant le nombre d'animaux nécessaires pour chaque expérience puisque nous pouvons obtenir des résultats plus fiables par animal. Ces systèmes de cages fournissent un environnement enrichi pour les animaux où ils peuvent entreprendre des tâches comportementales à leur propre rythme. Les souris resteront dans ces boîtes en fonction du temps nécessaire à l'animal pour obtenir de bonnes performances dans la tâche, pour une période pouvant aller jusqu'à 4 mois. De plus, tout animal présentant des symptômes de stress élevé ou un manque de motivation lors de la tâche comportementale sera exclu du protocole et laissé en stabulation sous observation. En plus de cela, anesthésie et analgésie seront administrées à tous les animaux soumis à des procédures chirurgicales afin de minimiser leur douleur. Nous retiendrons et manipulerons les animaux de manière douce et appropriée pour injections rapides et réussies. Nous vérifierons également la zone injectée avant de remettre l'animal dans sa cage. L'ensemble de la procédure ne dure que quelques secondes.
Choix des espèces
Nous disposons de souris qui présentent des comportements compulsifs. En effet, les comportements répétitifs sont la marque de certains troubles neuropsychiatriques apparentés, ce qui offre une occasion unique d'explorer le mécanisme neurobiologique qui sous-tend leur régulation. Dans ces pathologies, l'incapacité de réguler l'expression des comportements appris a souvent des conséquences comportementales délétères. Nous proposons d'utiliser ces conditions pathologiques chez ce modèle rongeur pour mieux comprendre la neurophysiologie des comportements répétitifs et leur rôle dans l’adaptation comportementale. Pour notre étude nous utilisons un modèle murin de troubles obsessionnels compulsifs qui a nécessité des techniques de génie génétique. La pertinence de ce modèle n’a pas d’équivalent dans d’autres espèces. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes entre 12 et 36 semaines (3 à 6 mois). L’utilisation d’animaux relativement jeunes est justifiée puisque ce modèle murin présente des lésions cutanées (perte de poils, croûte, plaies) suite au toilettage compulsif, plus fréquemment après 6 mois. Cependant, indépendamment de l'âge, tout animal présentant des lésions cutanées sera exclu du protocole et traité.
Etude de la physiopathologie du syndrome de Marfan dans un modèle de poisson-zèbre
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Troubles musculosquelettiques
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système musculosquelettique
2 814 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance modéré et sévère. Porteurs de mutations reproduisant le syndrome de Marfan, ils subissent des prélèvements de nageoire, des exercices de nage forcée pour mesurer vitesse et endurance et un protocole d'entraînement de plusieurs semaines, pour étudier les atteintes musculo-squelettiques de la maladie. Le porteur décrit une possible émaciation et des comportements d'anxiété ou de résignation, avec arrêt du protocole au-delà de 20 % de perte de poids. Il affirme que le poisson zèbre est le modèle vertébré "le plus simple" pour cette étude, plus rapide et moins coûteux que le rongeur.
Objectifs
Le syndrome de Marfan (SM) est une maladie génétique rare (1/5000), touchant aussi bien les hommes que les femmes. Les patients présentent des atteintes cardiovasculaires, oculaires et musculo squelettiques. Les anomalies cardiaques sont responsables d’une mortalité précoce, qui est maintenant contrôlable grâce aux progrès dans la prise en charge de la maladie. Par contre, la fatigue chronique et la moindre endurance physique sont des affections fréquentes des patients atteints de SM avec un impact important sur la qualité de vie, aussi l’intérêt de recherche s’est tourné vers une meilleure compréhension des atteintes musculosquelettiques. Une fragilité des tissus de soutien et un déficit musculaire, à l’origine d’un stress accru sur le système musculosquelettique, pourraient participer à ces symptômes. Une étude clinique a rapporté un déficit en masse maigre dès l'enfance et s'aggravant avec l'âge, et la pertinence d'un programme d'entraînement est actuellement évaluée. Comprendre les mécanismes à l’origine de ce déficit musculo-squelettique pourrait permettre l’identification de cibles thérapeutiques spécifiques et le développement de traitements. Nous proposons donc de développer un modèle animal original de la maladie et d’explorer les paramètres osseux et musculaires. Le poisson zèbre représente le système vertébré le plus simple disponible à ce jour pour évaluer l’impact d’une mutation d'un gène associé à une maladie génétique sur le système musculo squelettique à l’échelle tissulaire, cellulaire et moléculaire et de pouvoir évaluer les bénéfices éventuels d’un entrainement. Nous souhaitons donc développer et caractériser des lignées de poisson zèbre portant des mutations équivalentes aux mutations responsables du SM chez l'Homme. Leur comparaison permettra de mieux comprendre la physiopathologie du SM, afin d’identifier de possibles cibles thérapeutiques et d’optimiser les protocoles d’entrainement personnalisé.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux documenter la physiopathologie du SM, qui est à l’heure actuelle mal comprise, et d’identifier des stratégies thérapeutiques allant de programme d’entrainement à des approches pharmacologiques qui pourront toutes deux être testées dans ce modèle poisson -zèbre de la maladie.
Procédures
-Prélèvement unique à la nageoire caudale pour génotypage sous anesthésie -Mesure mensuelle de la taille et du poids sous anesthésie -Analyse locomotion et comportement; durée 3h avec acclimatation; isolement -Exercice de nage forcée pour détermination de la vitesse maximale; durée
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables attendus concernent essentiellement le phénotype associé à la perte de fonction du gène muté chez les patients atteints du syndrome de Marfan, qui devrait reproduire le syndrome de Marfan humain, et associe des malformations cardiovasculaires, oculaires et musculo-squelettiques. D’après les quelques données de la littérature, le développement du phénotype chez le poisson zèbre ne s’observe qu’à l’état homozygote (c'est-à-dire quand les 2 exemplaires du gène sont mutés) ou sur des doubles mutants. Cependant, le SM étant une maladie dominante (c'est-à-dire que la mutation sur un seul exemplaire du gène suffit à déclencher la maladie) chez l’Homme, une attention sera portée sur les hétérozygotes (un seul exemplaire du gène muté). En lien avec ces atteintes, les individus peuvent présenter une perte de poids, ou émaciation, accompagnée de changements comportementaux de type anxiété ou résignation avec notamment une diminution de la prise alimentaire ou une position dans la colonne d'eau qui sera facile à identifier (navigation exclusivement à la surface ou prostration au fond de l'aquarium). Pour les procédures expérimentales, le prélèvement caudal pour le génotypage est réalisé sous anesthésie et les animaux recouvrent leur capacité à nager normalement dès le réveil. L’analyse du comportement de nage nécessite l’isolement du poisson dans le bac où le film est réalisé, isolement qui est maintenu pendant une durée maximale de 3 heures. Pour la nage forcée, la durée de nage à la vitesse maximale est une source de stress, mais ne pourra excéder 3 minutes. L'ensemble des points limites est détaillé dans chaque procédure.
Devenir
A l'issue des différentes procédures les animaux seront euthanasiés afin de récupérer les tissus pour des analyses histologiques et de l'expression génique (taille des fibres musculaires, structure des tissus de soutien, analyse du squelette, inflammation).
Remplacement
Comprendre la physiopathologie du SM nécessite l’utilisation d’un organisme intégré dans lequel l’étude des différents systèmes (cardiovasculaire, musculosquelettique) altérés dans cette maladie soit possible de même qu’une évaluation comportementale transposable à l’Homme. A ce jour, ces informations ne peuvent être obtenues à partir de modèles non animaux (cultures cellulaires ou organoïdes). Le poisson -zèbre représente pour cela le modèle vertébré le plus simple à ce jour, avec de nombreux systèmes moléculaires et cellulaires conservés avec les mammifères, et présente l’avantage de pouvoir facilement réaliser de la mutagenèse in vivo et produire des lignées transgéniques d’intérêt.
Réduction
A notre connaissance, 3 équipes ont développé des modèles de SM (perte de fonction) mais qui ne sont pas rendus disponibles à ce jour. De plus, dans l’idée de réaliser des corrélations phénotype/génotype entre ces mutations perte de fonction et des mutations ponctuelles générées de façon originale par notre équipe, il est essentiel de comparer des animaux de même fond génétique afin de s’affranchir de l’effet de gènes influenceurs pouvant différer d’un fond génétique à un autre. Nous effectuerons cependant une veille régulière des différents dépositaires afin de stopper la production de modèles redondants avec ceux disponibles. Compte tenu de la variabilité des paramètres biologiques généralement observés au sein d’un groupe homogène et de la durée des protocoles, des groupes de 8 animaux par condition seront formés afin de pouvoir mettre en évidence des différences statistiques. Pour le suivi longitudinal des cohortes, des sous-groupes de 4 animaux seront nécessaires pour documenter les différents phénotypes au cours du temps. Les différents tissus seront biobanqués (congélation et inclusion paraffine) afin d’optimiser l’utilisation des animaux. Si un phénotype est présent sur les lignées simple mutation, les autres lignées ne seront pas produites. De même, si un phénotype est présent dès le stade hétérozygote, les élevages seront réalisés de façon à ne pas produire d’homozygotes. Afin de réduire le nombre d’animaux, les expérimentations n’ayant pas d’impact les unes sur les autres seront réalisées sur les mêmes animaux.
Raffinement
Les procédures seront réalisées dans le respect du bien être animal, sous anesthésie lorsque nécessaire pour limiter la souffrance, la douleur ou l’angoisse des animaux, et en respectant des points limites définis par le comportement des animaux, que ce soit leur comportement alimentaire, leur locomotion (position dans la colonne d'eau: nage en surface ou prostration au fond du bac) ou leur fonction respiratoire (mouvement operculaire). L'altération d'un ou plusieurs de ces paramètres pourra induire une perte de poids significative qui lorsqu'elle sera supérieure à 20% du poids de référence de l'animal (poids maximal atteint) conduira à l'arrêt du protocole expérimental. Lors des expérimentations, des phases d’isolement ou des mises en reproduction, les bacs seront posés sur des photos représentant des fond aquatiques. Pour les suivis longitudinaux nécessitant une séparation des différents animaux d’une même ponte, les animaux d’intérêt seront maintenus avec des animaux d’un autre fond génétique afin de ne pas rester isolés. Pour les tests fonctionnels (tunnel de nage), une phase d’habituation au nouvel environnement sera systématiquement réalisée. Tous les poissons sont nourris deux fois par jour, avec notamment des artémies (crevettes fraiches) vivantes, cultivées sur place, qui représentent une source de nutriments frais et une forme d'enrichissement, puisque les poissons les chassent dans le bac.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est génétiquement modifiable, rendant aisé la génération de mutant d’un gène d’intérêt reproduisant une maladie génétique humaine comme le SM, et permet des études de grande envergure tout en étant plus rapides et beaucoup moins couteuses que celles menées chez le rongeur. Le poisson zèbre est aussi un modèle pertinent pour étudier les dysfonctions musculo- squelettiques et cardiovasculaires, et récapitule les processus physiopathologiques observés chez l'Homme. De plus, beaucoup d’événements biologiques sont analysables par des approches non invasives et quantitatives. Actuellement, un très grand nombre de lignées rapportrices ont été générées et sont facilement disponibles dans la communauté scientifique, permettant de répondre à de vraies questions biomédicales. Pour toutes ces raisons, le poisson zèbre est à l’heure actuelle un modèle très pertinent utilisé dans de nombreux laboratoires académiques pour modéliser un large spectre de pathologies avec la possibilité d'aller très en profondeur pour l'exploration mécanistique. Un suivi du développement des signes de la maladie sera réalisé depuis le stade larvaire jusqu’au stade adulte, le SM étant une maladie se développant dès l’embryogenèse mais évoluant tout au long de la vie. De plus, une finalité du projet étant d’identifier des leviers thérapeutiques potentiels, l’évaluation du potentiel curatif d’approches thérapeutiques sur des traits cliniques installés est nécessaire.
Rôle du stroma dans les pathologies inflammatoires de la peau
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
2 220 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger et modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales répétées, des prélèvements de sang à la queue et une biopsie de peau sous anesthésie, pour étudier le rôle des cellules du derme dans l'inflammation cutanée à l'aide de lignées transgéniques portant un gène "suicide". Le porteur décrit un inconfort léger et n'attend aucun effet indésirable majeur. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de ces interactions multicellulaires "nécessite" un modèle murin in vivo, dont le système immunitaire serait proche de celui de l'humain.
Objectifs
Ce projet a pour objectif de caractériser le rôle du stroma dans les pathologies inflammatoires et allergiques de la peau. Les cellules stromales constituent une fraction importante du derme, et sont des producteurs majeurs de facteurs immunorégulateurs. Lors d’une inflammation, elles deviennent très pro-inflammatoires. Afin d’étudier le rôle de ces cellules stromales dans l’inflammation, et en particulier les interactions avec les celllules immunitaires, nous étudierons le rôle de différentes populations stromales inflammatoires grâce à l’utilisation de lignées de souris transgéniques qui expriment des gènes « rapporteur » ou « suicide» (le récepteur à la toxine diphtérique) sous contrôle de promoteur de facteurs stromaux.
Bénéfices attendus
L’objectif de ce projet est de mieux comprendre les mécanismes biologiques menant aux pathologies inflammatoires de la peau. Notre étude permettra de mettre en valeur le rôle des cellules stromales dans ces processus afin de pouvoir proposer des nouvelles cibles thérapeutiques visant à améliorer les traitements actuels des maladies chroniques inflammatoires ou allergiques de la peau, et blessures chroniques.
Procédures
- Un prélèvement sanguin a la veine caudale (durée : quelques secondes), 2x en 1 semaine, suivi d’une période de récupération de 1 semaine si besoin de refaire les prélèvements à l’identique. - Injection par voie intrapéritonéale quotidienne, ou tous les 3 jours. Durée : quelques secondes - Biopsie dermique localisée (1x par souris). Durée : 2 min sur souris anesthésiée
Impact sur les animaux
Inconfort léger dû aux injections ou prélèvement sanguin, rougeur peau. La biopsie dermique sera effectuée sur souris anesthésiée + analgésique local. Aucun effet indésirable majeur n’est attendu suite à ces procédures.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les organes pour analyse
Remplacement
Notre projet s’intéresse à l’interaction des cellules stromales avec leur microenvironnement à savoir les cellules endothéliales, les cellules épithéliales et les cellules immunitaires qui infiltrent le tissu. Comme l’étude de ces interactions cellulaires est donc multicellulaire et multi-organes (réponse immunitaire), elle ne peut pas être effectuée sur des cellules isolées in vitro et nécessite un modèle murin in vivo, qui ont un système immunitaire similaire à l’homme.
Réduction
Le nombre de souris à utiliser a été calculé avec l’objectif de réduire le nombre d’animaux autant que possible tout en assurant des résultats significatifs, qui seront confirmés par des analyses statistiques appropriées, par exemple le T Test ou le test Anova en fonction des questions posées. Ce nombre tient compte d’un minimum de cellules à collecter pour l’analyse et inclut pour chaque série d’expérience le nombre nécessaire de contrôles. Il tient également compte de la nécessité de reproduire les résultats, afin de pouvoir identifier et exclure des artéfacts expérimentaux et ainsi des erreurs d’interprétation.
Raffinement
Pour réduire au minimum les nuisances sur le bien-être des animaux dans les procédures expérimentales, les animaux seront surveillés quotidiennement pendant les traitements, et les biopsies de peau seront effectuées sur animaux anesthésiés, couchés sur un tapis chauffant et sur une peau traitée avec anesthésique local Si un comportement associé à de la douleur est détecté après les biopsies, des analgésiques seront administrés.
Choix des espèces
La souris est un bon modèle pour étudier les pathologies inflammatoires de la peau car des modèles sont bien établis et récapitulent la pathologie chez l’homme. De plus, la souris comporte tous les composants du système immunitaire inné et acquis, qui jouent un rôle essentiel dans l’inflammation chronique et sont semblables dans les pathologies inflammatoires humaines, de ce fait ce sont des bons modèles pour notre étude. Les conditions d’expérimentation proposées sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants en soumettant les animaux à moins de souffrance possible. Les souris seront âgées de 5 à 30 semaines car nous étudierons ces pathologies dans le jeune adulte (après sevrage) et l’adulte
Rôle du microbiote intestinal dans les troubles fonctionnels digestifs associés aux troubles du comportement alimentaire (TRANSMIC-TCA)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
768 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Isolées en cage individuelle pendant quinze jours, elles reçoivent par gavage un microbiote intestinal humain, puis sont soumises à un modèle d'anorexie par restriction alimentaire ou à un modèle de boulimie, pour tester le lien entre microbiote et troubles du comportement alimentaire. Le porteur indique que la restriction peut provoquer fatigue, prostration et forte perte de poids, une chute de plus de 20 % sur trois jours déclenchant la mise à mort. Il affirme que le recours aux modèles animaux est "indispensable", faute d'un autre modèle étudiant ces aspects "dans leur globalité".
Objectifs
Les Troubles du Comportement Alimentaire (TCA) constituent des pathologies graves de l’adolescence et des jeunes adultes, avec un impact fort en termes de morbidité et de mortalité à long terme. Les TCA regroupent différentes formes : l’anorexie mentale, la boulimie et l’hyperphagie boulimique. La prévalence mondiale de ces maladies atteint 8,4% chez les femmes et 2,2% chez les hommes, ce qui en fait un enjeu de santé publique très important. Les mécanismes moléculaires à l’origine des TCA sont encore mal compris. Ce sont des maladies complexes et impliquant différents facteurs biologiques, psychologiques et socio-culturels. Le microbiote intestinal, qui correspond à l’ensemble des micro-organismes vivant à l’intérieur de l’intestin, pourrait être un de ces facteurs. En effet, ces micro-organismes interagissent et communiquent de façon très étroite avec l’intestin mais également avec le cerveau. Ce microbiote intestinal joue également un rôle dans la digestion, dans la régulation de la prise de poids et dans le comportement alimentaire. Il a été montré que la composition du microbiote intestinal de patients souffrant de TCA était modifiée par rapport à des individus sains. Ces changements pourraient avoir un impact sur la physiologie intestinale, notamment en favorisant l’apparition de troubles fonctionnels digestifs (une comorbidité fréquemment retrouvée chez les patients avec TCA). Notre projet de recherche propose donc d’étudier le rôle du microbiote intestinal dans l’apparition et la persistance de ces maladies et de certaines de leurs comorbidités. Notre projet de recherche reposera sur l’utilisation d’approches expérimentales de type « greffes de microbiote intestinal », de l’Homme vers la Souris, ainsi que sur l’utilisation de plusieurs modèles animaux reproduisant différents aspects des TCA étudiés : un modèle de boulimie et d’hyperphagie chez la souris C57Bl/6 (modèle murin « Binge Eating Disorder » ou BED) et un modèle d’Anorexie chez la Souris C57Bl/6 (modèle murin « Activity-Based Anorexia » ou ABA). L’ensemble des connaissances apportées par ces expériences permettra de mieux comprendre les mécanismes d’apparition et de persistance des troubles du comportement alimentaire. Nous espérons en particulier identifier de nouvelles approches thérapeutiques basées sur la manipulation du microbiote intestinal, qui viendront compléter les approches psychologiques et nutritionnelles actuellement utilisées pour lutter contre ces maladies.
Bénéfices attendus
L’ensemble des approches expérimentales présentées dans ce projet nous permettront de déterminer s’il existe un lien de cause à effet direct entre les altérations du microbiote intestinal et l’apparition de troubles du comportement alimentaire. Les résultats obtenus permettront d’améliorer notre connaissance de la physiopathologie des Troubles du Comportement Alimentaire et ouvriront de nouveaux axes de recherche sur le développement de thérapies innovantes contre ces maladies, basées sur la modulation du microbiote des patients.
Procédures
- Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront séparés en cages individuelles après une semaine d’acclimatation à l’animalerie. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront pesés quotidiennement (animaux vigiles), soit 16 pesées pour chaque animal. Pour cela, les animaux seront extraits de leurs cages et pesés sur une balance adaptée. - L’ensemble des animaux de la procédure 2 (448 souris) et de la procédure 3 (224 souris) seront gavés oralement à 3 reprises (1 fois pour la première greffe de microbiote à J0, 1 fois pour la deuxième greffe de microbiote à J1 et 1 dernière fois à J16). Pour cela, les animaux (vigiles) seront extraits de leurs cages et maintenus en contention pendant quelques secondes. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront extraits de leurs cages le dernier jour du protocole et maintenus en contention pendant 2 minutes (animaux vigiles) pour effectuer l’analyse de leur composition corporelle. - Tous les animaux de ce projet (768 souris) seront extraits de leurs cages le jour de la mise à mort et maintenus en contention pendant quelques secondes pour la réalisation d’une injection intrapéritonéale d’anesthésiques.
Impact sur les animaux
- L’ensemble des expérimentations prévues nécessitent d’héberger les animaux pendant plusieurs jours en cages individuelles (15 jours). Cet isolement est indispensable pour pouvoir suivre la prise alimentaire et hydrique de chaque souris et évaluer leur activité physique. - La réalisation de greffes de microbiote intestinal par gavage oral chez la Souris nécessite de prendre les animaux en contention, ce qui peut engendrer un stress de quelques secondes. La mesure de composition corporelle (par Echo-MRI) nécessite également une contention d’une durée deux minutes. Ces différentes contentions seront réalisées par des expérimentateurs expérimentés afin de réduire au maximum le stress des animaux. - Le modèle murin d’anorexie « Activity-Based Anorexia » est un modèle très utilisé et bien documenté dans la littérature (Schalla et al., Front Nutr, 2019 ; doi: 10.3389/fnut.2019.00069). Suite à la restriction alimentaire imposée, les animaux peuvent présenter une fatigue, une prostration et une perte de poids importante. Tous ces paramètres sont pris en compte dans l’évaluation du bien-être animal. Le poids corporel sera suivi quotidiennement et fera également l’objet d’un point limite. - Le modèle murin de boulimie/hyperphagie boulimique « Binge Eating Disorder » est également bien documenté. L’accès intermittent à une nourriture riche en sucre et riche en graisse peut induire un stress lié au développement d’un comportement de type addictif. Cet aspect sera également pris en compte dans l’évaluation du bien-être animal.
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’information à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Ce projet est un projet de recherche en physiologie intégrée visant à étudier les interactions entre les bactéries du microbiote, l’intestin et le cerveau. Ce projet se concentre notamment sur l’analyse de l’impact du microbiote sur la physiologie intestinale (particulièrement les troubles fonctionnels digestifs) et sur le comportement alimentaire. L’utilisation de modèles animaux est donc indispensable pour réaliser cette étude et atteindre les objectifs de ce projet car aucun autre modèle « non animal » actuel ne nous permet d’étudier ces aspects dans leur globalité.
Réduction
Pour nos expérimentations, le nombre d’animaux prévu est dimensionné par rapport au nombre de patients et volontaires sains qui seront inclus dans le protocole clinique (validé par le CPP Ile-de-France V). Nous avons limité ce nombre d’animaux de façon à garder une puissance statistique suffisante dans le traitement des résultats et de pouvoir conclure sur le rôle du microbiote dans l’apparition des troubles fonctionnels digestifs. Les différents paramètres physiologiques et comportementaux mesurés pour chaque lot d’animaux seront comparés. Les analyses de composition du microbiote feront l’objet d’un traitement statistique particulier adapté à ce type de données.
Raffinement
La mise en place d’un suivi strict de points limites permettra d’éviter au maximum le stress et/ou la douleur des animaux au cours des expérimentations. L'ensemble des expériences sera mené par des personnels expérimentés, dans des locaux d'hébergement respectant les standards en vigueur. Pour limiter le stress des animaux, plusieurs points seront mis en place : - Après leur arrivée dans l’animalerie, les souris resteront pendant une semaine en période d’acclimatation avant le début des expérimentations. - Le milieu de la cage sera enrichi de coton pour permettre aux animaux de réaliser des nids. - Les animaux seront observés quotidiennement pour s’assurer de leur bien-être. Deux points limites seront évalués : - Au cours du modèle ABA (modèle de dénutrition), une attention particulière sera portée à la perte de poids. Un suivi quotidien sera réalisé et permettra d'évaluer le pourcentage de perte de poids des différents animaux. Une perte de poids supérieure à 20% du poids initial sur 3 jours consécutifs entrainera la mise à mort de l'animal. - Une évaluation de la souffrance animale sera réalisée à l’aide de l’échelle « Mouse Grimace Scale » composée de 5 items faciaux. Lorsque la somme des scores de ce critère sera supérieure à 5, les animaux recevront une injection sous-cutanée d’analgésique. Si la douleur persiste plus de deux jours, les animaux seront mis à mort. Lorsque la somme des scores de chaque critère sera supérieure à 7, les animaux seront mis à mort. - Au cours du modèle murin de boulimie/hyperphagie boulimique « Binge Eating Disorder », une attention particulière sera portée au développement d’un comportement de type addictif ou de sevrage chez les animaux lié à l’accès intermittent à la diète riche en sucre et riche en graisse Ces différentes manifestations seront prises en compte lors de nos observations quotidiennes des animaux et lors des tests comportementaux réalisés au cours de notre protocole.
Choix des espèces
La lignée C57Bl/6 a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiotiques (Tirelle et al., BMC Microbiol, 2020, DOI: 10.1186/s12866-020-02018-9). Cette lignée C57Bl/6 a d’autre part été utilisée à de nombreuses reprises par notre laboratoire pour l’étude du modèle ABA (Jésus et al., Clin Nutr, 2014, DOI : 10.1016/j.clnu.2013.11.006 ; Breton et al., Clin Nutr, 2021, DOI : 10.1016/j.clnu.2020.05.002). Il est donc pertinent de développer le modèle BED et d’effectuer l’ensemble des greffes de microbiote intestinal dans cette même lignée. Les souris seront livrées à l’animalerie à l'âge de huit semaines et utilisées pour les expérimentations à l'âge de neuf semaines (après 1 semaine d’acclimatation). Cet âge correspond un stade de jeune adulte chez les souris, ce qui correspond au pic d’incidence retrouvé chez l’Homme pour les troubles du comportement alimentaire (Galmiche et al., Am J Clin Nutr 2019 ; DOI : 10.1093/ajcn/nqy342).
Biodistribution et suivi pharmacologique de vecteurs conjugués VHH chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
- Toxicologie et autres tests de sécurité
240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sur animal vigile, elles reçoivent des injections intraveineuses ou sous-cutanées de vecteurs-médicaments et des prélèvements de sang à la queue, pour mesurer la biodistribution de molécules censées passer la barrière du cerveau. Le porteur, une société privée, indique un risque de choc anaphylactique parmi les effets possibles. Les bénéfices médicaux annoncés pour les patients sont renvoyés au long terme.
Objectifs
Les neuropathies, myopathies, et maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. A l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucuns traitements curatifs, ou palliatifs. Les maladies neurodégénératives telles qu’Alzheimer ou démences associées, les maladies lysosomales, les myopathies (Duchenne) sont des exemples d'enjeux de santé publique. C’est dans ce contexte scientifique que notre société a développé un savoir-faire qui consiste en la conjugaison de vecteurs (peptides) à des pro-drogues ou médicaments capables de passer les barrières physiologiques naturelle et dons d’atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). En effet, la plupart de ces médicaments restent inefficaces par manque de passage et d'accès aux régions ou organes à traiter. L’objectif principal de notre société sera donc de proposer de nouvelles formulations capables de reconnaitre leurs partenaires naturels spécifiques, au niveau des barrières cellulaires protectrices de l'organisme et d'utiliser leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. Par cette technique du cheval de Troie, nous faciliterons le passage de médicaments à travers la Barrière Hématoencéphalique (BHE) vers le système nerveux central (SNC). A travers cette demande de projet nous souhaitons développer et optimiser nos « vecteurs » (VHH) pour améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par des approches systémiques, en administrations intra-veineuses ou dermiques, en sous cutanées, nous tenterons d’améliorer le potentiel d’actions de nos vecteur-médicaments, sur une lignée murine de fond consanguin, génétiquement modifiée et humanisée pour le récepteur cible de ce projet.
Bénéfices attendus
> Choix d’une lignée murine "Humanisée" pour le récepteur : La transposition de nos recherches sur un modèle murin, aux récepteurs humanisés, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible endogène chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et donc économique), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos Vecteurs médicaments (VHH) constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures en validant sur un modèle souris pathologique, puis à terme, dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.
Procédures
Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil. Les manipulations expérimentales, sur animaux vigiles, (Pesées, intraveineuses ou sous-cutanées, prélèvements intermédiaires de sang) seront précises et rapides (≤ 2min). • Posologie : Les pesées (calculs posologies), annotations queues des souris (marqueur spécifique pour animaux), et l’ensemble des gestes à suivre seront réalisés par le même expérimentateur. En cas de procédure à doses répétées (≥ 24h), une pesée sera systématiquement effectuée avant chaque administration. • Administrations de VHH : Les administrations se font sur animaux vigiles au niveau caudal pour les intraveineuses, à la base du crâne (nuque), pour les sous-cutanée. Pour les administrations répétées (x3 maximum), un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. • Prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique, à différents « time points » sur animaux vigiles en contention spécialisée. Par une micro-incision de l’extrémité caudale, 3 à 5 gouttes de sang (≤50μl) suffiront pour quantifier la 1/2 vie plasmatique de nos VHH. Ces prélèvements de sang se feront aux temps intermédiaires de 4h, 24h, 72h ou encore 168h, en fonction des groupes, contrôles et VHH.
Impact sur les animaux
Dans ce projet nous chercherons à limiter au maximum le stress induit aux animaux. Ainsi, nous ne modifierons pas leur quotidien (cycles) et garderons les mêmes cages et aliments (absence de faim). Les animaux seront groupés par 4, ce, dès leur réception par les animaliers (absence isolement). Une salle spécifique servira de stabulation lors des cinétiques, elle présentera les mêmes conditions de vie qu’en hébergement. Dans ce projet, il n’y aura pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni d’intervention chirurgicale avec réveil (absence douleur, lésions). Les administrations, précises et rapides, se feront sur animaux vigiles et tenus en contention pour les intraveineuses (réduction stress et peur). De plus, nous proposons d’étudier nos VHH sur des temps d’incubations majoritairement courts. Certaines cinétiques pourront être élargies à 1 ou encore maximum 3 mois, en fonction du délai d’action pharmacologique. Si on se fie aux données de la littérature et notre expertise, les cinétiques d'incubations de quelques semaines à 3 mois ne suffisent pas pour générer des effets indésirables ou engendrer des conséquences physiologiques. En effet, les conjugués administrés présentent des demi-vies dites « relativement courtes », de quelques heures à quelques jours, seuls les effets cibles pharmacologiques de nos médicaments optimisés peuvent nécessiter des cinétiques plus longues avant d’en mesurer pleinement leurs efficacités. Ici, post-administration, le principal risque se trouve être la réaction immunitaire (choc anaphylactique), ainsi que d’autres effets indésirables (réaction allergique ; détresse cardio-respiratoire ; modification et troubles comportementaux). Mais là encore, ces problématiques sont étudiées en amonts et en post-expérimentales (immunogénicité) couplées à de la littérature et le savoir de nos experts en chimie et pharmacologie. Nos composés VHH administrés aux souris ne doivent pas présenter de toxicité, il en va de l’intérêts des animaux mais aussi de l’étude. Malgré ces précautions, une observation comportementale des animaux sera faite de manière quotidienne, à la recherche du moindre signe de souffrance, le tout accompagné d'un suivit du poids, du début des administrations à la fin des cinétiques, afin de s'assurer que les animaux ne perdent pas plus de 10% de poids initial.
Devenir
En fin de procédure, tous les animaux seront euthanasiés pour réaliser les prélèvements tissulaires en point final. Si, entre temps, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également euthanasié en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.
Remplacement
Pour mener à bien nos projets, nous envisageons de réaliser des expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres physiologiques, mécanistiques et homéostasiques, indispensables pour pouvoir étudier une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit pour cela de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. Les faibles cohortes d'animaux permettront d’obtenir un maximum de résultats, suffisant pour l’obtention de données statistiques significatives.
Réduction
L’optimisation de nos vecteurs et voies d’administrations permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), de limiter les possibles effets secondaires, mais aussi le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux se répartit sur de petits groupes de n=4, à raison de 240 souris/an, réparties sur 10 études de 24 individus. Cette estimation est basée sur notre expérience et d’anciens projets, similaires, réalisés sur le modèle souris par la société. Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des tests statistiques adaptés (non-paramétriques) permettant d’utiliser un faible nombre de souris sans compromettre les objectifs de l’étude. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile des souris et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (Prélèvement caudal ≤50 μl) en cours de cinétique permet d'obtenir des données de ½ vies plasmatiques supplémentaires, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.
Raffinement
La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires afin d’appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal (Annexe II : grille score et points limites). Nous porterons une attention particulière à la phase amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux pour un minimum de 14j dès réception. La veille des tests, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce cyclée (12h/12h), insonorisée, armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont ainsi maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 4 individus par cage, litières (copeaux de bois) et raffinements (maison en carton et Sizzle-Nest). Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil. Les manipulations expérimentales, sur animaux vigiles, (Pesées, intraveineuses ou sous-cutanées, prélèvements intermédiaires de sang) seront précises et rapides (≤ 2min). La simplicité des administrations nous permet facilement d’envisager différentes stratégies pharmacologiques plus complexes, à doses uniques ou répétées (x3 maximum) (administration i.v. 5.5ml/kg, s.c. 10ml/kg). Des points limites seront établis en cours de cinétique, lors du suivi des animaux. Un score modéré (7-9) conduira automatiquement à une exclusion et sortie de l’étude, puis à l’euthanasie (cf. 3.3.3) du ou des animaux en question (Pas de maintiens isolés inutiles, ni de soins ou d’utilisation d’analgésique). En point final de l'étude, les animaux seront tous euthanasié sans stress ni douleur, pour collecter les tissus d'intérêt. La lignée humanisée utilisée n’a jusqu’alors jamais présenté d’apparitions de phénotypes dommageables chez les animaux. Nous utiliserons des animaux issus du même élevage et fournisseur.
Choix des espèces
Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, et idéale pour la mise en place de premières études précliniques. Le développement préclinique nécessite tôt ou tard une première approche in vivo, sur un modèle animal tel que le rongeur, dans notre cas, la souris. C’est le modèle le plus standardisé et utilisé en expérimentation animale, car sa physiologie, bien connue (mammifère), est relativement proche de l’homme. Le modèle rongeur facilite les manipulations, les injections et observations comportementales. Il est aussi plus adapté et intéressant pour la partie pharmacologie (diminution des posologies). En pratique, on l’utilise principalement pour la facilité de mise en place des expérimentations et l’obtention de groupes allant jusqu’à 4-5 individus sans trop de contraintes de stabulation. Notre modèle souris humanisé est particulièrement avantageux dans notre projet car il présente l’avantage d’avoir notre cible endogène humanisée (récepteurs). Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, organes ou liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 25-27g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).
Etude de la relation entre l’épigénome des bovins et leurs performances
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
150 vaches Holstein vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis maintenues dans leur élevage. Chacune subit une prise de sang à la queue, pour développer une "puce d'épigénotypage" reliant leur épigénome à leurs performances. Le porteur présente l'objectif comme un outil de sélection au service d'un élevage "durable", et revendique une étude impossible ailleurs que sur "l'animal entier". Il reconnaît n'avoir fait aucun calcul statistique préalable, cherchant à récolter "un maximum de données".
Objectifs
Depuis plusieurs décennies, la sélection génétique des animaux de rente a permis de net progrès dans les capacités de production, d’efficacité alimentaire et de santé. Néanmoins, dans un certain nombre de cas, le potentiel génétique de l’animal semble sous-exprimé sous l’influence de facteurs environnementaux. L'épigénétique est actuellement reconnue comme l'un des domaines les plus prometteurs des sciences biologiques, basé sur l’étude des mécanismes moléculaires directement impliqués dans le contrôle du fonctionnement du génome, en réponse à l’environnement. Ce projet doit contribuer à améliorer la compréhension des processus épigénétiques mis en oeuvre et à intégrer ses nouvelles données aux connaissances génétiques afin de fournir une prédiction précise du phénotype chez les bovins. Les relations entre épigénome des bovins et leurs performances seront évaluées, sous différents environnements (différents types d’alimentation, d’hébergements ou encore effet du stress thermique). Le projet met en place un nouvel outil, dit « puce d’épigénotypage », à partir d'une simple prise de sang. Elles seront réalisées sur 100 vaches de race Holstein pour lesquelles des données de santé, de production, de conduite et d’environnement seront collectées. Cette démarche nous permetra de déterminer dans quelle mesure les biomarqueurs épigénétiques peuvent expliquer une partie de la variance phénotypique observée. Des modèles statistiques seront développés pour combiner les informations génomiques et épigénomiques afin d'améliorer les modèles de prédiction génomique. Ce projet établira les relations entre variations phénotypiques observables, la génétique, l’épigénome et l’environnement. La démarche mise en oeuvre va contribuer à mieux définir les caratéristiques de chaque individu et offrira de nouveaux modèles d’évaluation plus fiables. Il consistera dans l’identification de nouveaux indicateurs de gestion intégrant des données épigénétiques. Il sera utilisé pour rechercher des animaux capables de s'adapter aux changements environnementaux de par leur plus grande plasticité épigénétique et génomique. Ces connaissances aideront à définir de nouvelles stratégies de sélection visant des animaux plus robustes, aptes à exprimer leur potentiel dans des conditions variables tout en maintenant leur santé et bien-être pour un élevage durable.
Bénéfices attendus
La collection d’échantillons biologiques ainsi que l’ensemble des données fourniront pour la première fois l’opportunité de traiter une cohorte de vaches Holstein et d’en identifier l’épigénome. Cette étude originale est une première pour le monde de l’élevage. Cette étape est absolument incontournable pour déterminer la puissance de l’outil d’épigénotypage que nous développons et définir un nouvel index de management apte à prendre en considération tout l’historique de vie de l’animal. Cette démarche met les derniers progrès technologiques et méthodologiques de la biologie au service d’un élevage responsable et durable. En concertation avec le responsable de l'établissement, l’ensemble des vaches des différents troupeaux seront incluses dans le protocole de prélèvements. Le prélèvement consiste en une simple prise de sang à la veine caudale lors d’une contention au cornais ou dans un couloir de contention. Toutes les vaches, exceptées celles porteuses d’une pathologie avérée et suivant un traitement médicamenteux, seront incluses, quelques soient leur âge, leur parité ou stade physiologique. Au moment du prélèvement, un maximum de données relatives à l’élevage et à l’animal seront collectées à partir d’un questionnaire : système d’élevage, conduite du troupeau, alimentation et historique de vie de l'animal, ainsi que des relevés climatiques (températures et hydrométrie).
Procédures
Une seule prise de sang par voie caudale, faite de manière rapide 'moins d'une minute par animal) par du personnel formé.
Impact sur les animaux
Il peut rarement se produire un léger hématome au niveau du site du prélevement qui disparait naturellement au bout de quelques jours.
Devenir
La prise de sang n’aura aucun effet indésirable et sera sans effet secondaire sur les vaches ; par conséquent, nous considérons qu’aucun changement n’interviendra dans la conduite des vaches.
Remplacement
Le projet est conduit sur l’espèce bovine pour l’espèce bovine. Il ne peut donc y avoir de remplacement. Il s’agit d’une démarche de biologie intégrative pouvant prendre en compte tous les processus biologiques et ne pouvant être conduite qu’au niveau de l’animal entier. Le choix de la race Holstein tient à sa prépondérance dans la production de lait française : nous étendrons l’étude à d’autres races laitières et allaintantes dès obtention des financements.
Réduction
Le nombre de vaches à inclure dans l’analyse est de l’ordre de 150. Un nombre maximal d’individus est à inclure dans le protocole afin d’appréhender la grande variabilité phénotypique. L'intérêt de la démarche de génotypage étant de récolter un maximum de données pour avoir une étude de grande ampleur et significative à l'échelle du cheptel français, aucun test statistique préalable n'a été effectué pour déterminer le nombre d'individus à recruter.
Raffinement
La procédure de prise de sang par la veine caudale est une procédure classique en élevage pour un suivi sanitaire des animaux de ferme, pour lesquels les animaux sont habitués (prophylaxie). Les animaux sont déjà très largement habitués aux systèmes de contention qui seront mis en place (cornadis ou couloir de contention). Les prises de sang seront réalisées par du personnel qualifié et aguerri à ce geste simple.
Choix des espèces
Ce projet s’interesse à l’espèce bovine et toute la démarche expérimentale proposée doit aboutir à la création d’un nouvel index de management permettant une intégration de l’historique de vie de l’animal. Cet index doit être un indicateur du bien etre et de la santé des vaches. L’établissement de cet index sera associé à une série de recommandations dont l’objectif final est l’expression du potentiel génétique de l’animal dans le respect de ses besoins. Une simple prise de sang reste un geste très peu invasif et peu douloureux, n’occasionnant qu’une gêne transitoire. Il n'existe pas de contre indication à utiliser différents stades de développement. C'est pourquoi toutes les vaches du troupeau seront incluses dans le protocole car il s'agit de caractériser leur épigénome, quelques soient leur âge ou stades physiologiques (en lactation ou tarie).
Etude de la relation entre l’épigénome des bovins et leurs performances
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
100 vaches de race Holstein vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis réutilisées. Chaque animal fait l'objet d'une seule prise de sang à la veine caudale, complétée par un questionnaire sur l'élevage. Le porteur cherche à relier l'épigénome des bovins à leurs "performances" de production et à définir de nouveaux indicateurs de sélection. Il présente cette démarche comme utile au "bien-être" des vaches et à un "élevage durable", alors que l'objectif décrit reste l'expression de leur potentiel de production.
Objectifs
Depuis plusieurs décennies, la sélection génétique des animaux de rente a permis de net progrès dans les capacités de production, d’efficacité alimentaire et de santé. Néanmoins, dans un certain nombre de cas, le potentiel génétique de l’animal semble sous-exprimé sous l’influence de facteurs environnementaux. L'épigénétique est actuellement reconnue comme l'un des domaines les plus prometteurs des sciences biologiques, basé sur l’étude des mécanismes moléculaires directement impliqués dans le contrôle du fonctionnement du génome, en réponse à l’environnement. Ce projet doit contribuer à améliorer la compréhension des processus épigénétiques mis en œuvre et à intégrer ses nouvelles données aux connaissances génétiques afin de fournir une prédiction précise du phénotype chez les bovins. Les relations entre épigénome des bovins et leurs performances seront évaluées, sous différents environnements (différents types d’alimentation, d’hébergements ou encore effet du stress thermique). Le projet met en place un nouvel outil, dit « puce d’épigénotypage », à partir d'une simple prise de sang. Elles seront réaliser sur 100 vaches de race Holstein pour lesquelles des données de santé, de production, de conduite et d’environnement seront collectées. Cette démarche nous permetra de déterminer dans quelle mesure les biomarqueurs épigénétiques peuvent expliquer une partie de la variance phénotypique observée. Des modèles statistiques seront développés pour combiner les informations génomiques et épigénomiques afin d'améliorer les modèles de prédiction génomique. Ce projet établira les relations entre variations phénotypiques observables, la génétique, l’épigénome et l’environnement. La démarche mise en œuvre va contribuer à mieux définir les caratéristiques de chaque individu et offrira de nouveaux modèles d’évaluation plus fiables. Il consistera dans l’identification de nouveaux indicateurs de gestion intégrant des données épigénétiques. Il sera utilisé pour rechercher des animaux capables de s'adapter aux changements environnementaux de par leur plus grande plasticité épigénétique et génomique. Ces connaissances aideront à définir de nouvelles stratégies de sélection visant des animaux plus robustes, aptes à exprimer leur potentiel dans des conditions variables tout en maintenant leur santé et bien-être pour un élevage durable.
Bénéfices attendus
En concertation avec le responsable de l'établissement, l’ensemble des vaches des différents troupeaux seront incluses dans le protocole de prélèvements. Le prélèvement consiste en une simple prise de sang à la veine caudale lors d’une contension au cornais ou dans un couloir de contention. Toutes les vaches, exceptées celles porteuses d’une pathologie avérée et suivant un traitement médicamenteux, seront incluses, quelques soient leur âge, leur parité ou stade physiologique. Au moment du prélèvement, un maximum de données relatives à l’élevage et à l’animal seront collectées à partir d’un questionnaire : système d’élevage, conduite du troupeau, alimentation et historique de vie de l'animal, ainsi que des relevés climatiques (températures et hydrométrie).
Procédures
Une seule prise de sang par voie caudale, faite de manière rapide (moins d'une minute par animal) par du personnel formé.
Impact sur les animaux
Il peut rarement se produire un léger hématome au niveau du site du prélevement qui disparait naturellement au bout de quelques jours.
Devenir
La prise de sang n’aura aucun effet indésirable et sera sans effet secondaire sur les vaches ; par conséquent, nous considérons qu’aucun changement n’interviendra dans la conduite des vaches.
Remplacement
Ce projet est conduit sur l’espèce bovine pour l’espèce bovine. Il ne peut donc y avoir de remplacement. Il s’agit d’une démarche de biologie intégrative pouvant prendre en compte tous les processus biologiques et ne pouvant être conduite qu’au niveau de l’animal entier. Le choix de la race Holstein tient à sa prépondérance dans la production de lait française : nous étendrons l’étude à d’autres races laitières et allaintantes dès obtention des financements.
Réduction
Le nombre de vaches à inclure dans l’analyse est de 100. Notre démarche s’apparente aux analyses épidémiologiques menées chez l’homme, le nombre important d’individus à inclure dans le protocole permet d’appréhender la grande variabilité phénotypique.
Raffinement
La procédure de prise de sang par la veine caudale est une procédure classique en élevage pour un suivi sanitaire des animaux de ferme, pour lesquels les animaux sont habitués (prophylaxie). Les animaux sont déjà très largement habitués aux systèmes de contention qui seront mis en place (cornadis ou couloir de contention). Les prises de sang seront réalisées par du personnel qualifié et aguerri à ce geste simple.
Choix des espèces
Ce projet s’interesse à l’espèce bovine et toute la démarche expérimentale proposée doit aboutir à la création d’un nouvel index de management permettant une intégration de l’historique de vie de l’animal. Cet index doit être un indicateur du bien etre et de la santé des vaches. L’établissement de cet index sera associé à une série de recommandations dont l’objectif final est l’expression du potentiel génétique de l’animal dans le respect de ses besoins. Une simple prise de sang reste un geste très peu invasif et peu douloureux, n’occasionnant qu’une gêne transitoire. Il n'existe pas de contre indication à utiliser différents stades de développement. C'est pourquoi toutes les vaches du troupeau seront incluses dans le protocole car il s'agit de caractériser leur épigénome, quelques soient leur âge ou stades physiologiques (en lactation ou tarie).
Effet des cellules stromales mésenchymateuses humaines sur la résolution d’une septicémie induite après péritonite chez la souris jeune et âgée
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
2 530 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit une septicémie provoquée par ligature et perforation du caecum, un modèle que le porteur reconnaît induire une mortalité élevée, avant injection de cellules stromales dans la cavité péritonéale. Les souris sont réparties par âge, jusqu'à deux ans, pour évaluer l'effet du traitement au cours du vieillissement. Le porteur affirme qu'il est "indispensable" de confirmer in vivo des effets déjà montrés in vitro et qu'une étude chez la souris est "nécessaire".
Objectifs
L'objectif du projet est de mettre en évidence l'effet de différentes populations de cellules stromales sur la résolution d'une septicémie induit après une péritonite au cours du vieillissement et de comprendre les mécanismes d'action des différentes populations cellulaires.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra de mettre en évidence l’effet des cellules stromales mésenchymateuses "naives" ou primées sur l’inflammation et la résolution d'une septicémie induite après une péritonite et d’étudier l’intérêt de ce traitement au cours du vieillissement. En effet, nous espérons que les cellules stromales mesenchymateuses diminueront l’inflammation induite par la péritonite augmentant ainsi la survie des animaux. De plus, notre étude nous permettra de mieux comprendre le mode d'action des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses et de proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de péritonite.
Procédures
La péritonite est induite chez certains animaux par ligature et ponction du caecum. Les souris sont endormies par inhalation d’un gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. La profondeur de l’anesthésie est évaluée par l’absence de réponse à la stimulation des extrémités. Une incision cutanée au niveau de l’abdomen est réalisée puis l’ouverture de la cavité péritonéale est réalisée au ciseau. Le caecum est ligaturé et perforé à l’aide d’une aiguille. Après injection de différentes populations de cellules stromales mésenchymateuses dans la cavité péritonéale encore ouverte, la fermeture du péritoine en deux plans est réalisée. Réalisée par une personne entrainée, la chirurgie dure entre 7 et 10 min. Avant l'intervention, un analgésique est injecté sur animaux endormis Pour les animaux chez qui la péritonite sera induite par injection de composés protéiques, les animaux auront 2 injections intrapéritonéales l’une contenant le composés protéiques l’autres les cellules thérapeutiques. Avant l'intervention, une injection sous cutané d’analgésique est réalisée sur animaux vigiles. L'injection d'analgésique sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours
Impact sur les animaux
Le modèle de péritonite induit par ligature et ponction ceacale est un modèle qui induit une mortalité assez élevée chez les animaux opérés. La douleur induite par la chirurgie et par l'induction de la péritonite est gérée par administration d'analgésiques.
Devenir
Tous les animaux suivant ces différents protocoles seront mis à mort afin de permettre l'analyse de l'effet des différents traitements sur la réponse immunitaire, l'inflammation générale et les lésions des différents organes de la cavité péritonéale.
Remplacement
L'effet immunomodulateur des différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses a été démontré in vitro mais il est indispensable de confirmer ces résultats in vivo, en ayant une vraie situation d’inflammation mettant en jeu l’ensemble des partenaires cellulaires qui interviennent lors de l’inflammation. Une étude chez la souris s’avère donc nécessaire.
Réduction
Notre expérience nous permet de déterminer que le nombre de 5 souris par groupe et la réalisation en triplicat de l'expérience nous permettra d'évaluer l'effet de nos différentes populations cellulaires et de diminuer ainsi le nombre d'animaux utilisés. Nous inclurons suffisamment de souris par groupe et effectuerons trois expériences indépendantes pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. L’expérience de notre laboratoire nous permet de déterminer le nombre optimal de souris à utiliser par lot.
Raffinement
Les animaux sont anesthésiés sous gaz et maintenues endormies sous masque sur une table chauffante pendant l’intervention et jusqu’à leur réveil. Un antalgique est placé dans l'eau de boisson des animaux 24h avant l'intervention puis de manière continue après la chirurgie. Vu la stabilité de la molécule, le biberon sera changé tous les jours. De plus, une injection d’un analgésique sera effectuée au moment de la chirurgie sur animaux endormis afin de diminuer la douleur. Cette injection sera répétée toutes les 12 heures pendant 3 jours. Les animaux seront élevés à 5 animaux par cage) afin de limiter le stress lié à la chirurgie et à l'isolement. Du papier type kleenex ainsi que des cabanes type "igloo" seront ajoutés dans la cage afin de respectivement permettre la formation du nid et d’enrichir l’environnement de vie des animaux. Des croquettes imbibées d'eau contenant un analgésique seront placées directement dans la cage afin de limiter au maximum l'extension des animaux opérés. De plus, une grille de score et l’utilisation de point limite adaptés permettront de définir les critères d’arrêt de souffrance et d'entraîner la mise à mort de l’animal.
Choix des espèces
La souris est un modèle complexe qui nous permettra d'évaluer l'effet de nos cellules d'intérêt sur la réponse inflammatoire locale mais également en systèmique. De plus, le modèle de sepsis chez la souris est très bien décrit nous donnant des informations essentielles au bon déroulement de notre procédure. Enfin, les outils techniques et biochimiques nécessaires à l'analyse des données obtenues sont développées chez cette espèce. Les personnes âgées présentent un risque accru de mortalité lors d’une évolution négative d’une péritonite. L'utilisation d'animaux à différents âges (8 semaines, 1 an, 2 ans) nous permettra d'évaluer l'intérêt d'utiliser les différentes populations de cellules stromales mesenchymateuses comme traitement d'un sepsis induit après péritonite au cours du vieillissement.