Multisystémique

3 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont colonisées par gavage avec des souches d'Escherichia coli, soumises à un régime gras pendant plusieurs semaines à plusieurs mois et à des tests répétés de tolérance au glucose, certaines souches pathogènes pouvant entraîner une perte de poids déclenchant leur mise à mort. Le porteur qualifie le recours à l'animal d'"irremplaçable" pour ces bactéries et reconnaît ne pas avoir prévu d'analyse statistique préalable du nombre d'animaux. Toutes les souris sont tuées pour disséquer leurs tissus, un effectif de 3 360 justifié par la recherche d'un "seuil statistiquement valable".

Objectifs

Comprendre : i) les altérations du métabolisme du glucose et du microbiote intestinal induites par les infections à E. coli; ii) le rôle de l'inflammation intestinale dans les phénomene du point i); iii) comoprendre les mécanismes moléculaires selon lesquels les maladies métaboliques type obésité et diabète de type 2 predisposent aux infections.

Bénéfices attendus

Amélioration de la prise en charge des patients métaboliques et qui souffrent des maladies infectieuses à E. coli

Procédures

9 procédures : voir point 4. Durée de la procédure 1 de colonisation ~5 seconds, le temps du gavage; pour la procédure 2 high-fat diet courte durée, 4 semaines; pour la procédure 3 high-fat diet longue durée, ~3 mois; pour la procédure 4 IPITT 1 heure; pour la procédure 5 IPGTT 2 heures; pour la procédure 6 OGTT 2 heures; pour la procédure 7 IPPTT 2 heures; pour la procédure 8 injection de MCC950, ~5 seconds, le temps de l'injection; pour la procédure 9 de la NFS, durée de ~15 seconds, le temps du prélevement du sang.

Impact sur les animaux

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites.

Devenir

Les souris resterons en vie à la fin de chaque procédure. Les souris seront mises à mort à la fin de chaque protocole complet indiqué en 3.4.10. La mise a mort est nécessaire afin de permettre la dissection des tissus pour réaliser les analyses moléculaires et identifier les facteurs moléculaires à la base des phénotypes observés.

Remplacement

Pas adaptable dans ce cas car si les études avec des cellules ont permis d’identifier et caractériser les dommages à l'ADN provoqués par les génotoxines, le recours à l’animal est irremplaçable pour ce type d'étude avec des souches bactériennnes. En effet, aucun modèle cellulaire ne permet de récapituler les processus de la colonisation intestinale bactérienne, de la translocation, c’est-à-dire la diffusion des bactéries vers les autres organes, ni d’évaluer, au niveau de l’individu, le rôle de la colonisation par des bactéries produisant des génotoxines sur la santé.

Réduction

Le chiffre de 3360 souris nous permettra d’atteindre un seuil statistiquement valable et donc de pouvoir interpréter les résultats obtenus. Cela permettra donc de ne pas répéter les expérimentations tout en respectant la réduction du nombre d’animaux employés (règle de 3 R). En ce qui concerne les points limites (critères d'interruption) pour le raffinement des protocoles, l’inhibition pharmacologique de l’inflammasome intestinal NLRP3 et les procédures de colonisation n’ont pas été rapportées pour induire de douleur chez l’animal et sont bien tolérées sauf avec certaines souches pathogènes. Pour ces souches spécifiquement, le temps d’expérimentation sera réduit afin de minimiser la mortalité. Une perte (non attendue) du poids initial supérieure à 20% ainsi que des éventuels états de prostration ou isolement nous conduiront à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Nous envisageons d’utiliser de souris mâles, dont la littérature montre une vaste gamme de données sur le microbiote intestinal.

Raffinement

Les expérimentations décrites ne sont pas censées induire de douleur et sont bien tolérées par les souris adultes. Pour les souches pathogènes, une perte de poids supérieure à 20 % du poids initial nous conduira à sortir l’animal du protocole expérimental et à l’euthanasier. Eventuels états de prostration (pas prévus) et/ou isolement et poil hérissé seront aussi considérés comme points limites. Nous ne prévoyons pas une étude statistique à l’avance (analyse de puissance) car nous n’avons pas un pourcentage précis de modulation de variables que l’on va analyser.

Choix des espèces

Le microbiote intestinal chez la souris est désormais bien connu et sa structure ressemble à celle du microbiote intestinal chez l’homme. Pour cela, la translation des résultats obtenus chez la souris vers l’homme pourrait être faite rapidement (Serino et al., Acta Diabetol. 2013). Nous utiliserons des souris de 12 semaines d’âge au moment de la colonisation avec les souches bactériennes d’intérêt. Cette âge tient compte du temps d’acclimatation des souris en zootechnie (2 semaines), de l’éventuel protocole antibiotique (2 semaines) avant colonisation et du traitement par régime gras 60%HFD (4 semaines ou 3 mois, selon le protocole). Dans ce dernier cas les souris arriveront à l’âge de 6 semaines. Cette âge permet une réponse optimale des souris au régime gras diabétogène/obésogène pour l’induction des maladies métaboliques. Dans les autres cas sans régime gras les souris arriveront en zootechnie à l’âge de 10 semaines.

225 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent l'injection d'un agent bactérien pro-inflammatoire, puis un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d'être tuées pour prélever leurs organes. Le projet se limite à valider des souris dites "humanisées", porteuses d'un gène humain à la place du gène murin, étape préalable à des études ultérieures faisant l'objet d'une demande séparée. Le porteur affirme qu'il n'existe "pas d'alternative in vivo" et renvoie au conditionnel et au long terme les retombées annoncées pour le développement de médicaments chez l'humain.

Objectifs

Le but de ce projet est de valider des modèles génétiques de souris où un gène de souris est remplacé par un gène humain. Si le modèle fonctionne, la protéine humaine sera ensuite exprimée dans les cellules et les tissus où la protéine de souris était auparavant exprimée. Dans ce projet, la validation de l’expression des gènes humains chez la souris nécessite un challenge avec une injection d’un agent bactérien. Cette injection induira une réponse inflammatoire nécessaire à l’expression des gènes d’intérêt dans les organes de la souris. Pour chaque modèle génétique analysé, nous prévoyons de comparer des groupes de 5 animaux pour chaque génotype soit 15 animaux par modèle étudié. Durant la durée de ce projet, nous anticipons 5 études par année, soit un total de 15 animaux * 5 projets * 3 ans, soit 225 souris au maximum. Chaque étude se focalisera sur un gène d'intérêt disposant d'éléments de la littérature justifiant la création du modèle. Les gènes humains étudiés sont de potentielles cibles pour les thérapies dans les domaines de l’oncologie, la neurologie, les troubles cardiaques et métaboliques. Cette étape de validation de modèle est nécessaire pour étudier plus tard sur une plus large cohorte l’effet sur les fonctions biologiques de l’expression de ces gènes humains chez la souris. Cette étape préliminaire est donc requise avant d’étudier les processus biologiques humains in vivo qui sont associés aux gènes exprimés. Cette étude future nécessitera une demande éthique à part.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de valider des modèles de souris exprimant des gènes humains. Il nous apportera plus de connaissances sur le fonctionnement de ces gènes humains dans un organisme entier comme la souris. Les données générées nous permettront plus tard d'étudier l'effet de l'expression de ces gènes sur les fonctions biologiques. Ces modèles permettront de modéliser des maladies humaines où ces gènes sont impliqués. Plus tard, cela permettra d'envisager des pistes thérapeutiques potentielles qui seront utilisées pour le développement de nouveaux candidats médicaments dans le cadre des pathologies neurologiques, cardiaques, métaboliques ou encore les cancers. A plus long terme, ces données pourront permettre le développement de médicaments chez l'Homme.

Procédures

Une injection de produit pro-inflammatoire : durée moins d'une minute. Un prélèvement sanguin sera effectué. Ce prélèvement dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant ce projet les animaux subiront une injection de produit pro-inflammatoire qui entraine une réponse inflammatoire dans l'organisme et une faible réduction de l’activité locomotrice. Un prélèvement sanguin sous anesthésie avant d’être euthanasiés.

Devenir

Les animaux seront tous mis à mort en fin d'expérience pour prélever les organes d'intérêt afin d'évaluer le niveau d'expression du gène d'intérêt.

Remplacement

Ce projet vise à valider des modifications génétiques chez la souris de gènes humains impliqués dans les systèmes : nerveux, métabolique, cardiaque et les pathologies associées. Aujourd’hui il n’existe pas d’alternative in-vivo aux modèles animaux pour étudier les systèmes biologiques humains sans mettre les individus en danger. Les souris dites « humanisées » s'avèrent être très utiles pour les tests précliniques et pour l'étude de nombreux processus biologiques humains. Le génome de la souris étant bien caractérisé et son organisme présentant de similitudes avec celui de l’Homme, en fait un modèle d’intérêt.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi effectué des analyses permettant de déterminer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 5 par groupe constitue un bon compromis entre puissance d'analyse et réduction de nombre d'animaux utilisés. Durant cette étude, nous analyserons l’expression des gènes dans les organes d'intérêt de la souris entre les groupes de différent génotype grâce à un test statistique non paramétrique.

Raffinement

Dans le cadre de ce projet nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Une surveillance quotidienne de l'état des animaux ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux seront mises en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Durant l'ensemble de la procédure, des points limites spécifiques ont été mis en place afin de s'assurer du maintien des animaux dans des conditions éthiquement acceptables et d'une réponse appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être. Le cas échéant, une couverture pharmacologique pourra être employée et adaptée en accord avec notre vétérinaire (analgésie, antiseptiques...)

Choix des espèces

La souris est un animal dont la modification génétique est aisée. Nous avons donc décidé de valider la présence de gènes humains dans ce modèle. Ce mammifère permet de fournir de nombreuses données qui pourront ensuite servir dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte soit à partir de 8 semaines, âge où le système immunitaire est mature.

36 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent un test de tolérance au glucose et un test à l'insuline avec prélèvements sanguins répétés, deux isolements de 48 heures et deux échographies sous anesthésie, sous régime enrichi en lipides, avant d'être tuées pour prélever leurs tissus. Le porteur décrit un stress d'isolement et des lésions cutanées possibles liées au sur-toilettage, et présente ces tests comme "incontournables". Il indique combiner modèles cellulaires et animaux pour étudier une protéine impliquée dans une maladie mitochondriale.

Objectifs

Dans le cadre de ce projet nous nous intéressons à une famille d’enzymes, dont un membre de la famille est responsable d’une maladie mitochondriale caractérisée par des atteintes neuromusculaires sévères. A ce jour, les causes de cette pathologie sont inconnues. Récemment, en utilisant des cellules en culture, une sous-famille unique de ces enzymes dont les membres sont très similaires à l’enzyme responsable de la pathologie mitochondriale a été mise en évidence. Cette sous famille de protéines est également impliquée dans l’activité énergétique de la mitochondrie. Dans des modèles in vitro, un mécanisme pouvant expliquer l’atteinte mitochondriale observée chez les patients a été récemment décrit. Afin de confirmer que ce mécanisme est bien à la base de la pathologie et de la régulation du métabolisme énergétique mitochondrial, nous voulons étudier le rôle d’une protéine appartenant à cette sous famille. Pour cela un modèle de souris avec cette protéine désactivée a été généré. Nous voulons ainsi étudier les effets de la suppression de cette protéine en particulier sur les fonctions physiologiques en condition normale et sous régime riche en lipides. Nos objectifs spécifiques sont donc chez 36 souris : D’analyser les effets cardiaques et métaboliques en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De mesurer les variations de la biochimie du sang en condition normale et en condition de régime riche en lipides. De réaliser une étude tissulaire en condition normale et en condition de régime riche en lipides.

Bénéfices attendus

La mitochondrie est un élément présent dans les cellules et jouant un rôle central dans plusieurs fonctions. Elles produisent l’essentiel de l’énergie nécessaire au bon fonctionnement des différents organes chez l’homme. Cette activité énergétique mitochondriale est donc cruciale et son altération entraine des maladies rares et sévères. A l’heure actuelle, plus de 120 syndromes mitochondriaux ont été décrits pour lesquels aucun traitement n’existe. Aussi, la compréhension des mécanismes régulant ces activités énergétiques mitochondriales représente une étape essentielle vers le développement d’approches thérapeutiques contre ces pathologies. Dans ce projet, nous souhaitons comprendre le rôle important joué par une protéine dans la régulation du métabolisme énergétique mitochondriale. Celle-ci fait partie d’une famille de protéines dont certains membres sont responsables de syndromes mitochondriaux et dont la fonction reste inconnue. A court terme, en comprenant le mode d’action et l’impact de notre protéine sur la mitochondrie, notre projet permettra d’établir les causes des pathologies mitochondriales associées à cette famille. A long terme, notre projet permettra d'identifier les cibles sur lesquelles agir afin d'améliorer les fonctions mitochondriales. Ainsi, une fois que nous aurons détaillé le mode d’action de cette protéine, nous souhaitons identifier des molécules actives sur celle-ci et utiliser ces molécules pour restaurer les fonctions mitochondriales dans des pathologies.

Procédures

Durant ce protocole, une cohorte de 36 animaux suivra une série de tests qui viseront à déterminer l'effet d'un régime enrichi en lipides sur les fonctions métaboliques. Pour cela, nous effectuerons un seul test de tolérance au glucose par souris, dans lequel l'animal reçoit une injection intrapéritonéale de glucose suivi de 5 prélèvements d'une goutte de sang à la queue afin de suivre sa glycémie ; tout comme peut le faire l'homme en cas de diabète. Un seul test de sensibilité à l'insuline par souris sera aussi effectué, assez similaire au précédent mais avec une injection intrapéritonéale d'insuline entrainant une réduction de la glycémie. Ce test permet de vérifier si un diabète de type I ou type II est installé chez l'animal. Ces deux tests durent environ 3 heures durant lesquelles l'animal est placé dans un tube de contention afin de prélever des gouttes de sang à plusieurs temps (5 gouttes sur la durée du test). Un test de calorimétrie permet de vérifier la consommation en oxygène des animaux et nécessite d'isoler les souris durant 48h, ce qui peut être un stress d'isolement. Ce test sera répété deux fois par souris. Néanmoins, elles retrouvent ensuite leurs groupes sociaux. L'échographie sera réalisée deux fois par souris, elle nécessite que l’animal soit sous anesthésie. La procédure dure environ 20 min par souris. Enfin, des prélèvements sanguins seront effectués en fin d’étude pour analyser des paramètres biochimiques. Ces prélèvements, un par souris, se font en quelques minutes.

Impact sur les animaux

Durant le projet, les animaux subiront un prélèvement sanguin, qui dure quelques minutes. Nous étudierons les mécanismes de régulation du glucose et la sensibilité à l'insuline. Dans ce protocole, les animaux recevront une injection d'insuline et de glucose, et subiront des prélèvements de gouttes de sang à intervalle réguliers sur une période de 3 heures, afin de suivre leur glycémie. Pour connaitre leur métabolisme énergétique, ils seront isolés pour une période de 48h. Ce test sera répété deux fois par souris. Cet isolement permet de connaitre la valeur de chaque individu et est indispensable pour pouvoir conclure sur ce paramètre. Les deux échographies se déroulent quant à elles sous anesthésie à l'isoflurane pendant toute la durée du test. Les animaux seront rasés et une crème dépilatoire hypoallergénique sera appliquée. Enfin, le régime enrichi en lipides peut entrainer la présence de lésions cutanées dues à un hyper-toilettage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin du protocole pour collecter des tissus qui seront analysés afin de déterminer l'impact de ce régime et de la mutation génétique sur les organes.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous combinons l’utilisation de modèles in vitro et d'animaux. L’utilisation des modèles animaux est limitée aux études qui ne peuvent être conduites sur les modèles in vitro. Ainsi, les tests en conditions de régime riche en lipides et les analyses biochimiques, morphologiques et structurelles des tissus sont des impératifs incontournables de notre projet qui, en l'état des connaissances et des méthodes disponibles, ne peuvent pas s'affranchir de l'utilisation d'un modèle animal. En revanche, les investigations des mécanismes cellulaires et moléculaires sont développées sur des modèles cellulaires in vitro.

Réduction

D'un point de vue général, nous réalisons une grande partie de notre projet sur des modèles cellulaires in vitro et limitons autant que possible les approches expérimentales réalisées sur l'animal. Ces dernières sont uniquement destinées à valider/confirmer l'implication des processus révélés in vitro dans le domaine physiopathologique. Pour notre projet, nous avons procédé à une réflexion pour déterminer le nombre d’animaux par groupe. Nous avons établi strictement le nombre d’animaux nécessaire incluant mâles et femelles porteurs des génotypes KO et wild-type. de plus, les groupes contrôles et expérimentaux ont un fond génétique identique. Afin de limiter l'utilisation d'animaux, nous avons opter pour une approche intégrative où les animaux sont utilisés pour différents tests et analyses. Tous les types de tissus que nous souhaitons étudiés seront prélevés sur chacun des animaux utilisés. Pris dans son ensemble, le design de notre projet permet d'optimiser au maximum la quantité d’animaux nécessaire à sa réalisation.

Raffinement

Ainsi, afin d'améliorer le bien-être animal au cours de notre étude, les besoins physiologiques des animaux seront respectés (nourriture ad libitum, cages propres, nids d'enrichissement) permettant une réduction du stress et de limiter au maximum la souffrance des animaux. Dans le cadre des procédures expérimentales réalisées, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress engendré. Ainsi, durant le prélèvement sanguin, nous réaliserons des injections de sérum physiologique tiède afin de compenser la perte hydrique. Une surveillance accrue et quotidienne de l'état des animaux, une pesée hebdomadaire ainsi que la mise en place d'un suivi régulier de l'état général des animaux sera mis en place afin de s'assurer de la bonne santé de ceux-ci. En cas de rixe entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et procéderons à des soins locaux le cas échéant. Pour limiter toute souffrance chez l'animal nous suivrons les points limites durant la procédure, si ces derniers sont atteints nous procéderons à l'arrêt de l'expérience.

Choix des espèces

Le modèle expérimental utilisé dans ce projet et le modèle murin, largement utilisé dans le contexte de modifications génétiques. La souris est un modèle établit et solide concernant l’étude des pathologies mitochondriales. En effet, ce modèle permet d'exprimer fortement les syndromes mitochondriaux incluant les atteintes de différents systèmes, l’intolérance à l’effort et les déficits neurologiques. Les animaux seront utilisés à 8 semaines, soit le début de l’âge adulte.

1 568 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le virus Oropouche puis subissent des prélèvements de sang à la queue tous les deux jours et un prélèvement final avant la mise à mort, qui sert à prélever leurs organes. Le porteur indique que l'infection peut provoquer fièvre, tremblements, prostration, troubles de la motricité et perte de poids, et que chez le hamster elle tue la moitié des animaux, les souris atteignant un score défini étant mises à mort. Il reconnaît la souris comme peu sensible à ce virus et prévoit d'utiliser des lignées à l'immunité affaiblie pour rendre l'infection possible.

Objectifs

Les Orthobunyavirus dont fait partie Oropouche sont des virus émergents très peu étudiés. Ils ont de plus la particularité de pouvoir former des virus recombinés, gagnant en sévérité ou en infectiosité. Il est alors important d’accroitre nos connaissances à leur sujet et plus particulièrement sur les mécanismes de réplication virale et d’infection. Ce projet a donc pour objectif d’améliorer les connaissances sur la pathogenèse de ce virus qui a été récemment responsable d’une épidémie en Guyane française.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une meilleure compréhension du pouvoir pathogène du virus Oropouche. Ce virus étant émergent et pouvant causer des épidémies au niveau mondial il est important de développer des moyens de préventions et traitements efficaces contre ce virus. De plus, sa capacité à se recombiner pourrait donner naissance un jour à des virus plus pathogènes ou plus infectieux. Les résultats de ces recherches, intégrés dans un projet de plus grande ampleur permettront d’ouvrir la voie au développement de traitements et moyen de préventions.

Procédures

Des prélèvements seront réalisés tous les 2 jours à la queue après une petite incision (volume de 30 ml) de J-1 à J15. Chaque prélèvement ne dure que quelques secondes. Un prélèvement final de 200 ml sera réalisé par voie rétro-mandibulaire juste avant le sacrifice (30 secondes).

Impact sur les animaux

Les animaux seront infectés sous anesthésie générale afin de réduire le stress et la douleur liés à l’inoculation. L’infection des souris par des Orthobunyavirus est encore très peu décrite car souvent non sensible. Cependant, le hamster est un modèle animal sensible à l’infection. Bien que difficile d’extrapoler les symptômes d’une espèce à l’autre, on peut s’attendre chez la souris à des symptômes similaires. On s’attend alors dans le cas d’infections légères à ce que les animaux manifestent un manque d’hygiène et d’alimentation dans les premiers jours de l’infection. En cas d’infections modérées, des symptômes plus sévères peuvent apparaitre tels que de la fièvre, des tremblements ainsi qu’un état prostré. Ceux-ci peuvent également être accompagnés de troubles de la motricité et de l’équilibre ainsi que d’une perte de poids. Enfin, il a été remarqué chez le hamster que l’infection par le virus Oropouche pouvait entrainer la mort des animaux chez la moitié des animaux, les autres ne répondant pas à l’infection.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car nous avons besoin de leurs organes pour étudier la physiopathologie du virus Oropouche par des techniques de biologie moléculaire, cellulaire et d’histologie.

Remplacement

Dans un souci de remplacement, nous envisageons dans un premier temps de tester le tropisme de ces virus sur des cellules afin d’étudier le rôle joué par leurs protéines non structurales, cependant, il deviendra indispensable d’utiliser un modèle animal afin d’étudier l’infection au niveau systémique afin de mimer l’infection par un arthropode.

Réduction

Nous envisageons de faire une première expérience sur un petit nombre d’animaux par groupe (6 animaux des deux sexes) afin de déterminer les lignées de souris qui seront les plus sensibles. Dans le cadre de la deuxième expérience, nous prévoyons d’utiliser 8 individus par groupe, soit un sous-total (par expérimentation) de 256 individus répartis en 2 cages par groupe (4 individus par cage). En supposant un effet cage de 25 %, les effectifs proposés devraient nous permettre d'obtenir, pour chaque répétition de l'expérimentation, des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 0.47 (effets forts à très forts).

Raffinement

Les animaux seront observés quotidiennement dès l’apparition d’une gêne quelconque. Nous utiliserons une grille d’évaluation de la douleur prenant en compte l’ensemble des symptômes susceptibles d’être déclarés lors de l’infection, notamment les symptômes neurologiques (grille jointe à la dap). Dès que le score atteindra 1, les animaux seront observés bi-quotidiennement. Du dietgel sera ajouté dans la cage si les animaux présentent un amaigrissement supérieur à 10% ou bien si leur mobilité diminue. Si un score égal à 2 est atteint, les animaux seront mis à mort. Des igloos en carton ou du coton seront mis à disposition dans chaque cage afin que les animaux soient dans une ambiance confortable.

Choix des espèces

La souris est un animal de choix dans le cadre de l’expérimentation animale. Bien que ce modèle soit naturellement peu sensible à l’infection par certains Orthobunyavirus, nous estimons que l’utilisation de deux modèles d’étude devraient permettre de surmonter cet obstacle. En effet, les souris issues de croisements génétiques présentent une diversité génétique qui devrait permettre d’identifier une lignée qui sera sensible à l’infection. Le recul que nous avons à ce propos dans le cadre de l’étude de la pathogénicité des arbovirus montre en effet que certaines lignées présentent une virémie et des symptômes qui se rapprochent de ceux observés chez l’homme. Si toutefois aucune lignée ne répond de façon pertinente au virus, nous utiliserons comme alternative des souris dont la réponse immunitaire innée est invalidée (souris IFNAR-/-). Ce modèle est très utilisé dans le cadre de l’étude du pouvoir pathogène de nombreux arbovirus auxquelles elles sont très sensibles. Nous privilégierons l’utilisation de souris dont la réponse à l’interféron est temporairement invalidée par injection avant infection d’anticorps anti-IFNAR. Ces souris seront donc sensibles à l’infection mais recouvreront leur réponse immunitaire, ce qui les rendra plus résistantes aux effets pathogènes plus sévères que l’on peut observer chez les souris KO IFNAR-/-. Dans une première approche, les animaux seront utilisés à l’âge de jeunes adultes de 6 semaines. Les infections avec des arbovirus chez la souris sont en général dépendantes de l’âge et les souris plus âgées sont moins sensibles que les souris jeunes. En cas d’échec de l’infection, des animaux plus jeunes (3-4 semaines) pourront être utilisés afin de vérifier si des animaux dont le système immunitaire est moins mature seraient plus permissifs à l’infection.

260 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent un entraînement forcé sur tapis roulant et sur échelle, des tests moteurs et un test de reconnaissance d'objet, puis une suspension du train arrière jusqu'à trois semaines simulant la microgravité, avec des injections intrapéritonéales, avant le prélèvement de tissus. Le porteur indique que la suspension provoque un stress et une perte de poids modérée les premières 48 heures. Il justifie l'usage animal par l'absence de modèle cellulaire des effets "corps entier" de l'impesanteur, pour une recherche à finalité spatiale et clinique.

Objectifs

Ce projet a pour objectif de développer des méthodes de prévention des effets néfastes de l’inactivité physique et de la microgravité sur la santé. Celui-ci s’intègre donc à la fois dans la recherche spatiale (astronautes) mais également dans la recherche clinique (alitement, immobilisation, opération, sédentarité…). Pour répondre à ces objectifs, 7 équipes de recherche de spécialités différentes travailleront enssemble pour évaluer l’effet des méthodes de prévention sur l’ensemble de l’organisme et plus particulièrement l’appareil locomoteur qui est fortement impacté. L’expérimentation proposée sur le modèle rongeur devra permettre de mettre en place des recommandations pour une étude clinique humaine future, et proposer des hypothèses de travail pour des recherches cliniques en lien avec la sédentarité. Ces travaux se centreront autour de trois axes principaux : 1- Évaluer l’intérêt d’une préparation physique spécifique avant un vol spatial. 2- Evaluer un assortiment de moyens de prévention du déconditionnement de l’appareil locomoteur pendant la phase d’immobilisation. 3- Evaluer l’étendue de la récupération dans les différents organes de l’appareil locomoteur induite par les moyens de prévention proposés. L’ensemble de ce projet expérimental vise donc à la fois des études scientifiques fondamentales centrées sur les différents environnements (microgravité et remise en charge), mais également l’évaluation de contremesures pour préparer les défis spatiaux de demain. Enfin, bien que ces expérimentations soient réalisées dans le cadre d’étude du domaine spatial, leurs résultats auront un impact important dans le domaine clinique sur Terre, que ce soit en rapport à l’alitement prolongé, la sédentarité, les maladies chroniques, ou le vieillissement, ainsi que sur les moyens de prévention.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de ce projet permettront à la fois d’accroitre les connaissances scientifiques en lien avec l’appareil locomoteur et la microgravité/inactivité, mais également d’évaluer des mesures concrètes pour en atténuer les effets néfastes en se basant sur de nombreux travaux antérieurs. En effet, l’inactivité est, dans l’espace mais également sur Terre dans le domaine clinique, un réèl probème en matière de santé. Ces expérimentations sont de fait à la fois une étape importante pour réaliser les objectifs de demain dans l’exploration spatiale, mais également un axe de recherche primordiale en matière de santé humaine. Ces résultats pourraient donner lieu à des recommandations importantes lors d’immobilisation, de blessure, d’alitement prolongé dans le domaine clinique, ou encore au cours du vieillissement.

Procédures

Les animaux suivront un programme d’entrainement sportif sur tapis roulant (au maximum 9 fois 30 minutes pendant 3 semaines). Cet entraînement sera qualibré de manière individuelle. Les animaux suivront un programme d’entrainement sportif sur échelle d’escalade (au maximum 9 fois 30 minutes pendant 3 semaines). Cet entraînement sera qualibré de manière individuelle à l’aide d’un test de force d’agripement et un test de retournement réalisé une fois préalablement. Les animaux réaliseront également une évaluation de coordination motrice (3 fois 5 min), une évaluation de composition corporelle (3 passages de moins de 2 minutes), et un test comportemental de reconnaissance d’objet (1 passage; 15minutes). Enfin, une partie des animaux seront suspendus selon le modèle de suspension du train arrière (7 jours ou 3 semaines) et 3 injections intra-péritonéales (5 secondes par injection) seront réalisées au cours des 3 derniers jours de suspensions respectant les volumes préconisés (200 microlitres).

Impact sur les animaux

La nuisance à laquelle vont être soumis les animaux durant l’expérimentation sera lié à l’inactivité induite par le modèle de suspension du train arrière. En effet, celui-ci peut induire du stress et durant les premières 48h une perte de poids modérée et des bouchons externes des voies uro-génitales. Cette perte de poids s’arrête ensuite. Les animaux seront aussi stréssés lors des tests de force et de l’entrainement sur tapis roulant. Les animaux auront 3 injections intra-péritonéales respectant les volumes recommandés, et induisant une douleur légère de courte durée.

Devenir

A la fin des expérimentations, les animaux sont euthanasiés pour permettre les différents prélèvements de tissus pour analyses.

Remplacement

Dans le cadre de ces expérimentations très spécifiques, il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’animaux étant donné l’absence de modèle cellulaire permettant de mimer les effets corps entier de l’impesanteur sur l’ensemble des tissus d’interêt ainsi que les effets des méthodes de prévention. De plus, ces expériementations ne peuvent pas être directement réalisées chez l’homme. L’utilisation d’animaux est donc ici une étape obligatoire mais également extrêmement enrichissante du point de vue scientifique de part les résultats très précieux qu’elle génère.

Réduction

Ces expérimentations ont été adaptées pour diminuer au maximum le nombre d’animaux utilisés au moyens de deux axes de réductions. Le premier axe consiste à centraliser les procédures de 7 équipes de recherches lors d’une unique expérimentation animale, réduisant ainsi par 7 le nombre de souris qui aurait été classiquement employées. Le deuxième axe consiste à réduire le nombre d’animaux par groupe au moyen d’analyses statistiques réalisées préalablement en vue des effets attendus (logiciel Gpower).

Raffinement

Du point de vue du raffinement, les procédures engagées durant l’expérimentation n’entraînent pas de douleurs spécifiques. Pour l’activité physiques et les tests sportifs réalisés sur tapis roulant, les animaux y sont préalablement habitués progressivement pour réduire le stress induit. L’animal est libre de cesser de courir lorsqu'il le souhaite. Pour les différentes supplémentations de molécules naturelles, celles-ci sont associées à la nourriture. Les procédures de suspension du train arrières ont été validées et optimisées, et des soins quotidiens sont réalisés pour prévenir toute complication. La température d'élevage sera de 24 à 25 degrés pour éviter le refroidissement des animaux. De plus, les souris seront suspendues par deux pour éviter l’isolement social. Chaque procédure possède également des points limites et critères d’arret stricts. Nous assureront un suivi quotidien des animaux et mesureront le poids des souris tous les 3 jours. Enfin, pour permettre les prélèvements finaux des différents tissus d’intérêt les animaux sont anesthésiés par voie gazeuse avant d’être mis à mort.

Choix des espèces

La souris Mus musculus a été privilégiée pour plusieurs raisons. Même si il existe des différences subtiles, les espèces murines rat et souris se rapprochent de l'humain en ce qui concerne le système musculosquelettique. Les souris sont par exemple utilisées lors des missions dans l'espace « Bions » pour étudier les effets de la microgravité réèlle. De très nombreuses études ont employé ce modèle et témoignent de sa fiabilité. Les animaux seront utilisés entre 3 et 7 mois en fonction de leurs groupes. Cette tranche d'âge permet de travailler avec des animaux adultes mais non vieillissant, ce qui nous est indispensable vis à vis des différentes analyses (exemple : analyses osseuses) réalisées par la suite.