Multisystémique
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude par imagerie moléculaire du rôle de l’inflammation intestinale dans l’accident vasculaire cérébral chez la souris Mus musculus – Etude pilote
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système nerveux
À J1, une colite est déclenchée chez la moitié des 120 souris par un produit dans l'eau de boisson, à J5 vient une IRM sous anesthésie, à J6 un AVC provoqué par injection de thrombine lors d'une chirurgie d'une à deux heures, puis deux IRM à J7 et J13. Ces souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, avec diarrhées, saignements rectaux et faiblesse d'une patte. L'étude déclare n'être qu'un pilote, destiné à calibrer une expérience plus large sur les liens entre inflammation intestinale et AVC. Toutes sont tuées à J13 par exsanguination pour prélever cerveau et intestin.
Objectifs
Les accidents vasculaires cérébraux (AVC) constituent un enjeu majeur de santé publique. Le traitement de l’AVC ischémique repose actuellement sur la thrombolyse et/ou la thrombectomie. Cependant, ces interventions ne sont pas toujours réalisables et ne garantissent pas une récupération fonctionnelle complète. Cela justifie le développement de nouveaux outils pronostiques et thérapeutiques. Le rôle de l’inflammation intestinale dans la pathophysiologie de l’AVC suscite un intérêt croissant. Plusieurs travaux récents mettent en évidence des interactions étroites entre inflammation intestinale et neuroinflammation post-AVC. Dans ce contexte, l’objectif principal de ce projet pilote est de réaliser des expérimentations préliminaires visant à évaluer l’impact d’un état inflammatoire intestinal élevé sur la sévérité de l’AVC dans un modèle murin. Les données obtenues permettront d’optimiser les protocoles ultérieurs, en fournissant notamment les éléments statistiques nécessaires à une estimation rigoureuse du nombre d’animaux requis, dans une logique de réduction et de raffinement conformément aux principes des 3R. Ces expérimentations préliminaires aideront également à identifier d’éventuelles contraintes techniques ou biologiques, afin d’ajuster au mieux les procédures et d’améliorer le bien-être animal.
Bénéfices attendus
Les résultats obtenus dans le cadre de cette étude pilote constitueront une base expérimentale pour une étude de plus grande envergure, destinée à approfondir l’analyse des interactions entre l’inflammation intestinale et la neuroinflammation post-AVC.
Procédures
Les animaux seront soumis à une séquence expérimentale unique comprenant l’induction d’une inflammation intestinale, des examens IRM, l’induction d’un AVC thromboembolique et la mise à mort pour analyses histologiques. 1. Induction de l’inflammation intestinale (J1–J5) Chez la moitié des animaux (n = 60), une inflammation intestinale modérée sera induite par administration de DSS 2 % dans l’eau de boisson pendant 5 jours. Cette étape ne nécessite pas d’anesthésie. Un suivi clinique quotidien sera assuré. 2. IRM moléculaire (J5) Tous les animaux (n = 120) seront anesthésiés à l’isoflurane (2 % dans O₂/N₂O 30/70) pour un examen IRM de 30 à 45 minutes. Un cathéter sera inséré dans la veine caudale pour l’injection de MPIO, puis retiré en fin de séance. Une analgésie locale (lidocaïne/xylocaïne) sera appliquée au point d’insertion. 3. Induction du modèle d’AVC (J6) Sous anesthésie générale (isoflurane 2 % dans O₂/N₂O 30/70) et analgésie systémique (buprénorphine 0,1 mg/kg s.c. en prémédication), une chirurgie stéréotaxique sera réalisée pour induire une ischémie focale par injection de thrombine dans l’artère cérébrale moyenne. La procédure dure 60 à 90 minutes. Les animaux recevront ensuite soit du tPA (10 mg/kg i.v.), soit une solution saline. 4. IRM post-AVC (J7 et J13) Deux nouveaux examens IRM seront réalisés sous les mêmes modalités anesthésiques (isoflurane 2 %, durée 30–45 min) afin d’évaluer le volume lésionnel, la neuroinflammation et l’inflammation intestinale. 5. Mise à mort et prélèvements (J13) À l’issue du dernier examen, les animaux encore sous anesthésie générale seront mis à mort par exsanguination induite par perfusion intracardiaque de sérum physiologique (isoflurane 5 % en O₂/N₂O 30/70 ; fentanyl 0,3 mg/kg i.p. en prémédication). Les organes d’intérêt (cerveau, intestin) seront prélevés immédiatement pour analyses histologiques.
Impact sur les animaux
Le modèle d’induction d’une inflammation intestinale par traitement au DSS peut entraîner une perte de poids, des diarrhées et des saignements rectaux. Ces symptômes seront suivis avec attention grâce à l’utilisation quotidienne d’échelles de scores cliniques déjà établies, permettant un ajustement rapide des soins si nécessaire. Nos travaux antérieurs ont de plus montré que la dose de 2 % utilisée dans cette étude n’entraîne que des signes modérés de colite tout en induisant une inflammation intestinale suffisante pour atteindre les objectifs scientifiques du projet. Concernant le modèle d’AVC, certains animaux peuvent présenter des signes transitoires de douleur dans les heures suivant la chirurgie, ainsi qu’un affaiblissement temporaire de la patte avant gauche, correspondant à la zone cérébrale lésée, qui disparaît généralement au cours de la première semaine. Afin de limiter au maximum toute forme d’inconfort ou de souffrance, des analgésiques locaux seront appliqués au niveau du site chirurgical avant l’intervention, et des analgésiques systémiques seront administrés avant et après l’intervention. La surveillance quotidienne des animaux, associée à ces conditions environnementales contrôlées et à la prise en charge analgésique, permettra de réduire autant que possible les nuisances et la douleur liées aux procédures expérimentales.
Devenir
À l’issue de la procédure expérimentale, l’ensemble des animaux (n = 120) seront mis à mort afin de permettre la réalisation d’analyses histologiques indispensables à la compréhension des mécanismes étudiés. Ces prélèvements visent notamment à confirmer et compléter les observations issues des analyses d’imagerie in vivo (IRM), en permettant une évaluation fine des lésions cérébrales, de la neuroinflammation et de l’inflammation intestinale. Les échantillons obtenus fourniront également les données quantitatives nécessaires à l’optimisation et à la standardisation des protocoles ultérieurs. La mise à mort interviendra à la fin de la procédure. La mise à mort de tous les animaux se justifie par la nécessité scientifique de disposer de tissus parfaitement préservés pour les analyses post-mortem et par le souci constant de limiter toute utilisation et toute souffrance inutile, conformément aux principes de remplacement, de réduction et de raffinement (3R).
Remplacement
Les modèles animaux constituent à ce jour les outils expérimentaux les plus pertinents pour répondre à la question scientifique posée. En effet, aucun modèle de substitution disponible actuellement ne permet de reproduire la dimension multi-organe de la pathophysiologie de l’AVC étudiée ici et, donc d’apporter une réponse adéquate à la problématique susmentionnée.
Réduction
L’utilisation d’animaux à des fins scientifiques ne pouvant être ici exclue, nous veillerons à en limiter le recours au strict nécessaire. La présente demande d’autorisation de projet couvre une étude pilote, dont les résultats permettront de mieux anticiper et d’optimiser l’utilisation d’animaux lors des études ultérieures. Nonobstant le caractère préliminaire de cette étude, nous nous attachons à réduire le nombre d’animaux employés, tout en conservant un effectif suffisant pour assurer la robustesse et la validité des analyses. Par ailleurs, l’utilisation de méthodologies d’imagerie in vivo autorise le suivi longitudinal des mêmes individus et contribue, de fait, à la réduction du nombre total d’animaux nécessaires. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires tient également compte des aspects méthodologiques de la procédure expérimentale, notamment l’habileté et l’expérience de l’expérimentateur, ainsi que des risques de perte inhérents à la conduite de la procédure.
Raffinement
Au cours de la procédure expérimentale, une attention particulière sera portée au bien-être des animaux. La procédure inclut des modèles et des modalités d’imagerie susceptibles d’entraîner certaines nuisances et/ou un stress. Les animaux feront donc l’objet d’un suivi quotidien assuré par du personnel qualifié. Les symptômes intestinaux induits par le traitement au DSS seront évalués quotidiennement à l’aide d’une échelle de score spécifique, permettant d’anticiper la persistance ou l’aggravation des nuisances. Des protocoles validés d’anesthésie et d’analgésie seront également mis en œuvre, notamment lors de l’induction du modèle d’AVC et des examens IRM, afin de limiter au maximum toute forme de douleur, de détresse ou d’angoisse liées aux interventions. L’ensemble des manipulations sera réalisé par du personnel expérimenté et formé aux procédures chirurgicales et aux soins post-opératoires. Les animaux seront hébergés en petits groupes sociaux (n=5) dans des cages standard, dans des conditions conformes aux normes européennes en vigueur (température stabilisée à 21 °C, hygrométrie de 55 %, intensité lumineuse de 100 lux, et cycle lumière/obscurité de 12 h/12 h), avec du matériel d’enrichissement et un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) a été choisie comme espèce expérimentale pour ce projet en raison de sa pertinence scientifique et de sa faisabilité technique. La physiologie murine, notamment en ce qui concerne le système immunitaire intestinal et la réponse neuroinflammatoire post-AVC, présente des similitudes établies avec celle de l’humain, permettant ainsi d’étudier de manière appropriée les interactions entre inflammation intestinale et sévérité de l’AVC. De plus, des modèles murins bien caractérisés existent à la fois pour l’induction d’une colite expérimentale et pour l’ischémie cérébrale thromboembolique focale, avec des protocoles reproductibles et validés à l’échelle internationale. Enfin, aucune alternative in vitro ou modèle in silico ne permet aujourd’hui de reproduire de manière intégrée les interactions multi-organes dans le contexte post-AVC, rendant l’utilisation de la souris indispensable pour répondre aux objectifs scientifiques de ce projet. L’AVC est une pathologie qui touche principalement l’adulte, le plus souvent au-delà de 65 ans, mais son incidence augmente également chez l’adulte jeune. Pour reproduire au mieux la pathophysiologie humaine, les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8 à 12 semaines), stade où la maturation physiologique et la réponse neurovasculaire sont comparables à celles de l’adulte humain.
Etude de normalité chez la souris génétiquement modifiée pour un gène d’interêt
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
900 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Chacune subit un prélèvement de sang et une échocardiographie de vingt minutes sous anesthésie gazeuse, avant que ses organes ne soient prélevés. L'objet déclaré est de vérifier que ces nouvelles lignées se développent et vivent normalement. Neuf cents individus sont ainsi tués pour contrôler la normalité de lignées d'élevage, sans que l'effectif retenu soit justifié dans le texte.
Objectifs
Ce projet vise à mieux caractériser de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées afin de vérifier qu’elles se développent et vivent normalement. Il permet également de repérer d’éventuels effets inattendus liés à la modification génétique, susceptibles de fausser les résultats de recherches futures.
Bénéfices attendus
La réalisation d’un protocole de normalité lors de la création d’une nouvelle lignée de souris présente plusieurs intérêts majeurs, à la fois scientifiques et éthiques. Il permet de comprendre le phénotype de base et d’assurer la validité scientifique des études qui suivront, tout en réduisant le nombre d’animaux nécessaires pour les recherches futures. Ce protocole permettra également de mettre en place des points de surveillance clairs pour les études ultérieures.
Procédures
Dans le cadre de cette procédure, un prélèvement de sang sera réalisé sur l'ensemble des animaux. Ce geste dure moins d'une minute. Une échocardiographie sera réalisée par animal, sous anesthésie gazeuse, chacune durant environ 20 minute.
Impact sur les animaux
L’animal va ressentir un stress lors de la contention et une douleur légère lors de l’insertion de l’aiguille pour la prise de sang. L'animal aura une anesthésie gazeuse pouvant induire une hypothermie.
Devenir
En fin de protocole, tous les animaux sont mis à mort afin de procéder à la collecte des organes afin de les analyser.
Remplacement
Le but de ce projet est de réaliser des études de normalité sur de nouvelles lignées de souris génétiquement modifiées afin d’identifier potentiellement des effets inattendus de la modification génique qui pourraient biaiser toutes les études ultérieures. Ces études ne sont modélisables que dans un organisme complet, capable d’exprimer l’ensemble des fonctions physiologiques de régulation. Il n’existe actuellement pas de méthode alternative pour reproduire les analyses prévues dans ce projet. Par ailleurs, seule une approche sur un mammifère permet une première collecte de données concernant les mécanismes physiologiques complexes impliqués dans la création de nouvelles lignées de souris. Ces études de normalité fourniront de nombreuses données pouvant ensuite être utilisées dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe expérimental a été déterminé au fur et à mesure de notre expérience. Nous avons ainsi réalisé des analyses permettant d’évaluer la puissance statistique des paramètres mesurés et avons conclu que cet effectif de 9 animaux par groupe constitue un bon compromis entre puissance d’analyse et réduction du nombre d’animaux utilisés. Durant cette étude, nous générerons des données qui seront analysées à l’aide de tests statistiques. Nous avons également conçu notre protocole de manière à utiliser une seule cohorte d’animaux, qui suivra un ensemble de tests, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à notre problématique scientifique.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Un suivi régulier de leur état général sera mis en place pour garantir leur bonne santé et nous permettra d’évaluer l’atteinte de points limites, pouvant entraîner, à terme, l’euthanasie de l’animal afin d’éviter toute souffrance. Les animaux seront maintenus en groupes dans des conditions d’animalerie optimales, avec un accès illimité à la nourriture, à l’eau et à un environnement enrichi (nids en quantité suffisante, bâtons et balles à ronger). En cas de douleur, un antalgique pourra être administré conformément aux recommandations vétérinaires. Les animaux seront pesés et observés chaque semaine, en plus du suivi quotidien habituel. Lors du prélèvement sanguin, le volume prélevé sera compensé par l’injection de sérum physiologique.
Choix des espèces
La souris est un animal dont la modification génétique est aisée, et nous disposons de modèles d’intérêt porteurs de modifications génétiques sur les gènes étudiés. Par ailleurs, ce mammifère permet une première approche informative des mécanismes physiologiques, fournissant de nombreuses données pouvant ensuite être utilisées dans une approche translationnelle afin de mieux comprendre la physiologie humaine. Les animaux débuteront leur protocole en tant que jeunes adultes, à partir de 6 semaines. À ce stade, les différents systèmes de l’organisme sont matures.
Etude pour comprendre le rôle d’une protéine nucléaire dans la carcinogénèse dans le cancer mammaire, le mélanome et le cancer colorectal, et son évaluation comme cible thérapeutique potentielle.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
2481 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune pouvant recevoir une injection d'agent mutagène, une greffe de cellules cancéreuses dans la rate ou la paroi digestive, jusqu'à cinq prélèvements de sang sur quarante-deux jours et un produit qui provoque une inflammation du côlon. Les procédures sont classées au niveau de souffrance modéré. Le porteur signale des diarrhées, une perte de poids d'environ 10 % et des tumeurs pouvant devenir irritantes. L'ensemble vise à décrire le rôle d'une protéine nucléaire dans plusieurs cancers, sans qu'aucun bénéfice thérapeutique ne soit à ce stade autre chose qu'une preuve de concept.
Objectifs
Malgré des avancées dans la prise en charge des patients, les cancers restent la première cause de mortalité prématurée. Ce projet a pour but de décrypter les rôles dans les cancers d’une protéine et à apporter une preuve de concept pour son ciblage thérapeutique. Les cellules cancéreuses doivent s’adapter pour survivre dans un environnement en dehors de leur tissu d’origine. Interférer avec leur capacité d’adaptation, présente une opportunité thérapeutique potentielle. Ceci repose sur la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents. Nos travaux récents suggèrent que notre protéine d’intérêt en est un élément clé. Nos études précédentes ont démontré qu’elle facilite plusieurs étapes de la carcinogénèse, et pourrait représenter une nouvelle classe de cible thérapeutique. Il est nécessaire de mieux comprendre ses fonctions normales et son rôle dans des cancers différents, et tester les effets de son élimination. Notre projet, qui sera réalisé chez la souris, comporte 4 volets. Nous allons : 1) Déterminer si l’élimination du gène chez la souris interfère avec (a) l’équilibre du système immunitaire, comme suggéré dans la littérature scientifique; (b) le vieillissement (un facteur de risque dans les cancers); (c) la tumorigénèse intestinale, induite de différentes façons. 2) Déterminer si l’ablation du gène directement dans les cellules cancéreuses affecte la tumorigénèse et les réponses aux traitements (chimiothérapie ou immunothérapie) dans trois modèles de cancers différents: mélanome, cancers du sein et colorectal. 3) Identifier des protéines partenaires qui affectent aussi la tumorigénèse. 4) Apporter une preuve de concept thérapeutique via une molécule qui permet d’induire la destruction d’une protéine génétiquement modifiée. A terme, ce projet pourrait permettre de développer des nouvelles stratégies thérapeutiques contre les cancers.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre comment les cellules cancéreuses s’adaptent à leur environnement, aux réponses immunitaires anti-tumorales et aux traitements, et pourrait à terme permettre le développement de nouvelles thérapies.
Procédures
Les interventions sur animaux vigiles prévues sont : 1) des injections . Celles-ci seront uniques, pour injecter un agent mutagène afin d’initier la tumorigénèse, un médicament qui agit sur des cellules cancéreuses, ou un agent qui induit la perte transitoire des cellules immunitaires. Elles durent environ 5 secondes. 2) des piqûres pour prélèvement sanguins. Celles-ci seront effectuées un total de 5 fois sur 42 jours, espacés d’au moins une semaine. Elles durent environ 1 seconde. Les procédures chirurgicales prévues sont uniques, et se font sous anesthésie général. Elles consistent en la greffe des cellules soit dans la rate, soit dans la paroi du tube digestif. La procédure dure environ un quart d’heure.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sont: 1) L’inflammation intestinale provoquée par la prise dans l’eau de boisson d’un produit qui induit une inflammation transitoire dans le colon. Ceci peut provoquer des diarrhées et induit également une perte de poids d’environ 10% entre les jours 6 et 9 de la procédure. Ensuite les souris reprennent très vite du poids pour revenir à leur poids initial en 3-4 jours. 2) La greffe de cellules sous la peau. Il est possible que les tumeurs, qui généralement ne gênent pas les animaux, deviennent irritantes. Si c’est le cas nous appliquerons des crèmes cicatrisantes et anti-douleur aux animaux concernés. 3) Pour les animaux greffés dans la rate ou dans la paroi du tube digestif, la chirurgie peut entraîner de la douleur ou de l’inconfort liés à l’incision et à la manipulation des organes internes, ainsi que des complications possibles telles qu’une infection, un saignement ou une inflammation locale. Les injections dans la rate peuvent parfois provoquer des lésions ou hémorragies internes, tandis que les injections dans le tube digestif peuvent fragiliser l’intestin et entraîner une infection abdominale ou des troubles digestifs. Enfin, si la suture est arrachée avant cicatrisation, il pourrait y avoir une plaie non-fermée et/ou infectée. Ces souris seront surveillées quotidiennement pour détecter des signes précoces de mal être (pelage non nettoyé, manque de vivacité, perte de poids supérieure à 10%, sur-vascularisation des tumeurs, mauvaise cicatrisation des sutures). Les animaux montrant l’un de ces signes seront suivis quotidiennement et évalués selon une échelle standard de la nuisance afin de prévoir des adaptations, et la mise à mort de l’animal sera effectuée si la nuisance est excessive.
Devenir
Tous les animaux utilisés dans le projet seront mis à mort pour prélèvement d’échantillons.
Remplacement
Un large travail en amont pour étudier les rôles cellulaires de la protéine d’intérêt a préalablement été réalisé dans les cellules en culture. Il n’existe aucune méthode alternative au recours aux animaux pour suivre son éventuel rôle dans la production cellules sanguines, le vieillissement et la tumorigénèse.
Réduction
Nos études précédentes permettent d’estimer avec précision le nombre de souris nécessaires pour générer des données statistiquement robustes. Pour chaque procédure, une étude statistique préalable a été réalisée afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Notre pratique régulière nous permet de réduire au maximum le temps de contention et d’injection. Pour minimiser la douleur de la piqûre, l’aiguille utilisée sera très fine. Pour les prélèvements sanguins, nous utiliserons des lancettes qui possèdent une pointe fine pour une pénétration sans douleur et permettent une collecte de sang facilitée et une cicatrisation rapide. Les cages restent sous surveillance 20 minutes après toute injection pour détecter les éventuels signes de douleurs. Les animaux seront pesés une fois par semaine. Un anesthésique et un analgésique seront utilisées lors des chirurgies pour réduire la douleur. En post-chirurgie de la nourriture et de l'eau gélifiée seront posé à même le sol afin de leur permettre de se nourrir facilement. Enfin, la comparaison des observations quotidiennes des animaux avec une échelle de nuisance pré-établie permettra de prendre des décisions objectives pour soigner les animaux ou, le cas échéant, leur euthanasie si la souffrance est excessive.
Choix des espèces
Les lignées cellulaires de cancer de souris que nous avons choisi reproduisent au mieux les cancers humains. Les animaux génétiquement modifiés pour le gène de Ki-existent uniquement chez la souris, et permettent d’analyser les rôles physio-pathologiques de Ki-67. Les animaux seront utilisés à partir de 2 mois d'âge selon les protocoles établis dans la littérature, lorsqu’ils auront atteint un poids minimum de 20g. Cet âge tient compte de la maturité sexuelle nettement dépassée pour les animaux, compatible avec la description des âges des patients atteints de cancer du sein, colorectal ou mélanome.
Evaluation des bienfaits pour la santé d’un aliment à base de féverole fermentée dans un modèle pré-clinique de souris sous régime riche en gras et en sucre.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système gastrointestinal
76 souris mâles vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement de sang intracardiaque et de tissus. Pendant douze semaines, elles reçoivent des régimes riches en gras et en sucre, des prélèvements sanguins répétés à l'entaille de la queue, des gavages de glucose et de lipides et des injections d'insuline et d'héparine. Le porteur note que les prises de sang répétées sur douze semaines peuvent générer un stress modéré malgré l'espacement des tests. L'étude cherche à mesurer l'effet d'une féverole fermentée sur le métabolisme et le microbiote, et n'inclut que des mâles.
Objectifs
Ce travail s’inscrit dans une démarche globale d’exploration des bénéfices potentiels de la substitution partielle de protéines animales par des protéines végétales fermentées, dans le cadre d'un programme qui promeut le développement et la valorisation des protéines végétales dans l’alimentation humaine. La féverole (FB) (Vicia faba) est une légumineuse cultivée en Europe et reconnue pour sa forte teneur en protéines (25–30 %). Elle représente une piste majeure pour diversifier les sources protéiques et réduire la dépendance aux protéines animales dans un contexte de transition agroécologique. Sur le plan nutritionnel, elle est riche en acides aminés essentiels, en fibres fermentescibles et en composés bioactifs. Toutefois, la présence de facteurs antinutritionnels peut limiter sa digestibilité. La fermentation lactique des concentrats de féverole constitue une approche prometteuse pour améliorer ses qualités nutritionnelles en augmentant la digestibilité, en réduisant les composés antinutritionnels et en modulant favorablement les populations bactériennes intestinales. Dans ce contexte, ce projet vise à déterminer dans quelle mesure la substitution d’une partie des protéines animales par des protéines de (FB) fermentées peut influencer la santé cardio-métabolique et les composition/fonction du microbiote intestinal. L’étude des effets métaboliques d’une consommation de concentrats protéiques fermentés chez la souris après le sevrage, permettra d’évaluer l’impact de différents régimes (protéines animales, FB non fermentée, FB fermentée) sur la croissance, le métabolisme lipidique, la tolérance au glucose, l’inflammation de bas grade ainsi que la santé intestinale et la composition du microbiote. Des approches métabolomiques et transcriptomiques permettront d’identifier les voies biologiques modulées par ces régimes. L’impact de ces régimes sur le microbiote intestinal sera analysé en caractérisant sa composition taxonomique et fonctionnelle. Nous rechercherons si la fermentation des protéines de FB modifie favorablement la structure et les fonctions microbiennes intestinales. Ce projet vise à apporter des connaissances nouvelles sur le rôle d’ingrédients fermentés issus de légumineuses dans la prévention des pathologies métaboliques, sur les mécanismes impliquant le microbiote intestinal, et sur le potentiel de leur intégration dans l’alimentation humaine dans un objectif de santé publique.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à générer des connaissances essentielles sur l’impact de protéines végétales fermentées issues de la féverole (Vicia faba L.) sur la santé cardio-métabolique d’un mammifére et sur son microbiote intestinal. Les résultats attendus présentent un double intérêt, à la fois scientifique et sociétal. Ce projet permettra d’améliorer la compréhension des effets des protéines végétales fermentées sur la santé cardio-métabolique, en évaluant leur impact sur le métabolisme glucidique et lipidique ainsi que sur l’inflammation de bas grade. Il contribuera également à identifier des signatures métaboliques et microbiennes associées aux régimes à base de féverole, offrant de nouveaux biomarqueurs pour les recherches futures. Les résultats soutiendront le développement d’aliments plus durables et plus sains, en cohérence avec les objectifs du programme scientifique, et pourraient contribuer à la prévention des pathologies métaboliques chez l’humain.
Procédures
Des prélèvements sanguins seront réalisés les semaine 1, semaine 6, semaine 9, semaine 10, semaine 11 et semaine 12 du protocole sur animal vigile pour effectuer les tests de tolérance au glucose et aux lipides. Aprés administration des solutions (glucose, lipide) par biberonage ou gavage, des préevements sanguins seront effectués pour des dosages. Ils sont effectués par incision superficielle de l’extrémité de la queue, après désinfection et application préalable de lidocaïne et sont réalisés à 1 semaine d’intervalle minimum. Chaque goutte de sang correspond à un volume d’environ 5µL et le recueil ne dépassera pas 70µL par session sauf pour le test de tolérance aux lipides où le volume devra être de 180 µL au total. L’hémostase au niveau de la queue sera assurée par compression locale pendant 60 secondes à chaque prélèvement. Seulement en cas de nécrose de la queue, le prélèvement de sang sera réalisé par ponction de la veine caudale latérale après réchauffement de la queue de la souris sur un pad chauffant, ou bien un prélèvement dans la veine faciale submandibullaire.
Impact sur les animaux
Pour les souris incluses dans ce projet, les nuisances induites par la procédure seront limitées aux manipulations pour l’administration de lipide par gavage, de glucose par gavage ou biberonage, l’injection d’insuline, l’injection d’héparine, les prises de poids, les prélèvements sanguins ainsi que la mise à mort des animaux. Les prélèvements de sang réalisés à l’extrémité de la queue peuvent provoquer une gêne passagère, un stress léger et une douleur brève au moment de l’incision. Le test fonctionnel de tolérance au glucose implique l’administration d’une solution de glucose par biberonnage volontaire des souris ou bien par gavage gastrique, pouvant générer un stress transitoire lié à la contention et à la manipulation, de courte durée. Il en est de même pour le test fonctionnel de tolérance aux lipides qui implique un gavage en contention douce de l’animal, provoquant ainsi un stress transitoire. L’injection intrapéritonéale d’insuline générera un inconfort transitoire lié à la manipulation et à la procédure invasive. L’injection unique d’héparine en fin de protocole est également susceptible d'entraîner une gêne momentanée. L’ensemble de ces effets indésirables est attendu comme léger à modéré, transitoire, et limité par des pratiques de raffinement (contention douce, personnel formé, surveillance des animaux, arrêt anticipé en cas de signe clinique anormal). Cependant les prises de sang répétees sur la durée de 12 semaines d'expérimentation, bien que espacées d'au moins 1 semaine entre 2 tests peut générer un stress modéré.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l’étude afin de permettre la réalisation des analyses biologiques finales sur prélèvements de sang intracardique et de tissus, indispensables aux objectifs scientifiques du projet. Aucun animal n’est maintenu en vie à la fin du protocole.
Remplacement
Le recours au modèle murin est indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les interactions entre alimentation, métabolisme, microbiote intestinal et inflammation impliquent des mécanismes physiologiques complexes qui ne peuvent être reproduits ni par des modèles in vitro, ni par des simulations in silico. Les paramètres étudiés (tolérance au glucose, sensibilité à l’insuline, régulation lipidique, réponses inflammatoires systémiques, modifications du microbiote) nécessitent un organisme entier dans lequel les systèmes digestif, immunitaire et métabolique et microbien, interagissent. Aucun modèle alternatif ne permet aujourd’hui de refléter fidèlement cette intégration physiologique. Le recours aux animaux est donc justifié scientifiquement et constitue la seule approche pertinente pour répondre à la question posée.
Réduction
Le nombre d’animaux a été déterminé afin d’obtenir une puissance statistique suffisante tout en respectant l’objectif de minimiser l’utilisation d’animaux. Une analyse de puissance satistiques indique qu’un effectif théorique de 12 animaux par groupe serait nécessaire. Nous choisissons d’utiliser 14 animaux par groupe, cet effectif correspond au standard utilisé dans l’unité pour les études nutritionnelles et métaboliques, où il permet régulièrement d’obtenir des résultats robustes malgré la variabilité biologique qui est relativement faible pour des animaux consanguins. Par ailleurs, toutes les mesures physiologiques (poids, prise alimentaire, glycémie, insulinémie, prélèvements sanguins, collectes fécales) sont réalisées longitudinalement sur les mêmes individus, ce qui maximise la quantité de données obtenues par animal et évite la constitution de groupes supplémentaires. Pour tester l'appétit des souris (procédure 1) nous utilisons un effectif minimal (6 animaux) puisque le but est juste de vérifier que les animaux mangent et ne perdent pas de poids. Ainsi, le design expérimental adopté permet de réduire le nombre d’animaux au strict nécessaire, tout en garantissant la validité et la robustesse des résultats. Nous ne testerons les effets des régimes que sur des souris de sexe mâle.
Raffinement
Les procédures ont été conçues pour limiter au maximum le stress et la douleur des animaux. Les manipulations (pesées, collecte fécale, distribution des aliments) sont non invasives et réalisées avec une contention minimale, rapide mais sans brusquerie, par un personnel compétent et entraîné. Le stress généré par la pesée des animaux et des prélèvements sanguins seront limités du fait de leur mise en oeuvre dans le respect de la charte nationale sur l’éthique de l’expérimentation animale et des recommandations relatives aux volumes de sang prélevés. Les tests métaboliques (OGTT, ITT, OFTT) sont effectués par du personnel expérimenté, avec des jeûnes courts (4h à 12h) pour réduire le stress. Les animaux sont hébergés par 2 dans des cages enrichies à l’aide de matériau cellulosique pour le nid et de tunnels et font l’objet d’une surveillance quotidienne. L’absence de nuisance durable sur le bien-être animal sera néanmoins vérifiée par observation des animaux lors des visites qui seront effectuées quotidiennement et les observations seront recueillies dans un fichier de suivi des souris (Annexe 1). Tout animal présentant une perte de poids supérieure à 20 %, une léthargie marquée, un refus persistant de s’alimenter, une respiration anormale ou un comportement anormalement agressif persistant sera immédiatement retiré du protocole en accord avec le resposnable SBEA. Toute souffrance est anticipée par des points limites stricts (Annexe 2) ce qui conditionnera les éventuelles décisions d’administration d’analgésique sous-cutané dans le cas d’observation de signes attestant d’une souffrance ou si score de point limite supérieur à 22 (Annexe 2) a mise à mort sera proposée par le responsable SBEA et réalisée sous anesthésie générale profonde, garantissant l’absence de douleur.
Choix des espèces
Le modèle murin C57BL/6J est une lignée de souris est largement utilisé en recherche métabolique et nutritionnelle car il développe de manière reproductible une obésité, une altération de la tolérance au glucose, ainsi qu’une résistance à l’insuline lorsqu’il est exposé à un régime riche en sucre et graisse. Par ailleurs, le microbiote intestinal de la souris est l’un des plus étudiés en recherche préclinique, avec des signatures microbiennes bien référencées, ce qui en fait un modèle pertinent pour examiner les interactions nutrition–microbiote. Aucun modèle in vitro, ex vivo ou alternatif ne permet actuellement de reproduire l’ensemble des interactions physiologique entre digestion, microbiote, immunité et métabolisme. Ce choix est donc scientifiquement justifié, cohérent avec les standards internationaux en nutrition/microbiote, et indispensable pour répondre aux objectifs du projet. Les animaux à leur arrivée à l’animalerie auront 28 jours. À cet âge, les souris sont pleinement autonomes : elles ont achevé la transition alimentaire vers le solide, régulent correctement leur température corporelle et ne dépendent plus des soins maternels. A 35 jours de vie nous leur apporterons les différents régimes alimentaires à tester. A cet âge la croissance somatique des souris est presque stable et leur poids proche du plateau physiologique. Les régimes seront appliqués pendant 12 semaines. Les variations pondérales que nous observerons au cours du protocole reflèteront essentiellement des modifications de la composition corporelle — notamment l’accumulation de masse grasse induite par les différents régimes — et non la croissance physiologique normale des animaux. Ce stade post-sevrage avancé constitue également une période pertinente pour étudier la maturation du microbiote intestinal, qui est suffisamment structuré pour permettre l’analyse des interactions nutrition–microbiote, tout en restant sensible aux modifications alimentaires. Par ailleurs, les tests métaboliques tels que tolérance aux sucres et aux ainsi que les suivis physiologiques (poids, mesures des lipides plasmatiques) présentent à cet âge une fiabilité et une reproductibilité reconnues. L’utilisation d’animaux plus âgés ne permettrait pas d’évaluer l’impact des régimes durant les fenêtres critiques de maturation métabolique, tandis que l’utilisation d’animaux plus jeunes exposerait inutilement à des contraintes supplémentaires et obligerait à prendre en compte la croissance.
Rôle de l’interleukine-33 dans la fibrose intestinale chez la Souris
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système gastrointestinal
Rendues malades par une colite chimique chronique, une partie des 386 souris subit une hypersensibilité viscérale et une perte de poids qualifiées de sévères. Elles reçoivent aussi une déplétion du microbiote par antibiotiques puis un transfert par gavage quotidien pendant sept jours, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à sévère, toutes tuées à l'issue. Pour les colites induites chimiquement, l'usage décrit par le porteur est de ne donner aucun analgésique, ces molécules risquant d'interférer avec l'inflammation étudiée. L'étude vise l'interleukine-33 comme cible contre la fibrose intestinale, la souffrance sévère de la colite étant assumée sans traitement de la douleur.
Objectifs
Les maladies inflammatoires chroniques de l’intestin regroupent principalement la maladie de Crohn et la rectocolite hémorragique. Ces maladies se caractérisent par la récurrence de poussées inflammatoires, entrecoupées de phases de rémission. Une complication fréquente de ces maladies est la fibrose intestinale. Celle-ci se caractérise par un épaississement de la paroi intestinale lié à une réparation tissulaire chronique. Cela peut conduire à un rétrécissement de la lumière intestinale. Aujourd’hui, aucun traitement spécifique ne permet de prévenir ou d’inhiber le développement de la fibrose intestinale, ce qui conduit les patients à des interventions chirurgicales, d’où l’importance de trouver de nouvelles cibles thérapeutiques pour prévenir ou inhiber la fibrose intestinale. Nous avons décidé de cibler l’interleukine-33. L’interleukine-33 est une cytokine dont les taux sont plus élevés chez les patients atteints de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Elle est produite dans des cellules clés dans le développement de la fibrose intestinale comme les fibroblastes, les cellules musculaires lisses, les cellules épithéliales et endothéliales. De plus, des bactéries pathogènes sont retrouvées dans la muqueuse intestinale des patients atteints de la maladie de Crohn et contribuent à l’inflammation. La colonisation par ces bactéries dans des modèles précliniques induit de la fibrose intestinale et implique l’interleukine-33. Comme de plus en plus d’éléments suggèrent le rôle possible du microbiote intestinal ou de ses métabolites dans le développement de la fibrose intestinale, nous souhaitons savoir si les bactéries ou certains de leurs métabolites peuvent influencer la fibrose intestinale via la voie de l’interleukine-33. De plus, l’interleukine-33 est impliquée dans le développement de fibroses extra-intestinales.
Bénéfices attendus
Même si des progrès thérapeutiques notables ont été réalisés dans le traitement des maladies inflammatoires chroniques de l’intestin, il n’existe pas de traitement préventif ou thérapeutique contre le développement de la fibrose intestinale. Comme de plus en plus d’éléments suggèrent le rôle possible du microbiote intestinal ou de ses métabolites dans le développement de la fibrose intestinale, nous souhaitons savoir si les bactéries ou certains de leurs métabolites peuvent influencer la fibrose intestinale via la voie de l’interleukine-33. Ce projet permettra donc de mieux comprendre les mécanismes sous-jacents sur l’implication de l’interleukine-33 dans le développement de la fibrose intestinale et en particulier le rôle du microbiote intestinal.
Procédures
Transfert de microbiote intestinal et induction de la fibrose intestinale. Les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 minute par souris. Les protocoles de colite chronique induite chimiquement se feront respectivement soit par administration de l’agent chimique dans l’eau de boisson, soit par une injection intra-rectale sous anesthésie/analgésie, 1min par injection, selon la molécule utilisée. Les protocoles d’induction de fibrose sont de 59 jours et 42 jours respectivement. La composition corporelle est mesurée les premier et dernier jours de protocole de façon non invasive et la procédure dure environ 1 minute par souris.
Impact sur les animaux
Les protocoles d’induction de colite chronique sont de 59 jours et 42 jours respectivement. Les modèles de colites peuvent entrainer une hypersensibilité viscérale (modérée pour la colite aigue aux doses testées et sévère pour les modèles de colite chronique induite chimiquement) et une perte de poids corporel chez la Souris. Les souris ont accès de façon ad libitum à la nourriture durant la totalité des procédures mais de la nourriture pourra être donnée directement dans la cage si l’état de la souris ne lui permet pas d’accéder directement à la nourriture. Concernant le transfert de microbiote, les souris seront déplétées de leur microbiote par traitement antibiotique dans l’eau de boisson d’une durée d’une semaine. Puis, le transfert de microbiote intestinal se fera par gavage quotidien pendant 7 jours consécutifs et chaque gavage dure environ 1 minute par souris. Le gavage engendrant un stress chez la souris, avant toute contention ou gavage, l’animal sera acclimaté aux pièces d’hébergement et manipulé fréquemment afin de l’habituer aux expérimentateurs et de réduire son stress.
Devenir
A la fin du protocole, l’ensemble des animaux seront mis à mort afin de pouvoir évaluer différents paramètres physiologiques et marqueurs biologiques et collecter un maximum d’informations à partir de ces séries expérimentales.
Remplacement
Avant d’être testés in vivo, nos hypothèses de travail sont validées dans des modèles cellulaires comme des lignées de fibroblastes intestinaux humains en réponse à une cytokine pro-fibrotique ou des lignées de cellules épithéliales intestinales en réponse à des cocktails de cytokines pro-fibrotique ou pro-inflammatoire. Cependant, ces modèles in vitro ne permettent pas de rendre compte de la complexité physiologique de la réponse fibrotique ou inflammatoire in vivo. Les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales.
Réduction
Ce projet s’efforce de réduire le nombre de souris au strict nécessaire pour que l’étude soit concluante et en collectant le maximum d’observations au cours d’une même expérience : (i) données nutritionnelles (composition corporelle, poids des animaux), (ii) inflammation, (iii) fibrose intestinale, (iv) fonction de barrière intestinale et (v) microbiote intestinal. Le nombre d’animaux nécessaires a été évalué selon la sensibilité et la spécificité des procédures utilisées, en fonction de l’expérience acquise lors de nos précédentes études, d’études pilotes pour valider les doses d’agents chimique et des données de la littérature. Pour diminuer le nombre d’animaux utilisés, plusieurs approches combinées ont été prévues : des modèles de colites intestinales induites chimiquement par deux agents différents à des concentrations faibles mais efficaces d’après la littérature. Nous avons fait le choix d’utiliser une dose faible d’inducteur chimique pour limiter au maximum la mortalité, permettant ainsi d’optimiser le bien-être des animaux et de réduire le nombre d’animaux utilisés. - L’utilisation d’espèces d’animaux utilisés à des fins scientifique, caractérisés par une faible variation génétique permet de limiter la variabilité de la réponse biologique et par conséquent le nombre d’animaux. - L’effectif de chaque groupe a été déterminé par une approche statistique en prenant comme critère principal le score histologique. - Les données obtenues chez des animaux contrôles seront réutilisées autant que possible. Par exemple, des échantillons de colon sont préservés dans le laboratoire et indiqués dans la base de données communes à notre Unité et peuvent ainsi être réutilisés au cours d’un autre protocole par nous ou une personne de l’Unité.
Raffinement
Les souris seront hébergées dans des cages standards (4-5 souris/cage), avec enrichissement. Une période d’acclimatation d’une semaine après réception des souris sera réalisée avant le début des procédures. - Les conditions de soins et les méthodes utilisées viseront à réduire le plus possible toute douleur, souffrance, angoisse ou dommages durables que pourraient ressentir les animaux. Un suivi des animaux sera réalisé quotidiennement durant toute la durée des procédures, afin de déceler tout éventuel signe de souffrance. Pour cela, un scoring basé sur un examen clinique sera réalisé permettant d’évaluer l’état de bien-être de l’animal. Un animal présentant un état de mal être ou de souffrance sera exclu de l'étude et mis à mort en fonction de son score. Pour limiter la douleur des animaux avec colite induite chimiquement, l’usage est de ne pas utiliser d’analgésique en raison de leur interaction potentielle avec le processus inflammatoire. Il existe 3 analgésiques potentiels utilisés dans l’inflammation intestinale, qui présentent tous un risque d’interférence avec notre modèle selon la littérature scientifique. Nous ne pourrons donc pas utiliser ces analgésiques dans nos procédures expérimentales. Cependant, au cours de la procédure 1, nous évaluerons l’impact de l’administration d’une analgésique tel que le butorphanol, sur le développement de l’inflammation et de la fibrose intestinale. Si le butorphanol n’interfère pas avec le développement des paramètres d’intérêt, nous utiliserons par la suite cette molécule, dans l’ensemble des procédures (procédures 2 à 4) décrites dans le projet.
Choix des espèces
La souris est l’animal le plus couramment utilisé pour modéliser la colite expérimentale. Cette souche n’est pas résistante à l’induction de colite chronique comme d’autres souches de souris et permet ainsi de réduire le nombre d'animaux utilisés. La lignée de souris a été utilisée par notre laboratoire pour la mise en place des techniques de greffe de microbiote intestinal et de déplétion du microbiote endogène des animaux greffés par antibiothérapie. Nous utiliserons des souris d’environ 6 semaines. La réponse à la colite diffère en fonction de l'âge des animaux et le stade de développement choisi correspond à une phase de réponse optimale avec un risque de mortalité réduit.
Validation moléculaires de modèles génétiquement modifiés
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
1500 souris génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger. Elles reçoivent deux injections quotidiennes de tamoxifène pendant cinq jours pour déclencher une mutation, puis sont tuées pour vérifier au niveau des tissus que la modification a bien eu lieu. Le projet ne produit pas de résultat biologique en soi, il valide des lignées avant des études ultérieures. Le porteur justifie 30 animaux par lignée analysée, sans détailler le nombre de lignées qui aboutit au total de 1500 souris.
Objectifs
Dans le cadre de la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques, l'analyse du rôle joué par chaque gène dans l'organisme est l'une des pistes souvent explorées. Parmi les différents moyens pour effectuer ce type d'analyse, l'utilisation de modèles animaux constitue souvent l'étape finale permettant d'étudier des mécanismes complexes (métabolisme, immunité, comportement) qui ne peuvent pour l'instant être modélisés in vitro ou in silico. Pour générer ces modèles animaux, de nombreuses technologies existent visant à modifier le gène dans une partie du génome et dans son ensemble. De plus, il est possible de n’exprime la modification génétique que lorsque certaines molécules sont injectées. Ainsi, le gène s’exprime normalement pendant le développement de l’animal, mais peut être muté sous contrôle d’un traitement à l’âge adulte. Ce type de mutation conditionnelle nécessite des étapes de validation moléculaire qui sont indispensables avant de réaliser des protocoles d’analyses plus complets. Le but de ce projet est justement de réaliser cette étape de validation sur l’ensemble des modèles animaux génétiquement modifiés que nous obtenons. Pour cela, nous injecterons une molécule, le tamoxifène, qui déclenche l’expression de la mutation génétique qui a été mise en place. Les animaux seront ensuite étudiés au niveau des tissus pour valider que les modifications génétiques ont lieu tel qu’attendu.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de progresser dans notre connaissance des gènes étudiés en recherche préclinique. À plus long terme, ces données pourront contribuer au développement de médicaments pour l’Homme.
Procédures
Durant ce projet, les animaux recevront deux injections intrapéritonéales par jour pendant 5 jours. Chaque injection dure moins de une minute.
Impact sur les animaux
Une injection peut induire une légère douleur et un stress lié à la contention. Chaque injection dure moins de une minute et les animaux seront surveillés pendant l'heure qui suit.
Devenir
À l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés pour permettre l'examen détaillé de leurs organes, essentiel pour comprendre la fonction du gène supprimé.
Remplacement
Dans ce projet visant à valider des modèles génétiquement modifiés destinés à l’étude de mécanismes physiologiques complexes, le recours à un mammifère est indispensable, aucune approche in vitro ni aucune modélisation informatique ne pouvant, à l’heure actuelle, se substituer à l’analyse du gène cible dans son environnement naturel et dans l’ensemble de ses interactions au sein de l’organisme.
Réduction
Pour réaliser ce type d’analyse, un faible nombre d’animaux requis par groupe. Ainsi, nous utiliserons 5 animaux par condition. Afin de disposer des contrôles adéquats, nous pourrons utiliser jusqu’à 6 groupes expérimentaux selon la mutation utilisée. Ainsi pour une mutation étudiée, nous pourrions employer 30 animaux par lignée analysée. Cet effectif constitue un minimum pour obtenir des résultats qui soient analysables et pouvant permettre de conclure sur la bonne réalisation de l’étude.
Raffinement
Dans le cadre des procédures expérimentales, nous nous efforcerons de réduire autant que possible le stress des animaux. Une surveillance quotidienne de leur état, une pesée hebdomadaire, ainsi qu'un suivi régulier de leur état général seront mis en place pour garantir leur bonne santé. Par ailleurs, nous nous engageons à offrir les meilleures conditions d'hébergement possibles, avec un enrichissement adéquat. Ils disposeront sans limitation de nourriture, boisson et d'un milieu enrichi (nids en quantité suffisante, bâton et balles à ronger). En cas de conflit entre animaux, nous isolerons l'animal dominant et, si nécessaire, procéderons à des soins locaux. Tout au long des procédures, des seuils limites spécifiques seront établis pour assurer que les animaux demeurent dans des conditions éthiquement acceptables et pour réagir de manière appropriée à tout signe de souffrance ou de diminution du bien-être.
Choix des espèces
La souris est l’animal modèle de choix pour une première étude de la fonction d’un gène présent chez les mammifères. Elle permet notamment un accès facile à l’ingénierie génétique. Les animaux de la cohorte seront des animaux jeunes âgés de 6 semaines à réception et injectés au tamoxifène à partir de 8 semaines d'âge, hormis si le gène ciblé a un intérêt scientifique a être étudié durant la croissance, dans ce cas, nous injecterions des animaux agés de 4 semaines minimum.
Caractérisation et recherche d’indicateurs de la santé globale de vaches de race Holstein et Normande durant leurs lactations
- Recherche appliquée
- Bien-être animal
- Maladies animales
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
270 vaches laitières de race Holstein et Normande vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger, sans être tuées pour le projet. Les prises de sang, réalisées trois fois puis à la réforme au cornadis, ainsi que les pesées et la notation d'état peuvent causer un stress ponctuel et une douleur brève. Le projet cherche des indicateurs sanguins de la santé globale des vaches dans deux systèmes d'élevage contrastés, au service de la durabilité et de l'"acceptabilité sociétale" de l'élevage. À l'issue des mesures, les animaux poursuivent une vie de bovin de renouvellement dans le troupeau, leur devenir dépendant du calendrier d'élevage plus que du protocole.
Objectifs
La santé a longtemps été considérée sous la forme d’un caractère binaire : l’animal est sain ou malade au regard d’une affection ou d’une maladie donnée, à un instant donné. Toutefois, l’état de santé général est multifactoriel et évolutif. Il possède un fort impact sur le bien-être de l’animal, de même que sur ses performances et sa longévité. De ce fait, il s’agit d’un caractère clé pour la durabilité tant environnementale qu’économique de l’élevage, ainsi que pour son acceptabilité sociétale. Dans une optique de re-conceptualisation de la santé pour prendre en compte son caractère continu, explorer les mécanismes biologiques qui la caractérisent, et étudier ses liens avec les autres caractères, un collectif de scientifiques a défini ensemble les contours d’une nouvelle expérimentation de long terme en bovins laitiers
Bénéfices attendus
Nous attendons de ce projet des avancées de connaissances scientifiques, avec une meilleure caractérisation des phénotypes mesurés (variabilité individuelle, sensibilité environnementale, évolution au cours du temps), et des relations qui les unissent, aussi bien entre eux qu’avec les évènements de santé et les performances zootechniques, afin d’identifier les synergies et les compromis entre fonctions et leurs impacts sur la longévité des vaches dans deux systèmes d’élevage très contrastés en termes d'objectifs de performance, de conduite et de challenges.
Procédures
Pour la caractérisation fine des animaux, des prélèvements sanguins seront réalisés 3 fois au cours de l’expérimentation sur les vaches laitières, à chaque vêlage, et une dernière le jour de la réforme. Les animaux sont alors maintenus au cornadis. Les mesures de poids (une fois par semaine pour les vaches) se feront sans geste technique autre que le déplacement et la contention des animaux. Pour la mesure de la note d'état, les vaches seront maintenues au cornadis une fois par mois. Voici le temps estimé pour chaque acte : Prise de sang : 2 minutes Mesure du poids : 1 minute Mesure de la note d'état : 5 minutes.
Impact sur les animaux
Les prélèvements prévus (prises de sang) seront réalisés dans le cadre d'une contention adaptée au poids des animaux (animal bloqué dans une cage ou aux cornadis). Cette contention, ainsi que la simple présence humaine et la manipulation associée peuvent générer un stress ponctuel chez l'animal. Le prélèvement en lui-même peut générer sur le moment une douleur limitée et fugace.
Devenir
Les procédures n’entravent pas le devenir de l’animal et n’ont qu’un effet limité et de court terme sur son bien-être. Aussi, l’ensemble des animaux inclus dans cette expérimentation va poursuivre une vie normale d’un animal de renouvellement dans un troupeau de bovins laitiers.
Remplacement
Les mécanismes étudiés mettent en jeu des interactions complexes au sein de l’hôte qu’il est impossible de reproduire dans un modèle cellulaire, de culture d’organe ou in silico.
Réduction
L’objectif de cette expérimentation est d’étudier la génétique de la santé des bovins. Concrètement, nous mesurons dans le projet différents paramètres du sang, et des analyses statistiques visent à déterminer quelle part de la variation observée dans ces paramètres est liée à la génétique des animaux et quelle part est liée au milieu de vie des animaux (effets de l’environnement). Pour avoir des différences significatives entre individus sur chaque paramètre, il faut un effectif important d’animaux élevés dans les mêmes conditions (environnement). L’effectif de 270 animaux du projet doit permettre de repérer les paramètres les plus pertinents à mesurer.
Raffinement
Différentes mesures ont été prises afin de raffiner ce protocole. Tout d’abord, les différentes mesures ont été regroupées sur les mêmes temps, même si ce n’était pas toujours le moment optimal pour chaque paramètre pris séparément, afin de limiter le nombre d’interventions sur les animaux. Ensuite, chaque intervention a été pensée de manière à limiter les nuisances pour les animaux (limitation des volumes de sang prélevés, utilisation de tube sous vide pour minimiser la douleur…) Les procédures impliquées dans le projet sont de sévérité légère et appliquées par des opérateurs expérimentés. Les conditions d'hébergement et d'alimentation répondent aux normes d’élevage. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long de l’expérience. La prophylaxie et le traitement des animaux en cas d’affection ou de blessure ne sont pas modifiés par la mise en œuvre du projet. Tout animal présentant un trouble de santé sera soigné en fonction de la pathologie conformément aux pratiques de l'élevage, et, au besoin, le vétérinaire praticien sera consulté. Chaque prélèvement peut être reporté ou annulé si l'état de santé ou de stress de l'animal est jugé incompatible avec la réalisation dudit prélèvement. Les animaux sont gardés en vie en fin d'expérimentation. De par les interventions d'élevage, une phase d'imprégnation à l'homme est réalisée dès la naissance de chaque veau. Cela réduit grandement le stress généré par la présence de l'homme lors des prélèvements, d'autant que ce sont les mêmes personnes qui interviennent.
Choix des espèces
L’espèce animale choisie est le bovin. Il s’agit de femelles de race Holstein et Normande, grandes races laitières françaises (et internationale pour la Holstein). Ces animaux ne sont pas transgéniques et ont été obtenus par des méthodes de reproduction utilisées en élevage classique. Les animaux seront des femelles bovines laitières suivies depuis 60 jours après vêlage jusqu’à leur tarissement ou réforme, soit du stade vache en lactation au stade vache tarie / vache réformée.
Optimisation de la vaccination à ARNm : efficacité de transfection des nanoparticules lipidiques selon différentes voies d’injection
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Jusqu'à douze anesthésies à l'isoflurane et douze injections par animal pour l'imagerie: 3250 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des injections d'ARN messager encapsulé dans des nanoparticules par différentes voies, puis des séances d'imagerie répétées, avec possible perte de poids et réaction immunitaire. Le projet teste de nouvelles formulations vaccinales à ARN messager avant un éventuel passage chez l'humain. Tous les animaux sont tués pour mesurer l'efficacité de transfection et d'immunisation.
Objectifs
Suite à l’émergence de vaccin à acides nucléiques, l’ARN messager (ARNm) ouvre de nouveaux horizons thérapeutiques dans le développement de vaccins pour diverses pathologies tels que les maladies infectieuses, les cancers, les maladies auto-immunes, les maladies génétiques… Ils sont d’autant plus importants que c’est une technologie rapide à déployer qui pourra nous aider à faire face aux menaces sanitaires émergentes. Le principe repose sur la délivrance de molécules d’acide nucléique (ARNm), codant pour une protéine ou un fragment protéique, dans une cellule cible et d’utiliser la machinerie cellulaire pour produire la protéine d’intérêt. Cet ARNm peut coder pour une protéine fluorescente, une enzyme, un antigène viral ou bactérien dans le cas de maladies infectieuses ou encore une protéine spécifique pour rétablir une voie modifiée lors de maladie génétique. Les avantages de cette technologie sont nombreux incluant une rapidité de développement, la modularité des cibles, l’efficacité immunitaire et la sécurité puisque l’ARNm ne s’intègre pas dans le génome. De plus, il n’y a aucun risque infectieux. En revanche, l’ARNm est une molécule fragile qui se dégrade facilement. S’il est injecté seul dans l’organisme, il sera éliminé par notre propre système avant d’avoir rempli sa mission. Il faut donc le protéger. De nombreux vecteurs peuvent être utilisés pour protéger et délivrer l’ARNm. Ils agissent comme des bulles protectrices pouvant transporter l’ARNm jusqu’à sa cible. Dans ce contexte, notre laboratoire a fait le choix de développer des nanoparticules non virales lipidiques et/ou polymériques. Notre projet s’inscrit dans une démarche globale pour notre unité, qui vise à développer et accélérer des projets d'innovation thérapeutique et fournir une expertise en technologies ARNm. Cela comprend la mise en place et le test de nouveaux vecteurs ainsi que l’évaluation de séquences d’ARNm spécifiques conçus au laboratoire. À cette fin, ces approches doivent être testées dans des modèles complexes ; nous avons donc choisi d’utiliser des modèles murins. Objectif 1 : Evaluer l’efficacité de vecteurs non viraux pour l’encapsulation. Objectif 2 : Evaluer l’immunogénicité des nanoparticules et des séquences d’ARNm dans un organisme complexe. L’enjeu est de maximiser l’efficacité de nos formulations tout en minimisant les effets indésirables possibles dans le but de passer par la suite à des études cliniques chez l’homme.
Bénéfices attendus
Actuellement il existe moins d’une dizaine de formulations d’ARNm thérapeutique acceptées et validées par les instances chargées de la surveillance et de l’autorisation des produits pharmaceutiques. Ce projet vise à concevoir de nouvelles formulations innovantes et souveraines, à la fois sûres et efficaces, évaluées dans des modèles complexes représentatifs de conditions physiologiques réalistes. Le but à court terme est d’identifier des formulations efficaces et non immunogènes qui permettent de produire notre protéine d’intérêt et de perfectionner nos techniques de fabrication. Le but à long terme est de permettre l’émergence de nouvelles techniques de fabrication et des formulations adaptées à différents types de pathologies ou de maladies émergentes. Les demandes en traitement à base d’ARNm sont en pleine expansion, il y a donc un besoin croissant de trouver de nouvelles formulations.
Procédures
Procédure 1 : Chaque animal recevra au maximum : 2 injections d’ARNm avec une voie d’injection choisie (IM, ID, SC, IV, IN) 12 injections de substrat Luc en IP (1/jour pendant 5 jours puis 2x/semaine pendant 3 semaines) 12 Anesthésies générales à l’isoflurane de 15 min (1/jour pendant 5 jours puis 2x/semaine) 1 prélèvement sanguin sur la veine caudale sur animal vigile 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital sous anesthésie isoflurane Procédure 2 : Chaque animal recevra au maximum : 2 injections d’ARNm avec une voie d’injection choisie (IM, ID, SC, IV, IN) 2 prélèvements sanguins sur la veine caudale sur animal vigile 1 prélèvement sanguin en rétro-orbital sous anesthésie isoflurane
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une formulation par type d’injection choisi (intraveineuse (IV), intramusculaire (IM), intranasale (IN), sous cutanée (SC) ou intra-dermique (ID)). Les séances d’imagerie, d’environ 15 min, seront répétées et limitées à une fois par jour, avec injection de substrat à la luciférase en intrapéritonéale (IP). A la suite des injections, les animaux pourront avoir une perte de poids transitoire dûe au stress que peuvent engendrer les gestes techniques, une légère douleur au point d’injection pendant quelques heures, et une réaction immunitaire pouvant entrainer une baisse d’activité, modification du pelage, perte de poids modérée suivant l’antigène testé.
Devenir
A l’issue des procédures, tous les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements nécessaires aux analyses pour évaluer l’efficacité de transfection et d’immunisation post traitement.
Remplacement
Ce projet nécessite l’utilisation d’animaux pour tester l’effet des composés dans un contexte physiologique. Les méthodes d’études in vitro sont limitées par des éléments importants tels que la complexité des différents organes, leur architecture qui organise les relations entre ces populations cellulaires, ou encore la distribution des formulations dans les organes qui peut être différente selon les voies d’injections testées. Il est donc nécessaire d’évaluer la mise en jeu des différents éléments dans un système complexe comme le modèle murin. Aucun modèle alternatif ne peut remplacer un organisme entier pour ce type de projet.
Réduction
Afin de limiter au maximum le nombre d’animaux utilisés, des études in vitro sont réalisées en amont pour valider l’efficacité et l’innocuité des formulations. Seules les formulations les plus efficaces et biocompatibles sont testées in vivo. Le nombre d’animaux pour chaque procédure est fixé au minimum nécessaire pour obtenir des résultats statistiquement fiables, avec une puissance de 80 %, sur la base d’expériences antérieures. La première injection permet de suivre la cinétique d’expression chez le même animal, et la seconde sert au prélèvement des organes, réduisant ainsi le nombre total d’animaux. Pour l’objectif 2, le nombre de candidats est déjà limité et une seule voie d’injection sera choisie en se basant sur les résultats obtenus lors de la première procédure.
Raffinement
Une grille de score clinique, conçue spécifiquement pour cette procédure avec des points de contrôle spécifiques et pertinents, sera tenue à jour pour les animaux en cours d'expérimentation. Si des animaux présentent des signes de souffrance, un analgésique sera administré. Un analgésique local sera appliqué avant les injections intra-musculaires. De l’isoflurane sera utilisé comme anesthésiant pour limiter la douleur du geste réalisé lors des injections en intramusculaire, et permettre un meilleur contrôle de la respiration de la souris lors des injections intranasales. Lors de l’imagerie par bioluminescence, les animaux seront positionnés sur tapis chauffant pour limiter la perte de température corporelle. A chaque utilisation de l’isoflurane, les animaux seront observés jusqu’au réveil complet. Pour les injections intraveineuses, les souris seront mises en chambre chauffée pour augmenter légèrement leur température corporelle et permettre la dilatation des vaisseaux et limiter leur stress. A la suite des injections d’ARNm, de la nourriture humide sera déposée dans le fond des cages pour permettre un meilleur accès à la nourriture et garder une hydratation optimale.
Choix des espèces
La souris sera utilisée comme modèle d’études pour plusieurs raisons : - La génétique de la souris est bien connue, entièrement séquencée et proche de celle de l’être humain. Nous allons être amenés à tester différentes séquences d’ARNm et la machinerie cellulaire qui prend en charge l’ARNm est très similaire entre l’homme et la souris. - Les études menées sur les vaccins à ARNm sont basées sur des études murines. Nous pourrons donc comparer les résultats obtenus avec ceux de nos confrères. - Nous utiliserons des souris Ai9 capables de produire une protéine fluorescente uniquement dans les cellules qui exprimeront les vecteurs contenant une séquence ARNm codant pour la protéine Cre recombinase, ce qui n’existe pas dans d’autres modèles animaux. - La finalité de cette étude est de passer à un stade clinique. La souris est un mammifère qui présente une physiologie comparable à l’espèce humaine, il nous sera plus facile de comparer les réponses immunitaires obtenues et d’étudier la bio-distribution des vecteurs et séquences utilisées. Pour la procédure 1, Nous utiliserons des souris au stade adulte. Elles seront injectées à partir de 8 semaines et jusqu’à 16 semaines afin de garantir un système immunitaire mature et un processus de développement corporel terminé. Pour la procédure 2, les souris seront réceptionnées à l’âge de 5 à 6 semaines. Les injections se feront sur les souris âgées de 7 semaines. En effet, les procédures de vaccination avec deux doses espacées d’un mois sont longues, ce qui justifie de démarrer à un âge jeune, le vieillissement étant connu pour impacter la réponse immunitaire. Cependant, il est important d’attendre 6 semaines minimum pour avoir un système immunitaire mature.
Impact du microbiote intestinal sur le comportement social chez la souris : identification des mécanismes impliqués
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
Livrées à trois semaines, les souris reçoivent une greffe de microbiote fécal par gavage jusqu'à quatre fois par jour, des injections d'anticorps, six prélèvements de sang à la queue et, pour une partie, une section chirurgicale du nerf vague reliant l'intestin au cerveau. 1 734 souris vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélever leurs organes. Le projet cherche à savoir si le microbiote intestinal influence les interactions sociales et l'autisme, en transférant à des souris saines la flore de donneurs au comportement social altéré. Le porteur évoque des tests évaluant le "phénotype social", dont un maintien de 72 heures, sans préciser lesquels, et conclut que la souris est un "modèle de choix" faute d'alternative reproduisant la complexité de l'axe intestin-cerveau.
Objectifs
De nombreuses études récentes montrent que les micro-organismes vivant dans l’intestin, appelés microbiote intestinal, peuvent influencer le comportement via une communication entre l’intestin et le cerveau. Chez la souris, il a été démontré que le transfert de microbiote intestinal d’un animal à un autre, appelé transfert de matière fécale (FMT), permet non seulement de transmettre les bactéries intestinales du donneur, mais aussi certains traits comportementaux. Par exemple, des souris recevant le microbiote de donneurs présentant des troubles des interactions sociales développent à leur tour des difficultés à interagir avec leurs congénères. Des résultats similaires ont été observés lorsque le microbiote provient de patients atteints de troubles du spectre de l’autisme. D’autres travaux ont montré que l’exposition prolongée à une substance produite par certaines bactéries intestinales, le p-crésol, peut modifier la composition du microbiote et entraîner des altérations du comportement social chez la souris. Le microbiote de ces souris suffit ensuite à transmettre ces troubles comportementaux à des souris saines. Ces observations suggèrent que le microbiote intestinal joue un rôle important dans le comportement social. Toutefois, les mécanismes précis reliant l’intestin au cerveau restent mal compris. Plusieurs voies de communication sont envisagées, notamment le système immunitaire, certaines substances produites par les bactéries, ou encore une voie nerveuse directe reliant l’intestin au cerveau, appelée nerf vague. Les objectifs de ce projet sont : 1. Disséquer le rôle de ces voies de communications dans les effets du microbiote sur les comportements sociaux 2. Identifier les cibles thérapeutiques potentielles pour les troubles des interactions sociales.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de mieux comprendre les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal influence les interactions sociales et les comportements associés à l’autisme. Les résultats attendus offriront de nouveaux éclairages sur l’axe microbiote-intestin-cerveau, en identifiant des cibles pouvant moduler les symptômes comportementaux. À terme, cette recherche pourrait ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques pour lutter contre l’autisme ou les troubles du comportement.
Procédures
•Anesthésie à l’isoflurane pour identification: durée 10 min ; fréquence 1 fois dans la vie de l'animal • Injection d’anticorps (250 μL) : durée 10s ; fréquence deux fois dans la vie de l’animal. •Test de comportements évaluant le phénotype social: durée 10min et 72h en fonction des tests ; 3 tests de 10 min + 1 test de 72h/animal, le tout une fois dans la vie de l’animal• Prélèvement de sang de 20μL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence 6 fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois par jour pendant 4 jours à 4 fois par jour pendant 1 jour en fonction de la procédure. •Vagotomie sous anesthésie générale: durée 1h ; fréquence une fois dans la vie de l’animal.
Impact sur les animaux
Transfert de microbiote fécal (FMT) par gavage oral : Cette procédure peut engendrer un stress lié à la contention et au passage de la sonde, parfois une légère irritation buccale ou œsophagienne. Le gavage répété peut générer une perte de poids ou des troubles digestifs, selon la composition du microbiote transplanté. Transfert de microbiote fécal (FMT) par gavage oral (durée 5 sec): Cette procédure peut engendrer un stress lié à la contention et au passage de la sonde, parfois une légère irritation buccale ou œsophagienne. Le gavage répété peut générer une perte de poids ou des troubles digestifs, selon la composition du microbiote transplanté. Administration d’anticorps (durée 10 sec): Elle expose à un inconfort transitoire lors de l’injection, parfois à une douleur légère ou à un risque d’irritation locale ; des réactions inflammatoires ou allergiques sont rares. Prélèvements de sang dans la veine de la queue (durée 10 min): Risques mineurs tels que douleur à la ponction, formation d’hématome ou saignement local. Le prélèvement peut engendrer un stress lié à la contention. L’identification par puce RFID (durée 10 sec) sous anesthésie générale peut provoquer une légère hypothermie. Analyse comportementale (3 tests de 10 min + 1 test de 72h/ animal): Peut engendrer un stress transitoire lié à l’isolement ou aux manipulations, généralement modéré et temporaire. Les souris génétiquement altérées peuvent présenter une susceptibilité accrue aux infections opportunistes, associée à un risque augmenté de morbidité en cas de contamination. La vagotomie bilatérale sous anesthésie générale peut provoquer douleur et inconfort post-opératoires.
Devenir
À l’issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort afin de permettre le prélèvement d’organes nécessaires à la réalisation d’analyses biologiques. Ces analyses sont indispensables pour approfondir la compréhension des mécanismes impliqués dans notre contexte d’étude.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’étudier les mécanismes par lesquels le microbiote intestinal agit sur le comportement social. Ce projet nécessite donc l’utilisation d’animaux. En effet, les alternatives non animales comme les expériences in-vitro ou les modélisations informatiques (in silico) ne permettent pas actuellement de reproduire la complexité du microbiote ni les interactions avec le système digestif, le système immunitaire et le système nerveux ainsi que l’impact sur le comportement social. Par ailleurs, les études de perte de fonction ne peuvent être menées que chez un animal vivant.
Réduction
Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs de puissance réalisés avec un logiciel dédié (GPower) ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques adéquats : en cas de distribution normale, nous utiliserons des tests paramétriques (t-test pour comparer 2 échantillons, ANOVA pour comparer n échantillons). En cas de distribution non normale, nous utiliserons des tests non-paramétriques (tests de Mann-Whitney ou de Kruskall Wallis), même si ceux-ci sont moins sensibles. Les résultats seront analysés avec le logiciel GraphPad Prism. Au total, 1734 animaux sont requis pour l’ensemble du projet, ce chiffre ayant été réduit au strict nécessaire en respectant les principes de la règle des 3R. Toutes les étapes expérimentales seront réalisées dans un ordre prédéfini, chaque intervention dépendant des résultats obtenus précédemment. Ainsi, toute procédure non pertinente au vu des données déjà recueillies au cours de procédures précédentes ne sera pas réalisée.
Raffinement
Plusieurs stratégies de raffinement seront mises en œuvre: • Utilisation systématique de l’analgésie pour toutes les procédures invasives, afin de réduire la douleur. • Application de techniques de manipulation respectueuses et de contention douce pour limiter le stress avant, pendant et après les interventions. • Administration d’un volume réduit pour minimiser l’impact de l’injection. • Prélèvement d’un volume très faible de sang• Une phase d’habituation aux dispositifs expérimentaux précèdera les tests comportementaux et ceux-ci seront espacés de 2 jours pour favoriser la récupération des animaux. • Le réveil post-opératoire après la chirurgie de vagotomie se fera dans une chambre de réveil chauffée spécifiquement dédiée. •Surveillance attentive des souris pour détecter rapidement tout signe de douleur, de détresse ou de complication, et intervenir avec euthanasie de l’animal si atteinte de point limite conformément aux recommandations si nécessaire. •La surveillance sera biquotidienne et renforcée pour les souris génétiquement altérées et ces souris seront hébergées dans une armoire d’animalerie ventilée permettant un environnement contrôlé et une atténuation de l’expression éventuelle du phénotype dommageable. Afin de limiter le risque infectieux chez ces souris, l’ensemble des équipements utilisés lors des tests comportementaux (arènes, objets, surfaces de contact) sera nettoyé à l’éthanol 70% entre chaque animal ou chaque groupe, selon les procédures en vigueur.
Choix des espèces
L’autisme entraîne d’importants troubles du comportement, et ces altérations peuvent être reproduites chez le rongeur à l’aide de batteries de tests comportementaux adaptés. La souris constitue un modèle de choix, car son système nerveux et le développement de son cerveau présentent de nombreuses similitudes avec ceux de l’humain, contrairement à d’autres espèces. Par ailleurs, les études de perte de fonction ne peuvent être menées que chez un animal vivant, et la souris offre un excellent compromis entre complexité biologique et faisabilité expérimentale. Ce choix de modèle permet donc d’investiguer les mécanismes impliqués dans les effets du microbiote intestinal sur le comportement de manière pertinente et dans un modèle bien caractérisé. Les souris arrivent au laboratoire à l’âge de 3 semaines (21 jours d’âge). Elles restent d’abord 1 semaine sur place pour s’habituer à leur nouvel environnement. Les expériences commencent lorsqu’elles ont 4 semaines (28 jours d’âge). À cet âge, nous réalisons un transfert de microbiote intestinal (c’est-à-dire que nous leur administrons des bactéries dans leur intestin). Leur comportement sera ensuite étudié lorsqu’elles seront adultes, à 8 semaines d’âge (56 jours d’âge). Certaines souris subissent une intervention chirurgicale qui consiste à sectionner une partie du nerf (le nerf vague) qui relie l’intestin au cerveau. Dans ce cas, les souris arrivent à l’âge de 5 semaines (35 jours d’âge) puis sont utilisées dès la semaine suivante après 1 semaine d’habituation au nouvel environnement. La chirurgie sous anesthésie générale sera réalisée sur la souris âgée de 45 jours. Une période de repos de 2 semaines après la chirurgie permettra une récupération optimale. Après récupération, les souris subiront un transfert de microbiote intestinal à l’âge de 8-9 semaines (56-63 jours d’âge). Trois semaines après le transfert de microbiote intestinal, le comportement sera analysé (77-84 jours d’âge).
Etude des mécanismes conduisant au développement de la cachexie rénale (EU 2/2)
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Une partie des souris porte une mutation qui détruit progressivement leur fonction rénale et les fait maigrir, l'autre reçoit un régime qui produit le même effet. 1 636 souris au total vont être utilisées, toutes tuées, dont 512 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent des mesures toutes les deux semaines, des prélèvements sanguins sous anesthésie, jusqu'à sept jours d'isolement en cage métabolique et, pour certaines, deux injections par jour pendant quinze jours. Le porteur qualifie chacune de ces nuisances de légère et affirme que l'insuffisance rénale ne provoque ni douleur ni stress avant les stades avancés, tout en indiquant que les animaux seront gardés plusieurs mois, jusqu'à ce qu'ils aient développé cette insuffisance accompagnée d'une cachexie.
Objectifs
La cachexie est un syndrome d’amaigrissement sévère et involontaire qui ne peut pas être corrigé simplement par une approche nutritionnelle, et qui réduit fortement la qualité et l’espérance de vie des patients. Elle touche souvent les patients à des stades avancés de maladies chroniques telles que le cancer, les maladies rénales, cardiaques et pulmonaires ou maladies infectieuses. Jusqu'à présent la plupart des études se sont concentrées sur la cachexie associée au cancer, les autres types de cachexie, et en particulier celle associée aux maladies rénales chroniques (MRC), ont été peu étudiées. Les maladies rénales constituent un grave problème de santé publique, puisqu'elles touchent plus de 850 millions de personnes et représentent l'une des dix principales causes de décès prématurés dans le monde. À un stade avancé de la maladie rénale, notamment chez les patients sous dialyse, un syndrome appelé cachexie rénale peut apparaître. Elle se caractérise par une perte de masse maigre et/ou grasse menant à une altération fonctionnelle des patients. Il n’existe aujourd’hui aucune norme de soin pour la cachexie rénale et une meilleure compréhension des altérations métaboliques menant à son développement représente un enjeu crucial. L’objectif de ce projet est d'identifier de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce et de nouvelles cibles thérapeutiques pour une meilleure prise en charge de la cachexie rénale. A l’heure actuelle, il n’existe aucun modèle in vitro qui permette de reproduire la complexité de la physiopathologie de la cachexie rénale, ce qui rend indispensable le recours à des modèles animaux pour appréhender les interactions biologiques complexes associées à cette pathologie. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.
Bénéfices attendus
La cachexie rénale est un syndrome grave qui touche de nombreux patients atteints d’insuffisance rénale chronique. Elle réduit l’espérance de vie, entraîne une fatigue importante, des hospitalisations fréquentes, et rend difficile une vie sociale et professionnelle normale. Elle contribue donc au très fort impact économique des maladies rénales en Europe, qui est à la hauteur de 140 milliards d’euros par an. Ce projet de recherche vise à court terme à mieux comprendre la cachexie rénale et à développer des outils de diagnostic. À plus long terme, il pourrait mener à de nouveaux traitements, et ainsi améliorer la qualité de vie et la survie des patients.
Procédures
Dans le premier établissement utilisateur, les animaux subiront des mesures de composition corporelle (3 minutes/animal), de force musculaire (5 minutes/ animal) et de fonction rénale (45 minutes/animal) au maximum toutes les 2 semaines à partir de l’âge de 6 semaines. Ces mesures se font chez les animaux vigiles et sont non-invasives, les animaux pourront cependant être anesthésiés pendant quelques minutes pour certains gestes techniques. Des prélèvements sanguins (2 minutes) seront réalisés sous anesthésie toutes les 2 semaines également. Les animaux seront mis en cages métaboliques une fois pendant une durée maximum de 7 jours. Certains lots d’animaux recevront des traitements : soit 3 injections par semaine pendant une durée maximale de 2 mois ; soit 2 injections par jour pendant une durée maximale de 15 jours ; soit une injection unique. Certains animaux seront mis sous régime particulier. Dans le second établissement utilisateur, seules les procédures terminales seront réalisées.
Impact sur les animaux
Certains animaux de sont porteurs d’une mutation génétique responsable du développement d’une maladie rénale chronique. Celle-ci provoque une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement, qui sont les critères recherchés dans notre projet. D’autres groupes d’animaux sont soumis à un régime alimentaire qui induit également une détérioration de leur fonction rénale et un amaigrissement. Le poids des animaux et leur état général seront suivis attentivement. L’insuffisance rénale ne provoque pas de douleur, ni de stress avant des stades avancés au cours desquels une baisse de l’alimentation et une altération de l’état général peuvent apparaitre. Tous les animaux seront soumis à : (1) suivi régulier de leur poids : léger stress lié à leur manipulation de la cage à la balance et vice-versa (2) prise de sang à la queue : léger stress et risque de saignement (3) mesure de leur composition corporelle: léger stress lié à leur contention transitoire (3 minutes) (4) mesures du métabolisme : léger stress lié à l'isolement (7 jours au maximum) dans une cage individuelle (5) mesure de la fonction rénale: légère douleur liée à l’injection, et léger stress lié à la présence du capteur pendant 1h maximum (6) traitements pharmacologiques : léger stress dû à la contention + légère douleur liée à l’injection
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure en vus de l'analyse de leur sang, leur urine et leurs organes.
Remplacement
La cachexie est un syndrôme multifactoriel, initiée par le tissu affecté (ici le rein), qui va conduire à l’altération métabolique et à la dysfonction de nombreux tissus vitaux. Ces tissus vont à leur tour sécréter de nombreux médiateurs pro-cachectiques, initiant un cercle vicieux qui aggrave la fonte des tissus musculaires et adipeux. De telles interactions inter-tissulaires dans un contexte d’insuffisance rénale sont donc impossibles à reproduire in vitro. Une approche complémentaire ex vivo sur des cellules primaires en culture est également utilisée, elle permet d’obtenir une grande quantité de cellules à partir d’un nombre restreint d’animaux
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé est calculé au plus juste d’après notre connaissance du modèle pour permettre d’identifier statistiquement des différences intergroupes scientifiquement interprétables pour chaque paramètre et chaque modèle. Il est prévu d’utiliser un maximum de 1636 souris. Les résultats seront interprétés en utilisant des tests statistiques.
Raffinement
Les études sont optimisées d’après la littérature et les observations réalisées au laboratoire (doses injectées, durée du traitement). Les animaux seront hébergés, par groupes de 2 à 5 dans des cages comprenant des éléments d’enrichissement (papier, tunnels...), avec alimentation et eau ad libitum. Ils seront observés quotidiennement par les zootechniciens et plusieurs fois par semaine par les expérimentateurs afin de s’assurer de leur bien-être . Une grille de scoring et des points limites ont été établis. Pour les changes et les manipulations, les animaux sont tenus dans la main de l’expérimentateur mais jamais suspendus par la queue. Les procédures sont optimisées de façon à limiter au maximum la souffrance des animaux (des anesthésiques et antalgiques seront utilisés pour les gestes qui le nécessitent, suivi attentif des animaux tout au long des différentes procédures). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport). Les animaux sont transportés dans leur cage d'origine afin de minimiser le stress, pour un transport d'une durée de moins de 10 minutes.
Choix des espèces
Nous utilisons la souris car elle est à l’origine d’un grand nombre de données dans la littérature et qu’il existe un nombre important de modèles de souris mutantes et transgéniques ciblant des protéines d’intérêt dans la régulation de la fonction rénale et la cachexie. Pour l’un des 2 modèles, nous utiliserons des souris âgées de 6 semaines au début de l'expérience, afin d’effectuer des mesures en conditions basales avant tout amaigrissement et perte de fonction rénale. Pour l’autre modèle, nous utiliserons des animaux âgés de 8 semaines au début du protocole. A cet âge les reins sont pleinement développés, ce qui permet de modéliser au mieux les conditions cliniques chez l’adulte. Nous garderons les animaux jusqu’à ce qu’ils aient développé une insuffisance rénale accompagnée d’une cachexie (processus se mettant en place sur plusieurs mois).
Caractérisation d’une molécule impliquée dans la synthèse des lipides chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
13 470 souris vont être utilisées, toutes tuées, dont 12 672 dans des procédures d'un niveau de souffrance léger qui relèvent de l'élevage et du génotypage par biopsie de queue. Les 798 autres subissent un régime obésogène de six semaines, jusqu'à 21 administrations orales, sept injections, une mise à jeun de 12 à 15 heures, et pour les femelles gestantes une injection destinée à induire la pathologie chez l'embryon. Le porteur annonce des retombées pour le cancer, le diabète de type 2, l'obésité, les maladies lysosomales et les myopathies, alors que l'objectif immédiat reste de caractériser une molécule dont il écrit que les effets sont mal connus. Il affirme que les interactions entre types cellulaires ne peuvent être étudiées de façon complète que sur des animaux entiers, ce qui rend selon lui le modèle "indispensable".
Objectifs
Récemment, des travaux sur des cellules ont montré l’identification d’une nouvelle cible impliquée dans la synthèse d'un lipide majeur constituant les membranes biologiques cellulaires. Les effets de l'activité de cette molécule sont mal connus. Le projet a pour objectif de créer des nouveaux modèles de souris présentant différentes formes d’activation de cette cible. Il sera utilisé différents traitements pharmacologiques, avec un régime alimentaire spécifique afin d’étudier différents tissus pour des analyses moléculaires et métaboliques.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de confirmer les données obtenues dans des modèles cellulaires dans un contexte physiologique et pathologique. A ce jour les mécanismes de régulation de cette cible ne sont pas encore bien caractérisés. L’identification et la caractérisation de nouvelles cibles participeront à apporter une réponse thérapeutique aux maladies telles que, le cancer, le diabète de type 2, l'obésité, les maladies lysosomales et les myopathies.
Procédures
injection de femelles gestantes pour induction du modèle pathologique chez l'embryon (1 fois, 10 secondes), par voie oral d'une molécule médicament avec effet sur les lipides pour tester leur potentiel thérapeutique (21 fois, 10 secondes), injection d'une molécule médicament pour tester leur potentiel thérapeutique (7 fois, 10 secondes), induction d’un régime obésogène (1 fois, 6 semaines), mise à jeun (1fois, 12 à 15H). Entre J63-98 maximum : mise à mort précoce et prélèvement des tissus pour différentes analyses, et mise à mort précoce pour l'étude de survie à l'âge de 4 mois.
Impact sur les animaux
La contention peut causer un stress léger de courte durée. La biopsie de queue peut occasionner une douleur légère de quelques secondes. douleur légère au point d'injection. risque de fausse route. Baisse de la fonction du rein.
Devenir
Mise à mort pour prélèvement d'organes nécessaires aux analyses prévues dans le projet.
Remplacement
Dans un contexte de recherche physiopathologique sur des anomalies de croissances cellulaires , les intéractions complexes entre différents types cellulaires et d'autres organes ne peuvent être étudiés de façon complète que sur des animaux entiers rendant le modèle indispensable. Les expérimentations chez ces modèles sont nécessaires pour répondre à notre objectif.
Réduction
Des études préliminaires dans des modèles cellulaires ont déjà été menées. Le nombre d’animaux nécessaire pour l'élevage et l'analyse des résultats a été évalué statistiquement par des logiciels dédiés.
Raffinement
Les souris bénéficieront d'un enrichissement et des mesures de raffinement ont été mis en place avec une surveillance quotidienne par les membres qualifiés de l'animalerie et lors de l'entrée en procédure par les responsables de projet afin de détecter tout signe de douleur ainsi que les weekends par les personnes d'astreinte. L'application de points limites stricts et spécifiques au projet seront respectés par les responsables du projet qui tiendront une fiche d’observation des points limites précoces stricts et adaptés.
Choix des espèces
La physiologie de la souris est proche de celle de l’Homme, L’étude de souris génétiquement modifiées est particulièrement intéressante pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques et les résultats obtenus peuvent être transposables chez l’Homme. Le modèle d'anomalie de croissance est un modèle idéal pour modéliser cette maladie et représente un modèle communément utilisé dans ce domaine de recherche. De nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale.
Modèle de neuropathie induite par un anticancéreux : évaluation des atteintes nerveuses, rénales et musculaire
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
Développer un modèle vendable de neuropathie, d'atteinte rénale et de fonte musculaire liées aux anticancéreux, telle est la finalité annoncée pour 900 rats, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent l'anticancéreux de façon chronique, subissent des mesures de sensibilité mécanique de trente minutes, jusqu'à huit prélèvements sanguins et vingt heures en cage métabolique individuelle sans litière. Le porteur décrit une perte de poids musculaire importante, une perte d'appétit, une hypersensibilité à la douleur et une baisse de production d'urine, et signale que les traitements répétés génèrent un stress chronique. L'établissement présente ce modèle comme une ouverture de son "catalogue" d'études précliniques à un domaine où les organes atteints constituent son expertise.
Objectifs
Certaines thérapies anti-cancéreuses ont des effets néfastes sur la fonction rénale, les fibres nerveuses et/ou le poids et la masse musculaire. De nombreuses stratégies thérapeutiques sont en cours d’étude pour limiter ces effets secondaires irréversibles. Pour pouvoir tester ces stratégies, il nous faut mettre en place des modèles animaux adaptés tels qu’un modèle de rats traités chroniquement avec un composé anti-cancéreux pour induire la neuropathie (atteinte nerveuse), la néphropathie (atteinte rénale) et la cachexie (atteinte musculaire) associé aux traitements anti-cancéreux.
Bénéfices attendus
En proposant un modèle de rat d’étude préclinique de neuropathie, de néphropathie, de cachexie associées à l’utilisation d’anti-cancéreux, nous ouvrons notre catalogue à un nouveau modèle d’étude préclinique dont les organes atteints constituent notre expertise et nous permettra l’étude de nouvelles molécules. Également par la mise en place de ce modèle, nous permettrons d’éclaircir les mécanismes mis en place pour le développement de ces atteintes et nous permettrons ainsi un gain de connaissance.
Procédures
Les rats recevront des administrations de divers composés (anticancéreux et composés à tester), les administrations se font sur animal vigile (environ 30 secondes) ou sur animal anesthésié (environ 2 minutes). La composition corporelle est réalisée sur animal vigile et dure environ deux minutes et est indolore et peu stressante. La sensibilité mécanique est réalisée sur animal vigile et dure environ 30 minutes où l'animal est dans une petite cage et un stimulus mécanique est appliqué maximum 5 fois 10 secondes à intervalle de 5 minutes. La force musculaire est réalisée sur animal vigile, cette mesure dure envrion 5 minutes (3 mesures de quelques secondes espacées de 30 secondes). Pour mesurer le débit de filtration du rein, l'animal est anesthésié pendant 5 minutes pour placer le moniteur sur dos et injecter le composé fluorescent puis il est réveillé et maintenu en cage individuelle pendant 2h de mesure. Le moniteur est ensuite retiré et l'animal est remis dans sa cage d'origine. Toutes ces mesures seront réalisées 2 fois durant la période de traitement. En fin de période de traitement, nous récolterons l'urine sur une durée de 20h, l'animal sera donc mis en cage individuelle à métabolisme. Des prélèvements de sang auront lieu jusqu'à 2 fois par semaine (soit 8 prélèvements maximum) , sur animal anesthésié (2 minutes) ou vigile (30 secondes).
Impact sur les animaux
1 – l’intoxication avec l'anticancéreux : les animaux vont être atteints d’effets secondaires altérant leur bien-être tels qu’une perte de poids notamment musculaire importante, une perte d’appétit, une neuropathie se traduisant par une hypersensibilité au stimuli mécanique, une atteinte rénale altérant leur production d’urine et leur prise hydrique 2 - Les mesures réalisées : L’analyse de la sensibilité mécanique au niveau de la voûte plantaire et la mesure de la force musculaire peut induire un inconfort ou possiblement une douleur. La mesure de débit de filtration du rein nécessitant une anesthésie entraine des conséquences sur la prise alimentaire et hydrique les heures suivant le réveil ou la survie si l’animal ne répond pas bien à l’anesthésie. Enfin, la cage métabolique, où l’animal est isolé et dans une cage sans litière peut induire un stress et modifier le comportement de l’animal. La mesure de la composition corporelle consiste à restreindre l’animal pendant quelques minutes dans un tube à contention limitant ses mouvements 3 – Les traitements réalisés à répétition génèrent un stress chronique. Après chaque geste technique, l’état de l’animal sera surveillé : apathie, prostration, agressivité, etc.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort pour pouvoir prélever et analyser les organes cibles.
Remplacement
Les effets secondaires à l’utilisation d’anticancéreux touchent de nombreux organes (neurones, reins, muscles). Nous pouvons reproduire certains effets in vitro en mettant en culture des neurones et en les mettant en contact avec l'anticancéreux. Les atteintes au niveau du rein peuvent être étudiées à partir de culture de cellules rénales in vitro mais le modèle est discutable car il ne mime par réellement l’organisation cellulaire du rein. Ces deux possibilités sont actuellement étudiées mais ne répondront pas totalement au besoin puisque les effets secondaires des anticancéreux sont multiorganiques et nécessitent l’utilisation d’un animal vivant dans son entier.
Réduction
Toutes les procédures nécessaires à la caractérisation des effets secondaires aux anticancéreux ou leurs résolutions, le cas échéant, seront réalisées sur le même animal afin de réduire le nombre d'animaux inclut dans l'étude.
Raffinement
Une double litière sera déposée en fond de cage en cas de polyurie pour éponger l'urine produite au maximum et garantir le confort de l'animal. Dès la première injection de l'anticancéreux, le bien-être de l’animal sera suivi quotidiennement (mesure du poids 3 fois semaines) par les zootechniciens et la SBEA (Structure du Bien Etre Animal). Jusqu'en fin d'étude, des changements significatifs dans le comportement des rats peuvent être annonciateurs de douleur : une démarche altérée ou une posture recroquevillée ou une déshydratation/perte d’appétit ou les yeux mi-clos ou une absence de selles ou une diarrhée, ou une absence de comportement de toilettage ou à l’inverse un léchage excessif ou une sécrétion de porphyrine au niveau du nez et des yeux, entraineront un examen clinique poussé. Si l’état clinique de l’animal venait à se dégrader et atteindre les points limites fixés, ce dernier sera mis à mort. En cas de déshydratation, une injection sous cutanée de solution de réhydratation est envisagée sur 2 à 3 jours maximum au-delà, l’animal sera mis à mort. En cas d’hypothermie, l’animal peut être placé en armoire chauffante pendant maximum 2-3 jours. Les prélèvements de sang effectué en cours et en fin d’étude se feront en respectant les volumes préconisés par les règles éthiques et avec une couverture anesthésique et analgésique adaptée. Une phase d'habituation sera réalisée pour la mise en cage a métabolisme et la mesure de sensibilité mécanique (sans stimulation) pour limiter le stress de l'animal. Parce qu’elle est stressante et peut induire une perte de poids, la procédure impliquant l’utilisation de cage métabolique se fait la veille de la mise à mort. Pour limiter le stress, les cages étant transparentes et les unes à côté des autres, les rats peuvent voir leur congénère à proximité. Mais pour laisser la possibilité au rat de se cacher, un papier occultant à moitié la vue sera positionné sur les cages. Enfin, en cas d'apparition de plaies en cours d’étude, des soins seront réalisés.
Choix des espèces
Le rat est une espèce répondant correctement à l'anticancéreux. Les rats seront commandés à l’âge adulte.