Multisystémique

Les animaux qui perdent plus de 20 % de leur poids en trois jours, avec prostration et dos courbé, sont mis à mort. 4 750 souris, rats et hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélever foie, sang et tissus. Ils reçoivent des régimes gras et sucrés, parfois additionnés d'éthanol, pendant jusqu'à 60 semaines, avec un ou deux gavages par jour, des tests de tolérance au glucose, des séjours de 40 heures en cage individuelle sans enrichissement et des courses de 20 minutes sur tapis roulant. Le porteur retient le hamster parce qu'il consomme spontanément l'alcool, et rattache ce choix à la hausse de la consommation humaine depuis les confinements liés au COVID-19.

Objectifs

L’augmentation de l'urbanisation dans le monde, combinée à la consommation d'aliments contenant des quantités importantes de graisses, d’acides gras saturés et de fructose sont considérés comme les principaux responsables des troubles métaboliques. Les mécanismes physiologiques ancestraux favorisant le stockage de l'énergie sous forme de graisse dans le tissu adipeux, le foie et le sang pour assurer la survie de l’individu en cas d’absence de nourriture, sont maintenant associés à l’obésité, la résistance à l'insuline, au diabète de type 2 et la Stéatose Hépatique Non-Alcoolique (NASH) . Dans ce contexte, un effort de recherche continu est engagé pour développer un ou des traitement (s) pour lutter contre ces dysfonctionnements. Ces dysfonctions métaboliques sont très complexes et sont liées entre elles, les études in vitro servent pour cibler le potentiel thérapeutique des molécules mais il est essentiel de pouvoir tester ces molécules sur des modèles animaux proche de l'Homme. Il est important de mesurer les dysfonctions métaboliques, cardiaques et rénales car à ce jour, il n’y a pas de thérapies efficaces pour les traiter. En outre, ces modèles animaux ne tiennent pas compte du fait que les patients atteints de NASH consomment également de l'alcool. Il a été démontré que la consommation d'alcool favorise la progression de la NASH vers des formes plus sévères. De plus, cette consommation d'alcool a considérablement augmenté dans la population générale depuis la pandémie de COVID-19, à cause des périodes de confinements. Par conséquent, il est important d'inclure la contribution de l'alcool dans les complications hépatiques liées à l'obésité et la NASH afin de mieux modéliser le contexte humain. Si les modèles d'alcool chez le rat ou la souris ne sont pas très pertinents car ces deux espèces ne sont pas naturellement attirées par l’alcool, le hamster est un modèle intéressant car il consomme spontanément et métabolise efficacement l'éthanol. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés, a lieu dans la poche pré-gastrique. Ces modèles seront utiles pour tester des thérapeutiques potentielles ciblant l'obésité, le diabète, la dyslipidémie, la stéatose, la NASH, la fibrose et l'inflammation.

Bénéfices attendus

L'intérêt de ce projet est le développement de modèles nutritionnels ressemblant à la réalité humaine occidentale (sédentarité et régime hyperénergétique avec ou sans alcool) qui permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans le développement des maladies métaboliques et ainsi de tester et valider plus rapidement de nouvelles thérapies pour le traitement de l'obésité, de la NASH, de la fibrose, des maladies cardiovasculaires et rénales associées aux maladies métaboliques, qui sont parmi les maladies les plus problématiques pour la santé publique française et mondiale.

Procédures

Pour induire des dysfonctions métaboliques, des régimes hypercaloriques associés ou non à des boissons enrichies en fructose et/ou en éthanol et/ou en composé chimique pro-inflammatoire seront mis à disposition dans les cages d'hébergement à partir de 4 ou 6 semaines d'âge et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines). Les composés à tester/de référence seront administrés une à deux fois par jour par toutes voies possibles (1 minute sur animal vigile et 5 minutes sur animal anesthésié). 3 prélèvements de sang seront réalisés au cours de la vie de l’animal afin de suivre des paramètres biologiques ou l’élimination des produits testés. Un prélèvement de sang dure environ 2 minutes par animal. Dans le cas de prélèvements de sang visant à quantifier des paramètres métaboliques, les animaux seront mis à jeun 6h maximum avant le prélèvement. Des tests de tolérance au glucose et à l’insuline pourront être effectués la semaine précédant la fin de projet. La surcharge en glucose ou en insuline pour un animal diabétique induit une difficulté de retour à l’euglycémie. Si l’animal montre des signes de détresse, nous pourrons l’aider à retrouver une glycémie normale en administrant soit du glucose soit de l’insuline. Pour mesurer la fonction cardiaque, nous ferons des échocardiographies sur animal anesthésié en fin de projet (durée inférieure à 30 min). Pour mesurer la dépense énergétique, nous hébergerons les animaux pendant 40h en cage individuelle sans enrichissement, en début, milieu et fin de période de traitement. POUR MESURER LA FORCE MUSCULAIRE, NOUS TESTERONS L'AGRIPPEMENT SUR GRILLE (2 MINUTES DE FACON HEBDOMADAIRE) ET LA DUREE DE COURSE SUR TAPIS ROULANT EN MESURANT LES ECHANGES GAZEUX (20 MINUTES TOUS LES 15 JOURS). Pour mesurer l'impact sur la fonction rénale, nous mesurerons le débit de filtration glomérulaire en début et en fin de projet et la mesure de divers paramètres urinaires en cage métabolique uniquement en fin de projet. Cela consiste à administrer un composé fluorescent par voie veineuse (sous anesthésie pendant environ 10 minutes) et de mesurer sa distribution via un capteur posé sur la peau pendant 2h (animal vigile). Pour faire les échographies, nous devrons au préalable épiler les animaux, sous anesthésie pendant environ 10 minutes. Les récoltes d'urine se feront sur 24h en cage métabolique.

Impact sur les animaux

Les animaux seront nourris à partir de 4 ou 6 semaines d'âge en fonction de la procédure et jusqu'à la fin du projet (jusqu’à 60 semaines) avec des régimes enrichis en graisse et ou en sucre, cela va modifier leur métabolisme. Les effets indésirables sont les dysfonctions métaboliques : obésité, diabète, stéatose hépatique qui peuvent engendrer de la douleur. Les administrations et les prélèvements peuvent engendrer un léger stress et une douleur légère. Les animaux auront des mises à jeun alimentaires de 6 heures maximum. Certaines techniques nécessitent une anesthésie légère, l’animal peut mettre quelques minutes à récupérer. Durant les récoltes urinaires, les animaux seront isolés et hébergés sur grille pendant 24h.

Devenir

En fin de projet, tous les animaux seront euthanasiés pour récupération de tissus et de sang, et évaluation de critères d’efficacité des composés (histologie, immuno marquages et expression de gènes dans le foie, paramètres métaboliques et de fonction hépatique dans le sang...)

Remplacement

Des projets de cultures ainsi que de co-cultures cellulaires sont de plus en plus développées pour tenter de mimer les différents organes. Ce seront des alternatives à l'utilisation de l'animal, notamment pour les études de screnning, de toxicité et d'efficacité sur l’organe cible. Cependant, ces modèles ne sont encore suffisamment développés et ne sont pas un miroir suffisamment fiable de ce qu'il se passe dans la complexité de l’organisme. Les dysfonctions métaboliques associées aux complications hépatiques, cardiovasculaires et rénales ne peuvent être envisagées et reproduites que dans un système in vivo pour le moment.

Réduction

Avec un nombre final d'animaux égal à 10 par groupe de traitement, une différence de +/- 30% est théoriquement détectable. La stratégie expérimentale consiste à mesurer les valeurs de chaque paramètre mesurable de façon longitudinale (taux de lipides, glycémie, taux de transaminases, marqueurs inflammatoires dans le sang/plasma), l'animal est donc son propre contrôle, dans la mesure du possible, ce qui permettra de réduire le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Plusieurs types d'enrichissements seront placés dans les cages hébergeant les animaux : des objets en bois seront systématiquement ajoutés pour permettre aux rongeurs de les mordiller. En effet, le régime gras est assez mou contrairement aux croquettes classiques, donc cet enrichissement est très adapté. La durée de ces projets étant souvent longue, nous alternerons les enrichissements au fil du temps (petits ou gros tunnels, boules ou briquettes en bois, lanières de papier ou morceaux de coton). L'état des animaux sera contrôlé quotidiennement, le poids corporel, la prise alimentaire et la prise hydrique seront mesurés par du personnel compétent afin de s'assurer de leur bien-être. Si un animal ne suit pas la courbe de poids attendue, une recherche approfondie d’éventuels symptômes sera faite. Les points limites de ce projet seront les suivants : absence de mouvement, piloérection et dos courbé. Si un animal présente des signes de stress ou de douleur, il sera pris en charge par l'équipe zootechnique et la structure du bien-être animal. Des soins tels que : hydratation et mise en place de nourriture dans la litière si nécessaire seront effectués. Si l'animal présente une dermatite, par exemple, un protocole de soin sera effectué (nettoyage / désinfection / cicatrisation). Si l'état de l'animal ne s'améliore pas dans les 48 heures, les expérimentateurs compétents excluront l'animal de l'étude et l'euthanasieront. Si un animal atteint l'un des points limites, il sera euthanasié immédiatement. Pendant la phase de traitement, si la perte de poids est supérieure à 20% en l'espace de 3 jours et associée à d'autres signes tels que la prostration, le dos courbé et l'absence de toilettage, l'animal doit être euthanasié ou la dose et la fréquence de traitement adaptées.

Choix des espèces

Les souris et les rats sont suffisamment caractérisés pour l'étude des maladies métaboliques. Les hamsters présentent un métabolisme du cholestérol et des acides biliaires semblable à celui des humains. Les rats et les hamsters peuvent aider à étudier les effets de médicaments potentiels pour les complications cardiovasculaires (dysfonctionnement diastolique) et rénales. Chez les hamsters, la combinaison d'un régime riche en graisses, en cholestérol et en fructose et de la consommation d'alcool peut imiter le mode de vie de certains patients atteints de NASH, notamment pendant et après le confinement lié à la pandémie COVID-19. Si le modèle associé à la consommation d'alcool chez le rat ou la souris n'est pas très pertinent, le hamster est un modèle intéressant car il consomme et métabolise l'éthanol très facilement. Cette capacité serait liée à l'anatomie particulière de l'estomac du hamster, qui se compose de deux compartiments où la fermentation alcoolique des aliments ingérés a lieu dans la poche prégastrique. Les animaux sont utilisés à partir de 4 ou 6 semaines d’âge afin d'être similaire à la problématique humaine (sédentarité et alimentation hyper énergétique) dès le jeune âge.

Une partie des souris utilisées développe spontanément une maladie auto-immune dès vingt-cinq semaines d'âge, et le projet cherche à accélérer ce développement par une infection. 240 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole ou plus tôt si elles atteignent un point limite. Les expérimentateurs leur injectent des bactéries dans l'abdomen pour provoquer un sepsis, les traitent aux antibiotiques deux heures après, puis prélèvent leur sang derrière l'œil sous anesthésie jusqu'à cinq fois, avec cinq à dix semaines entre deux prélèvements. Une partie d'entre elles sera gardée jusqu'à quarante semaines après l'infection, le porteur indiquant ne pas pouvoir prédire les symptômes qui apparaîtront.

Objectifs

Les maladies auto-immunes à autoanticorps sont des maladies où le système immunitaire, qui est censé protéger le corps, se met à produire des anticorps contre l’organisme lui-même (autoanticorps), et à attaquer certains organes voire tout le corps (on dit alors que c’est systémique). Ces maladies sont rares (moins d’une personne sur 2000) et peuvent être causées par l’environnement (comme la pollution ou l’alimentation), des hormones (elles touchent plus souvent les femmes), et/ou des prédispositions génétiques, c’est-à-dire que certaines personnes sont plus à risque à cause de leurs gènes. On a remarqué que les personnes qui font une infection grave (comme un sepsis, qui est une infection très sévère) et qui vont en réanimation ont un risque cent fois plus élevé que les autres de développer une maladie auto-immune dans les six mois qui suivent leur sortie de l’hôpital. On ne comprend pas pourquoi, après une infection très grave, certains patients développent une maladie auto-immune et d’autres non. Si on arrive à prédire quels patients risquent de développer ce genre de maladies dans ces conditions, on pourra mieux les soigner et essayer d’empêcher que la maladie auto-immune ne se développe, car ces maladies diminuent la qualité de vie des patients et coûtent très cher à la société. Notre projet a pour but de comprendre comment une infection grave peut déclencher une maladie auto-immune, en utilisant des souris pour faire des expériences et observer ce qu’il se passe. On veut répondre à deux questions principales : 1) Est-ce qu’une infection sévère peut déclencher une maladie auto-immune chez des souris déjà à risque ? 2) Est-ce qu’une infection sévère peut aussi déclencher une maladie auto-immune chez des souris normales qui ne sont pas à risque ? En comprenant mieux ces mécanismes, on espère trouver de nouvelles façons d’identifier les individus à risque et ainsi améliorer leur prise en charge et mettre en place des stratégies de prévention.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet se situent à deux niveaux. Le premier niveau concerne les connaissances scientifiques car le projet permettra d’accroître la compréhension des mécanismes du lien entre infection sévère et développement de l’auto-immunité. Les cellules et molécules impliquées dans cette induction auto-immune seront ainsi identifiées. Le deuxième niveau concerne la santé humaine. En effet, la compréhension de ces mécanismes et l’identification des biomarqueurs (marqueurs de maladie faciles à détecter dans le sang ou les urines) associés à cette évolution de l’inflammation aiguë vers l’auto-immunité permettront de pouvoir identifier les patients à risques et de prévenir le développement de telles affections chroniques.

Procédures

Les animaux utilisés dans ce projet seront soumis à 3 types d’interventions : des injections dans le ventre (« intrapéritonéales ») et sous la peau (« sous-cutanées), des contentions (attrapés et immobilisés dans une main) et les animaux seront soumis au prélèvement d’un petit volume de sang sous anesthésie générale. Les gestes réalisés durent moins de 30 secondes chacun. L'anesthésie générale dure entre 1 et 2 minutes. Des animaux seront injectés par voie intrapéritonéale avec des bactéries une seule fois pour imiter une infection sévère. 2 heures plus tard, elles seront traitées avec des antibiotiques par injection sous-cutanée quatre fois sur une période de 24h dans le but de les guérir de l’infection, comme les patients en réanimation. Ces souris auront un prélèvement sanguin sous anesthésie générale avant l’infection, puis certaines seront à nouveau prélevées 4 fois avec 5 à 10 semaines entre deux prélèvements. Cela nous permettra de comparer les paramètres sanguins des souris avant et après infection pour voir si elles ont développé une maladie auto-immune.

Impact sur les animaux

Certaines souris utilisées ici développent une maladie auto-immune légère mais quantifiable dès 25 semaines d’âge. Ces animaux entreront en procédure à l’âge de 10 semaines (+/- 2 semaines), c’est-à-dire à l’âge adulte, et ne seront conservés que deux semaines supplémentaires après l’infection sévère traitée par antibiotique. Nous nous attendons à cette procédure entraîne une accélération du développement de la maladie avec des signes d’auto-immunité à 12 semaines d’âge équivalents à ceux d’animaux non-infectés de 25 semaines. Une autre procédure utilisera des animaux normaux qui seront conservés sur un maximum de 40 semaines après l’infection sévère afin de déterminer s’ils développent une maladie auto-immune ou non, sans que nous puissions prédire concrètement les symptômes éventuels induits. Une grille d’évaluation clinique sera utilisée sur toute la durée de l’expérience afin d’éviter les éventuelles nuisances sur le bien-être des animaux. Lors des procédures, les souris seront soumises à quatre types de nuisance. 1) les contentions nécessaires à la réalisation des actes (injections et prélèvements d’urine) entraîneront un stress léger et bref pour les animaux (moins de 30 secondes chacun). 2) les injections intrapéritonéales (ip) et sous-cutanées (sc) (1 ip et 4 sc/animal réparties sur 24 heures) entraineront des douleurs brèves de piqure à chaque occurrence (moins de 30 secondes). 3) les prélèvements sanguins de faible volume par voie rétro-orbitale sous anesthésie générale gazeuse (1 à 2 minutes) pourront entraîner ensuite un inconfort à l'orbite le temps que la cicatrisation soit complète (24 heures). 4) l’infection entraînera une gêne pour les souris (fièvre et inconfort) durant les deux premières heures. Le traitement antibiotique sera alors réalisé ce qui soulagera les souris rapidement.

Devenir

Les animaux seront systématiquement euthanasiés en fin de procédure pour analyse ou avant dans le cas d’atteinte de points limites.

Remplacement

Les études des maladies de systèmes (impactant différents organes) et de leurs traitements (validés ou expérimentaux) nécessitent de pouvoir tester les hypothèses sur des organismes entiers vivants avant de pouvoir passer chez l’humain. La localisation et l’activation des cellules d’intérêt au cours du développement des maladies étudiées ne peuvent être observées que dans des organismes entiers. Les études in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité des organismes, ni des maladies étudiées, ni de la séquence infection/auto-immunité à l’échelle d’un organisme. Malheureusement, aucune des technologies actuelles ne peut se substituer aux modèles animaux dans ce domaine. Nous ne pouvons donc pas utiliser d’autre approche que l’expérimentation animale pour ces études visant à améliorer la prise en charge des patients.

Réduction

Dans notre laboratoire, on a déjà fait le modèle de péritonite avant, ce qui nous permet d’utiliser seulement le nombre de souris nécessaire. Il y aura 10 souris par groupe pour bien prendre en compte les différences entre chaque animal et voir comment ils réagissent à l’infection et au risque de maladies auto-immunes. Cela nous aide à être sûrs que nos résultats sont fiables et qu’on peut vraiment voir s’il y a une différence entre les groupes, sans utiliser plus d’animaux que nécessaire. Les souris qui servent de contrôles seront juste traitées avec des antibiotiques et on n’ajoutera pas d’autres groupes pour ne pas en utiliser trop. Après les expériences, on gardera des échantillons pour pouvoir répondre à d’autres questions plus tard, toujours dans l’idée d’utiliser le moins d’animaux possible. Enfin, pour prouver que nos résultats sont solides et que l’expérience peut être refaite par n’importe quel autre laboratoire avec le même résultat, on fera chaque test trois fois, ce qui est le minimum demandé pour que ce soit accepté scientifiquement.

Raffinement

Avant et pendant les expériences, les souris vivent dans de bonnes conditions pour éviter qu’elles soient stressées. Elles ne sont jamais seules, ont toujours des objets pour s’occuper (comme du coton pour faire leur nid ou des petites maisons pour se cacher) et sont observées tous les jours. Pendant les expériences, on fait tout pour que les souris souffrent le moins possible. Après l’infection, on les surveille toutes les 6 heures pendant 24 heures et il n’y a que quelques souris à la fois pour pouvoir bien toutes les observer. Le traitement avec des antibiotiques commence 2 heures après que les souris ont reçu les bactéries, et donc aucune ne mourra à cause de cela. Si une souris est trop malade, elle sera euthanasiée tout de suite, sans attendre la fin de l’expérience. L’état de santé des souris est suivi grâce à une grille d’évaluation. On regarde à chaque fois trois choses : sa posture, sa façon de bouger et l’état de ses poils. À chaque critère, on donne un score de 0 à 3. Si la souris a 6 points ou plus au total, ou si elle a 3 points dans la posture ou la mobilité, elle sera euthanasiée. Après le traitement, en plus de surveiller les souris chaque jour, on continue de calculer les scores des souris chaque jour pendant 3 jours, puis une fois par semaine pendant 40 semaines, pour vérifier si elles restent en bonne santé. On regarde aussi leur poids et si elles n’ont pas de problèmes de peau, de poumons ou d’articulations. Si une souris atteint certains scores qui montrent qu’elle va trop mal, elle est euthanasiée et analysée immédiatement.

Choix des espèces

Notre projet s’inscrit dans l’objectif de définir des mécanismes de développement de maladies d’intérêt pour la santé humaine afin de pouvoir améliorer la prise en charge des patients. Les procédures et les souris utilisées dans le présent projet nous permettront d’atteindre cet objectif. L’espèce Mus musculus domesticus est le seul modèle de mammifères disposant des lignées modifiées génétiquement pertinentes pour les objectifs scientifiques de notre projet et dont la biologie se rapproche suffisamment de la biologie humaine pour que son étude puisse y être transférée. De plus les outils d’analyse disponibles et l’expertise acquise des modèles utilisés ici justifient l’utilisation de ce modèle. Les animaux entrant en procédure auront tous un âge supérieur ou égal à 10 semaines (stade adulte). Ce stade adulte correspond au stade de la population de patients concernés par la présente investigation.

Tuées à l'issue des tests pour que leurs organes soient analysés, 960 souris atteintes d'un modèle du syndrome de Wolfram vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection intrapéritonéale par jour pendant quinze jours consécutifs, puis passent un test de vision de trente minutes sur animal vigile et deux explorations fonctionnelles sous anesthésie, dont un test d'audition d'une heure. Ces souris perdent la vue et l'audition et développent un trouble vestibulaire qui les rend hyperactives, au point que le porteur remplace les abris en matériau dur par du carton pour qu'elles ne se blessent pas. Il conclut que tous ses tests d'exploration fonctionnelle sont indolores.

Objectifs

Le syndrome de Wolfram est une maladie multi-organe caractérisée par des diabètes ,une surdité , une cécité, et des signes neurologiques. A ce jour, aucun traitement pour lutter contre la progression de cette maladie n’existe. L'objectif principal de ce projet de recherche est de déterminer le potentiel thérapeutique de cinq composés chimiques sur les pertes visuelles et auditives de ce modèle murin de la maladie. MODIFICATION: ce projet prévoyait, initialement, le test de cing composés chimiques. Un nouveau composé a été identifié et semble plus prometteur que les précédents, faisant passer le nombre de composés à tester à six.

Bénéfices attendus

Les stratégies thérapeutiques dans le syndrome de Wolfram sont actuellement basées sur la prévention et le traitement des complications pour améliorer le bien-être des patients. Aucun traitement n'est disponible pour arrêter la progression de cette maladie. Ce projet va permettre, d'apporter une preuve de concept d'efficacité de composés développés/cédés par des chimistes sur un modèle murin de la maladie.

Procédures

Les gestes techniques à réaliser lors de ce projet sont les suivants : identification par marquage à l'oreille - injection en intrapéritonéal sur animal vigile - tests fonctionnels d'évaluation de la vision et de l'audition sous anesthésie et sur animal vigile. Chaque animal sera identifié une fois. Les injections quotidiennes en intrapéritonéales seront effectués pendant 15 jours consécutifs. Un test de vision sur animal vigile sera effectué à un mois (test de 30min). Les animaux seront anesthésiés 2 fois, à 3 jours d'intervalle pour les tests d'exploration fonctionnelle (test de surdité, test d'une heure et test de vision, test de 30min).

Impact sur les animaux

Les effets attendus seront "légers" à "modérés". La procédure d'identification peut engendrer du stress. Les souris vont développer en plus de la cécité et de la perte d'audition, un trouble vestibulaire qui entraine une hyper activité et qui peut générer un inconfort des souris Les animaux seront sous surveillance quotidienne. Une feuille de suivi a été mise en place afin de garantir le bien être animal. Les animaux présentant au moins un des points limites seront systématiquement euthanasiés. Les injections en intrapéritonéal n'entrainent généralement pas de complication. Si l'animal présentait une perte de poids importante, ou un mauvais état du pelage, les injections seraient interrompues. Tous nos tests d'explorations fonctionnelles sont indolores.

Devenir

A l'issue de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs organes collectés pour procéder aux analyses permettant la compréhension des mécanismes mis en jeu.

Remplacement

L'utilisation de modèle murin du syndrome de Wolfram pour ce projet est indispensable car ce modèle est le seul recours mammifère autre que l'humain à présenter les symptomes de ces pathologies rapidement permettant l'élaboration d'un traitement curatif. L’utilisation de modèles animaux demeure essentielle pour décrypter le vivant. Aucune alternative à ce jour ne peut s'y substituer totalement. Même si les méthodes in vitro ou in silico jouent un rôle important dans de nombreux projets de recherche, elles ne permettent pas, seules, de comprendre et de reproduire les interactions multiples au sein d’un organisme vivant.

Réduction

Notre expérience de plus de 20 années de mesures fonctionnelles chez la souris (vision et audition), nous montre que des lots de 10 animaux par groupe sont nécessaires et suffisants pour assurer des tests statistiques fiables. Les mêmes lots d'animaux seront utilisés pour des tests de vision et d'audition afin de réduire le nombre total d'animaux, sans impacter sur leur bien être. Enfin les analyses biochimiques et histologiques seront réalisées sur les mêmes animaux.

Raffinement

Nous procéderons à l'enrichissement du milieu avec accès à des maisons en carton et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. Les animaux seront manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur. L'état des animaux sera suivi régulièrement avec une surveillance journalière. En plus des procédures habituelles d’hébergement, une attention particulière sera portée à la litière des animaux. Si une augmentation de la production d'urine à la suite du développement d'un diabète est constatée, le fond de cage sera renouvelé plus fréquemment. Pour limiter l’agitation des souris présentant un syndrome vestibulaire, l’enrichissement sera renforcé dans les cages. Enfin, pour éviter que les souris présentant un syndrome vestibulaire ne puissent se blesser, les abris utilisés pour enrichir les cages seront en carton et non en matériau dur.

Choix des espèces

La pathologie du syndrome de Wolfram est une pathologie multiorgane où les altérations neurosensorielles s'accompagnent de signes neurologiques, cognitifs et endocrinologiques. Un modèle rongeur permet de caractériser les signes d'altérations sensorielles (vision, audition) et d'ainsi tester le potentiel thérapeutique d'une ou plusieurs molécules thérapeutiques. L'injection de molécule à tester sera réalisée tous les jours, pendant 2 semaines consécutives. Des tests d'audition et de vision seront réalisés à un mois, age auquel les souris perdent la vision et l'audition, afin d'évaluer l'efficacité de ces molécules sur les pertes neurosensorielles du modèle souris du syndrome de Wolfram.

112 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune maintenue à la main pour l'application du produit jusqu'à quarante fois de suite dans le protocole chronique, douze fois dans le protocole aigu. Les procédures relèvent d'un niveau de souffrance modéré. Les oreilles sont rasées sous anesthésie au premier jour, puis une substance y est appliquée pour déclencher une dermatite atopique, ce qui provoque des démangeaisons et un comportement de grattage, avant un prélèvement sanguin terminal et la mise à mort. Le porteur espère que l'oncostatine M deviendra une cible pour de futures biothérapies, en reconnaissant que son implication directe dans la maladie n'a jamais été démontrée dans un organisme vivant.

Objectifs

La dermatite atopique est une maladie inflammatoire chronique de la peau fréquente en Europe, touchant aussi bien les enfants que les adultes. Elle se caractérise par une inflammation persistante de la peau et une altération de sa fonction de barrière naturelle qui nous protège de la pénétration des micro-organismes pathogènes. Cette maladie pose un problème de santé publique car il n’existe pas vraiment de solution pour la guérir. Les personnes atteintes par cette maladie produisent une molécule inflammatoire appelée oncostatine M dont on soupçonne le rôle délétère sur le système immunitaire et son implication dans le développement de cette maladie. Ce projet a donc pour objectif d’étudier le rôle de l’oncostatine M dans le développement et le maintien de l’inflammation de la peau. Bien que l’oncostatine M soit présente dans les lésions de dermatite atopique chez l’être humain, son implication directe dans cette maladie n’a jamais été démontrée dans un organisme vivant. Pour cela, le projet utilisera un modèle de dermatite atopique chez la souris afin de comparer l’évolution de la maladie chez des animaux produisant l’oncostatine M et chez des animaux génétiquement modifiés qui ne produisent pas cette molécule.

Bénéfices attendus

Les résultats de cette étude nous permettront de faire progresser les connaissances sur le rôle de l’oncostatine M dans le développement de la dermatite atopique. A plus long terme, s’il s’avère que l’oncostatine M joue un rôle important dans le développement et/ou le caractère chronique de la maladie, celle-ci pourrait constituer une nouvelle cible pour le développement de biothérapies visant à bloquer les effets de cette molécule proinflammatoire, telles que le développement d'anticorps bloquants ciblant l'oncostatine M. Dans un contexte où le nombre de biothérapies pour le traitement de la dermatite atopique est actuellement limité et où certains patients peuvent être non-répondeurs ou développer des résistances à ces traitements, il est nécessaire de pouvoir identifier de nouvelles cibles pour développer ces nouveaux outils thérapeutiques.

Procédures

Pour tous les animaux inclus dans cette étude, une anesthésie sera pratiquée, une seule fois, le premier jour afin de pouvoir immobiliser l’animal pendant le temps de rasage des oreilles (pendant 10 secondes) à l’aide d’une tondeuse puis d’appliquer localement le traitement sur la peau pour induire la dermatite atopique (pendant 10 secondes) et mesurer l’épaisseur de la peau de manière non-invasive (10 secondes par oreille). Les jours suivants, les traitements et mesures seront effectuées sur animal vigile pour éviter les anesthésies répétées. Tous les animaux inclus dans cette étude seront donc brièvement maintenus par l’expérimentateur afin de permettre l’application locale du traitement sur la peau pour induire la dermatite atopique et mesurer l’épaisseur de la peau de manière non-invasive pendant une durée maximale de 20 secondes. Cette contention manuelle de courte durée peut entraîner un stress léger et transitoire. Elle sera répétée 12 fois pour les animaux qui sont inclus dans le protocole d’induction aigue, à court terme, et répétée 40 fois pour les autres animaux qui sont inclus dans le protocole d’induction chronique, à long terme. En fin de protocole, une analgésie et une anesthésie profonde seront réalisées pour effectuer un prélèvement sanguin terminal d’une durée de 30 secondes au maximum et la mise à mort des animaux en vue de collecter les échantillons biologiques.

Impact sur les animaux

Au début du protocole, l'induction d'une anesthésie et le réveil après anesthésie provoquent un stress léger et transitoire des animaux. L’injection pour induire l’analgésie et l'anesthésie à la fin du protocole crée une douleur légère et transitoire. Les protocoles d'induction d'une dermatite atopique aigue et chronique provoquent un prurit susceptible d'occasionner un comportement de grattage des animaux.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le projet seront mis à mort de manière à collecter les différents échantillons biologiques (sang, peau de l'oreille) pour effectuer des analyses moléculaires et des analyses de tissus par microscopie.

Remplacement

Des études précédentes ont été réalisées in vitro pour décrire les propriétés de l'oncostatine M dans différents modèles de culture de cellules cutanées d’origine humaine et murine, développés sous la forme de peaux reconstruites. Cependant, il est nécessaire d’effectuer des expériences in vivo chez l’animal afin d’étudier la contribution de cette molécule à l’inflammation cutanée dans un système complexe où de nombreuses cellules immunitaires activées infiltrent la peau et où de nombreux médiateurs de l’inflammation y sont sécrétés. Il n’existe pas encore de modèle in silico pour mimer ces interactions complexes.

Réduction

A partir des données de la littérature scientifique, nous avons pu calculer un effectif de souris minimum nécessaire pour assurer une validation statistique de l’étude, à l’aide d'une formule mathématique appropriée. Une stratégie par étapes sera également appliquée permettant de réduire potentiellement de moitié le nombre d'animaux utilisés. De plus, au sein de l'animalerie, des accouplements de souris seront effectués à la demande, et non en continu, de manière à limiter le nombre d'animaux produits.

Raffinement

Afin de satisfaire les besoins comportementaux des souris, celles-ci seront maintenues en groupes de 3 à 4 individus par cage ventilée. Leur milieu sera enrichi de structures adaptées répondant à leur besoin naturel de ronger (buchettes de peuplier) et leur permettant de se cacher (nid). Afin de limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse des animaux, ceux-ci seront anesthésiés, avec contrôle de la température par tapis chauffant, lors de certaines phases d’expérimentation. Des points limites gradés, précis et adaptés sont listés dans une grille et feront l’objet d'une surveillance quotidienne des animaux. Une prise en charge par un traitement antalgique sera mise en oeuvre précocement en cas de besoin.

Choix des espèces

Le protocole que nous utilisons chez la souris est reconnu pour reproduire de nombreuses caractéristiques cliniques de la pathologie humaine (rougeur, épaississement cutané, desquamation, prurit), histologiques (épaississement de l’épiderme, présence anormale de cellules immunes dans le derme) et ses mécanismes moléculaires et cellulaires. Par ailleurs, le système immuno-inflammatoire de la souris est décrit et étudié depuis des décennies et autorise des comparaisons avec le système immuno-inflammatoire humain. Les modèles murins, bien que pouvant présenter certaines limites par rapport à la physiologie humaine, restent largement utilisés pour étudier la réponse immuno-inflammatoire de la peau et évitent d’avoir recours à des espèces animales plus proches de l'Homme. Les animaux seront inclus dans le projet à partir de l’âge de 8 semaines, lorsque leur système immuno-inflammatoire est bien développé.

120 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue après un prélèvement de sang dans le cœur sous anesthésie. Elles reçoivent un régime gras pendant quinze semaines pour installer un surpoids, passent quatre analyses de composition corporelle, des mises à jeun de cinq à sept heures, des tests de perception gustative et de préférence alimentaire, et jusqu'à trente essais d'apprentissage de trois minutes. Le porteur reconnaît que le surpoids peut gêner leurs déplacements et que les bagarres imposeront d'isoler certains individus. Il affirme avoir minimisé les effectifs pour garantir la solidité statistique, sans donner un seul chiffre à l'appui, et annonce l'arrêt des expériences dès que l'effectif sera suffisant.

Objectifs

Le récepteur nucléaire d’aryl hydrocarbone (AhR) est impliqué dans la toxicité des substances comme des polluants, dans les maladies du foie et des reins, et sur le fonctionnement du système immunitaire. Des études ont également mis en évidence l'influence de l'AhR sur la perméabilité intestinale. Cependant, aucune étude n'a encore analysé son rôle dans la détection orale des lipides Or, une perturbation de ce système de détection lipidique peut avoir des conséquences néfastes sur le métabolisme et le comportement. Les individus en condition d’obésité présentent un dérèglement de ce système. Cette étude vise ainsi à décrypter le rôle de l'AhR dans la détection orale des lipides, notamment dans un contexte d’obésité. En menant cette recherche, nous espérons contribuer à une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l'obésité et ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.

Bénéfices attendus

Les perspectives par rapport aux résultats obtenus devraient : - Etablir les rôles « physiologiques » de l’AhR au niveau de la sphère orale - Déterminer si les effets obésogènes des molécules environnementales et ligands de AhR, pourraient avoir pour origine des interactions sur la détection orale des lipides.

Procédures

Les souris seront toutes soumises à 4 tests d’analyse de leur composition corporelle de 2 min, un test d’analyse de leur prise alimentaire et hydrique sur 24h, puis à des tests comportementaux : 1) analyse de leur mobilité et anxiété (30 min), perception gustative (4 tests de 30 min avec mise à jeun entre 5h et 7h) et préférence alimentaire (16h maximum) ou 2) analyse de leur motivation (4 tests de 10 min, dont 2 tests avec mise à jeun entre 5h et 7h) et de leur apprentissage (entre 25 et 30 tests de 3 min, dont 7 maximum avec mise à jeun de 6h). Un prélèvement sanguin sera réalisé, de moins d’une minute, sous anesthésie, juste avant l’euthanasie des animaux. Un hébergement individuel durant les périodes de mise à jeun aura lieu si les animaux se battent.

Impact sur les animaux

La majorité des analyses sont des études du comportement alimentaire des animaux. Les effets indésirables attendus sont un stress dû aux mises à jeun et la possibilité de bagarres qui nécessitera l’isolement des animaux pour la réalisation de ces tests qui seront minimisés aux durées d’expérimentation. Les autres nuisances possibles sont associées à l’utilisation d’un régime gras qui entrainera possiblement un surpoids chez les animaux. La durée du régime (15 semaines) qui sera appliquée permet de mettre en place une obésité mais sans aller jusqu’au développement d’une insulino-résistance ni d’un diabète. Les animaux en régime hyperlipidique peuvent également avoir des difficultés à se mouvoir en raison du surpoids. Les animaux pourront également être stressés à cause des manipulations, un minimum de personnel, auquel les souris auront été habituées, réaliseront les protocoles.

Devenir

A l’issue de chaque procédure, tous les animaux seront euthanasiés sous anesthésie afin de réaliser des prélèvements sanguins et tissulaires.

Remplacement

Le remplacement est impossible car il s’agit d’étudier des processus physiologiques mettant en jeu plusieurs organes (intestin, tissu adipeux et foie). Il est donc indispensable de recourir au modèle animal pour une approche intégrée. Ce projet est couplé à des expériences réalisées in vitro dans l’objectif à terme de développer des études sur la détection des lipides dans ces modèles cellulaires sans nécessité d’avoir recours à des animaux.

Réduction

Les effectifs ont été minimisés tout en garantissant une pertinence biologique et une solidité statistique afin d’obtenir des résultats fiables. De plus, les analyses seront réalisées rapidement, dans le but d’arrêter les expérimentations dès que l’effectif sera suffisant pour obtenir des résultats fiables et diminuer ainsi le nombre d’animaux utilisé à son minimum.

Raffinement

Hormis les périodes de tests de comportement les animaux seront hébergés par fratries, dans des cages transparentes, pour garantir le maintien des interactions sociales. Les animaux seront hébergés dans des conditions optimales avec un enrichissement de leur milieu adapté. Ils bénéficieront d’un suivi quotidien de leur état général. Le prélèvement sanguin intracardiaque sans thoracotomie sera réalisé sous anesthésie générale, par des personnes expérimentées. S’agissant d’un projet nécessitant l’utilisation d’animaux vivants, l’utilisation de techniques non invasives et indolores ainsi que de tests comportementaux est privilégiée afin d’acquérir les paramètres physiologiques nécessaires au projet tout en respectant les questions d’éthiques en expérimentation animale et la règle des 3Rs. Enfin, un nombre restreint d’expérimentateurs disposant d’une formation et d’une qualification adéquate à l’expérimentation animale interviendra dans ce projet. Cependant, si les animaux atteignent les points limites du projet, ils seront sortis de l’étude puis euthanasiés.

Choix des espèces

Beaucoup d’études sur la thématique associée au projet ont été réalisées chez la souris. La confrontation de nos résultats avec la littérature s’avèrera donc plus pertinente. En effet, la souris est un modèle couramment utilisé dans les études sur l’obésité et les organes associés. D’autre part, dans le cas présent, le modèle transgénique utilisé permet d’éviter le passage sous un autre fond génétique et la génération d’animaux que cela engendre. Les animaux seront à l’âge adulte car tous les systèmes biologiques étudiés doivent être matures, hors phase de puberté et avant la phase de dégénérescences physiologiques liées à l’âge.