Éthologie / comportement / biologie animale

8 macaques rhésus vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec une réutilisation ou un placement en retraite envisagé à l'issue. Ils subissent deux chirurgies dont une craniotomie de six heures, une stimulation transcrânienne par ultrasons, des enregistrements d'électrophysiologie et d'imagerie sur animal vigile, la tête fixée par un plot implanté, dans le cadre d'un contrôle hydrique pouvant provoquer une sensation de soif. Le porteur reconnaît que la stimulation peut induire une gêne et une "brûlure superficielle de la peau" et que les marges des implants sont des zones d'infection potentielle. Il affirme que les primates non humains sont "le seul choix possible" de modèle et prévoit huit animaux, ramenés à six "si tous coopèrent".

Objectifs

L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.

Devenir

La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.

Remplacement

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.

Réduction

Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.

Raffinement

Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.

Choix des espèces

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)

200 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un régime enrichi en graisses et en sucre pendant 23 semaines, six séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un radiotraceur et des tests comportementaux d'activité motrice, de dépression et d'anxiété, pour étudier par imagerie l'atteinte cérébrale liée à une maladie du foie. Le porteur décrit comme effets attendus une prise de poids et un possible stress au réveil des anesthésies. Il affirme qu'un modèle animal est "indispensable" pour cette approche globale et présente le rongeur comme le "modèle de choix".

Objectifs

La NAFLD (acronyme anglais, non-alcoholic fatty liver disease) regroupe un large spectre de maladies hépatiques chroniques caractérisées par une accumulation excessive de graisses dans le foie (stéatose) sans lien avec l’alcool, et qui touchent environ 25% de la population générale et 80% des personnes en obésité morbide. Dans certains cas, la maladie évolue vers la stéatohépatite non alcoolique (NASH, acronyme anglais non-alcoholic steatohepatitis), une forme sévère et irréversible avec inflammation. Cette forme agressive de la maladie favorise l’accumulation de fibrose et peut évoluer vers la cirrhose et ses complications, principalement cardiovasculaires. Cette maladie hépatique est désormais reconnue comme un dysfonctionnement multisystémique, c’est-à-dire que le mauvais fonctionnement du foie entraine le mauvais fonctionnement d’autres organes, comme le cerveau. L’encéphalopathie hépatique est la complication la plus fréquemment décrite et des études ont mis en évidence l’impact de l’obésité et d’une mauvaise alimentation sur le fonctionnement cérébral et cognitif. Cependant, les mécanismes cérébraux sous-jacents restent inconnus à ce jour. L’imagerie fonctionnelle offre la possibilité d’explorer in vivo certains des mécanismes élémentaires qui affectent le fonctionnement cérébral tels que le métabolisme cérébral, la densité synaptique ou l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE). L’objectif de ce travail est de mettre en œuvre ces méthodes d’imagerie déjà développées et appliquées dans notre laboratoire, à un modèle rongeur NAFLD/NASH bien caractérisé afin d’identifier les mécanismes physiopathologiques à l’origine des dysfonctionnements cérébraux observés dans cette maladie hépatique.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier les différents mécanismes physiopathologiques impliqués dans le dysfonctionnement cérébral observé dans la NAFLD/NASH, et d’établir un score de corrélation entre ces dysfonctionnements cérébraux et les comportements observés chez ces animaux. Cela permettra également d’identifier quelle(s) méthode(s) d’imagerie sera la plus pertinente pour continuer le développement de cette approche chez l’homme. A plus long terme, cela permettra d’envisager l’étude de cette pathologie in vivo chez des patients atteints par ces pathologies avec pour objectif d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : -Administration d’un régime alimentaire enrichi en graisses et sucre, pendant 23 semaines. -Réalisation de sessions d’imagerie (6 par animale) sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum,) -Injection d’un radiotraceur (1 minute) -Les rongeurs seront soumis à des tests comportementaux ( 5/animale) afin de mesurer l'activité motrice qui dure 30 minutes, la dépression qui dure 6 minutes et l’anxiété qui dure 5 minutes. -

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus sur les animaux : - Accumulation de gras dans le foie (asymptomatique) et prise de poids - Possible stress et désorientation au réveil de l’anesthésie relativement longue. - Stress possiblement induit par les tests de comportement

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin des procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.

Remplacement

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’atteinte multisystémique d’une maladie hépatique. Un modèle animal est indispensable afin d’envisager cette approche globale de la pathologie. Le modèle rongeur NAFLD/NASH est le modèle de choix pour cette approche car déjà largement utilisé pour l’étude de cette maladie avec une atteinte cérébrale mise en évidence par certaines études. Le choix du rongeur est également adapté aux différentes expérimentations envisagées (imagerie et comportement) qui pourront être conduites aisément avec ces animaux.

Réduction

L’utilisation des différentes modalités d’imagerie permettra de réduire drastiquement le nombre d’animaux. Dans la mesure du possible, un même animal passera plusieurs examens d’imagerie sur plusieurs jours d’une même semaine (2 au maximum). Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé comme minimal grâce à une approche statistique.

Raffinement

Les souris, âge de 4 semaines, seront hébergés par groupe dans une cage enrichie avec un tunnel de camouflage, bâtonnets de bois et du matériel pour la fabrication de nids. Les animaux seront observés quotidiennement par les zootechniciens en charge de leurs soins et par les expérimentateurs. Une semaine d’acclimatation est prévue au début de leur séjour et avant de débuter le régime alimentaire HFHSD. Un suivi régulier permettra d’éviter toute souffrance animale. Les animaux traités par le régime HFHSD feront l’objet d’une surveillance journalière et d’un suivi hebdomadaire du poids au cours du traitement. Toutes les interventions invasives (injections intraveineuses) sont réalisées sous anesthésies générales par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal et les douleurs liées aux interventions. Afin de minimiser le stress, la phase de réveil sera réalisée dans leur cage. Si un changement de cage est prévu, le transfert d’un peu de litière (généralement un papier absorbant) sera prévu dans la cage propre. En cas de complications, le vétérinaire de l’installation sera alerté afin de mettre en œuvre des traitements appropriés. L’étude comportementale sera réalisée avec des animaux vigiles mais sera conduite de manière la plus brève possible afin d’éviter tout stress supplémentaire aux animaux. Des points limites sont définis pour éviter toute souffrance animale. .

Choix des espèces

Ce projet a pour objectif d’évaluer l’impact sur le cerveau d’affections hépatiques. La souris est l’animal de choix car plusieurs modèles ont déjà été développés sur cette espèce pour reproduire des dysfonctionnements observés dans cette pathologie. Cette espèce présente également l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP et IRM ainsi qu’à l’étude comportementale. Les souris utilisées seront au stade adulte quand le cerveau a atteint sa maturité et son développement complet (5 semaines à 8 semaines).

8 macaques rhésus vont être utilisés, réutilisés ou placés en retraite à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit deux neurochirurgies de quatre à six heures avec pose d'implants crâniens, puis des séances d'enregistrement sur animal vigile maintenu en chaise de contention, sous contrôle hydrique. Le projet étudie les réseaux du cortex préfrontal impliqués dans l'adaptation comportementale. Le porteur indique un risque d'infection des implants, une sensation de soif entre les sessions et une possible brûlure superficielle liée aux ultrasons, et affirme que les primates non humains sont "le seul choix possible".

Objectifs

L’adaptation comportementale repose sur plusieurs processus importants: établir la valeur des stimuli de l’environnement, des buts à atteindre et des actions en fonction de l’état interne du sujet, sélectionner un comportement et évaluer ses conséquences. La nécessité d’agir dans un contexte sociale implique la prise en compte d’information relative aux valeurs et intentions d’autres agents biologiques. Notre objectif vise à mieux comprendre les interactions au sein de larges réseaux neuronaux dans la régulation flexible de nos comportements. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une region considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Pour cela, il est indispensable 1) d’identifier les relations anatomo-fonctionnelles entre les régions du lobe frontal et temporal, 2) d’étudier l’implémentation des mécanismes de l’adaptation comportementale au niveau neuronal et 3) de comprendre le rôle causal de ces différentes structures sur le fonctionnement intégré de ces réseaux. Ceci nécessite une combinaison d’approches d’imagerie et d’électrophysiogie, dont certaines invasives. Les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal, sur la base de critères anatomiques et cognitifs, pour conduire le projet proposé. Ce projet sera réalisé dans 3 étab lissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Une caractéristique de notre survie dans le monde réel est notre capacité à faire preuve d'adaptation comportementale. Les primates en général et les humains en particulier sont très efficaces pour extraire rapidement les signaux informatifs de l'environnement social et non-social, et les intégrer aux conséquences de leurs actions, afin de maintenir ou de modifier si besoin leurs décisions. Ce projet est un projet de recherche fondamentale qui vise à comprendre les mécanismes par lesquels les différentes régions du cortex frontal et temporal interagissent et comment elles contribuent aux comportements adaptifs en contexte social et non social. Le principal bénéfice attendu sera donc l’amélioration des connaissances scientifiques qui découleront de la réalisation des expériences de ce projet. 1. Le projet nous permettra de mieux d’identifier les circuits neuronaux et les mécanismes physiologiques qui supportent l’expression de comportements adaptatifs. 2. Le projet nous permettra de comprendre comment les perturbations de ces interactions préfronto-temporales conduisent à des altérations des processus cognitifs supportant les comportements adaptatifs Des bénéfices secondaires pourraient inclure des hypothèses en recherche clinique dans le domaine de la neuropsychiatrie. 3. Le projet nous permettra de mieux comprendre le couplage neuro-vasculaire Des bénéfices secondaires pourraient inclure une meilleure utilisation translationnelle des données d’électrophysiologie obtenues chez le singe aux données de neuroimagerie obtenues chez l’humain.

Procédures

Les animaux seront soumis à 2 actes chirurgicaux pour permettre la stimulation transcranienne par ultrasons et la collecte des données d'électrophysiologie et d'imagerie chez l'animal vigile. Les chirurgies seront réalisées après entrainement aux tâches comportementales. Une première chirurgie implantatoire permettra de réaliser les procédures de stimulation transcranienne et d'imagerie par résonance magnétique. Ce type de chirurgie dure en moyenne 4h. La seconde chirurgie sera réalisée à l’issue de la collecte des données d’imagerie fonctionnelle dans ces mêmes tâches. Elle est nécessaire pour la réalisation des procédures d'électrophysiologie et d'imagerie par ultrason. Ce type de chirurgie implantatoire nécessite la réalisation d’une craniotomie et sont plus longues (durée moyenne = 6h). Toutes les actes seront réalisés dans l'EU1, sauf la collecte de données CT préalable aux chirurgies qui sera réalisée dans l'EU3, et les chirurgies qui seront réalisées dans l'EU2.

Impact sur les animaux

Au cours du projet, les animaux auront plusieurs anesthésies générales pour les deux neurochirurgies et au moins un examen en neuroimagerie. Les anesthésies sont réalisées pour les différentes formes d'imagerie cérébrale nécessaires au projet, et pour la chirurgie destinée à l'implantation d’une chambre d'enregistrement. L'anesthésie générale provoquera également en elle-même un inconfort au réveil. La chirurgie pourra susciter un inconfort post-opératoire temporaire, normalement maitrisé par l'administration d'analgésique et un suivi rapproché par les expérimentateurs et les zootechniciens. Les marges des implants constituent des zones d’infection potentielle qui seront maitrisés par une surveillance régulière des implants et par l’administration de soins appropriés. Les singes travailleront dans le cadre traditionnel d'un box expérimental. Ils seront assis, ou en position dite du sphinx dans une chaise à primate, la tête fixée par le plot implanté. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et plutôt bien tolérée, mais les animaux éprouveront un léger inconfort lors de l’apprentissage de la procédure. Les singes seront formés dans le cadre d'un protocole de contrôle hydrique. Ce protocole est progressivement mis en œuvre et, dans la grande majorité des cas, les animaux reçoivent leur dose normale de liquide. Cependant il est possible pendant l'adaptation au processus, une certaine sensation de soif puisse se manifester entre les sessions. La stimulation ultrasonore peut induire une sensation de gêne lors de son application. Les animaux seront formés à cette procédure par renforcement positif, la procédure étant bien établie et bien tolérée. La stimulation ultrasonore peut induire une brûlure superficielle de la peau. Une modélisation au préalable des variations thermiques engendrées par la stimulation préviendra de cet effet négatif potentiel.

Devenir

La potentielle réutilisation des animaux en fin de protocole sera prise en accord avec la vétérinaire. Si les animaux ne peuvent pas être utilisés, un placement en retraite sera considéré.

Remplacement

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex prefrontal, une région cérébrale considérée comme une spécificité de l’organisation cérébrale des primates. Sur la base de critères anatomiques et cognitifs, les primates non humains sont le seul choix possible de modèle animal pour conduire le projet proposé. Il n'existe pas d’alternative qui permette d'obtenir des informations similaires à partir d'expériences n'impliquant pas d'animaux, ou des modèles animaux non-primates.

Réduction

Contrairement à la neuroimagerie chez l’humain qui nécessite un grand nombre de sujet (n>20), les protocoles chez le primate non-humain bénéfient de la possibilité de répéter les sessions chez un même sujet. Chez le singe, 3 est également le nombre minimal d'animaux par étude sur lequel la communauté scientifique s'accorde. Dans le cadre du présent projet, il est important de prendre en compte le facteur social : dominants vs dominés. Nous travaillerons donc sur 2 groupes de 3 sujets. Cependant il arrive parfois que des animaux s’accommodent mal au travail en chaise de contention, ou ne tolèrent pas les implants. Nous envisageons le besoin de 8 animaux mais nous nous arrêterons à 6 si tous les animaux coopèrent, apprennent les tâches comportementales et tolèrent les implants.

Raffinement

Chaque animal reçoit un long pré-entrainement par renforcement positif pour l'habituer à la vie au laboratoire (nettoyage des volières, pesées régulières, etc.). Des protocoles d’enrichissement de l’environnement sont développés pour stimuler l’animal et lui permettre d’exprimer au mieux son répertoire comportemental en dehors des phases de collecte de données. L’utilisation de station de travail mobile permettra de réaliser certaines phases du conditionnement dans les volières des animaux. Un raffinement continu est également pratiqué pour développer des implants moins invasifs et moins sensibles aux infections. L’optimisation des techniques d’enregistrements électrophysiogiques permettra de réduire la phase de collecte des données. Tout sera mis en œuvre pour limiter la douleur, la souffrance et l’angoisse de l’animal grâce aux différentes mesures mises en place dans l’animalerie (hébergement en groupe social, enrichissement, etc.) et un suivi médical régulier de l’animal (perte de poids, alopécie), et des implants sera mis en œuvre (signes d’infections). Un suivi medical plus spécifique sera également mis en oeuvre post intervention chirugical.

Choix des espèces

Nous proposons d'étudier le fonctionnement des réseaux neuronaux impliqués dans l’adaptation comportementale. Ces réseaux sont centrés sur le cortex préfrontal. Cette région est considérée comme une specificité de l’organisation cérébrale des primates. Les expériences présentees sont invasives. La combinaison des approches proposées permettront l’obtention d’informations fondamentales impossible à obtenir avec d'autres techniques, et impossible à réaliser chez l’humain. Notre recherche porte sur des animaux post-puberté (>4ans)

1 360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ou deux chirurgies du cerveau pour implanter des électrodes et injecter des virus, puis des enregistrements de leurs neurones pendant l'éveil et le sommeil, pour étudier un récepteur au glutamate. Le porteur indique que les souris implantées sont maintenues isolées, une autre souris pouvant endommager les électrodes, et signale une douleur post-opératoire de 48 heures et des risques liés à l'anesthésie. Il renvoie au long terme les retombées, des traitements des troubles anxieux liés au sommeil, et affirme qu'aucune alternative au rongeur ne préserve un réseau neuronal intact.

Objectifs

La présente demande concerne un projet préalablement autorisé pour lequel nous devons effectuer une étape nécessitant une expertise spécifique non disponible en interne. Aucun animal supplémentaire n'est ajouté à ce projet par rapport au projet principal déjà autorisé. Le projet a pour but d’étudier des récepteurs activés par le glutamate et fortement présents dans le système nerveux central des vertébrés. Ces récepteurs jouent un rôle central dans la communication et le fonctionnement de nos neurones, ainsi que dans les mécanismes associés à l’apprentissage et la mémoire. Ces récepteurs étant également impliqués dans de nombreuses pathologies neurologiques et psychiatriques (épilepsie, neurodégénérescence, troubles cognitifs), ils constituent des cibles thérapeutiques à fort potentiel. L’objectif de ce projet est d’évaluer et comprendre le rôle et l’importance de la régulation d’un des récepteurs au glutamate dans le fonctionnement des circuits neuronaux, à la fois dans un cadre physiologique et pathologique. Nous voulons comprendre si et comment ces récepteurs participent à l’activation et au dialogue de différentes structures du cerveau durant la veille et le sommeil. Pour cela, nous réaliserons des enregistrements de l’activités des neurones chez des souris libres de leurs mouvements et endormies.

Bénéfices attendus

Les troubles anxieux sont des troubles psychiatriques très répandus et constituent une préoccupation croissante pour la santé publique mondiale. Ils sont aussi systématiquement associés à des troubles du sommeil, considérés soit comme une cause, soit comme une conséquence des symptômes. Ce projet de recherche fondamentale utilisera des modèles animaux pour développer nos connaissances sur les mécanismes neurophysiologiques précis potentiellement affectés chez les patients humains. A long terme, il permettra ainsi de développer et de mettre en œuvre des stratégies thérapeutiques précises de prévention et de guérison axées sur le sommeil dans les troubles anxieux.

Procédures

Selon la procédure considérée, les animaux seront soumis à un ou deux types de chirurgie au niveau du cerveau (implantation d’électrodes (2-6h) et/ou injection de virus (1h30)) avec ou sans enregistrement de l’activité des neurones pendant l’éveil et le sommeil sur animal vigile (2 à 8 h, 1x/jr). Ainsi, 3 options peuvent se présenter : 1) implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones ; 2) injection de virus ; 3) injection de virus + implantation d’électrodes + enregistrement de l’activité des neurones. A la fin de chaque procédure, il sera réalisé sur chaque individu une euthanasie selon une méthode réglementaire qui permet les prélèvements et analyses ultérieurs (10min). L’ensemble des actes est réalisés sous anesthésie et analgésie.

Impact sur les animaux

Nous détaillons ci-dessous l’ensemble des dommages prévus dans ce projet. Nuisances induites par les actes effectués : Chirurgie du cerveau : implantation d’électrodes et injection de virus (légère perte de poids, problème de cicatrisation et douleur post-chirurgicale pendant 48h) ; risques anesthésiques (hypothermie, détresse respiratoire, arrêt cardio-respiratoire, etc) ; isolement (stress modéré) ; 2 transports entre les établissements utilisateurs (source de stress)

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Elle sera pratiquée au sein de l'établissement d'origine des animaux. Il s'agit d'un projet déjà autorisé, réalisé sur deux établissements et n'ajoutant aucun animal supplémentaire.

Remplacement

Un impératif concernant les études sur récepteurs natifs est de conserver l’intégrité d’un réseau neuronal afin de préserver les connections synaptiques. A ces fins, il n’existe, à ce jour, aucune méthode alternative à l’utilisation de modèle rongeurs. Les techniques d'enregistrement chroniques sont invasives et ne peuvent être effectuées chez l'homme chez le sujet sain. Elles sont utilisées chez des patients épileptiques dont l'activité cérébrale est par conséquent anormale. Ceci ne permet pas d'effectuer des études systématiques car le placement des électrodes est dicté par l'impératif médical. D'autre part, l'état des connaissances actuelles et la puissance requise d'un point de vue technologique ne permettent pas de modéliser le fonctionnement de ces réseaux sur ordinateur.

Réduction

Les enregistrements électrophysiologiques de grande ampleur in vivo permettent d'enregistrer un grand nombre de neurones simultanément, ce qui augmente la puissance statistique des analyses et permet de réduire le nombre d'animaux utilisés. Pour les tests comportementaux, le nombre d'animaux proposé reste standard par rapport à la littérature existante. Le couplage entre électrophysiologie in vivo et comportement permet également de corréler les résultats comportementaux des individus avec leur activité neurale. Ceci permet de s'affranchir partiellement du problème de variabilité individuelle et de réduire le nombre d'animaux. Le calcul du nombre d’animaux a également été réalisé en fonction des travaux précédents. Au total, sur 5 ans, ce projet de recherche impliquera 1360 animaux : dont 1120 impliqués sur ce site.

Raffinement

Après leur réception, les animaux sont habitués à l’animalerie de l’Institut pendant une semaine avant de débuter toute procédure. Sauf si cela n’est pas approprié, toutes les procédures expérimentales du projet sont pratiquées sous anesthésie générale ou locale en recourant à des analgésiques. Les enregistrements en soi ne sont pas douloureux. Les administrations et prélèvements seront effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Les animaux sont stabulés dans les conditions d'hébergements standards (enrichissement de nidification) comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux implantés seront maintenus en isolation: la présence d'une autre souris pourrait ralentir la cicatrisation et endommager les électrodes implantées chroniquement (grattage, rognage) entraînant l’euthanasie de l’animal et ne permettant pas de récolter des données. Le maintien en isolation permet donc de maximiser la quantité de données récoltées sur chaque animal et ainsi de minimiser le nombre total d'animaux pour le projet. Les animaux non-implantés servent de groupe contrôle et doivent donc être logés dans les mêmes conditions que les animaux implantés. Cependant, pour diminuer le stress lié à l’isolement les animaux sont maintenus dans des cages contenant 2 compartiments séparés par une cloison transparente percée de trous permettant ainsi à l’animal d’avoir des interactions avec l’animal isolé dans le second compartiment (contiguïté visuelle, olfactive, auditive). Afin de garantir la taille minimale réglementaire au sein d'un compartiment une fois la cloison installée, les cages utilisées sont des cages prévues pour des rats. Pour éviter toutes blessures et d’endommager les électrodes, la nourriture sera directement dispersée dans la sciure. Cette démarche aura pour avantage d’enrichir l’environnement de l’animal puisqu’il sera obligé de fouiller la sciure pour trouver les croquettes et facilitera l’accès à la nourriture. Cet enrichissement sera également complété par le dépôt de morceaux de bois dans la cage de l’animal. Une construction de lego sera mise en-dessous du biberon d’eau pour réduire la hauteur et faciliter l’accès à l’eau. Une surveillance quotidienne sera réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis. Avant le début de chaque procédure l’animal sera pesé et son état général contrôlé. En cas de signe de douleur (utilisation de l’échelle de grimace), les animaux seront exclus du protocole.

Choix des espèces

Le choix de la souris est scientifique : il s’agit d’un mammifère de petite taille, au cycle de vie reproductif rapide et qui possède un système nerveux central ‘développé’. La souris est un modèle classique pour l'étude de la physiologie des réseaux neuronaux en lien avec le comportement. Seules des souris au stade adulte seront utilisées pour ce projet (à partir de 6 semaines), plus alertes et plus prompts à explorer leur environnement que les animaux âgés.

1 216 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies du crâne pour implanter des électrodes de stimulation et des fibres optiques et injecter des virus dans le cerveau, avant deux mois de tâches de prise de décision et un enregistrement neuronal terminal sous anesthésie. Le porteur signale des douleurs possibles liées aux craniotomies, des infections des sutures et des bagarres entre souris pouvant les blesser. Il justifie le recours à la souris par le fait que l'étude ne serait "réalisable que sur des animaux", et rattache les retombées, de futures pistes de traitement de l'addiction à la nicotine, au long terme.

Objectifs

L’exposition à la nicotine pendant le développement peut augmenter la vulnérabilité à l’addiction, vu que plus de 90 % des fumeurs adultes ont commencé à fumer pendant leur adolescence. Cependant, la manière dont la nicotine produit cette vulnérabilité reste peu connue, limitant ainsi notamment nos pistes d’intervention et de traitements visant à réduire l’usage de la nicotine. L'adolescence est une période où le cerveau est supposé subir une poussée de plasticité qui sous-tend en particulier l'émergence des aspects cognitifs, émotionnels et motivationnels des comportements chez l’adulte, qui sont tous liés à l'activité des neurones dopaminergiques (DA) de l’aire tegmentale ventrale (ATV). L'apprentissage par renforcement et la flexibilité comportementale sont des domaines comportementaux-clés, qui ont été largement associés aux changements d'activité des neurones DA. La flexibilité comportementale fait référence à la capacité d'abandonner des activités précédemment gratifiantes pour explorer de nouvelles stratégies lorsque les conditions environnementales changent. L'exploration est un processus adaptatif important qui permet de découvrir des alternatives plus avantageuses. En particulier, l'exploration peut être orientée vers des options incertaines, puisque la réduction de l'incertitude a une valeur informative. La flexibilité comportementale est donc un comportement-clé dans le cadre de la vulnérabilité à l’addiction, qui peut être changée par l’exposition à la nicotine pendant l'adolescence. D’un point de vue fondamental, ces travaux visent donc à améliorer notre compréhension des effets de la nicotine sur le développement du système dopaminergique pendant l’adolescence, et les effets à long terme d’une exposition à la nicotine pendant cette période sur la prise de décision chez les adultes. De manière importante, si l’exposition à la nicotine pendant l’adolescence produit des changements dans la prise de décision quand ces souris atteignent l’âge adulte, nos résultats nous permettront aussi d’envisager de développer des interventions visant à réduire la vulnérabilité à l’addiction à la nicotine.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de mettre en lumière les voies neuronales spécifiques de la vulnérabilité individuelle face aux substances addictives et de comprendre comment celles-ci sont impactées par l’usage de nicotine pendant l’adolescence. De nombreuses pathologies sont associées à un déficit d'adaptabilité, et elles sont liées à la prise de la nicotine pendant l’adolescence, qui – bien qu’étant un enjeu de santé majeur en France- se généralise avec l’introduction des « e-cigarettes ». Une meilleure compréhension de ces mécanismes, notamment à un niveau comportemental et physiologique permettra d'appréhender efficacement les cibles cellulaires en vue de traitements futurs face à cet enjeu sociétal majeur.

Procédures

Une biopsie d’oreille et/ou de queue va être réalisée sur les souris transgéniques. Les souris subiront des procédures chirurgicales en vue d'implantater d'électrodes de stimulation electriques, mais aussi d'injecter des adenovirus-associés (AAV) permettant l'expression de gènes spécifiquement dans le cerveau, et de fibres optiques afin d'enregistrer l'activité neuronales. Tous les chirurgies durent environ 1h chacune. Les chirurgies d'injection d'AAV et d'implantation sont séparées car l'expression d'un AAV au sein du cerveau est d'environ 3-4 semaines. Ainsi, afin d'éviter d'abimer les électrodes et les fibres implantées, celles-ci seront implantées 2-3 semaines plus tard, augmentant grandement les chances d'avoir des résultats exploitables à l'enregistrement. Le comportement des animaux sera évalué durant 2 mois environ, et à la fin les animaux seront anesthésiés et un enregistrement unitaire de neurones sera effectué. A la fin de l'enregistrement, la souris sera euthanasiée sans être réveillée.

Impact sur les animaux

Les souris transgéniques pourront connaître un inconfort transitoire lors du prélèvement rapide des biopsies. Les souris qui subiront des neurochirurgies peuvent éventuellement avoir des douleurs associées aux craniotomies effectuées sur l'os mais aussi au niveau des sutures. Des infections au niveau des sutures peuvent également survenir. Des bagarres entre souris blessant superficiellement ou gravement certaines souris peuvent aussi survenir. Il peut également y avoir des effets indésirables liés à la stimulation électrique ou optogénétique, pouvant troubler l'activité locomotrice des animaux.

Devenir

A l'issue des procédures, tous les animaux seront euthanasiés. - Soit directement à la fin de la procédure en tant qu'étude électrophysiologique – Soit si des points limites sont atteints, - Soit que pour extraire le cerveau de l'animal pour l'étudier. En effet, nous prélevons systématiquement le cerveau de tous les animaux testés afin de confirmer la bonne expression des virus injectés dans le cerveau et l'emplacement des électrodes/fibres implantées. Cette confirmation est indispensable comme contrôle pour prouver que l'enregistrement ou la manipulation de l'activité neuronale est bien liée à la zone cérébrale étudiée. Donc on étudie les cerveaux de tous les animaux utilisés dans ces expériences après leur mort.

Remplacement

Notre projet vise à étudier la complexité́ du comportement de la souris. Le découplage et la corrélation entre comportement et neurophysiologie est aussi une composante majeure de ce projet. Cette étude n’est donc réalisable que sur des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux, pour ce projet, est déterminé sur la base d'une littérature vaste et robuste dans des domaines similaires ainsi que les tests de puissance statistique. Afin de réduire l'utilisation de souris au minimum, nous nous imposerons un cahier des charges strict. Pour ce faire, les procédures ont été pensées pour qu'une même souris puisse passer dans un nombre maximum d'expériences afin de réduire l'utilisation de nouveaux animaux pour chaque expérimentation. Vu que notre projet porte sur les variations inter-individuelles en identifiant les stratégies idiosyncratiques/personnalisées de souris, un nombre minimum de 50 animaux par groupe pour les expériences comportementales est nécessaire pour atteindre la puissance statistique pour pouvoir comparer ces variabilités. Pour les expériences ne concernant que l’électrophysiologie, notamment en procédure 5, on peut réduire le nombre de souris nécessaires vu que l’analyse est faite par groupe et pas par individu. Pour ces expériences, le nombre de souris nécessaire pour une puissance statistique est 20.

Raffinement

Les animaux seront habitués aux taches comportementales progressivement pendant la première semaine de conditionnement. Pour faciliter l’habituation des animaux aux manipulations et aux environnements de test, les animaux seront toujours tenus en « berceau » c’est-à-dire sortis de leur cage en glissant les mains ouvertes sous la souris pour la transporter entre les environnements sur les mains ouvertes. Toutes manipulations par la queue de la souris seront évitées. Pour la gestion de la douleur, les souris vont être examinées par le même expérimentateur chaque jour, dès le jour de leur chirurgie. Des points limites adaptés aux procédures ont été définis entrainant une réponse appropriée. Cependant, des bagarres entre animaux peuvent aussi arriver, blessant superficiellement ou gravement certaines souris. Si l'étendue des blessures n'est pas trop grave, des soins seront apportés aux souris blessées (en fonction de la grille d’évaluation) et celles-ci seront isolées le temps de la récupération. Une fois le regroupement effectué, les souris seront surveillées pendant quelques heures pour observer tout comportement agressif envers l'animal préalablement blessé. Si certains effets indésirables liés à la stimulation électrique ou optogénétique sont constatés, la stimulation sera immédiatement arrêtée et l'animal laissé au repos. Les critères d'arrêt surtout pour les phases post-opératoires concernent des signes de douleurs accrues constatés.

Choix des espèces

La souris a été choisie car le système dopaminergique mésocorticolimbique est bien conservé chez l'ensemble des mammifères et en particulier chez les rongeurs par rapport à l'Homme, anatomiquement et fonctionnellement. En addition, il y a une période adolescente bien marquée chez la souris, ce qui n'est pas le cas chez les espèces comme les invertébrés, les poissons ou encore les oiseaux. Ces deux points indiquent que les souris sont l’espèce idéale pour ce projet. De plus, la génétique de la souris offre des outils de modulations des réseaux neuronaux, difficilement accessibles chez d'autres modèles. Ces outils génétiques sont des moyens de moduler les réseaux neuronaux (par exemple l'utilisation d'organismes génétiquement modifiés permet l’invalidation d'un gène, sa réexpression ciblée en utilisant l’optogénétique) difficilement accessibles même chez d'autres mammifères, tels que le rat ou le singe. Les souris sont considérées juvéniles lorsqu'elles sont à moins de 21 jours après la naissance, l'adolescence commence quand les souris sont naturellement sevrées environ 21 jours après la naissance. L'âge adulte est atteint quand les souris complètent leur maturation sexuelle et hormonale à environ 60 jours après la naissance. Des animaux âgés de 3 semaines sont utilisés pour les pré-traitements nicotiniques et les expériences, mais toutes les étapes de chirurgie, conditionnement comportemental, et neurophysiologie/euthanasie ne sont réalisées qu’une fois atteint l'âge adulte.