Éthologie / comportement / biologie animale

12 000 têtards de xénope vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés au métronidazole pendant dix jours puis à des molécules à tester, avec quatre anesthésies et quatre tests comportementaux, pour cribler cinquante molécules candidates contre la sclérose en plaques. Le porteur estime la mortalité prématurée à environ 10 % pour le développement et 10 % pour l'exposition au métronidazole, et certaines doses peuvent être toxiques. Il justifie le recours au têtard par sa transparence et par le grand nombre d'individus que produit l'espèce.

Objectifs

La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurologique et inflammatoire, c’est la première cause d’handicap chez le jeune adulte, et touche environ 110 000 personnes en France, avec 4 000 à 6 000 nouveaux cas par an. Dans cette maladie, la perte de la gaine de myéline (structure graisseuse qui entoure et protège une partie du neurone, permettant la conduction de l’information nerveuse) peut se traduire par un ralentissement voire une interruption de la conduction du message nerveux. Les personnes atteintes de ce type de désordres sont progressivement ou d’amblée handicapées, sur le plan physique et cognitif. Au cours des 20-25 dernières années, des progrès remarquables ont été réalisés dans la prise en charge des patients par l’introduction de traitements visant la composante inflammatoire de la maladie. Cependant bien que ces traitements diminuent notoirement les symptômes, ils ne semblent pas avoir une forte influence sur l’amélioration du statut clinique ou pour prévenir la progression du handicap, comme évalués par les scores cliniques classiques. Des faisceaux d’arguments (modèles expérimentaux, examens neuropathologiques de cerveaux de SEP, nouvelles méthodes d’imagerie chez les patients SEP) suggèrent que la remyélinisation (régénération de la myéline) est un élément clé dans la restauration des capacités motrices et cognitives. L’effort international actuel est donc d’essayer de développer des molécules favorisant la remyélinisation, pour améliorer la prise en charge de la maladie et donc la qualité de vie des patients. Le but de notre projet est d’étudier des molécules améliorant la remyélinisation dans un modèle animal de sclérose en plaques (Xenopus laevis), en couplant des analyses histologiques et comportementales adaptées aux têtards. A plus grande échelle, si ces molécules présentent un effet bénéfique sur la remyélinisation, elles pourront présenter un espoir thérapeutique pour les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques, ou plus largement les maladies affectant la myéline.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’identifier des molécules pouvant favoriser la remyélinisation. Identifier des molécules remyélinisantes permettrait dans le cas de maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, d’éviter la neurodégénérescence et à terme la dégradation des capacités fonctionnelles. Les molécules pro-remyélinisantes identifiées pourraient ensuite être utilisées comme piste thérapeutiques.

Procédures

Les têtards sont mis en contact avec du métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) durant 10 jours, puis avec des molécules à tester pro-myélinisantes pour une durée de 3 jours maximum. Les têtards sont mis en contact avec les molécules dans leur eau de balnéation. Les têtards vont être anesthésiés 4 fois 5 minutes (3 jours minimum entre chaque anesthésie) pendant toute la durée de la procédure. Ils effectueront 4 tests comportementaux de moins de 5 minutes avec un temps de 3 jours minimum entre chaque test.

Impact sur les animaux

L’anesthésie est maintenue durant toute la procédure pour ne pas engendrer de stress chez l’animal, mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires, les battements du cœur sont donc fréquemment contrôlés durant l’anesthésie (facilement visible chez les têtards). La capture à l’épuisette, pour les tests comportementaux, peuvent aussi induire un léger stress chez le têtard, sans entrainer de blessures ou de comportements anormaux. Malgré le soin que nous portons au choix de la dose des molécules, d’après la littérature et les tests in vitro, il arrive que certaines de ces concentrations soient toxiques et peuvent entrainer la mort des têtards. Une mort prématurée des têtards est possible pendant le développement, nous estimons cette perte à 10 pour cent, ainsi que suite à l’exposition au métronidazole, que nous estimons à 10 pour cent également.

Devenir

Afin d’étudier les différents mécanismes impliqués suite à l’exposition aux molécules à tester, il est ensuite nécessaire d’euthanasier les têtards pour faire des études immunologiques plus poussées sur leurs tissus.

Remplacement

Le développement de stratégies thérapeutiques visant les maladies démyélinisantes est confronté à la difficulté de suivre les mécanismes pathologiques au sein de la complexité du système nerveux. C’est la raison pour laquelle les modèles de culture cellulaire ne suffisent pas. A l’opposé, le recours à des animaux vertébrés, qui ont un système nerveux organisé avec des couches de myéline, comparable à ce qui est retrouvé chez l’Homme (et donc intéressant pour étudier les maladies qui atteignent cette structure) peut permettre une première démonstration de l’action d’une molécule in vivo. Cette étape permet de choisir plus objectivement les molécules efficaces et de les tester ensuite chez l’homme. Le choix de l’utilisation du modèle Xenopus laevis repose sur les arguments suivants : - Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro - La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central sans euthanasie, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal - Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux - Le Xenopus laevis est un animal robuste et facile d’élevage en comparaison à d’autres modèles animaux - Enfin, il existe une grande conservation des protéines de la myéline inter-espèces (amphibiens versus mammifères)

Réduction

Dans le souci de respecter la règle des 3R, ce sont les mêmes têtards qui sont utilisés pour compter le nombre de cellules oligodendrocytaires dans le nerf optique qui seront soumis au test visuel. La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences grâce à l’observation des têtards au macroscope, et ainsi d’éviter des suivis histologiques tout au long du protocole nécessitant l’euthanasie des têtards expérimentaux. Nous souhaitons utiliser environ 240 têtards par molécule, en sachant qu’une molécule est testée en triplicat à 7 concentrations différentes, en comparaison avec un groupe contrôle (8 groupes au total), avec 10 têtards par condition (soit 80 têtards en triplicat donc 240 têtards au total). Ces calculs ont été réalisés à la suite de calculs de puissance pour les expériences proposées. Le nombre de 10 têtards par groupe prend en compte la mortalité spontanée au cours du développement pour certains têtards. Chaque molécule nécessitera 240 (80x3) têtards, et nous avons 50 molécules à tester, soit au total environ 12 000 têtards.

Raffinement

Les têtards sont placés dans un bain de 4L d’eau (moitié eau dure, moitié eau osmosée) à une température de 23 degrés avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau est renouvelée au minimum une fois par semaine avant le commencement du protocole pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets urémiques, et tous les 3 jours suite à l’exposition au métronidazole. Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les surplus de nourriture sont aussi retirés de l’eau quotidiennement. De plus, des souches d’arbres flottants en composite plastique sont placées dans les bacs des têtards, qui leurs permettent de se cacher dessous. Des points limites sont définis et respectés pour éviter toute souffrance animale. Si les doses n’ont pas précédemment été déterminées dans d’autres modèles animaux, elles sont adaptées à partir de l’efficacité des molécules in vitro. Par notre expérience, ces doses sont peu ou pas toxiques chez le têtard de Xénope. Suite à l’anesthésie, les animaux sont placés dans un bac avec une oxygénation de l’eau plus importante et avec leurs congénères, et surveillés dans les minutes suivantes jusqu’au réveil, qui a lieu généralement 5 minutes après la fin de l’anesthésie, avec une reprise de la nage normale. Durant l’exposition au métronidazole, les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour et nuit n’impacte pas les têtards car nous n’avons pas observé de stress ou d’augmentation de la mortalité durant les 10 jours d’exposition.

Choix des espèces

La transparence des têtards facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction car étude longitudinale), de plus la grande homologie des protéines de la myéline des Xénopes avec celle des mammifères justifie l’utilisation de ce modèle. Les têtards sont utilisés entre stade 50 et 55. A cette période de développement, on peut facilement observer la dynamique de la mort et de la réapparition des oligodendrocytes in vivo et sans recours à l’euthanasie des animaux. De plus, le stade 48 correspond au début de la myélinisation dans le système nerveux central, au stade 50-55 la myélinisation est beaucoup plus avancée, donc plus facile à étudier.

160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent huit semaines de tests comportementaux (discrimination visuelle, mémoire spatiale, coordination motrice, mémoire de travail) et reçoivent une injection bihebdomadaire d'un traitement, avant d'être tuées pour prélever cerveau, foie et muscles. Le porteur indique n'attendre aucun phénotype dommageable de la lignée trisomique et recourir à une eau de boisson légèrement acide pour renforcer l'apprentissage sans priver les animaux. Il affirme que l'étude de fonctions cognitives impose de travailler sur un "organisme vivant dans son intégrité".

Objectifs

Le projet consiste à comprendre les mécanismes des déficiences intellectuelles associées à des trisomies. Nous nous intéressons plus spécifiquement dans cette étude à la restauration de déficits cognitifs (apprentissage, mémoire) et de coordination motrice dans un modèle de trisomie. Un traitement potentiel, déjà évalué sur un autre modèle de trisomie, a montré son effet positif sur des fonctions simples. Le présent projet souhaite étendre la caractérisation du traitement sur d’autres fonctions d’apprentissage et de mémoire. Il permettra de qualifier plus précisément les effets de l’administration du traitement.

Bénéfices attendus

Cette étude vise à étudier les effets thérapeutiques visant à réduire des défauts de coordination motrice et d’apprentissage et de mémoire. Cette étude constitue donc la base pour la recherche de voie d’amélioration pour les patients.

Procédures

Les animaux seront évalués lors d’un ensemble de tests comportementaux visant à observer leurs performances cognitives. Ces tests seront réalisés pendant une durée totale de 8 semaines. 4 semaines d’apprentissage de discrimination de motif visuelle, 2 semaines de tests évaluant la mémoire spatiale, 2 ou 3 (suivant le test choisi) jours de mesure de coordination d’activité motrice et 1 jour d’évaluation de la mémoire de travail + jours de repos entre les tests. Les animaux subissent une injection (30 s) bi-hebdomadaire (sur les 8 semaines de tests) d’un traitement visant à améliorer leurs fonctions cognitives sans effet négatif décrit.

Impact sur les animaux

Aucun phénotype dommagable n’a été rapporté lors d’études précédentes de la lignée de souris étudiée. L’injection du traitement par voir intra-péritonéale entraînera une légère douleur. Les souris seront soumises à un stress léger ou modéré lors des tests comportementaux (stimuli lumineux et changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétente l’eau lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Cela permet d’optimiser la durée de la procédure globale. L’apparence des animaux (état du pelage qui doit rester brillant et propre, perte de poids visible par saillie des hanches) sera surveillée au cours des manipulations quotidiennes des animaux pendant les tests comportementaux.

Devenir

Tous les animaux de la lignée transgénique étudiée seront mis à mort car nous allons faire des prélévements (cerveau, foie, muscles …) pour faire des études approfondies des tissus et des processus moléculaires

Remplacement

La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des retards mentaux requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer l’effet d’un traitement sur les processus cognitifs et moteurs. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.

Réduction

Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Nous analyserons les résultats de chaque test avec des tests statistiques adaptés. Nous prélèverons un maximum d’échantillons (organes, tissus…) sur chaque animal afin de pouvoir créer une banque pouvant être utilisée dans d’autres études.

Raffinement

Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Les animaux auront une eau de boisson quotidienne légèrement aversive afin de faciliter l’apprentissage du test par renforcement positif (la récompense dans le test d’apprentissage est constituée par du lait mélangé à du sirop de fraise) sans à avoir subir de privation ou de renforcement négatif. La boisson sucrée présentée dans le test devient d’autant plus appétente que l’eau de boisson quotidienne est acide ; cela renforce donc l’apprentissage des animaux, sans les priver. Des études précédentes ont montré que les souris ne perdent pas de poids malgré l’acidité de l’eau quotidienne.

Choix des espèces

La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la pathologie humaine étudiée (trisomie). Les souris seront testées une fois adultes (8 semaines). Nous avons choisi cet âge car il correspond à une période hors développement. Les patients porteurs de trisomie montrent des défauts cognitifs à l’âge adulte.

3 228 souris vont être utilisé·es, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des injections répétées, une infection chronique par le parasite Toxoplasma pouvant provoquer "un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à sept jours" et une perte de poids, des chirurgies stéréotaxiques et des tests cognitifs, pour étudier la neuro-inflammation dans la maladie d'Alzheimer. Les organes, dont le cerveau, sont prélevés après mise à mort. Le porteur affirme que les études in vitro "ne permettent pas" d'étudier le comportement et la cognition.

Objectifs

Une inflammation à bas bruit tout au long de la vie contribuerait aux mécanismes du vieillissement et même pourrait fortement peser dans la physiopathologie de la maladie d'Alzheimer et des démences associées. Au niveau du cerveau, des médiateurs de l’inflammation, les cytokines, qui circulent en grande quantité dans le cerveau au cours des infections ou lors des maladies neurodégénératives pourraient perturber les mécanismes de réponses physiologiques du neurone. Il est donc important de mieux comprendre comment les processus de neuro-inflammation affectent le comportement et la cognition. Ici, il est proposé d'utiliser des modèles de souris dans lesquels il est possible d’induire la suppression de l’expression d’un récepteur à une cytokine à la fois, et cela seulement dans les neurones. Cela permettra d’étudier l’importance de cette cytokine dans les processus mnésiques et comportementaux normaux, ainsi que dans des processus pathologiques. Ces derniers sont la neuroinflammation chronique ou des infections du système nerveux central. L'étude utilisera un modèle transgénique entrainant les symptômes de la maladie d'Alzheimer, ou une infection par Toxoplasma ou l'expression isolée de médiateurs de l'inflammation. Le recours à un modèle animal est donc irremplaçable pour cette étude, puisqu'elle vise à déterminer les effets de la suppression de la signalisation de cytokines sur la physiologie de neurones, le comportement et la cognition.

Bénéfices attendus

Comprendre le rôle des signaux pro-inflammatoires reçus par les neurones au cours des infections du système nerveux central et la réponse neuro-inflammatoire et la neurodégénérescence, permettra, sur le plan fondamental d'élucider les mécanismes clés mis en jeux dans les neurones et leur importance pour la fonction cognitive. Sur le plan médical, ces recherches pourraient déboucher sur l'identification de nouvelles cibles, pour des stratégies thérapeutiques contre des maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer, pour laquelle aucun remède n'est connu.

Procédures

Les interventions concerneront: i) des injections intrapéritonéales répétées journalièrement pendant 5 jours, sur animaux vigiles (2904 souris, 5 jours, chaque injection prend quelques secondes); ii) une infection chronique réalisée par une seule injection intrapéritonéale d'un parasite, dont la phase d'invasion peut engendrer un syndrome fébrile d'une durée de 7 jours, avant de devenir asymptomatique (2796 souris, une injection de quelques secondes); iii) deux types de chirurgies sous anesthésie générale: une de moins de 15 minutes (chirurgie cutanée, 432 animaux), ou/et une de moins de 40 minutes par animal (injection intracrânienne bilaterale, 960 animaux, 40 minutes); iv) une évaluation comportementale de l'anxiété et de l'activité locomotrice (une seule session de 10 minutes par animal), la force (une session de 5 minutes au total par animal, à raison deux 3 essais de 5 secondes chacun et 30 secondes au minimum entre chaque groupe de 3 essais) et les processus cognitifs ( toutes les souris (3228), sur 15 jours au total, tests d'objets (3 sessions chacune de 10 minutes d'exploration libre sur 2 jours par animal), labyrinthe de Barnes ( chaque souris testée une fois pendant 7 jours consécutifs, à raison de 3 essais d'exploration libre sur la table de 3 minutes maximum (selon la performance de l'animal) chacun par jour)), la perfusion intracardiaque sous anesthésie générale profonde terminale (sans réveil, 3228 animaux, moins de 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les souris utilisées ne présentent aucun symptômes apparents de maladie et n'ont donc pas de phénotype dommageable, ce que nous avons confirmé lors de leur utilisation dans le cadre du premier protocole APAFIS autorisé pour ces lignées. Dans le cas d'infection par Toxoplasma ou l'infusion chronique de cytokines pro-inflammatoires par implantation de pompes sous cutanées, les animaux présentent un syndrome fébrile qui peut durer jusqu'à 7 jours et peut entraîner une perte de poids, et de l'anxiété. Les chirurgies stéréotaxiques peuvent parfois entrainer une angoisse ou une prostration pendant les 48 premières heures post-chirurgie. Du fait que les animaux sont acclimatés à l'environnement des tests comportementaux et sont habitués aux expérimentateurs par manipulations régulières des animaux dans les semaines précédant les tests, aucune nuisance n'est constatée durant les tests comportementaux. Seul durant la semaine de labyrinthe de Barnes; où les souris doivent être hébergées individuellement, l'hébergement pourrait devenir anxiogène mais des mesures d'enrichissement du milieu et de nidification sont renforcées pour limiter l'anxiété potentielle, et l'isolement est limité à 14 jours maximum.

Devenir

Les 3228 animaux seront en fin de procédure euthanasiés. L'euthanasie est nécessaire afin de prélever les organes en post-mortem (dont le cerveau) des animaux pour comprendre ensuite au niveau cellulaire et moléculaire, les causes et mécanismes des changements observés au niveau comportemental, et limiter le double-emploi au maximum. Ces prélèvements post-mortem sont aussi nécessaires afin de confirmer l'efficacité de la procédure.

Remplacement

Le recours à l’expérimentation animale dans le cadre de cette étude intervient après de nombreuses études in vitro utilisant des modèles cellulaires qui ont démontré l’impact de facteurs produits par des pathogènes et de l’inflammation sur l’activation des cascades conduisant la neurodégénérescence. Le principe de remplacement n’est pas applicable à ce projet car ces études in vitro ne permettent pas d’étudier l’importance des manipulations proposées sur le comportement et la cognition. Par conséquent les études in vitro ne permettent pas l’obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine.

Réduction

Les expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en permettant une analyse statistique valide des résultats. Des études sur des modèles animaux similaires ont montré que des groupes de 15 animaux par expérience comportementale étaient nécessaires (12 pour les groupes contrôles témoins). En outre, un même groupe d'animaux pourra être utilisé pour plusieurs tests comportementaux et nous reproduirons chaque expérience 3 fois de manière indépendante. La variabilité interindividuelle ne nous permet pas de diminuer davantage le nombre d’animaux par groupe.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’une procédure de suivi du bien être animal. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’initiation du modèle. Un animal sera euthanasié s’il atteint un point limite caractérisé par l'atteinte d'au moins deux des 4 signes de souffrance décrits dans la section dédiée. Ces signes, nous les avons défini en accord avec le comité local de suivi du bien-être animal pour limiter la douleur, la souffrance ou l’angoisse de l’animal. Ces signes sont: perte de poids >20% du poids initial, déshydratation, léthargie, absence de toilettage. L'utilisation d'implants sous-cutanés permettront de délivrer des molécules de manière chronique ce qui évitera de devoir recourir à des injections journalières répétées. Des mesures seront prises pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental sur les souris (amélioration de l'enrichissement par de petites maisonnettes, tubes en carton et bâtons de bois à ronger, et ajouts de coton pour la confection de nids). La maitrise des interventions qui pourraient s'avérer douloureuses sera effectuée par l'utilisation d'analgésiques en péri-opératoire. Une surveillance journalière, par observation directe de l'attitude des souris dans la cage et leur pesée, par le personnel animalier ou expérimentateur permettra de déterminer l’éventuelle souffrance des animaux .

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. La souris est l’hôte naturel du parasite Toxoplasma gondii, ce qui nous permettra d’étudier les mécanismes physiopathologiques la signalisation de médiateurs de l'inflammation dans les neurones dans le cadre d’une infection naturelle. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet: faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. De plus, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation des animaux génétiquement modifiés (modèles invalidés pour un gène contribuant à la maladie ou exprimant les protéines humaines responsable de la pathologie Alzheimer). Aucune autre espèce d’animaux déficients pour la protéine étudiée n’est disponible. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc …) qui sont indispensables pour déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Seuls des animaux adultes d'âge supérieur à 6 semaines seront utilisés. Les recherches s'intéressent à l'impact de manipulations sur un système nerveux central mature et adulte, avec un impact de l'âge.

48 souris vont être utilisé·es, gardées en vie et conservées comme reproductrices dans l'élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Après une douzaine de semaines d'apprentissage par renforcement positif, elles passent des tests comportementaux décrits comme "potentiellement modérément anxiogènes" pour évaluer une méthode de capture moins stressante. Le porteur indique que les animaux sont placés dans des situations qu'ils "éviteraient probablement en conditions naturelles" et que leur "liberté comportementale est donc affectée". Il affirme que le projet reste utile "tant que l'élevage et l'expérimentation sur des rongeurs" existent.

Objectifs

Dans un cadre expérimental, les souris sont généralement attrapées à la main par la queue ou en les incitant à entrer dans un tube de transport. Bien qu'il ait été démontré que ce dernier type de manipulation soit moins stressant, il impose l’ouverture de la cage par l’expérimentateur ce qui est susceptible d'induire un certain stress chez la souris capturée et chez celles qui partagent sa cage. En outre, les difficultés rencontrées pour attraper les souris dans des environnements d'hébergement enrichis et complexes, par la queue ou à l’aide d’un tube de transport, peuvent conduire à freiner l'adoption de ces nouveaux types d'hébergement, qui amélioreraient considérablement le bien-être de ces animaux. En entraînant les animaux à venir volontairement dans une boite de transport, en utilisant un apprentissage par renforcement positif, on réduirait l'anxiété due à l’ouverture de la cage et à la capture, et on autoriserait l'utilisation d'environnements plus complexes sans créer de contraintes supplémentaires pour les expérimentateurs. Le premier objectif de ce projet de recherche est de développer un protocole d’apprentissage basé sur le conditionnement opérant, de sorte que chacune des souris, vivant dans un petit groupe social, apprenne à répondre à un signal sonore, différent pour chacune, en venant dans une boite de transport connectée à leur cage d'origine. L'animal pouvant alors être transporté jusqu'au dispositif expérimental. Notre deuxième objectif est de déterminer si cette procédure permet de réduire l'anxiété des animaux comparativement à une manipulation classique dans un tube de transport.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont l’obtention d’animaux moins stressés lors de la manipulation. Les manipulations des animaux sont nécessaires lorsque les animaux sont placés dans les dispositifs expérimentaux, ou changés de cage. Outre l’intérêt éthique d’éviter le stress, ce stress lié à la manipulation peut notamment affecter les mesures effectuées lors de divers tests comportementaux et affecter la qualité des expériences scientifiques utilisant des animaux de laboratoire. La capture d’animaux dans des environnement complexes (diverses parois, et enrichissements) peut s’avérer encore plus délicate et stressante. Cette procédure permettrait, une fois développée et automatisée, la capture plus aisée des animaux dans ces environnements complexes sans créer un stress supplémentaire ni compliquer le travail des expérimentateurs.

Procédures

Durant une première phase s'étalant sur une douzaine de semaine, les animaux connaitront un apprentissage où les animaux seront récompensés en effectuant certaines tâches. Les animaux seront ensuite soumis à des tests comportementaux non invasifs de brève durée (5 minutes chacun). Les deux premiers sont réalisés l'un à la suite de l'autre. Le second le jour suivant. Ces tests sont réalisés à deux reprises, à une semaine d'intervalle.

Impact sur les animaux

Deux nuisances peuvent résulter du projet. D'une part, les animaux seront soumis à des situations anxiogènes lors des procédures de test, Un certain stress pourra donc en résulter. D'autre part les animaux sont placés activement par l'exprimentateur dans des situations qu'il éviterait probablement en conditions naturelles. Sa liberté comportementale est donc affectée. Les tests comportementaux non invasifs effectués sont communément utilisés pour évaluer l’anxiété des animaux et sont donc potentiellement modérément anxiogènes. Ces tests ne durent que 5 minutes chacun, limitant ainsi la durée de l’exposition des animaux à cette situation anxiogène. Les animaux conservent la possibilité de rester en retrait des zones les plus anxiogènes des dispsitifs de test.

Devenir

A l'issue de la procédure expérimentale, les animaux n'ayant pas été, en apparence, particulièrement perturbés par les tests comportementaux (après avis du vétérinaire et de la personne en charge de la structure bien être animal), sont maintenus dans l'élevage afin de servir de reproducteurs pour la génération suivante d'animaux.

Remplacement

Le projet visant à élaborer une méthode moins stressante de manipulation des souris ne peut se passer de l’expérimentation sur l’animal. Il est en effet nécessaire que les animaux puissent exprimer leur comportement pour évaluer l'efficacité de cette nouvelle méthode sur une base comportementale. Ce projet demeure d'intérêt tant que l'élevage et l'expérimentation sur des rongeurs, impliquant systématiquement une manipulation des animaux existe.

Réduction

Un total de 4 groupes de 12 individus est prévu. Deux groupes (24 individus) ayant appris à répondre à un stimulus sonore. La comparaison de ce 2 groupes a pour objectif d'évaluer chez des individus ayant connu un même apprentissage, les niveaux de stress liés à un accès volontaire (à un signal sonore), ou incité par l'expérimentateur dans la boite de transport (méthode classique). Deux autres groupes (24 individus) ne sont pas soumis à l'apprentissage. Ces deux groupes permettent d'évaluer l'effet de la procédure d'apprentissage sur les niveaux de stress des animaux. Ils permettent d’évaluer cet effet lors d'un accès via la boite de transport connectée au dispositif et lorsque les animaux sont manipulés de manière classique. Des comparaisons statistiques pourront alors être effectuées sur ces 4 groupes de 12. Cet effectif tient compte de la variabilité interindividuelle relativement importante pouvant exister chez cette souche sauvage de souris. En outre, ces mêmes individus seront testés une nouvelle fois une semaine plus tard, où les individus des différents groupes seront alors incités à entrer dans la boite de transport de manière différentes à celle qu'ils ont connu la fois précédente. Nous tentons d'assurer avec cette répétition qui accroît la puissance des tests statistiques que malgré le nombre relativement réduit d'individus par groupe, un effet marquant de l’accès volontaire à la boite de transport sur les niveaux d'anxiété des animaux sera mis en évidence.

Raffinement

Toutes les cages utilisées pour l’hébergement des animaux dépassent largement le minimum requis pour l ‘hébergement de deux individus (31 x 20 x 14 cm) et sont enrichies par deux tubes de carton, du matériel de construction pour faire un nid et des bûchette de bois. Un suivi quotidien des animaux utilisés permet de vérifier que les procédures d’apprentissage employées, les moyens utilisés pour le transport des animaux et les tests comportementaux ne conduisent pas les animaux à adopter des comportements pouvant traduire un stress ou mal-être chronique. Des points limites sont définis en amont et des mesures appropriées seront prises en cas de blessures ou de comportements anormaux.

Choix des espèces

Les souris domestiques sont les animaux les plus utilisés en expérimentation animale, cette espèce est donc celle qui est la plus concernée par les questions relatives aux manipulations par les expérimentateurs. Nous n’utilisons pas une souche de souris particulière, mais des animaux d’origine sauvage élevés en laboratoire depuis de 15 générations dans notre laboratoire en tentant de préserver au mieux une forte diversité génétique. Nous espérons de ce fait que résultats obtenus sur ce modèle seront d’autant plus généralisables aux diverses souches de souris de laboratoire. Tous animaux utilisés sont des adultes (70 à 160 jours). Cette tranche d’âge est communément utilisée dans bon nombre d’études chez la souris, permettant le transfert de nos résultats à ces nombreuses études.