Éthologie / comportement / biologie animale

360 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'un gène de l'autophagie invalidé, elles subissent une série de tests de développement puis des tests comportementaux nommés, dont l'activité locomotrice, l'anxiété, la résignation et la communication, avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie pour prélever le cerveau. L'objet est d'étudier le rôle de l'autophagie dans les troubles du neurodéveloppement comme l'autisme, les retombées thérapeutiques étant renvoyées au long terme. Le porteur affirme que l'effet d'un tel défaut sur le comportement ne peut s'étudier autrement qu'in vivo.

Objectifs

Les troubles du développement sont en augmentation constante, avec un nombre de cas estimé par exemple pour les troubles du spectre autistique (TSA) à 1 enfant sur 54 aux Etats-Unis pour l'année 2014 et 1 enfant sur 89 en Europe. Parmi les causes récemment décrites dans la littérature scientifique, l’hypothèse d’un défaut d’un processus cellulaire appelé autophagie, au sein des cellules du cerveau, lors du développement chez l’enfant, est émise. Des études récentes ont ainsi démontré, chez l’homme et chez l’animal, un rôle de la dérégulation de ce mécanisme dans la survenue de comportements de type autistique. Par ailleurs l’autophagie est le moyen par lequel les cellules éliminent des composés d’origine environnementale. Un défaut dans ce mécanisme d’élimination apparaît alors crucial dans le cadre de l’apparition de troubles du développement, reconnus comme étant le résultat d’une combinaison « gènes x environnement ». Dans ce contexte, notre projet vise alors à étudier à différents âges le développement du système nerveux central chez un modèle souris pour lequel un gène de l’autophagie a été invalidé, par des approches complémentaires d’études du comportement et d’analyses des tissus prélevés. En particulier, nous étudierons le développement sensoriel et moteur chez le jeune animal pendant les trois premières semaines de vie, par la mise en place de tests successifs classiquement utilisés ; puis nous étudierons un ensemble de registres comportementaux individuels ou sociaux chez l’animal adolescent et adulte, tels que le niveau d’activité locomotrice, l’anxiété, les capacités cognitives, les comportements compulsifs, la résignation et les capacités de communication. Les échantillons prélevés nous permettront d’étudier les mécanismes d’autophagie et de mise en place des connexions nerveuses, par des techniques complémentaires.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra à court terme la compréhension du rôle de l’autophagie dans le développement du système nerveux central et dans la survenue de troubles du neurodéveloppement, en constante augmentation dans la population générale. A plus long terme, ce projet servira de point de départ à des tests précliniques visant à déterminer l’efficacité de molécules pharmacologiques modulant ce mécanisme cellulaire pour atténuer la survenue de ces troubles.

Procédures

Les animaux sont soumis à des tests de développement ou de comportement non invasifs. Ils sont tous soumis à une procédure sans réveil de quelques minutes (perfusion intracardiaque sous anesthésie se finissant par l’euthanasie de l’animal).

Impact sur les animaux

A notre connaissance, cette souris n’a jamais été étudiée d’un point de vue de son développement cérébral ou de son comportement. Le phénotype n’est à ce jour pas connu comme étant dommageable. Dans les procédures du présent projet, les animaux subissent exclusivement des tests non invasifs de développement et de comportement, jusqu’à l’euthanasie, pour laquelle un protocole d’anesthésie est mis en place.

Devenir

A l’issue des procédures 1, 2 et 3, les animaux sont soumis à la procédure 4 (sans réveil). La procédure 4 décrit une perfusion intracardiaque réalisée afin de prélever les tissus d’intérêt. Les procédures 1, 2 et 3 sont classées en degré de gravité « modéré » et la 4ème est une procédure sans réveil. Les 3 premières procédures concernent chacune 120 animaux, la 4ème est réalisés sur l’ensemble des 360 animaux soumis à l’une des 3 premières procédures modérées. Nous comptons donc dans cette demande d’autorisation de projet 360 animaux en procédure modérée et 0 en procédure sans réveil. Les animaux ne sont donc pas maintenus en vie à l’issue de la procédure 4.

Remplacement

L’étude de l’effet d’un défaut de l’autophagie sur le comportement de l’individu ne peut se faire autrement que par des explorations fonctionnelles menées in vivo. Ainsi, même si nous ne pouvons pas remplacer les études prévues sur ce modèle in vivo, nous veillerons à réduire le nombre d’animaux et raffiner notre protocole.

Réduction

Ce projet nécessite l’utilisation d’un total de 360 souris. Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée de souris. De même, les animaux femelles et mâles générés sont utilisés. De plus, quand cela est possible, un même animal est utilisé successivement pour plusieurs tests de comportement, puis pour des études de biologie moléculaire et la réalisation de séries de coupes par cerveau nous permet de réaliser plusieurs marquages différents pour un même cerveau. D'une manière générale, nous avons conçu les lots pour que soit généré le nombre optimal d’animaux compatible avec la réalisation des tests et des analyses des prélèvements. Enfin, nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque procédure, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les données obtenues seront ultérieurement étudiées statistiquement : La normalité de la distribution des data obtenues sera analysée par le test de Shapiro-Wilk, et des tests paramétriques (ANOVA et test a posteriori de Bonferroni pour les données issues des tests de développement et comportement ou test t de Student pour les analyses des échantillons) ou non paramétriques (test de Kruskal-Wallis puis Mann-Whitney) seront ensuite appliqués. Par ailleurs, pour chacune des approches expérimentales, ce travail servira de base pour de futurs travaux intégrant une exposition précoce à un facteur environnemental afin de calculer le nombre juste d’animaux requis pour comparer d’une manière statistique et robuste les conditions mutantes à la condition contrôle avec une excellente reproductibilité.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Les animaux sont surveillés quotidiennement et une grille de suivi (annexe) est en place. Paramètres environnementaux : humidité comprise entre 45 % et 65 %, température constante entre 20 à 24 °C. L’éclairage est circadien (8h/20h) pour respecter le rythme biologique des animaux. Ils ont accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Le milieu est enrichi avec du matériel de construction de nid. Les souris sont hébergées en groupe sociaux et des observations du bien-être sont réalisées quotidiennement. Les jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Un aliment enrichi et de l’eau sont mis à disposition directement dans la cage pour les animaux apathiques, surveillés 1 ou 2 fois/ jour. Si l’état général de l’animal atteint les points limites définis dans les procédures expérimentales (douleur manifeste, dégradation de l’état de la fourrure et manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture, perte de poids de plus de 20 % par rapport au poids normal attendu selon la courbe de croissance standard de la souche C57BL/6Ncrl), alors il sera euthanasié par décapitation avant PND14 et dans une chambre à CO2 après PND14. Pour le protocole de perfusion intracardiaque suivi des prélèvements de tissus, un protocole d’anesthésie adéquat est mis en place (procédure 4). Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés conformément aux bonnes pratiques vétérinaires et à la réglementation en vigueur.

Choix des espèces

L’obtention d’un modèle génétique pertinent visant à étudier un facteur génétique, ici Irgm1, est souvent complexe et long à mettre en oeuvre pour de nombreuses espèces. Néanmoins le modèle Irgm1 KO existe depuis 2001 chez la souris. Par ailleurs, de nombreux outils ont été conçus et sont disponible pour étudier le comportement, les paramètres physiologiques et biologiques chez la souris et nous maitrisons l’utilisation des outils à disposition. Ce modèle animal fait partie des animaux les plus étudiés et caractérisés aux différentes échelles de la biologie. Par ailleurs, les modèles génétiques murins de déficience autophagique sont pertinents dans l’étude des troubles du neurodéveloppement (voir 3.3.2). Plusieurs stades de développement seront analysés : nous nous intéressons en effet aux conséquences de la mutation sur l’élagage synaptique et sur la fonctionnalité de l’autophagie, qui sont des événements majeurs du développement du système nerveux central. Pour cela plusieurs stades de développement, correspondant chacun à un temps d’euthanasie, seront étudiés : jeune (procédure 1 de PND4 à 17), adolescent (procédure 2 de PND25 à 34) et adulte (procédure 3 de PND70 à 89).

96 souris glaneuses vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Les jeunes sont separes de leur mere aux jours 9 et 12 pour enregistrer leurs cris de separation, puis testes en champ ouvert et face a un objet nouveau aux jours 35 et 50, avant d'etre tues au jour 55 pour peser leurs organes, dont les glandes surrenales comme marqueur de stress. Le porteur reconnait que la separation maternelle peut, dans de rares cas, conduire la mere a un infanticide et que les tests repetes imposent un stress. Il affirme qu'une etude du comportement individuel ne peut se passer d'animaux, l'objectif etant de mesurer l'effet de l'age de la mere sur la personnalite de la descendance.

Objectifs

Les effets de l'âge maternel sur le développement de la personnalité de la progéniture ont rarement été étudiés dans des modèles animaux. Dans notre étude, nous visons à examiner les différences potentielles de différences individuelles cohérentes dans le comportement (c'est-à-dire les différences de « personnalité ») entre la progéniture née de mères jeunes et âgées. Ceci sera fait par le phénotypage comportemental des jeunes. Tout d'abord, pendant la période de nidification, cela se fait par des tests répétés de vocalisation de séparation, libérant généralement des fréquences variables de cris de séparation ultrasoniques chez les petits. Plus tard, après le sevrage, nous effectuons deux tests combinés, qui sont également répétés, les tests en champ libre et directement après, un nouvel objet est introduit dans l'arèneet l'exploration de l'objet par l'animal est quantifiée. Ainsi, ces deux tests servent à quantifier des différences individuelles cohérentes (différences de personnalité) dans la tendance à l'exploration. Le premier type de test a été fréquemment utilisé pour phénotyper les différences individuelles chez les jeunes mammifères, y compris chez les souris. En outre, la tendance à l'exploration, quantifiée par des tests de champs libre et des tests du nouvel objet, est un trait de personnalité clé chez de nombreuses espèces de petits mammifères.

Bénéfices attendus

Nous pourrons mettre en évidence la contribution de l'âge de la mère dans la personnalité de la progéniture, ce qui est un aspect jusqu'à présent peu exploré des caractéristiques maternelles dans ce contexte. Deuxièmement, en associant les vocalisations ultrasoniques des petits en réponse à la séparation à leur tendance à l'exploration lors des tests effectués après le sevrage, nous serons en mesure de conclure dans quelle mesure les vocalisations au cours de la vie précoce sont prédictives des différences de personnalité au cours des étapes ultérieures de la vie.

Procédures

Seules des mesures comportementales seront effectuées. Les tests suivants sont effectués sur des animaux vigiles : (1) Une séparation maternelle est effectuée les jours postnatals 9 et 12 (5 minutes chacun), c'est-à-dire pendant la période de nidification. Au cours de ce test, on quantifie la fréquence des vocalisations non ultrasoniques des animaux lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs (appel de séparation). (2) Les jours postnatals 35 et 50 (5 minutes chacun), les animaux sont introduits dans une nouvelle arène et leur exploration et leur activité locomotrice sont quantifiées. Directement après ces 5 minutes de test, un nouvel objet (une boîte métallique, par exemple) est introduit dans l'arène et les réponses de l'animal (pendant les 5 minutes suivantes) à ce nouveau stimulus sont quantifiées.--- Au total, chaque individu sera soumis à 6 tests comportementaux entre les jours postnatals 9 et 50, chaque test ayant une durée de 5 minutes. -- Une fois l'expérimentation terminée, les animaux sont euthanasiés au jour postnatal 55 et seront disséqués par la suite.

Impact sur les animaux

Les tests comportementaux que nous utilisons peuvent être considérés comme peu ou modérément invasifs. De brèves séparations des petits de leur mère, comme cela a été fait lors du test de vocalisation de séparation aux jours 9 et 12, peuvent, dans de rares cas, conduire à un infanticide par la mère. En outre, les tests répétés aux jours 35 et 50 peuvent imposer un certain stress aux jeunes. Cependant, nous considérons que les effets négatifs d'un tel stress plutôt léger ou modéré n'affecteront pas notablement le bien-être.

Devenir

A la fin de la procédure, au jour postnatal 55, les 96 animaux expérimentaux seront euthanasiés. Ensuite, les animaux seront disséqués et nous allons mesurer et peser leurs organes. Sur la base de ces données, nous comparerons, par exemple, le poids des glandes surrénales (en tant que marqueur du stress chronique) entre les petits issus de mères âgées et de mères jeunes.

Remplacement

Les conséquences de l'âge maternel sur l'émergence de différences individuelles constantes de comportement ("différences de personnalité") ne peuvent être évaluées par d’autres moyens que ceux où l’utilisation d’animaux est requise. S’agissant d’une étude sur le comportement des individus il n’est pas possible de se passer des animaux.

Réduction

Selon notre hypothèse, la cause sous-jacente des différences potentielles de personnalité entre les descendants de mères jeunes et de mères âgées sont les effets de l'âge des mères, qui trouvent donc leur origine au niveau maternel. Ainsi, il est nécessaire de tester un nombre suffisamment élevé de mères, c'est-à-dire 12 portées de mères jeunes et 12 portées de mères âgées. Cependant, il est également nécessaire de tester plusieurs jeunes par portée afin de démêler les effets de facteurs tels que le sexe et la masse corporelle des jeunes, qui peuvent également influencer l'émergence de différences de personnalité. Ainsi, nous avons décidé de tester 4 jeunes par portée, de préférence 2 mâles et 2 femelles. Cette stratégie nous permettra également de garder les 4 frères et sœurs ensemble dans un groupe après le sevrage, ce qui est favorable du point de vue du bien-être animal. La taille d'échantillon (au total: N = 96 animaux expérimentaux) nécessaire pour obtenir des résultats fiables a été calculée par un test de puissance.

Raffinement

Des enrichissements environnementaux (matériaux de nidification, rondins à ronger) seront fournis aux animaux à tout moment, aux couples reproducteurs ainsi qu'aux jeunes après le sevrage. Après le sevrage, les animaux expérimentaux (N = 96) sont toujours gardés en groupe avec leurs frères et sœurs de la même portée, ce qui leur procure un environnement social stable. En outre, la présence de frères et sœurs apporte généralement un soutien social et contribueront ainsi à amortir les conséquences négatives du stress. Tous les transferts d'animaux d'une cage à une autre ou à un dispositif de test se feront sans manipulation directe mais par l'utilisation d'une petite boîte dans laquelle l'animal sera encouragé à entrer. Les différents tests auxquels les animaux sont soumis sont brefs (5 minutes chacun) et peu invasifs. Lorsque les jeunes sont séparés de leur mère lors des tests effectués pendant les jours postnatals 9 et 12, nous empêchons le refroidissement des jeunes par un sol chauffé à 30°C dans le cadre du test. En outre, pour éviter efficacement un éventuel infanticide de la mère lors du retour au nid, nous avons pris diverses mesures, par exemple : utilisation de gants portant uniquement l'odeur de la portée particulière, séparation courte seulement, la mère n'entendra pas les cris de séparation des petits pendant la procédure. Un point limite majeur de cette expérimentation est d'éviter l'utilisation de petits pour le test de vocalisation de séparation dont la température corporelle s'est déjà refroidie trop bas avant l'expérience. Il s'agit d'un processus réversible, qui peut se produire car certains petits, au cours de leur dynamique naturelle dans le nid, perdent parfois temporairement le contact avec leurs frères et sœurs de portée avant d'être récupérés au nid par la mère. Par conséquent, lorsque nous sortons les petits pour l'expérimentation, nous mesurons leur température de surface corporelle à l'aide d'un thermomètre infrarouge sans contact. Seuls les petits dont la température de surface corporelle est supérieure à 34°C sont utilisés. Si la température de surface corporelle du petit choisi est trop basse, il est ramené au nid et peut être testé après 1-2 heure, lorsqu'il s'est remis de son épisode de basse température. Les tests comportementaux aux jours postnataux 35 et 50 donnent généralement aux animaux la possibilité d'adopter une solution comportementale qui leur convient.

Choix des espèces

La souris glaneuse a, dans des conditions naturelles, une durée de vie très courte. Seuls les juvéniles nés pendant les mois d'été survivent à l'hiver. Pour cette raison, le schéma suivant se dessine : (1) Au printemps, toutes les femelles qui se reproduisent sont primipares mais sont les vieilles femelles (environ 7-8 mois) nées au cours de l'année précédente. (2) Plus tard au cours de la saison de reproduction, les mères sont principalement nées au cours de la même année (=des mères plus jeunes). Il existe des différences distinctes dans l'âge maternel au printemps et en été chez cette espèce. Notre projet utilise ce phénomène intéressant de l'histoire de vie de cette espèce, et explorera dans une étude en laboratoire si les différences d'âge maternel conduisent à des différences de personnalité chez la progéniture. Nous quantifierons la vocalisation des jeunes pendant la période de pré-sevrage, vers les jours 9 et 12. À cet âge, les petits émettent des cris de séparation ultrasoniques lorsqu'ils sont séparés de leur mère et de leurs frères et sœurs. Plus tard, à l'âge de 35 et 50 jours (stade juvénile, avant la maturité), nous testerons la tendance à l'exploration des animaux dans une arène ouverte et lorsqu'ils sont confrontés à un nouvel objet. Des études précédentes ont montré que tester les animaux à ces jours est approprié, car ils sont généralement très motivés pour explorer l'arène de test.

80 souris modeles de la trisomie 21 vont etre utilisees, toutes tuees a l'issue, dans des procedures impliquant un niveau de souffrance modere. Chaque animal est gave quotidiennement pendant dix-sept jours avec une molecule a visee therapeutique ou sa forme inactive, subit un poincon d'oreille pour le genotypage, passe des tests de memoire spatiale et de reconnaissance d'objets, puis est tue pour doser l'effet du compose dans le cerveau. Le porteur indique que les gavages repetes peuvent devenir douloureux et espere une amelioration des performances cognitives du modele. Il affirme que l'etude de ces deficiences intellectuelles d'origine genetique passe par un organisme vivant proche de l'homme, sans autre methode possible.

Objectifs

Le Syndrome de Down (SD) aussi appelé Trisomie 21 (T21), est dû à la présence d’un chromosome 21 surnuméraire. Ce syndrome touche 1 nouveau-né pour 600-800 naissances et représente environ un tiers des déficiences intellectuelles chez les enfants d’âge scolaire. C’est la forme la plus fréquente de retard mental, qui est également associée à un large panel de dysmorphies ou malformations. Parmi les gènes candidats à l’apparition de ces symptômes, un gène présent sur le chromosome 21 humain et donc en 3 copies chez les sujets porteurs de la T21, est aujourd’hui une des cibles privilégiées pour le développement de traitements thérapeutiques. Les études de ce gène chez la souris ont démontré son implication dans le développement et la maturation du cerveau. En effet, les souris ayant une copie supplémentaire de ce gène présentent une altération des capacités d’apprentissage et un déficit de la mémoire similaires à celles observées dans la T21. Arriver à déplacer de quelques dizaines de points le quotient intellectuel des patients atteints de la T21 leur permettrait d’avoir une vie plus autonome et socialement intégrée et constituerait un progrès très important pour la qualité de vie des patients et de leur entourage. L’objectif de la recherche sur la T21 est donc de mettre au point un traitement améliorant les fonctions intellectuelles des patients. Des collaborateurs proposent de tester 1 nouveau composé (et 1 composé non fonctionnel, utilisé comme contrôle négatif) pour leur propriété à améliorer les capacités cognitives qui sont altérées dans cette pathologie en ciblant l’activité de notre protéine d’intérêt. Durant ce projet, nous souhaitons déterminer si ce composé sera efficace en terme de restauration des fonctions intellectuelles. En parallèle, le composé non fonctionnel devrait avoir aucun effet. Ces composés ont été synthétisés et testés pour l’ADME (Administration, Distribution, Métabolisation et Excrétion) pharmacologique, par nos collaborateurs. Ces composés seront ainsi administrés par notre équipe à des souris modèles de T21. Les souris traitées feront l’objet de différents tests comportementaux afin de détecter une amélioration de leurs performances cognitives.

Bénéfices attendus

Nous espérons obtenir une amélioration significative des performances cognitives (notamment dans 2 types de mémoires : mémoire de reconnaissance spatiale et mémoire explicite de reconnaissance d'objets) dans un modèle murin de trisomie 21, qui montre de faibles performances dans ces 2 tests. Cette amélioration sera caractérisée également par un dosage de l'activité de phosphorilation de Dyrk1a, activité qui devrait être diminuée par l'effet du composé testé. Les animaux traités avec la forme non active du composé devraient présenter les mêmes déficits que les individus contrôles sauvages non traités.

Procédures

Les animaux seront gavés quotidiennement avec des molécules à visée thérapeutique pour une durée maximale de 17 jours. Le temps du gavage est de 20 à 30 secondes maximum. Pour le genotypage des animaux, un poinçon d’oreille sera effectué, conjointement à la pose d'une bague d'identification . Ce geste est rapide et ne prend que quelques secondes

Impact sur les animaux

Les nuisances attendues sont l'introduction d'une canule de gavage pour l'administration des molécules per os. Une douleur peut apparaitre à cause de la répétition des gavages, au maximum 17 jours au total, soit 1 par jour. Stress léger et rapide dû à la pose de bague et prélèvement d'une biopsie d'oreille.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à l'issu des 17 jours de traitement. Les cerveaux seront prélevés pour réaliser un dosage de l'effet des molécules à visée thérapeutique.

Remplacement

L’utilisation de la souris dans cette étude est justifiée par le fait que les anomalies à observer (altération des capacités d’apprentissage et déficit de la mémoire) nécessitent un modèle vivant et suffisamment proche de l’homme pour pouvoir être transposé.

Réduction

Pour ce projet, des souris mâles et femelles seront utilisés à partir de 3 mois, âge équivalent au jeune adulte. Nous utiliserons et testerons le composé sur les deux sexes afin de vérifier qu’il n’y a pas de différence entre mâle et femelle. L'étude nécessitera 5 groupes de 16 animaux (8 femelles et 8 mâles), soit 80 souris au total. 13 animaux par groupe sont nécessaires pour avoir une puissance statistique suffisante. Comme les tests comportementaux sont sans contraintes, certains animaux ne répondront pas, c'est pourquoi nous testerons 3 animaux de plus dans chaque groupe.

Raffinement

Les animaux bénéficieront d’un suivi quotidien à partir du début de leur traitement jusqu’à la fin de l’expérience. Et dans le cas où les animaux présenteraient des signes de souffrance, de mal-être, ou de douleur, ils seront exclus des analyses et soignés ou euthanasiés selon leur état. Pour la manipulation des animaux, et afin de limiter le stress, nous utiliserons des tubes de manipulation, ce qui évite de les prendre par la queue. Les tubes seront laissés dans les cages d'élevage comme enrichissement du milieu. Les animaux seront élevés par groupe de 2 animaux minimum pour éviter l'isolement.

Choix des espèces

La compréhension des mécanismes physiologiques et moléculaires ainsi que des origines développementales des pathologies génétiques associées à des retards mentaux requièrent l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité et sa globalité et il n’existe donc pas de méthode autre que l’étude in vivo. La souris est une espèce physiologiquement et génétiquement proche de l’homme dans laquelle nous pouvons réaliser les manipulations génétiques pour obtenir ces modèles de pathologies humaines. De plus, les études dans le modèle humain sont limitées tandis que le modèle murin permet d’accéder à tous les tissus et à toutes les étapes du développement. En outre, le génome de la souris étant manipulable, il permet donc de recréer les modifications génétiques qui sont à la base du syndrome de Down. Les souris seront étudiées à partir de l’âge adulte, c’est-à-dire 3 mois, car c’est l’âge auquel le comportement exploratoire et les aptitudes de mémorisation sont présents.

225 souris adultes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, 200 mâles tués à l'issue et 25 femelles réutilisées pour d'autres projets. Les mâles subissent une chirurgie stéréotaxique ouvrant la boîte crânienne pour injecter un vecteur viral supprimant le récepteur aux androgènes, puis des tests de comportement sexuel, d'anxiété, de locomotion et de fertilité. Les 25 femelles, utilisées comme animaux stimulus, subissent une gonadectomie et des injections de progestérone. Le porteur affirme que l'étude du comportement de reproduction ne peut se faire que sur "l'organisme entier" et signale des risques de douleur post-opératoire, d'hypothermie et d'arrêt cardio-respiratoire liés à la chirurgie et à l'anesthésie.

Objectifs

Ce projet vise à identifer les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction et du comportement de reproduction chez la souris adulte mâle. La survie des espèces dépend de la capacité des individus à se reproduire. Une reproduction réussie requiert la production de gamètes mais également l’expression des comportements de reproduction mâle et femelle afin d’optimiser la fécondation. Chez le mâle, la fonction de reproduction ainsi que le comportement de reproduction sont contrôlées par le cerveau sous l’action des androgènes. Des études précédentes ont démontré un rôle de la signalisation androgénique au sein du cerveau contrôlant la fonction de reproduction ainsi que l’expression du comportement de reproduction mâle. Ces études ont utilisé des souris dont la délétion du récépteur aux androgènes ciblait l’ensemble du tissu neural tout au long de la vie sans distinction du type cellulaire (i.e. cellules gliales versus neurones) ni de la région cérébrale. Ici, nous souhaitons décrypter plus en profondeur les phénotypes cellulaires et les régions cérébrales régulées par les androgènes dans la fonction et le comportement de reproduction mâle à l’âge adulte. Dans ce but, nous déléterons spécifiquement le récepteur aux androgènes au sein d’une région spécifique du cerveau, la region préoptique médiane, dans les cellules gliales ou neuronales à l’âge adulte puis nous étudierons la fonction et le comportement de reproduction suite à ces délétions.

Bénéfices attendus

Les perturbations hormonales au cours de la vie peuvent avoir un impact majeur sur les réponses neuroendocrines et comportementales liées à la reproduction par le biais d’altérations des structures cérébrales impliqués dans ces réponses. Cette étude participera à faire progresser la compréhension des mécanismes d’action sous-tendant cette régulation. Les modèles transgéniques utilisés nous permettront de comparer les mécanismes neuraux des deux voies de signalisation majeures impliquant les récepteurs des oestrogènes et des androgènes chez le mâle.

Procédures

Un nombre de 200 souris mâles subiront une chirurgie sous anéthésie générale avec réveil qui durera entre 30 et 45 minutes maximum. Après 3 semaines de rétablissement, les souris subiront différents tests de comportements sexuels, d’anxiété et de locomotion ainsi que des tests d’étude de leur fertilité. L’ensemble de ces tests n’a pas d’effet indésirable. Un lot de 25 souris femelles subira des gonadectomies sous anesthésie générale avec réveil qui durera entre 15 et 30 minutes maximum. Ces femelles subiront également 2 injections sous-cutanées de progestérone avant les tests de comportement sexuels.

Impact sur les animaux

Au sein de ce projet, nous pratiquerons sur les animaux des chirurgies sous anesthésie générale à l’isofluorane pendant lesquelles une ouverture de la boîte cranienne est réalisée afin d’injecter dans une région cérébrale donnée un vecteur viral qui nous permettra de déléter le récepteur aux androgènes (AR). Les éventuels nuisances et effets indésirables à court et à long terme liés à cette chirurgie sont : - Une hypothermie - Arrêt cardio-repsiratoire liée à l’anesthésie - Une douleur post-opératoire se traduisant par une apparence, une position et des comportements anormaux - Une perte de poids rapide. La délétion de l’AR dans l’ensemble du système nerveux dès la conception n’entraîne pas d’effets indésirables : nous ne nous attendons donc pas à des nuisances ou des effets indésirables suite à la délétion restreinte de l’AR dans la région préoptique à l’age adulte.

Devenir

Au sein de cette demande d’autorisation de projet 200 animaux seront euthanasiés à la fin des différentes procédures afin de réaliser des prélèvements et analyses post-mortem nécessaires à l’étude du role du récepteur aux androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Les animaux stimuli nécessaires à l’étude du comportement sexuel mâle (25 femelles) seront réutilisés pour des projets au sein de l’équipe de recherche ou par des collaborateurs afin de respecter la règles des 3Rs.

Remplacement

L’étude des fonctions et comportements de reproduction ne peut se faire que sur l’organisme entier. Dans cette étude, nous souhaitons identifier les cibles cérébrales des androgènes nécessaires à la régulation de la fonction de reproduction et l’expression du comportement sexuel mâle. Cela nécessite des modèles animaux afin de pouvoir étudier les structures et populations cellulaires contrôlant la reproduction et les méthodes alternatives et/ou substitutives ne peuvent remplacer l’animal entier pour ce projet. La souris est le modèle animal sélectionné afin de tirer profit des techniques récentes (transgénèse conditionnelle et transduction virale) pour l’étude de la fonction des gènes dans le cerveau

Réduction

Dans cette demande d’autorisation de projet, nous utiliserons un total de 1125 animaux (225 souris adultes et 900 souriceaux) sur 4 procédures qui nous permettront d’étudier le rôle du récepteur des androgènes dans la régulation de la fonction et du comportement de reproduction mâle. Pour chaque procédure, nous avons eu à cœur de calculer au plus juste le nombre d’animaux dans chaque groupe afin de réduire le nombre d’animaux utilisés tout en garantissant la puissance statistique de l’étude. Pour les études comportementales, 8 à 12 animaux par groupe sont nécessaires pour des résultats fiables et consistants. Un même groupe d’animaux est utilisé pour plusieurs tests. De plus, nous utiliserons les mêmes cohortes d’animaux pour les analyses comportementales et immunohistochimiques. Nous péléverons également d’autres organes et les garderons pour de futures études ou nous les proposerons aux collaborateurs de l’équipe.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans une animalerie spécialisée sous la supervision des soigneurs et du vétérinaire-référent. L’hébergement des animaux sera réalisé conformément à la directive européenne en termes d’espaces et d’environnement. Les souris seront soumises à un cycle de lumière-obscurité de 12h dans un environnement à température contrôlée avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Les cages complètes seront changées chaque semaine. Pour l’enrichissement, un nid végétal sera placé dans la cage. Au cours des chirurgies, les animaux seront anesthésiés par anésthésie gazeuse. Afin de minimiser les effets indésirables de la chirurgie, les animaux seront injectés en sous-cutané avec un analgésique en pré-opératoire 30 minutes avant la chirurgie et avec un analgésique anti-inflammatoire en post-opératoire toutes les 24h pendant 3 jours suivants l’opération. Par la suite, un suivi journalier sera réalisé afin d’observer les signes potentiels d’un mal-être animal. Les critères absolus suivants seront observés : - Apparence et position anormale : poil ebouriffé, perte excessive de poils, dos courbé, yeux enfoncés, couché sur le coté et hypothermie - Comportements anormaux : aggressivité soudaine, abbatement, inactivité, vocalisation et mutilation, isolement, diminution de l’appétit et déhsydratation (mesure du poids des biberons et observation des signes physiologiques de déshydratation) - Une perte de poids rapide et supérieur à 20 pourcents du poids corporel de l’animal mesuré avant la chirurgie. Les animaux seront pesés tous les jours pendant 5 jours après le protocole de chirurgie stéréotaxique puis 1 fois par semaine. - Etat de choc, léthargie, inconscience, immobilité - Difficulté respiratoire Les souris seront surveillées quotidiennement et pesées hebdomadairement afin de s’assurer que toute souris présentant une perte de poids excessive (-20 pourcents du poids corporel au début de l’étude) ou une détresse seront euthanasiées. Suite à l’observation de ces critères et au diagnostic d’une douleur ou d’un mal-être animal, celui-ci sera euthanasié.

Choix des espèces

La souris est l’un des modèles les mieux caractérisés pour ces études neuroendocrines et comportementales grâce à la disponibilité d’outils biotechniques (anticorps, lignées transgéniques, vecteurs viraux, …) et de données dans la litérature permettant de comparer les résultats obtenus avec ceux d’autres laboratoires et ainsi d’implémenter les connaissances sur cette thématique. Les animaux utilisés sont issus d’accouplements réalisés au sein de notre établissement utilisateur et seront utilisés à l’âge adulte lorsque leur maturité sexuelle est atteinte (à partir de 8 semaines). Chaque souris est identifiée soit par tatouage soit par encoche aux oreilles.