Autre recherche fondamentale

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.

La perte de 20 % du poids maximal accompagne souvent une baisse de mobilité, une prostration et un retrait de l'animal dans sa cage, et le porteur prévoit de tuer les hamsters avant ce seuil. 22 hamsters dorés vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Ils reçoivent dans l'abdomen des parasites responsables de la leishmaniose viscérale, qui colonisent leur foie et leur rate au cours d'une phase silencieuse pouvant durer six mois, puis subissent jusqu'à trente-six séances d'imagerie sous anesthésie, chacune précédée d'une injection dans l'abdomen, et un à quatorze gavages. L'objet déclaré est de faire apparaître chez ces animaux des parasites résistants au principal traitement de la maladie, et leur mise à mort permet de prélever le foie et la rate qui en sont la source.

Objectifs

Le développement de parasites résistants à la molécule testée devient un problème de santé publique d’autant qu’il s’agit actuellement du principal traitement contre la leishmaniose viscérale. Les résultats des recherches conduites in vitro sur le développement de parasites résistants à cette drogue anti-parasitaire ne sont malheureusement pas transposables sur des parasites de terrain (isolés de malades ne répondant pas au traitement) suggérant qu’in vivo les mécanismes et les cibles conduisant à l’apparition du phénotype de résistance sont différents. Le principal objectif de ce projet est donc de nous donner les moyens de comprendre les mécanismes qui conduisent à l’apparition chez les mammifères de parasites résistants à la molécule testée.

Bénéfices attendus

Les mécanismes d’acquisition de résistance à la molécule testée in situ chez l’homme et l’animal sont encore très mal connus alors que des récidives à l’issu de ce traitement apparaissent. Les recherches réalisées à ce jour par des approches in vitro sont insuffisantes puisqu’elles ne nous permettent pas d’appréhender et de comprendre pourquoi les malades ne répondent pas au traitement. Par ce projet qui consiste à générer in vivo (chez les hamsters) des parasites résistants à la molécule testée et donc à se rapprocher des conditions de terrain, nous espérons être en mesure d’apporter des réponses à cette problématique de santé publique. En effet, les parasites résistants à la molécule testée ainsi générés seront analysés par séquençage de leur génome et de leur transcriptome. Cette approche duelle nous informera sur les signaux génétiques et les signatures transcriptomiques corrélant avec l’adaptation des parasites en réponse à la molécule testée et nous permettra d’identifier les réseaux d’interaction à l’origine de la réponse/résistance à la drogue. Au-delà de l’importance de ces résultats sur notre connaissance générale des mécanismes d’adaptation des Leishmania en réponse à un stress (molécule testée), si ces derniers sont validés avec des prélèvements provenant de patients/chiens en échec de traitement ils représenteront une avancée majeure dans la recherche sur les traitements anti-Leishmania.

Procédures

A compter de l’inoculation des parasites, les animaux seront soumis à 3 types d’interventions : - Imagerie intra-vitale non invasive sous anesthésie générale, impliquant une injection intrapéritonéale préalable (15 minutes). Ce suivi sera réalisé au maximum 36 fois, avec un délai entre chaque mesure de 2 semaines minimum. - Pesée une fois par semaine (20 secondes), pendant toute la durée de la procédure soit entre 20 et 50 fois selon les groupes d’individus. - Gavage (20 secondes),1 à 14 fois selon les groupes sur toute la durée de la procédure.

Impact sur les animaux

L’inoculation des parasites aux hamsters se fera en intrapéritonéale après anesthésie légère des animaux par exposition à l’isoflurane dans une chambre d’induction. En absence de traitement par les drogues anti-parasitaires, les espèces de Leishmania viscérales vont coloniser principalement le foie et la rate des hamsters. Dans ce cas la première phase de la maladie est silencieuse et peut durer jusqu’à 6 mois selon les individus. Au-delà, le premier signe clinique de l’évolution de la pathologie est une stabilisation de la prise de poids suivi d’une perte progressive de poids. Cette perte de poids lorsqu’elle atteint la limite de 20% du poids maximal de l’animal s’accompagne souvent d’une réduction de la mobilité voire de prostration et d’isolement dans la cage. Le traitement est délivré par administration intragastrique (gavage), pendant un maximum de 5 jours ce qui est source de douleur et inconfort de courte durée et de stress. Dans les cas de traitement de l’homme ou du chien pour lesquels l’administration de la drogue anti-parasitaire est répétée sur 28 jours des troubles digestifs ont pu être observés. Compte-tenu de nos connaissances sur le modèle hamster dans un contexte de traitement, la probabilité d’apparition de tels effets chez les hamsters est toutefois minime. Le suivi de la parasitémie par imagerie intra-vitale non invasive est réalisé sur des animaux anesthésiés par exposition continue à l’isoflurane. Toutefois, cette procédure nécessite une injection intrapéritonéale, source de douleur et inconfort légers de courte durée, lorsque les animaux sont endormis. La répétition de la mesure au cours du temps est potentiellement vectrice de stress chronique pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure. Ils ne peuvent en effet être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la fin de la procédure implique la mise à mort des animaux pour réaliser le prélèvement des lésions ou organes internes sources de parasites nécessaire à nos analyses.

Remplacement

Les recherches réalisées à ce jour sur les mécanismes d’acquisition de résistance à la molécule testée par des approches in vitro sont réalisées majoritairement sur des parasites libres. Or les traitements anti-Leishmania administrés aux mammifères ciblent le stade de développement intra-cellulaire du parasite. Les lignées de cellules de type macrophage qu’elles soient d’origine humaine ou murine sont peu permissives au développement intracellulaire des parasites étudiés ce qui limite fortement leur utilisation. De plus, notamment dans le cas de traitement ou de résistance aux drogues anti-parasitaire il est primordial de pouvoir prendre en compte le tissu (organes cibles = rate et foie) et au-delà l’organisme entier. Le recours à des animaux vivants est de fait indispensable.

Réduction

Ce projet repose sur l’utilisation de 22 hamsters. Ce nombre nous permet d’avoir 4 à 6 individus par groupe pour chacune des analyses que nous avons prévues de réaliser. Le but final n’est pas de faire une étude comparative statistique entre les animaux traités et non traités mais d’observer les trajectoires individuelles sélectionnées après un traitement flash ou une augmentation croissante de la dose de molécule testée comparativement à l’inoculum initial. Pour réaliser ce projet et afin de diminuer le nombre d’animaux utilisés nous avons choisi d’utiliser le parasite transgénique qui nous permet de mesurer l’évolution de la charge parasitaire par imagerie intra-vitale non invasive sans avoir à mettre à mort les animaux. Ceci nous permet également d’adapter au mieux la mise en œuvre du traitement sur tous les animaux.

Raffinement

L’infection parasitaire étant silencieuse en terme de signes cliniques pendant les 8 premières semaines, les hamsters sont observés tous les jours par le personnel de l’animalerie au moment du changement des cages ou par l’expérimentateur. Afin d’adapter au mieux la mise en place des traitements par la molécule testée, en plus d’un suivi pondéral les animaux font l’objet d’un suivi de la charge parasitaire par imagerie intra-vitale non invasive. L’imagerie sera réalisée toutes les deux semaines entre la deuxième semaine suivant l’inoculation des parasites et la fin des cycles de traitement. L’augmentation de la charge parasitaire dans les organes cibles est corrélée à l’apparition des signes cliniques de la maladie, notamment la perte de poids. En fin de processus, les animaux sont mis à mort selon la procédure validée avant d’atteindre le point limite. L’injection des parasites est réalisée après anesthésie légère des animaux et l’imagerie intra-vitale non invasive est réalisée sous exposition continue d’isoflurane. Durant l’expérience, en cas de prostration ou difficulté locomotrice un gel d’hydratation pourra être placé dans la cage tout comme les granulés alimentaires. De même, une litière douce à base de cellulose pourra être substituée à la litière traditionnelle. Un triple enrichissement des conditions d’hébergement est mis en place (frisettes carton, coton, boule).

Choix des espèces

Deux raisons majeures quant au choix du hamster pour ce projet : - Le modèle murin est peu adapté pour les espèces de Leishmania viscérales,d’où le choix du hamster qui développe une pathologie proche de celle observée chez l’homme et rend possible la production en nombre des parasites à partir de la rate et du foie des animaux infectés. - Le traitement anti-Leishmania par la molécule testée est efficace avec une même posologie que celle de l’homme. C’est donc l’animal de choix pour toute recherche liée aux traitements anti-parasitaire. Les parasites seront inoculées aux hamsters entre la 5ème et la 6ème semaine soit avant la stabilisation de la prise de poids pour un animal non traité. En effet, l’un des premiers marqueurs révélateurs de l’initiation des dommages systémiques est la stabilisation dans la courbe d’évolution du poids, le second révélateur de la progression des dommages étant une perte pondérale. D’autre part, compte tenu de la durée de l’expérimentation il est important d’utiliser des animaux jeunes.

Isolés en cage individuelle pendant quatorze semaines, soumis à treize prélèvements de sang à la queue étalés sur deux heures, à 72 heures en cage de mesure de la dépense d'énergie puis à 48 heures en cage de recueil des urines et des fèces, 144 rats subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Tous sont tués à la fin pour doser leurs organes. Le projet évalue l'intérêt nutritionnel et les risques toxicologiques de quatre farines d'insectes, présentées comme une alternative durable aux protéines animales. Le porteur annonce vouloir étudier la motricité, la mémoire, le stress et l'anxiété de ces rats, sans nommer un seul des tests comportementaux prévus.

Objectifs

La production alimentaire actuelle est indissociable de son empreinte écologique. En effet, notre façon de nous alimenter devra changer en raison de l'épuisement de certaines ressources, de la dégradation de l'environnement et de la biodiversité liée à certaines pratiques agricoles et habitudes de consommation. Pour nourrir la population mondiale de demain, il y a un enjeu majeur à trouver d'autres sources de protéines riches en composés nutritionnel d'intérêt pour pallier la consommation de viandes et de poissons (dont la disponibilité diminue). Les insectes riches en protéines de haute qualité sont considérés comme une alternative durable aux protéines animales face à la raréfaction des ressources naturelles et à l’augmentation de la population mondiale. Actuellement, 2/3 des terres agricoles dans le monde sont consacrées à l’élevage ou à la production d’aliments pour le bétail. Ce mode de production a des répercussions négatives sur notre environnement, notamment sur l’émission de gaz à effet de serre, sur l’eau potable et sur les surfaces agricoles. L’élevage des insectes, plus vertueux, utilise des déchets agricoles et nécessite en moyenne quatre fois moins de nourriture qu’un élevage conventionnel. Face à cette problématique, la consommation de farine d’insectes se présente comme une solution durable et écologiquement viable pour nourrir l’ensemble de la population. Néanmoins, il est essentiel d’évaluer les impacts sur la santé d’un remplacement des protéines de notre alimentation actuelle par des protéines d’insectes. Ainsi notre objectif est d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de farine d’insectes. De plus, nous nous intéressons aux différentes conditions d’élevage des insectes car l’alimentation donnée aux insectes pour leur croissance peut impacter leur qualité nutritionnelle et leur potentielle contamination. Notre évaluation des impacts sanitaires reposera sur deux objectifs : 1) l’évaluation des bénéfices nutritionnels et 2) l’évaluation des risques toxicologiques, le tout en fonction des conditions d’élevage.

Bénéfices attendus

Nous pensons que le statut nutritionnel de ces farines d’insectes sera comparable, voire supérieure, à celui des produits animaux traditionnellement consommés et représentant l’apport protéinique dans notre alimentation. Notre étude pourra potentiellement mettre en évidence un bénéfice nutritionnel à la consommation de ces farines dont il est envisagé qu'elles puissent être utilisées pour remplacer les protéines d'origine animale dans notre alimentation. De plus, pour promouvoir une alimentation humaine à base de farine d’insectes il est nécessaire d’évaluer les impacts sur la santé d’une consommation de ces farines d’insectes et donc d’étudier leur contamination en résidus de pesticides et contaminants de l’environnement. Une évaluation approfondie du rapport bénéfice/risque est donc indispensable pour déterminer s’il est possible de promouvoir une augmentation de la consommation de farine d’insectes et si ces farines peuvent être consommées en quantités suffisantes pour remplacer les protéines animales. L’étude inclut également l’analyse de différentes méthodes de production d’insectes afin de mieux maîtriser les modes d’élevage dans le but d’optimiser les avantages nutritionnels tout en minimisant les risques pour la santé. En conséquence, cette recherche pourra offrir des recommandations précises aux producteurs en matière d’élevage, ainsi qu’à la population concernant leur consommation. Si la qualité nutritionnelle et la sécurité sanitaire des farines d’insectes sont confirmées, leur utilisation pour remplacer les protéines animales pourrait avoir un impact environnemental positif. En effet, remplacer la consommation de poisson par celle d’insectes présenterait un avantage notable, notamment en réduisant la pression sur la biodiversité marine, menacée par la pêche intensive répondant à la demande croissante en protéines animales.

Procédures

Les animaux seront en isolement physique pendant 14 semaines. Ils pourront cependant se sentir, s’entendre et se voir. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme et sur leur activité locomotrice spontanée. Au cours de cette intervention les rats sont placés dans des cages de dimension similaire à celle utilisée pour l'hébergement standard. Seul le couvercle est différent : dans ce cas, il est équipé des capteurs nécessaires au recueil des données. Les cages sont disposées dans une enceinte dotée de capteurs infrarouge permettant de suivre le déplacement de l'animal. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48h pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible à l'aide de jouets. Treize prélèvements sanguins au niveau de la queue, espacés sur 2 heures, seront réalisés pendant les tests de glucose et d’insuline, à la 12ème et 13ème semaine. Pour le test du glucose, un gavage oral sera réalisé sur quelques secondes. Pour le test de l’insuline, une injection sera réalisée en quelques secondes. De plus, ce protocole nécessite de placer les animaux en cage de mesure de la dépense d’énergie pendant 72 heures afin d’évaluer l’impact de l’alimentation sur le métabolisme. Ce protocole nécessite également de placer les animaux en cage spécifique de recueil d’urines et de fèces pendant 48 heures pour le recueil des urines et fèces en fin de protocole. Pour les mesures de tolérance au glucose, à l’insuline et avant l’euthanasie, la durée de mise à jeun ne dépasse jamais 15 heures consécutives et permet d’obtenir des résultats fiables et en accord avec ce qui est réalisé dans la littérature. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de pouvoir réaliser l’ensemble des prélèvements nécessaires, notamment des dosages au niveau des organes.

Remplacement

Cette étude fait suite à une étude in vitro réalisée au sein de notre projet. Ils démontrent une faible toxicité en test sur cellules pour une exposition à une fraction d’insecte. Dans ce même projet nous avons également analysé la composition nutritionnelle et la contamination de plusieurs farines d’insectes. Ceci a révélé une teneur en métaux lourds à étudier plus en détail. Notre étude vient donc dans la suite de ces résultats, évaluer l’impact sur un organisme entier. De même, aucun modèle de simulation ne pourra reproduire la complexité de l’organisme et il n’existe pas, dans ce cas-là, d’alternative expérimentale. L'étude du métaolisme ainsi que les effets bénéfiques nutritionnels d’une alimentation enrichie en farine d’insectes ne peut pas être évaluée in vitro. Une étude épidémiologique ne peut pas être réalisée dans ce cas car la farine d’insectes est très peu consommée (et de manière irrégulière) en France. Cette consommation par quelques individus est anecdotique et correspond à des quantités très faibles de farine d’insectes. Une étude épidémiologique ne pourrait pas être réalisée avec les données de consommations de pays consommant régulièrement des insectes car la production d’insectes est différente de celle aujourd’hui réalisée en Europe. De plus, cette étude s’intéresse à la métabolisation et l’élimination par un organisme entier de substances toxicologiques tels des contaminants ou résidus. Le modèle de rat correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports et les consommations en nourriture enrichie en farines d’insectes sur la durée totale du projet (95 jours) ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur une étude statistique de l’effectif nécessaire basée sur des données de la littérature qui permet chez un groupe ayant consommé des protéines d’insectes de mesurer des modifications des statuts nutritionnels statistiquement différentes d’un groupe témoin. Selon nos évaluations statistiques et ce qui a été retrouvé dans la littérature scientifique, nous estimons un nombre de sujets nécessaires de douze rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. De plus, nous souhaitons tester quatre farines insectes différentes qui présentent des propriétés nutritionnelles et des contaminations en polluants différentes afin d’identifier celle qui sera la plus pertinente à commercialiser. Le nombre de rats dans chacun des groupes expérimentaux a été décidé afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Notre protocole utilisera des rats femelles et des rats mâles. Ce choix est fait en regard de différences connues entre le métabolisme chez la femelle et chez le mâle.

Raffinement

Les rats seront nourris avec un régime standard auquel sera incorporé de la farine d’insectes qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ce protocole nécessite l’isolement des animaux en cage individuelle tout au long du protocole afin de contrôler la consommation quotidienne d’eau et d’aliment de chaque animal et maîtriser ses refus. Le milieu sera enrichi le plus possible. De même, les cages des animaux seront placées dans une même salle de stabulation et les animaux pourront se voir et se sentir tout du long du protocole. Des méthodes d’enrichissement social seront mises en place pour tous les animaux : une remise en groupe sociaux une fois par semaine pendant 15 minutes et deux séances de tickling par semaine de 5 minutes. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi en tenant compte de la littérature récente et des études de biodisponibilité et de toxicologie. En effet, les études sur le sujet ont pour la plupart été réalisées sur des modèles de rat. Nous comptons nous appuyer sur les données décrites dans ces études pour l’analyse de nos résultats. Le choix du rat se justifie également par les connaissances déjà accumulées dans le laboratoire sur ce modèle. Le rat est un modèle qui a la capacité de prendre des décisions et de s'adapter à son environnement avec des zones cérébrales fonctionnelles analogues à celles de l'homme notamment pour la motricité, la mémoire et le stress ou l’anxiété. Nous souhaitons étudier ces comportements dans notre étude pour évaluer l'impact des apports nutritionnels. C'est également une espèce plus susceptible de fournir des résultats satisfaisants et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de subir des dommages durables dans les conditions de la procédure expérimentale. Les rats seront âgés de 10 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 24 semaines à la fin de l'étude. Notre étude cible une population de jeunes adultes plus disposée à consommer des protéines issues d’insectes. Nous souhaitons donc avoir des rats « équivalents » à cette tranche d’âge. De plus, plusieurs études de biodisponibilité de protéines ou d’impact toxicologique via une exposition alimentaire ont été menées sur des rats de cet âge. Réaliser l’expérimentation dans des conditions similaires à ces études nous permettrait de comparer nos résultats avec ceux de la littérature.

Une sonde rectale introduite dix à quinze fois en trois à cinq heures, une hypothermie poussée jusqu'à 32 °C et jusqu'à quatre prélèvements de sang à la queue attendent chaque souris de ce projet. 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées en fin de protocole pour prélèvements de tissus et de sang. Le porteur décrit une technologie qu'il compare à un cheval de Troie, des molécules-médicaments détournant les mécanismes naturels de passage des barrières de l'organisme pour atteindre le cerveau. Il qualifie ces manipulations de précises et rapides et écrit que la procédure ne comporte "pas d'anesthésie, pas d'analgésie", tout en retenant comme point limite l'apparition d'une hypothermie irréversible.

Objectifs

Les maladies et troubles neurologiques sont la première cause mondiale de handicap. À l'heure actuelle, les besoins médicaux restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, nous avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

La transposition de nos recherches sur un modèle murin humanisé pour notre cible permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos vecteurs-médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une, avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention avant toutes administrations intraveineuses (1 à maximum 4) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administrations des conjugués : 1 à maximum 4. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations lors de l’euthanasie : 1 seul/individu. Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements n’excédant pas ≤10% de la volémie sur 14 jours). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations intraveineuses, sous-cutanées (deux à quatre maximum par individu) ou intrapéritonéale (dose unique), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individu, n’excédant pas 10% de la volémie sur 14 jours). Un stress thermique peut quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mis à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos vecteurs médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 6 groupes par étude et 2 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 96 animaux par an (4 *6*2*2), soit un total de 384 souris sur 4 ans (96*4). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

Les animaux sont répartis à raison de 4 individus maximum par cage (de même sexe) et maintenus dans un environnement familier (même cage pour les odeurs, taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Toutes les administrations sont réalisées par un personnel formé, expérimenté et pratiquant en routine les études de biodistribution chez la souris, tout en respectant les recommandations de volume injecté en fonction des voies d’administration. Les prélèvements intermédiaires de sang sont réalisés après asepsie de l’extrémité de la queue. Une compresse de gaz imbibée d’eau oxygénée est appliquée immédiatement après le prélèvement. Les prélèvements terminaux sont réalisés sur des souris sous anesthésie générale profonde et ayant préalablement étaient analgésiées. Les points limite impliquant l’euthanasie immédiate des animaux sont les suivants : Apparition d’une hypothermie irréversible (température

Choix des espèces

Nous réalisons en amont de nos procédures des tests in vitro. Ces tests permettent de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques qui conditionnent le succès de nos vecteurs. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons de réaliser nos expériences sur la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique. La souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques et homéostasiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux et permettra une extrapolation plus pertinente au modèle humain. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Sept jours d'antibiotiques dans l'eau de boisson, une injection intraveineuse de cellules tumorales pulmonaires, cinq gavages de microbiote fécal ou cinq administrations intranasales sous anesthésie, puis jusqu'à vingt séances d'imagerie chacune précédée d'une injection dans l'abdomen : 300 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur mentionne des diarrhées, une déshydratation, des microlésions du tube digestif, de rares fausses routes lors des gavages et une gêne respiratoire transitoire. L'objectif est de voir si un transfert de microbiote fait apparaître des amas de lymphocytes dans la tumeur et améliore la réponse à une immunothérapie à laquelle 60 % des patients ne répondent pas. Toutes sont tuées pour que les tumeurs soient récupérées et l'organisation du système immunitaire autour des cellules tumorales examinée.

Objectifs

Les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires (ICI) ont révolutionné le traitement de nombreux cancers. Cependant, environ 60 pourcents des patients ne répondent pas aux ICI nécessitant de trouver d’autres thérapies pour soigner cette majorité de patients non répondeurs aux ICI. La présence de cellules immunitaires dans la tumeur est primordiale pour répondre aux ICI. En particulier, les lymphocytes organisés en agrégats (communément appelés structures lymphoïdes tertiaires, TLS) sont associés à une meilleure survie des patients et une meilleure réponse aux ICI. Très récemment, il a été montré que des bactéries peuvent stimuler l’activité des TLS. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer la capacité des bactéries d’un microbiote intestinal à induire la formation de TLS pour améliorer l’efficacité des ICI dans un modèle pré-clinique.

Bénéfices attendus

Le cancer du poumon est le 3ème cancer le plus fréquent et la 1ère cause de décès par cancer en France (source : site de l’INCa). Seulement 40 pourcents des patients répondent aux immunothérapies. Le présent projet portera sur un modèle murin de cancer du poumon. L’étude du transfert du microbiote fécal chez la souris déterminera : 1) si ce traitement induit la formation des structures lymphoïdes tertiaires (TLS) et 2) si la réponse à l'inhibiteur de point de contrôle et la survie des animaux sont améliorées. Les résultats de ce projet pourraient permettre d'améliorer les traitements en médecine humaine pour le cancer du poumon.

Procédures

Les animaux seront soumis à : un traitement antibiotiques dans l'eau de boisson (animal vigil, traitement en continu pendant 7 jours); des injections intraveineuses pour inoculation de tumeurs (animal vigil, 1 fois, 1 minute); des gavage pour implanter le microbiote sur certains groupes (animal vigil, 5 fois, 1 minute); des administrations intranasales sur d'autres groupes (animal anesthésié, 5 fois, 5 minutes); puis un suivi par imagerie (animal anesthésié, 20 fois maximum, 15 minutes) avec injection intrapéritonéale au préalable (animal vigil, 20 fois maximum, 1 minute) pour les animaux avec tumeurs ainsi qu'un suivi du microbiote intestinal (animal vigil, 3 fois, 2 minutes).

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables possibles sont : L’antiobiothérapie via l'eau de boisson pourra engendrer des diarrhées et une déshydratation. Les injections pourront induire une douleur de courte durée aux animaux. Les gavages peuvent induire des microlésions ou des irritations et dans de rares cas une fausse route. Les administrations intranasales et l'imagerie seront effectuées sous anesthésie qui pourra engendrer une baisse de la thermorégulation. Ces administrations pourront également engendrer une gêne respiratoire transitoire. L'induction de tumeur pourra induire une douleur modérée ainsi qu'une réduction de la mobilité. Le recueil des fèces se fera par contention manuelle douce qui pourra toutefois engendrer un léger stress.

Devenir

Toutes les souris seront euthanasiées pour qu'on puisse récupérer les tumeurs et étudier la façon dont le système immunitaire s'organise autour des cellules tumorales.

Remplacement

Les structures lymphoïdes tertiaires (TLS) sont des organisations en 3 dimensions de cellules immunitaires se développant à proximité des vaisseaux sanguins. L’étude des TLS ne peut se faire à ce jour que chez l’animal. Ainsi, les modèles souris sont considérées comme un modèle nécessaire et indispensable pour étudier la fonction des TLS dans le développement d’une réponse immunitaire contre la tumorale.

Réduction

300 animaux seront utilisés pour ce projet. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. En effet, les groupes sont constitués de 5 ou 10 animaux, groupes établis grâce à un calcul de puissance mathématique et les résultats seront analysés à l'aide de tests statistiques pour permettre une interprétation fiable des résultats. L'utilisation de l'imagerie dans ce projet, permet un suivi longitudinal (plusieurs mesures sur le même animal) et donc de réduire le nombre d'animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans des portoirs ventilés (5 animaux maximum par cage) et ne seront expérimentés qu'après une semaine minimum de stabulation. Les conditions d'hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique. Les animaux sont hébergés avec leurs congénères (isolement limité à la fin d’une seule expérience) en portoirs ventilés avec un système d'abreuvement automatique (ou biberon d’eau lors de l’antibiothérapie) et un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après : carré de lanière Kraft, carré de coton, bâtonnet en bois, rouleau en carton ou maisonnette. Les conditions de températures et d'hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Dans la réalisation de ce projet, l'ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie). Tout sera mis en oeuvre pour limiter au maximum les nuisances. Les animaux sont manipulés par du personnel formé et compétent dans des pièces dédiées à chaque type d'intervention. Pour les injections, les volumes injectés seront réduits au minimum. L'évolution tumorale sera suivie et mesurée. Quand l'acte technique le nécessite, les animaux seront sous anesthésie. Les animaux seront vérifiés quotidiennement. Ils seront également pesés deux fois par semaine et leur état de santé sera reporté sur une grille de suivi individuel. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de la procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie).

Choix des espèces

En accord avec la littérature scientifique sur le microbiote, les structures lymphoïdes tertiaires et les réponses anti-tumorales et la disponibilité de l'ensemble des réactifs nécessaires à la procédure, ce projet sera entièrement réalisé chez la souris. De plus, différents protocoles développés chez la souris sont décrits de façon détaillée dans la littérature. Ils sont donc applicables sans avoir besoin d’utiliser des animaux supplémentaires pour réaliser la mise au point des protocoles expérimentaux. Le projet utilisera des souris non génétiquement modifiées car particulièrement adaptées à l'étude des réponses anti-tumorales. Les animaux seront reçus à l'âge de 11 semaines puis mis en acclimatation pendant une semaine minimum avant de débuter l'expérimentation. Cet âge a été choisi car à ce stade de développement, les souris sont sevrées, ont atteint une taille adulte et disposent d'un système immunitaire mature. Les expériences dureront de 13 jours à 2 mois maximum.