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Programme d’immunisation génique de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux
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- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
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Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.
Objectifs
L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.
Procédures
4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Production d’anticorps polyclonaux anti LasB et anti CBPD chez le lapin
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Immunisés à l'adjuvant de Freund par quatre à sept injections transdermiques, quatre lapins subissent aussi quatre à six prises de sang sur animal vigile, puis une anesthésie de quinze minutes suivie d'une ponction fémorale. Tous sont tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce que le projet produit est un réactif de laboratoire, des anticorps polyclonaux dirigés contre deux protéines de Pseudomonas aeruginosa, qui serviront à purifier ces protéines dans des extraits bactériens. L'adjuvant peut provoquer des douleurs articulaires et une forte inflammation aux points d'injection, et le lapin est retenu parce que sa taille moyenne donne beaucoup de sérum en consommant peu de protéine.
Objectifs
La résistance aux antibiotiques est devenue l'une des plus grandes menaces pour la santé mondiale. De plus en plus de bactéries sont résistantes, rendant ainsi ces molécules moins efficaces voire totalement inefficaces pour traiter les infections bactériennes. Pseudomonas aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste responsable d'infections nosocomiales touchant principalement les patients immunodéprimés, les brûlés, ou encore les patients sous ventilation mécanique. Aujourd’hui, la lutte contre les souches de P. aeruginosa multi-résistantes aux antibiotiques, représente un enjeu sanitaire et médical important, enjeu souligné par l’Organisation Mondiale de la Santé. Les modifications post-traductionnelles (PTM) constituent une piste de recherche innovante. Ce sont des ajouts de groupements chimiques qui s’effectuent notamment sur les protéines. Elles impactent alors les interactions, les structures et donc la fonction de ces protéines. Leur importance est clairement établie chez les eucaryotes puisqu’elles sont la cible de traitements contre certains cancers ou maladies neurodégénératives. En revanche chez les bactéries, leur mise en évidence est relativement récente et leur rôle reste encore à être déterminé. Si de nombreuses études ont été menées pour identifier les résidus modifiés, très peu d’entre elles, malheureusement, se focalisent sur leur rôle. Pourtant leur rôle, lors de la formation de biofilm, la résistance, la virulence ou la persistance bactérienne, semble important. Notre hypothèse est que cibler les PTMs bactériennes impliquées dans la pathogénèse, pourrait être utilisée comme une stratégie de lutte contre les infections causées par les pathogènes. Nous avons d’ores et déjà identifié de nombreux facteurs de virulence sécrétés par P. aeruginosa qui sont modifiés, parmi eux deux proteine B et D sont deux facteurs majeurs. Notre étude consiste donc à évaluer l’implication des différentes modifications dans l’acquisition de résistances aux antibiotiques, dans l’augmentation de la virulence et dans la formation de biofilms chez P. aeruginosa. La production d’anticorps polyclonaux chez le lapin pour chacune de ces protéines nous permettra d’isoler et de purifier B et D sous toutes leurs formes dans chacune de nos différentes souches cliniques de P. aeruginosa et ainsi de trouver le relationnel entre les modifications post-traductionnelles et l’augmentation de la pathogénicité chez cette bactérie.
Bénéfices attendus
L’obtention de ces anticorps polyclonaux ciblant B et D permettra de capturer et purifier ces deux protéines dans des lysas bactériens issus de différentes souches cliniques. Chaque souche ayant des particularités différentes de virulence de résistance aux antibiotiques ou de « culture » (planctonique ou en biofilm) nous effectuerons une cartographie des modifications post-traductionnelles de chaque protéine en corrélation avec son activité clinique. Le but final étant de cibler la ou les modifications pour développer un anticorps thérapeutique ou une stratégie antibactérienne sans utilisation d’antibiotique.
Procédures
4 à 6 prélèvements sanguins sur animaux vigiles (5 minutes chacun)et 4 à 7 injections transdermiques (5minutes chacune). Une anesthésie générale de 15 minutes puis une ponction fémorale de 5 minutes.
Impact sur les animaux
L’utilisation de l’adjuvent de Freund peut induire des douleurs articulaires et provoque une forte inflammation au niveau des points d’injection. La réaction immunitaire peut aussi induire une hausse de la température.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort.
Remplacement
Des méthode de production d'anticorps recombinant existent mais ils ne permettent en aucun cas d'obtenir une polyclonalité aussi élevé que chez l'animal. Un système immunitaire mature et actif est indispensable pour la production de cet outil biologique fondamental dans nos travaux de recherche
Réduction
Nous avons utilisé les données de la littérature pour calculer de façon théorique les capacités moyennes de production d'anticorps pour chaque lapin. Nous avons donc pu déterminer que 2 lapins par protéine seraient nécessaires pour obtenir la quantité d'anticorps indispensable à nos études. Pour chaque protéine cible, deux lapins seront immunisés avec 15 jours de décalage ceci permettra d’évaluer la toxicité intrinsèque de la protéine recombinante et de ne pas immuniser le second lapin si la protéine était mal supportée par le premier lapin.
Raffinement
Afin de diminuer au maximum toute douleur articulaire et toute douleur due à l’inflammation des sites d’injection, les animaux recevront un patch transcutané de d'analgésique. Ce patch sera changé toutes les 72 heures. Le suivi sérologique de l’immunisation nous permettra de limiter au strict minimum les rappels d’immunisation et de mettre fin à la procédure au plus vite. L’observation des animaux au quotidien basée sur le score grimace scale permet d’établir un point limite précoce qui mettrait fin immédiatement à la procédure. Afin de limiter au maximum le stress des animaux pendant les manipulations, ils seront légèrement anesthésiés au masque.
Choix des espèces
Le lapin est l’espèce de choix pour la production d’anticorps polyclonaux. Sa taille moyenne permet d’obtenir une bonne quantité de sérum riche en anticorps tout en utilisant peu de protéine pour l’immunisation. La longueur des CDRs des IgG de lapin leur confère une excellente affinité, de plus ces IgG sont facilement purifiable. Les animaux seront des jeunes adultes de 1,5 à 2 kg (30 à 45 jours) car ils possèdent un taux maximum d’anticorps circulant et un système immunitaire mature.
Infection expérimentale de rongeurs par Plasmodium : production de parasites génétiquement modifiés et test de nouvelles molécules
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Certaines souris de ce projet sont désignées comme donneuses de globules rouges parasités, d'autres comme receveuses, les premières étant infectées puis tuées pour transmettre le parasite aux secondes. 4 545 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées. Elles sont infectées par Plasmodium berghei, agent du paludisme du rongeur, par groupes de 8 ou de 12, et leur parasitémie est suivie par frottis à partir d'une micro-goutte de sang. Le porteur indique que l'infection non contrôlée tue les souris par hyperparasitémie et anémie, et qu'elles sont mises à mort lorsque la parasitémie atteint environ 5 %, pour prélever leur sang et constituer des stocks de globules rouges parasités.
Objectifs
Le paludisme reste encore à l’heure actuelle un problème de santé publique majeur. L’apparition de résistances aux traitements thérapeutiques et l’absence de vaccin efficace motivent l’intérêt que nous portons à la biologie du parasite responsable : le Plasmodium. Nous nous intéressons à des phénomènes cruciaux pour la survie du parasite dans le but de confirmer l'essentialité de certaines protéines pour le parasite et de tester de potentiels nouveaux médicaments antipaludiques ciblant ces protéines. Si la plus grande partie de nos expériences fait appel à des techniques de biologie moléculaire et biochimie, il est indispensable de valider nos résultats sur le parasite directement. Pour cela nous cultivons le parasite Plasmodium falciparum in vitro. Nous pouvons ainsi non seulement suivre la localisation des différentes protéines d’intérêt chez le parasite, mais également tenter de générer des parasites génétiquement atténués afin de tester l’essentialité des gènes correspondants. Ces différentes étapes in vitro permettent de réduire le nombre d’animaux utilisés pour la suite de nos projets. De fait, le modèle in vitro présente des limites. L’utilisation de P. berghei (parasite spécifique du rongeur) est donc une approche de choix en cas d’échec de l’approche in vitro. Dans ce contexte, nous réalisons des infections expérimentales de souris par P. berghei. Les animaux sont utilisés dans le but soit de générer des parasites génétiquement modifiés, soit de tester des composés à potentiel thérapeutique dans le cadre d’études pré-cliniques (composés préalablement sélectionnés in vitro).
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet doit permettre une meilleure compréhension du rôle de certaines protéines chez le parasite Plasmodium. La génération de parasites génétiquement modifiés n’exprimant pas ces protéines permet en effet d’en étudier l’essentialité pour le parasite et ce à différents stades de son cycle. Outre l’avancée en termes de connaissances scientifiques, cette étude ouvre la possibilité de développement de nouveaux composés anti-malariques. En effet, une protéine essentielle représente une cible potentielle dans le cadre d’une stratégie chimio-thérapeutique. Notre deuxième objectif vise donc au développement de nouveaux composés anti-malariques. Ainsi, notre projet permettra de tester in vivo des composés conçus avec l’aide de collaborateurs chimistes. Ces composés auront été préalablement sélectionnés in vitro pour leur potentiel anti-malarique d’une part, et leur non-toxicité sur cellules de mammifères d’autre part.
Procédures
La procédure 1 a pour objectif la préservation des différentes souches de parasites utilisées dans les procédures 2 et 3. Cela consiste à infecter de groupes de 12 souris (injection de globules rouges parasités) et suivre la parasitémie par frottis sanguin à l’aide d’une micro-goutte de sang. Lorsque la parasitémie atteint environ 5%, les souris sont euthanasiées et leur sang est prélevé afin de constituer des stocks de globules rouges parasités qui seront conservés à très basse température. La procédure 2 vise à générer des parasites génétiquement modifiés afin d’analyser le rôle d’un gène d’intérêt pour le parasite. Pour cela, des groupes de souris sont infectées avec des parasites modifiés. Si les parasites sont viables (suivi sur frottis sanguin), les souris sont euthanasiées et leur sang est prélevé afin de conserver/propager les parasites et vérifier les modifications génétiques introduites. L’effet de l’extinction du gène d’intérêt sera alors étudié à différents stades de développement du parasite chez des souris infectées avec ces parasites génétiquement modifiés, en comparaison avec des souris infectées avec les parasites non modifiés. La procédure 3 consiste en l’étude préclinique de nouveaux composés anti-malariques. Des composés développés en collaboration avec des collègues chimistes et conçus pour cibler des protéines essentielles pour le parasite sont testés pour leur capaciter à protéger des souris d’une infection. Des groupes de 8 souris sont infectées par le parasite et traitées avec les composés. Leur parasitémie est observée 4 jours après l’infection sur frottis sanguin et la protection est évaluée par rapport aux souris contrôles infectées et non-traitées. Si une protection est observée, la parasitémie est suivie pendant 1 à 2 semaines puis les souris sont euthanasiées.
Impact sur les animaux
L’infection expérimentale par Plasmodium berghei, si elle n’est pas contrôlée, conduit à la mort des souris par hyperparasitémie et anémie. Cependant, dans le cadre du suivi de l’infection par des parasites génétiquement atténués ou dans celui des tests de composés à potentiel thérapeutique, l’objectif de notre projet est de diminuer la gravité de l’infection, soit par l’utilisation de parasites moins viables soit par l’utilisation de composés thérapeutiques. La souffrance potentiellement engendrée par l’infection palustre doit donc être diminuée. Un suivi quotidien des animaux (signes cliniques, parasitémie sanguine) permet de contrôler l’évolution de l’infection et d’euthanasier par anticipation les animaux présentant des risques de souffrance.
Devenir
Tous les animaux sont mis à mort au cours ou à la fin des procédures, soit pour prélever le sang et préserver/propager les parasites, soit pour éviter la douleur engendrée par l'infection palustre, soit pour mettre fin à un suivi de parasitémie qui serait négatif. En effet, il a été démontré qu'une souris infectée mais ne prenant pas l'infection (absence de parasites sanguins sur frottis) ne peut être ré-infectée.
Remplacement
L’utilisation des animaux est remplacée par des tests in vitro chaque fois que possible : les parasites génétiquement modifiés sont générés chez Plasmodium falciparum (espèce que l’on peut cultiver in vitro), et l’efficacité anti-malarique des composés est toujours testée en première intention in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est déterminé en fonction de la question posée et grâce à notre connaissance de longue date du modèle expérimental, dans le but de permettre une analyse statistique des résultats. Le suivi cinétique de la parasitémie d’un même animal permet de diminuer le nombre d’animaux utilisés. Les expérimentations sur animaux ne sont répétées que lorsque les effets observés sont au minimum intermédiaires.
Raffinement
Les conditions de détention des animaux sont améliorées grâce à des enrichissements (coton, batônnets de bois, maisons), le nombre d’animaux par cage permet de leur garantir à la fois un espace suffisant et une sociabilité. Dans le cadre du suivi de l’infection par le parasite Plasmodium, les animaux sont observés une à deux fois par jour afin d’évaluer l’apparition de douleur (grille de suivi) et sont euthanasiés si nécessaire (score de douleur atteignant le point limite).
Choix des espèces
Le protocole de production de parasites génétiquement modifiés que nous utilisons est un protocole validé au niveau international et implique l’utilisation de souris ‘donneuses’ de globules rouges parasités (souris non consanguines ; faible parasitémie donc pathologie modérée) et de souris receveuses qui seront infectées avec les parasites transfectés. D’autres souris seront ensuite nécessaires pour propager les parasites transfectés, et analyser les parasites mutants et l'effet de la non-fonctionnalité d'un gène, ou encore étudier la localisation de la protéine d’intérêt, voire caractériser l'ensemble des protéines interagissant avec elle. Les tests antipaludiques sont faits sur souris non-consanguines ou consanguines. Différents couples souche de souris – souche de Plasmodium sont utilisés car la réponse et la sensibilité du rongeur au Plasmodium dépend du fond génétique de l’animal (différents modèles expérimentaux de paludisme). Toutes les souris sont utilisées à l’âge adulte (entre 6 et 12 semaines)
Evaluation d’un médicament biologique innovant chez la souris pour favoriser la cicatrisation des brûlures sévères
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
L'ablation d'un morceau de peau sur le dos, sous anesthésie, en quinze minutes de chirurgie, puis la pose d'un dispositif de protection et des injections du produit testé tous les trois ou sept jours pendant sept, quatorze ou vingt-huit jours. 231 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour prélever du sang et la peau en cours de cicatrisation. Le porteur décrit pourtant les nuisances attendues comme une douleur et une légère perte de poids pendant trois à quatre jours, plus le stress de l'isolement et du pansement. Le titre annonce des brûlures sévères et le texte parle d'un contexte d'inflammation élevée, sans dire comment cette inflammation est provoquée ni en quoi une excision cutanée reproduit une brûlure du troisième degré.
Objectifs
En raison de sa fonction protectrice, la peau est un organe indispensable à la survie de l’organisme. Lors d’agressions importantes, telles qu’une brûlure du troisième degré, la peau n’est plus capable de cicatriser spontanément et induit un déséquilibre parfois mortel. La prise en charge des victimes de brûlures sévères se base sur l’utilisation de greffe de peau ou dans les cas les plus graves de substituts cutanés artificiels. Pourtant, malgré leur utilisation courante, la prise de greffe reste assez aléatoire avec une cicatrisation longue et incomplète, qui aboutit souvent à une cicatrice douloureuse et invalidante. Un traitement capable de favoriser significativement la prise de greffe est donc souhaitable pour augmenter les chances de survie et la récupération des patients. L’objectif de ce projet est d’évaluer l’efficacité d’un médicament innovant basé sur les produits sécrétés par des cellules, appelés vésicules extracellulaires, pour favoriser la cicatrisation. Le but est d’améliorer la qualité de la cicatrisation des grands brûlés. Nous souhaitons ainsi évaluer l’efficacité de notre médicament dans un modèle de cicatrisation dans un contexte d’inflammation élevée que l’on retrouve dans les cas de brûlures graves.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre d’apporter les preuves d’efficacité et de sécurité d’utilisation d’un nouveau médicament biologique pour la mise au point d’un protocole de prise en charge de patients atteints de brûlure sévères.
Procédures
Les animaux, sous anesthésie générale, seront soumis à l’enlèvement d’un morceau de peau avec pose d’un dispositif de protection sur le dos pour une durée moyenne de chirurgie de 15 minutes par souris pour éviter qu’elle ne se blesse en se grattant et/ou abîme la zone de cicatrisation. Selon les étapes du projet, des injections du produit à tester d’environ 30 secondes seront réalisées sur animaux anesthésiés tous les 3 jours ou 7 jours pendant 7, 14 ou 28 jours. Des prélèvements sanguins et tissulaires sont réalisés lors de la mise à mort des animaux pour procéder à des analyses.
Impact sur les animaux
La nécessité d’isoler les animaux le temps de la procédure et le port du dispositif de protection de plaie sur le dos des animaux peut induire un stress. L’anesthésie peut provoquer chez les animaux une légère baisse d’activité au réveil pendant une ½ journée. La chirurgie peut provoquer une douleur et une légère perte de poids pendant 3 à 4 jours.
Devenir
L'euthanasie de tous les animaux inclus dans l’étude est nécessaire pour prélever du sang et la peau en cours de cicatrisation pour réaliser les analyses qui viendront compléter les observations visuelles de la plaie et permettre de conclure à l’efficacité du médicament.
Remplacement
Malgré l’existence de modèles d’études de réparation cutanée impliquant des cultures de cellules, les mécanismes mis en jeu dans la cicatrisation et après une brûlure diffèrent de ceux induits en laboratoire. Par exemple, le test de blessure en laboratoire est biaisé car il se fait sur une surface plane avec du plastique, alors que dans le corps humain la peau est un système en 3 dimensions et l’environnement est plus hostile, impliquant de nombreux acteurs et mécanismes interdépendants. Les modèles de cicatrisation et/ou de brûlure à partir d’échantillons de peau ou de peau artificielle par exemple reproduisent plus fidèlement l’environnement de la peau mais sont limités par l’absence de nombreux mécanismes retrouvés dans l’organisme, à l’échelle du corps humain comme l’inflammation. Le remplacement par ces modèles n’est ainsi pas possible ici car seul un modèle animal permet de rendre compte de la complexité de la réparation tissulaire, notamment des effets induits par l’inflammation suite à une brûlure, et d’atteindre les objectifs du projet.
Réduction
Pour limiter le nombre d’animaux utilisés, des premières études en laboratoire sur différents types de cellules de la peau ont été effectuées afin de restreindre la fenêtre de doses de médicament utiles à tester sur les animaux et ainsi déterminer 3 doses potentielles de médicament. Pour réduire le nombre d’animaux utilisés dans ce projet, différentes étapes de mise au point successives seront effectuées avec des étapes conditionnelles aux résultats précédemment obtenus. Des tests statistiques ont été réalisés pour prédire le nombre nécessaire d’animaux pour qu’une procédure soit valide mathématiquement et soit représentative.
Raffinement
Tout le long du projet, les animaux auront un accès sans restriction à la nourriture et à la boisson. Le bien-être des animaux sera assuré par l’utilisation de moyens d’enrichissement du milieu de vie des animaux (abris, jeux à ronger, cages en plastique transparent permettant un échange visuel avec les congénères), par une visite quotidienne et un suivi analgésique avant, pendant et après les chirurgies. Pour pallier l’éventuelle perte de poids, des gelées enrichies sont données aux animaux quotidiennement. Une grille de suivi des animaux est mise en place et des points limites ont été définis afin de réduire la souffrance animale.
Choix des espèces
Nous avons choisi l’espèce de souris car c’est une des espèces les plus utilisées dans la littérature scientifique pour les gestes que nous souhaitons réaliser et l’évaluation de la cicatrisation. De plus, la manipulation de cette espèce et de cette technique de chirurgie sont bien maîtrisées au sein du laboratoire. Nous avons choisi une lignée stable permettant l’obtention d’une meilleure reproductibilité des résultats obtenus (et donc en faveur d’une réduction du nombre d’animaux). Les souris seront utilisées au stade du jeune adulte (8 semaines). Un compromis a été effectué pour utiliser des souris à un stade du développement suffisamment avancé pour s’affranchir du cycle de croissance des souris (pouvant entrer en jeu dans les processus de cicatrisation) mais suffisamment jeunes pour s’affranchir des processus de vieillissement de la souris.
Conservation d’espèces de cervidés par procréation médicalement assistée
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système urogénital
Mettre au point la production d'embryons in vitro et le transfert entre espèces, sous couvert d'un programme de conservation de la biodiversité : 57 cervidés vont être utilisés, 52 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 5 un niveau léger. Les femelles donneuses sont soumises à des cycles de synchronisation puis à des prélèvements d'ovocytes par cœlioscopie sous anesthésie générale, jusqu'à quatre fois par an et huit fois sur quatre ans, chaque intervention pouvant durer deux heures de l'anesthésie au réveil. Les receveuses reçoivent un embryon par endoscopie une fois par an. Aucun animal n'est tué à l'issue, tous étant réutilisés puis susceptibles de rejoindre le groupe de reproduction, et les deux espèces employées, le cerf élaphe et le cerf sika du Japon, sont l'une comme l'autre communes, le porteur précisant que le sika "ne correspond pas à une espèce en voie de disparition".
Objectifs
Dans le cadre de ses missions de conservation de la biodiversité, notre laboratoire de recherche mène différents programmes de conservation ou d'amplification de la génétique d'espèces rares, basés sur l’utilisation de biotechnologies de la reproduction. Une stratégie pour augmenter le nombre de descendants à partir d'effectifs très limités de géniteurs, consiste à utiliser la production in vitro d'embryons pour l'espèce menacée couplée au transfert embryonnaire sur des femelles porteuses proches génétiquement (espèce ou sous espèce). Cette stratégie s'est déjà avérée concluante sur le plan conceptuel avec un premier succès mondial en 2006 (naissance d'un jeune cerf sika du Japon ou Cervus nippon nippon porté par une mère élaphe Cervus elaphus).
Bénéfices attendus
Les techniques modernes de procréation assistée telles que l’insémination artificielle, la fécondation in vitro, la gamétogenèse in vitro ou le transfert embryonnaire, sont autant d’outils qui permettront à l’avenir d'améliorer l'efficacité des programmes conservatoires ex situ. Le stockage patrimonial à long terme de la génétique des espèces les plus rares grâce à la cryo-conservation de semences, d’ovules, de tissus gonadiques et embryons dans l’azote liquide représente une stratégie complémentaire de conservation désormais applicable à la faune sauvage. Ces approches permettront, au-delà du stockage sur le long terme, un meilleur brassage génétique entre sites de conservation et une facilitation pour la réintroduction de cette génétique vers les sites in natura. En théorie, ces échantillons sont susceptibles d’être conservés plusieurs centaines d’années (le recul actuel montre que nous pouvons conserver ces échantillons à minimum à moyen terme 50 ans).
Procédures
Les animaux de lots distincts seront soumis à des procédures chirurgicales (chirurgie mini invasive) pour permettre soit la collecte d'ovocytes dans le but de produire des embryons soit pour permettre le transfert d'embryons produits in vitro. Les femelles donneuses d'ovocytes seront soumises à des cycles de synchronisation/prélèvements de gamètes après anesthésie un maximum de 4 fois par an et au total 8 fois sur 4 ans. Les femelles receveuses d'embryons (transfert embryonnaire par endoscopie sur animaux anesthésiés) pourront être transférées sous anesthésie générale une fois par an. Les procédures chirurgicales n'excèdent pas deux heures du moment de l'anesthésie au réveil de l'animal.
Impact sur les animaux
La conduite des protocoles de procréation médicalement assistée chez les cervidés repose généralement sur des protocoles conduits sous anesthésie générale après manipulation des animaux. Les nuisances ou effets indésirables attendus sont celles et ceux associés à cette pratique (le risque anesthésique et notamment le risque de détresse respiratoire est considéré comme étant le plus probable dans nos procédures).
Devenir
Les animaux utilisés proviennent de l'élevage réalisé sur le site. Après utilisation dans le cadre des procédures expérimentales de ce projet, ces animaux pourront tout à fait rejoindre le groupe de reproduction naturelle. Par ailleurs, ces animaux feront l'objet d'études non invasives. Différentes études du comportement (reproduction, interactions sociales, expériences sur la communication acoustique ou comportement alimentaire) sont réalisées sur notre structure dans le cadre de protocoles hors-champ de l'expérimentation animale.
Remplacement
La mise au point des techniques de procréation assistée chez les mammifères nécessite l’utilisation d'animaux (cette étude ne peut être remplacée par des modélisations in silico). Le recours aux modèles in vitro sont déjà proposés dans l'étude permettant de minimiser le nombre d'interventions sur les animaux.
Réduction
Nos approches doivent permettre la collecte de gamètes en nombre suffisant (2 lots de 15 ovocytes) pour constituer des lots expérimentaux et comparer l'efficacité de 2 méthodologies de production in vitro (ovocytes fécondés par injection de spermatozoïdes vs. ovocytes fécondés par fécondation in vitro classique; ovocytes cryoconservés vs. ovocytes frais) sur la base de tests statistiques. La répétition de la procédure sur l'animal (5 à 6 ovocytes par femelle et par collecte) permet de réduire le nombre total d'animaux utilisés. La cryoconservation de semence permet de limiter les interventions sur le mâle. En effet, un même échantillon de semence cryoconservée peut être utilisé pour plusieurs inséminations ou fécondations in vitro (fractionnement de l’éjaculat avant cryoconservation) sur plusieurs années.
Raffinement
L'ensemble des procédures (élevage ou Procréation Médicalement Assistée) fait l'objet d'une bonne maîtrise technique par la structure. Afin de réduire le stress lié aux manipulations, un protocole d’habituation est appliqué par les soigneurs tout au long de l’année pour habituer les animaux aux procédures nécessaires au projet. Les animaux font l'objet d'une surveillance attentive par soigneurs et vétérinaires 7 jours sur 7. Dans le cas des procédures de coeliochirurgie sous anesthésie générale, des anesthésiques locaux seront administrés aux sites d’insertions des trocarts afin de minimiser la douleur au réveil de l’animal. Les traitements anti-inflammatoires non-stéroïdiens, définis avec le vétérinaire référent, permettent de réduire la douleur post opératoire. Ces procédures sont réalisées sur nos espèces modèles en coelioscopie avec des matériels pédiatriques permettant de réduire la taille des trocarts utilisés, de minimiser les douleurs post opératoires pour les animaux et d'accélérer la cicatrisation. Un suivi est réalisé sur l'ensemble des individus et une fiche de score ou scoring est établie pour permettre de diagnostiquer et évaluer la douleur chez les animaux (absente, légère, modérée ou sévère). En cas de diagnostic d'une douleur sévère, la procédure est stoppée pour l'individu. Pour les douleurs légères et modérées, un signalement est réalisé au responsable de l'établissement utilisateur ainsi qu'au vétérinaire référent pour avis et traitement. S'il n'est pas constaté d'amélioration dans les 48 heures (pas de disparition des symptômes ou aggravation de la douleur), la procédure expérimentale est stoppée pour l'individu. Une prise en charge intégrale pour soins vétérinaires est réalisée pour les animaux.
Choix des espèces
De par sa collection unique d’espèces de cervidés rares et en voie d’extinction, les programmes de recherche développés par notre structure visent des applications pour la conservation d'espèces cervidés. Deux espèces communes de cervidés seront ici utilisés : l’espèce élaphe (Cervus elaphus) et l’espèce sika (Cervus nippon). L’espèce élaphe, du fait de sa disponibilité (espèce commune en France), de son grand gabarit et de la bonne connaissance de sa physiologie est une espèce de choix comme espèce receveuse d’embryons. L’espèce Sika du Japon, donneuse d’embryons ne correspond pas à une espèce en voie de disparition, mais est utilisée pour mettre à l’épreuve la faisabilité des techniques de production in vitro et du transfert d'embryons interspécifiques. Des transpositions de nos recherches pourront être faites sur les sous espèces de cerfs sika menacées dans le milieu naturel (ex C.n.taiouanus, C.n.pseudaxis, C. eldii).
Exposition du poisson Médaka adulte à des efflorescences simulées de cyanobactéries appartenant au genre Microcystis
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Plongés cinq jours dans des cultures de cyanobactéries du genre Microcystis, 360 poissons médakas adultes ne subissent aucune autre intervention, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance légère. Tous seront tués en fin d'exposition pour prélever leurs organes, seule voie d'accès selon le porteur aux compartiments biologiques étudiés. L'objectif porte sur l'effet des métabolites produits par ces bactéries sur le microbiote des poissons et, par ricochet, sur leur santé, un sujet que le porteur qualifie de "vierge". Il indique que les doses employées n'atteignent pas celles qui entraînent une souffrance "visible" au niveau morphologique ou du comportement, sans préciser ni les signes surveillés ni la fréquence des observations, alors qu'il attend par ailleurs un inconfort digestif et hépatique.
Objectifs
Les altérations des milieux aquatiques par les proliférations de cyanobactéries sont susceptibles de modifier le fonctionnement des écosystèmes aquatiques. Les préjudices associés à ces efflorescences comprennent : des perturbations de la chaîne trophique, une diminution de la pénétration de la lumière dans l’eau, une diminution de l’oxygène dissous disponible, mais également la production de métabolites secondaires potentiellement bio-actifs et parfois toxiques pour certains organismes qui y sont exposés. En effet, de nombreux genres de cyanobactéries sont susceptibles de produire et/ou de relarguer dans le milieu aquatique des molécules aux propriétés éminemment, ou potentiellement, bio-actives, délétères, voire toxiques. Si les effets toxicologiques (sensu stricto) de ces microorganismes et de leurs métabolites sont connus sur certaines cellules ou tissus de vertébrés, notamment chez certains poissons, on ignore leur impact sur la communauté microbienne associée et les répercussions sur la santé de l’organisme hôte. Des travaux menés ces dernières années ont montré que le microbiote, localisé à l’interface entre un organisme et le milieu extérieur, peut jouer un rôle important dans la physiologie de l’hôte, mais aussi dans de nombreux paramètres biologiques chez les Vertébrés, parmi lesquels la résistance aux pathogènes. Le présent projet propose d’étudier l’effet de l’exposition à des doses représentatives des conditions environnementales de divers efflorescences de cyanobactéries sur le poisson modèle en écotoxicologie aquatique, le médaka. A ce jour, peu d’études se sont ainsi efforcées de caractériser la réponse des poissons à différentes compositions d’efflorescences de cyanobactéries au niveau de l’holobionte (organisme hôte + microbiotes) et de tâcher ainsi de prendre en compte la réponse au niveau des différents compartiments biologiques et des différents organes.
Bénéfices attendus
Cette étude constituera un prérequis indispensable au développement de ce sujet encore vierge. La caractérisation du microbiote de poissons n’en est en effet qu’à ses débuts et dévoile déjà une large diversité microbienne inattendue. Les interactions entre hôte, son microbiote associé et l’environnement sont peu explorées, encore moins dans le cadre de stress écotoxicologiques, et pourraient s’avérer informatives de processus biologiques méconnus. A terme ces travaux permettront de mieux appréhender les conséquences (éco)toxicologiques des efflorescences de cyanobactéries et de la production de métabolites bio-actifs associés.
Procédures
Mis à part la balnéation avec les biomasses de cyanobactéries qui aura lieu pendant les 5 jours de l’expérimentation, aucune intervention ne sera réalisée sur les animaux.
Impact sur les animaux
Les poissons seront exposés 5 jours par balnéation à différentes doses environnementale de cultures de souches de cyanobactéries. Certains métabolites produits par les cyanobactéries pourraient induire des effets physiologiques occasionnant un inconfort alimentaire pour les poissons (digestif, hépatique). Les doses n’atteignent pas les doses toxicologiques entrainant de la souffrance visible au niveau morphologique ou du comportement.
Devenir
Les poissons seront euthanasiés en fin de procédures et leurs organes prélevés pour analyses. Seuls les prélèvements tissulaires post-mortem permettent d’avoir accès aux différents compartiments biologiques qui seront ici investigués.
Remplacement
Seul ce type d’analyse intégrée portant sur des organismes entiers permet de générer une compréhension fine des processus écotoxicologiques qui en oeuvre chez ces modèles biologiques complexes (organismes + microbiote associé).
Réduction
Notre expérience dans ce type de travaux nous a permis de raffiner le design expérimental au niveau du temps d’exposition qui passe ici de 28 jours à seulement 5 jours. Par ailleurs, nos travaux mettront en oeuvre une approche de comparaison de la variance des différents paramètres biologiques ici renseignés (composition bactérienne et métabolique) afin d’estimer à la fois les variabilités biologiques et expérimentales. Nos expérimentations seront réalisées à des concentrations environnementales (en teneurs en cyanobactéries) et avec des effectifs nécessaires et minimums pour être en mesure de démontrer l’occurrence d’effets moléculaires d’un nombre réduit d’organismes.
Raffinement
Nos travaux sont développés dans le contexte de la caractérisation de biomarqueurs précoces (et également plus sensibles) de stress au niveau du microbiome et du métabolome (ensemble des métabolites retrouvés dans un échantillon biologique, et sa concentration) des poissons Médaka. En en accord avec le principe de raffinement de la règle des 3R pour l’expérimentation animale, les expérimentations seront menées à des concentrations en cyanobactéries produisant des cocktails bio-actifs proches de la concentration minimale induisant les premiers effets détectables toxicologique, afin de limiter les potentiels effets toxicologiques. Durant toute l’expérimentation, les organismes seront maintenus en groupe dans des conditions d’élevages standards, correspondants aux critères de raffinement préconisés par l’Organismes de Coopération et de Développement Economique pour l’élevage et l’expérimentation sur cet organisme.
Choix des espèces
Oryzias latipes : Espèce modèle aquatique vertébrée couramment utilisée en expérimentation scientifique pour des travaux de développement, d’écologie ou d’écotoxicologie avec différents types de contaminants environnementaux Jeunes adultes (entre 3 et 5 mois), afin de pouvoir aisément les sexer et d’éviter qu’ils ne présentent les altérations cellulaires qui commencent à apparaître après l’âge de 6 mois chez cette espèce.
Acquisitions des données in vivo pour le développement d’une plate-forme innovante d’enseignement de la physiologie expérimentale dans l’enseignement supérieur (LEARN « L3Rn »)
- Enseignement supérieur
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Un rat qui montre des signes de mal-être est retiré de l'étude, ce qui n'empêche pas sa réutilisation dans un autre projet. 108 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, aucun tué dans le cadre de ce projet, tous destinés ensuite soit à des expériences sur organes isolés, soit à des travaux pratiques et à la formation à la chirurgie. Ils subissent une à six anesthésies gazeuses pour être rasés des flancs, portent un gilet à capteurs enregistré jusqu'à vingt-quatre heures d'affilée sur une période allant jusqu'à six mois, sont parfois séparés visuellement et olfactivement de leurs congénères, et courent sur un tapis roulant jusqu'à trente minutes à 80 % de leur capacité, stimulés à la queue. Le porteur annonce que ces données serviront à construire des vidéos et une plateforme de simulation pour l'enseignement de la physiologie, et reconnaît qu'un risque de détresse cardio-respiratoire "ne peut être exclu" lors des anesthésies.
Objectifs
Bien que prenant en compte le contexte sociétal, l’enseignement de la physiologie à l’université continue d’inclure des animaux principalement en raison de l’absence de méthodes alternatives satisfaisantes. Les systèmes de simulation actuellement disponibles restent rares, rudimentaires, peu évolutifs et restreints à des conditions basiques. Ce projet vise à acquérir de façon non-invasive des données physiologiques de la fonction cardio-respiratoire, de la mobilité et des vocalisations chez le rat pour construire un ensemble de supports d’enseignement incluant des vidéos de démonstrations et une plate-forme digitale permettant de simuler différentes conditions en lien avec la vie quotidienne. Cela permettra à terme de réduire au maximum l’utilisation d’animaux en enseignement à l’université et d’envisager son remplacement dans certaines filières où l’acquisition de gestes pratiques n’est pas nécessairement obligatoire.
Bénéfices attendus
De tels outils pédagogiques permettront d’envisager à terme un remplacement de l’utilisation d’animaux pour les filières générales et une réduction significative de leur nombre et un raffinement des procédures pour les formations professionnalisantes.
Procédures
Les animaux seront soumis à une à six anesthésies générales volatiles durant quelques minutes en vue d’être rasés sur les flancs. Par la suite ils seront habillés avec un gilet contenant des capteurs physiologiques ; les enregistrements parfois quotidiens, pourront durer jusqu'à 24h pour une période allant jusqu'à 6 mois. Les rats seront observés en condition de vie quotidienne ou suivront un protocole d’exercice physique. Certains rats seront hébergés individuellement sans pour autant être isolés socialement (isolement visuel et olfactif), cet isolement des congénaires n'exédant pas 24h. D'autres rats seront contraints à une course sur tapis roulant n'exédant pas 30 minutes à maximum 80 % de leur capacité physique. Ils y seront encouragés par stimulation physique non douloureuse.
Impact sur les animaux
L'ensembre des rats subira des contraintes de niveau léger : notament trois brèves anesthésies générales volatiles pendant laquelle le risque de détresse cardio-respiratoire ne peut être exclu. Certains rats peuvent ne jamais s’adapter au protocole : port du gilet et surtout course contrainte. Ceci engendrerait un mal être et une prostration.
Devenir
L’ensemble des procédures du projet permet d’envisager la réutilisation totale des animaux. A ce jour, deux types de réutilisation sont envisagées : soit une réutilisation pour la réalisation d’experience sur organes isolés, soit une réutilisation en enseignement universitaire (Formation à la chirurgie, TP de licence professionnelle).
Remplacement
Ce projet n’offre pas une alternative complète à l’utilisation d’animaux puisqu’il nécessite l’utilisation des animaux vigiles pour la production initiale des données et la création de la base. En revanche il contribue de façon significative à chacun des 3R puisque les résultats du projet permettront d’envisager la réduction du nombre d’animaux utilisé en formation et en enseignement, de remplacer l’utilisation d’animaux en enseignement dans certaines filières générale et d’envisager le raffinement des procédures expérimentales par un suivi de paramètres physiologiques de façon non-invasive. C’est sur ces éléments que les acteurs du projet axeront leur communication (communication dans des conférences sur le bien- être animal) auprès de tous les acteurs du domaine.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet a été réduit au minimum afin de permettre d’avoir un nombre suffisant d’animaux pour obtenir des statistiques descriptives (moyenne, écart-type,) pour chacune des conditions expérimentales et a été fixé à 5 à 24 rats par sexe. S'agissant d'études physiologiques et comportementales, l’effet du sexe et de l'âge doit être pris en compte. Le nombre d'animaux permettra de réaliser les supports didactiques à utiliser en TP ou en formation professionnelle. Un nombre minimal (inferieur à 5) sera utilisé pour la mise au point du dispositif de suivi et la finalisation des réglages techniques.
Raffinement
A leur réception, les rats bénéficieront d'une semaine d'acclimatation. Le milieu de vie de chaque rat sera enrichi le plus possible suivant les protocoles de la SBEA. La tonte des flancs est systématiquement réalisée sous brève anesthésie générale volatile. Les rats bénéficieront tous d'une phase individualisée d'acclimatation/habituation au port du gilet et aux phases d'enregistrement. L’utilisation de la technologie de télémétrie consistant en un dispositif radio non invasif maintenu dans un gilet ergonomique porté par l'animal, permet une surveillance combinée de l'activité cardiaque, de la fonction respiratoire et de l'activité locomotrice au cours de l’exercice physique. Ce dispositif couplé aux enregistrement vidéo et audio permet l'acquisition des données sans contrainte supplémentaire pour l'animal. Les séances d'exercice physique (course sur un tapis roulant) nécessitent le recours à une stimulations physique non douloureuse au niveau de la queue des animaux. Dans tous les cas, nous veillerons à ce que les exercices soient réalisés avec le moins de stimulations possibles. Si l’objectif d’apprentissage de la 1ère semaine n’est pas atteint, l’animal ne suivra pas la seconde semaine de conditionnement, il sera retiré du projet mais pourra être réutilisé dans d’autres projets. Tout signe de mal être d’un animal conduira à son retrait de l’étude, et ce même pendant la période initiale de stabulation.
Choix des espèces
L’espèce choisie est le rat adulte, qui constitue le modèle le plus utilisé en enseignement de la physiologie experimentale à l’université et qui présente une taille compatible avec le dispositif de suivi de la fonction cardio-respiratoire utilisé dans ce projet. Nous utiliserons des rats adultes d’un poids corporel de 250 à 450g (c’est-à-dire entre 8 et 24 semaines). Les animaux compris dans cette gamme de poids sont les plus utilisés dans le domaine cardiorespiratoire et en adéquation avec la taille de la version actuelle du dispositif. De plus, l’utilisation d’animaux de poids différents permet de valider la continuité des mesures même lors du changement de gilet lié à la taille des animaux.
Développement par imagerie d’une méthode d’expression de protéines bioluminescentes via l’injection de vecteur ADN dans les cellules musculaires de la souris
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Les souris utilisées sont immunodéficientes, dépourvues de défenses efficaces au point qu'une contamination bactérienne ou virale les tuerait, ce que le porteur qualifie de phénotype dommageable. Elles sont 180, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvements post-mortem. Chacune subit jusqu'à cinq injections, dix anesthésies à l'isoflurane, quatre séances d'imagerie de bioluminescence et jusqu'à cinq prises de sang à la mandibule sur animal vigile, l'injection intramusculaire étant couplée à des décharges électriques pour faire entrer un plasmide dans le muscle. L'objectif est de transformer ce muscle en ce que le porteur appelle une "usine de production" d'anticorps, preuve de concept dont il annonce les débouchés chez les espèces domestiques, contre l'arthrite ou le psoriasis.
Objectifs
Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. Le plasmide est injecté dans les cellules musculaires de souris afin d’induire une sécrétion à une dose supérieure ou égale à la dose minimale efficace de l’anticorps. L'objectif est donc double : 1/ mettre en place une méthode d’expression d‘anticorps par les cellules musculaires 2/ induire une expression qui soit suffisante pour être détectée dans le sang des animaux et agir sur des cibles présentes à distance des muscles sécréteurs. Ce projet fait suite à de nombreux tests cellulaires de vérification de la fonctionnalité des plasmides ADN utilisés. Sa réussite ouvrira la voie à des études plus approfondies et à visée thérapeutique chez des espèces domestiques. En bref, nous aurons une preuve de concept de l’utilisation de vecteurs ADN injectés dans les muscles des animaux, qui fonctionneront alors comme des « usines de production » d’anticorps dirigés contre des cibles. La niche d’utilisation de cette stratégie clinique concerne les maladies chroniques, dans notre cas, les maladies chroniques inflammatoires articulaires (ex : arthrite) et cutanées (ex : psoriasis ou pelade).
Bénéfices attendus
Une fois abouti, le présent projet a pour vocation de mettre en place une méthode de production de biomédicament par les cellules musculaires de souris via l’injection d’un vecteur ADN. Celle-ci ouvrira de nombreuses perspectives thérapeutiques et vétérinaires.
Procédures
Les souris de ce projet subiront au maximum : - 5 injections d’une durée total de 12 min (1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10min ; 4 IP pour l’imagerie, soit 2 min) - 10 anesthésies à l’isoflurane pour une durée totale de 70 minutes (5 rasages, soit 10min ; 1 IM couplée ou non à l’électroporation, soit 10 min ; 4 imageries de bioluminescence, soit 50 minutes) - 2 à 5 prélèvements de sang sur souris vigile, soit 2 à 5min au total.
Impact sur les animaux
Les injections intramusculaires et l’application de courants électriques pour l’électroporation peuvent potentiellement induire des douleurs. Ils seront réalisés sous anesthésie générale. Une prise de sang au niveau submandibulaire sera également réalisée sur animaux vigiles dans les deux premières procédures. Les souris seront suivies grâce à nos grilles de scoring pour surveiller l’apparition de signes de souffrance tel que la perte de poids, la modification de la physiologie ou du comportement (dont la locomotion suite à l’injection intramusculaire avec ou sans électroporation). Nous utiliserons des souris immunodéficientes qui sont à phénotype dommageable car elles présentent une absence de défenses immunitaires efficaces. Si elles sont contaminées par des bactéries et/ou virus, cela entrainerait leur décès. Elles seront donc hébergées en portoir ventilé où il y a une très haute protection contre ces agents pathogènes empêchant ainsi l’expression de ce phénotype. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…).
Devenir
Mise à mort de tous les animaux à la fin de chaque procédure pour prélèvements post-mortem.
Remplacement
Une première sélection des meilleurs plasmides d’expression a été réalisée en amont par nos collaborateurs par des études in vitro. L’étude de la production d’un anticorps ou d’une protéine recombinante par un tissu musculaire et sa sécrétion dans la circulation sanguine générale n’a pas de méthode alternative que l’utilisation d’animaux vivants à l’heure actuelle.
Réduction
Nos protocoles expérimentaux ont été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés en injectant des vecteurs exprimant des protéines bioluminescentes, qu’il est possible de suivre par imagerie de bioluminescence et par luminométrie. Le suivi par bioluminescence in vivo permettra de suivre l’expression de la luciférase au cours du temps sur un seul et même animal et d’éviter de multiplier les groupes. C’est donc un double bénéfice au niveau scientifique et au niveau de l’utilisation d’animaux. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet est réduit au minimum sans toutefois compromettre les objectifs. Sur 5 ans, nous prévoyons l’utilisation au maximum de 180 souris qui seront réparties ainsi : - Mise en place des protocoles de transfert de vecteur ADN au sein de notre laboratoire : 40 souris - Étude du contrôle du système immunitaire : 40 souris - Étude des méthodes de transfert du vecteur ADN dans les cellules musculaires en utilisant soit différents polymères, soit différents produits de transfection : 100 souris.
Raffinement
La modalité d'imagerie mise en œuvre est non invasive et est réalisée sous anesthésie gazeuse. Les injections intramusculaires sont également effectuées sous anesthésie gazeuse. Le matériel stérile à usage unique adapté aux rongeurs, ce qui limite le risque d’infection et la douleur infligés au cours de l'expérimentation. Enfin, les souris auront 1 semaine minimum d’acclimatation avant le début de l’expérimentation. Elles seront 2 à 6 souris maximum par cage de 530 cm² selon leur poids. Ces cages seront en portoir ventilé, ce qui empêchera l’expression du phénotype dommageable des souris immunodéficientes. Ce statut est également garanti durant les différentes séances d’imageries durant lesquelles des procédures strictes sont respectées (désinfection du matériel, entretien des locaux, ordre de passage des souris dans l’imageur…). Les souris immunocompétentes seront également hébergées en portoir ventilé. Les cages sont enrichies avec du matériel pour la fabrication d’un nid et des granulés pour ronger et jouer avec ses congénères. Elles auront un accès à l’eau et la nourriture ad libitum et un cycle jour/nuit 12h/12h pendant toute la durée de l’expérimentation. Des grilles de scoring avec des points limites prédictifs seront mis en place et le personnel assurera l’observation des animaux quotidiennement afin d'anticiper leur souffrance. Néanmoins, en cas de douleur observée en post injection du plasmide, une injection sous-cutanée d’un analgésique) sera effectuée. Une injection intramusculaire peut provoquer une douleur liée à un hématome. Pour les prises de sang, un crayon hémostatique sera appliqué à la fin du prélèvement afin d’arrêter le saignement.
Choix des espèces
Le présent projet vise à développer, grâce à l’imagerie, une méthode permettant de faire exprimer par un muscle un anticorps ou fragment d’anticorps à partir d’un plasmide contenant leur gène. La souris est une espèce animale très largement employée dans la littérature pour ce genre d’étude de par la relative faible durée des expérimentations (quelques semaines), ainsi que par la possibilité d'utiliser des techniques d'imagerie in vivo. C'est ainsi le modèle animal de choix. La méthode mise en place dans ce projet a pour vocation de faire produire notre anticorps d’intérêt dans un système complètement fonctionnel et développé. Les animaux employés seront donc adultes, entre 7 et 10 semaines au moment de l'arrivée des animaux et leur entrée dans le protocole.
Production de souris humanisées pour le système immunitaire humain par injection de cellules souches humaines.
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Fournir à des clients académiques et industriels des souris porteuses d'un système immunitaire humain, par lots pouvant atteindre cent individus : 14 000 souris immunodéficientes vont être utilisées à cette fin, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Les nouveau-nées reçoivent une injection de cellules souches humaines trois à quatre jours après leur naissance, après une irradiation ou un traitement qui détruit les cellules de leur moelle osseuse. Des prélèvements sanguins suivent, jusqu'à un toutes les deux semaines, et le porteur indique attendre l'apparition de la maladie du greffon contre l'hôte, avec les lésions tissulaires qui l'accompagnent. Les souris de la phase de validation sont tuées, celles de la phase de production sont expédiées aux partenaires, parfois en avion, sur des lots calibrés selon les "besoins commerciaux".
Objectifs
Les souris immunodéficientes sont depuis plusieurs décennies des modèles de choix pour la transplantation de cellules humaines pour obtenir des souris humanisées car elles sont particulièrement tolérantes à l’implantation de cellules ou tissus. Les souris sont dites « humanisées » lorsqu’elles développent un système immunitaire humain après la greffe des cellules humaines. Le développement et la production de souris humanisées par injection de cellules souches humaines consiste à proposer des modèles expérimentaux pertinents et adaptés en recherche biomédicale sur les maladies inflammatoires aux utilisateurs finaux (académiques et industriels). L’une des particularités de ces modèles est le développement de plusieurs sous populations de globules blancs humains restant présents pendant plusieurs mois chez l’animal injecté, permettant ainsi de réaliser des études plus longues. Ainsi ce type de modèle permet l’étude de nombreuses pathologies dans lesquelles le système immunitaire joue un rôle majeur chez l’Homme dans des domaines tels que la production de cellules du sang, l’immunologie, les maladies infectieuses, la vaccination, l’oncologie et les maladies auto-immunes. Ces modèles permettent également l’amélioration de traitements et des méthodes de diagnostics notamment en oncologie, le cancer étant la première cause de mortalité prématurée ; mais aussi les maladies inflammatoires chroniques et certaines maladies d’origines infectieuses. Parmi les traitements, l’immunothérapie fait partie de ces nouveaux traitements innovants qui a révolutionnée la prise en charge des patients atteints de cancer. L’oncologie n’est pas le seul domaine dans lequel l’immunothérapie a eu des effets prometteurs et encourageants, les maladies inflammatoires chroniques ainsi que certaines maladies d’origines infectieuses sont sensibles à l’immunothérapie. Le recours à ces souris humanisées devrait permettre d’évaluer de nouvelles approches thérapeutiques nécessitant des modèles expérimentaux au plus proche de la situation humaine et permettant l’étude des réactions inflammatoires.
Bénéfices attendus
Le développement des souris humanisées pour le système immunitaire permet d’améliorer la compréhension des mécanismes pathologiques et immunologiques, d’identifier des marqueurs biologiques caractéristiques et de développer de nouvelles cibles thérapeutiques pour l’Homme. Les modèles de souris « humanisées » sont donc des modèles très pertinents pour le développement de traitements pharmacologiques. Depuis quelques décennies, le modèle humanisé est notamment très présent dans les études de nouvelles thérapies innovantes, dites immunothérapies. Il s’agit de thérapie qui se basent sur le fonctionnement du système immunitaire et de sa compréhension afin de combattre la pathologie du patient. Il n’est plus question de viser directement l’infection ou la tumeur, mais d’activer/booster le système immunitaire. De grand espoirs sont fondés notamment sur la médecine dite « personnalisée », pour laquelle ces modèles permettraient de greffer le système immunitaire et la tumeur d’un patient à des souris pour tester plusieurs thérapies avant l’administration du traitement le plus efficace au patient.
Procédures
Une partie des animaux recevront des injections d’un produit réduisant les cellules de la moelle osseuse ou une dose d’irradiation comme pré-traitement. Pour chacune des procédures dans la phase de validation, une injection unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue ou dans le foie en fonction de l’âge de l’animal. Pour toutes les procédures, des prélèvements sanguins seront effectués à plusieurs reprise jusqu’à 1 fois toutes les deux semaines post-humanisation dans la veine sous-mandibulaire. Pour chacune des procédures dans la phase de production, une injection intraveineuse unique de cellules humaines sera réalisée dans la veine de la queue ou dans le foie en fonction de l’âge de l’animal. Chaque geste sera réalisé en moins d’une minute pour diminuer au maximum le stress et la douleur.
Impact sur les animaux
Après production et validation des contrôles qualités, les souris seront expédiées aux partenaires. Ces déplacements peuvent induire un certain stress par la manipulation et les bruits inhabituels. Lors du protocole d’humanisation les injections ou les rayons X, pourront induire un bref état de stress et/ou de douleur. Un ou plusieurs prélèvements de sang seront réalisés sur de petit volume et ave un écart d’au moins deux semaines entre les prélèvements, ce qui pourra aussi induire un stress et/ou une douleur transitoire. Un effet secondaire connu lié à l’injection de cellules humaines du sang se déclare chez la souris injectée. Il s’agit de l’apparition de la maladie du greffon contre l’hôte, amenant à des lésions tissulaires à travers une réponse inflammatoire.
Devenir
Les animaux de la phase de validation seront mis à mort (points limites atteints ou fin de protocole). Les animaux de la production seront expédiés à nos partenaires pour une utilisation continue ou gardés en fin de validité si un suivi de l’humanisation dans le temps est nécessaire.
Remplacement
Pour le moment, ce type de modèle n’est pas remplaçable car il s’agit d’un modèle complexe et innovant mimant le système immunitaire humain, mélangeant de nombreux mécanismes encore méconnus qui nécessitent encore des avancées en recherche fondamentale. Actuellement, il n’existe pas d’équivalent aussi complet in vitro, ex vivo ou in silico. Par ailleurs, les souris humanisées permettent d’approcher la situation physiologique humaine en limitant le recours aux modèles de primates non-humains.
Réduction
Les modèles testés sont déterminés en fonction des tendances et besoins sur les avancées scientifiques en lien avec les pathologies citées en introduction, par conséquent aux besoins expérimentaux liés à l'utilisation de ces animaux auprès de nos partenaires. Nous avons utilisé un test statistique afin de déterminer le nombre d’animaux à inclure dans nos sous-groupes. Les paramètres utilisés sont tirés de la recherche bibliographique et de nos données internes ou partenariat relatives au processus. Pour la partie mise au point ou amélioration de protocole, nous testerons un ou différents paramètres pour un modèle donné. Pour chaque modèle, le nombre de groupes de souris entrant en protocole pourra varier en fonction des paramètres suivants : •Nouveau-nés versus juvéniles (entre le sevrage et la maturité sexuelle), •Techniques de traitement : produit réduisant les cellules de la moelle osseuse versus irradiation ou absence de traitement (en fonction du modèle), •Dose de traitement : jusqu’à 5 doses différentes testées, •Quantité de cellules souches humaines : jusqu’à 3 quantités différentes, •L’injection d’un mélange de donneurs de cellules souches humaines versus l’injection d’un donneur unique, •L’ajout ou non d’un agent booster du système immunitaire humain. Pour chaque test, un groupe contrôle sera ajouté, compris entre 1 et 10 souris, pour observer l’impact de nos protocoles sur les animaux et servir de témoins dans nos analyses. Pour un modèle donné, les paramètres testés seront choisis en fonction des données bibliographiques, des données internes et des spécificités du modèle, équivalent à 20 souris maximum par sous-groupes. Si les résultats ne sont pas concluants, des tests complémentaires pourront être menés pour évaluer la dose administrées ou l’impact des quantités de cellules humaines injectées lors de l’humanisation. Pour la partie production, des lots de souris produites seront proposées aux partenaires sur des souches préalablement étudiées et connues par notre établissement, répondant aux besoins commerciaux. Un nombre maximal de 100 souris par lot pourront être produites, toute demande supérieure fera l’objet d’une commande spécifique demandée par le client (Les commandes spécifiques seront réalisées dans le respect du protocole de la souche concernée et le bien-être des souris).
Raffinement
Un hébergement sous barrière sanitaire de niveau élevé est appliqué (litière, enrichissement et congénères) associé à une surveillance quotidienne. Toutes les observations feront l'objet d'une documentation adaptée. Le maintien de conditions d’hygiènes strictes exemptes de pathogènes et d’opportunistes étant la clé pour éviter l’expression du phénotype dommageable des animaux immunodéficients et limiter les nuisances associées. En fonction du pré-traitement choisi, un analgésique pourra être injecté si les animaux présentent des signes de douleur. En cas manipulation répétés sur les nouveaux nés, il sera nécessaire d’imprégner l’odeur de chaque cage par application de sciure souillé sur les gants du manipulateur pour éviter l’abandon des nouveaux nés par la mère. Concernant les prélèvements sanguins, les animaux seront prélevés de manière répétée jusqu’à 1 fois toutes les deux semaines à partir de 2 semaines post-humanisation au niveau de la veine sous mandibulaire pour que le prélèvement soit le moins invasif possible. Le volume maximal prélevé respectera les recommandations de 7,5% du volume sanguin de la souris afin que les souris puissent être prélevées 1 fois toutes les deux semaines en alternant le coté de prélèvement. Si nécessaire, une injection de sérum physio pourra être réalisé après chaque prélèvement pour rétablir la volémie des animaux et leur permettre une récupération plus rapide. Une attention particulière sera apportée à tout animal présentant des signes potentiellement avant-coureurs de la maladie du greffon pour appliquer des points limites. Après production, les souris seront expédiées aux partenaires. Pour limiter le stress occasionné par le transport, des processus d’envoi ont été établi. Pour des transports de moins de 24 heures à 48heures, tous nos colis contiennent de la litière, de l’enrichissement de l’aliment et un gel de transport. Pour les transports plus longs comme ceux en avion, la quantité d’aliment et de gel de transport est doublé.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est conditionné par les besoins scientifiques des projets de nos partenaires. Les rongeurs sont des modèles animaux simples à élever, relativement peu coûteux à reproduire et à entretenir en grand nombre ainsi qu’à manipuler et modifier génétiquement comparativement à d’autres espèces. Ils représentent un modèle de choix pour les études précliniques en raison de leur petite taille, de leur courte gestation, de leur durée de vie et de la disponibilité en réactifs expérimentaux. Le génome des souris est bien caractérisé et très comparable au génome humain, avec 90% des gènes humains qui ont un équivalent chez la souris. Enfin, la proximité clinique entre les modèles de rongeurs génétiquement modifiés et les maladies humaines fait de ceux-ci des modèles de choix relativement robustes pour extrapoler les résultats et en tirer des résultats pertinents pour la pathologie humaine. Que ce soit pour la mise au point ou la production, les souris pourront entrer dans le protocole à des âges différents. Cet âge sera choisi en fonction du protocole le plus pertinent pour une souche donnée. Les souris pourront être humanisées soit à l’état nouveau-né ou soit entre le sevrage et la maturité sexuelle. Pour une humanisation à l’état nouveau-né, les souris recevront une injection de cellules souches humaines entre 3 et 4 jours après naissance. Pour une humanisation entre le sevrage et la maturité sexuelle, les souris recevront une injection de cellules souches humaines entre la 3ème et la 8ème semaine après la naissance.
Effets des domaines Fc d’anticorps sur la déplétion de cellules ou de complexes immuns
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injectées à une ou deux reprises alors qu'elles sont éveillées, puis piquées cinq à six fois pour des prélèvements sanguins, 5 274 souris sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole prévoit un dernier prélèvement sous anesthésie, et les injections d'anticorps peuvent faire chuter leur température centrale de deux à trois degrés pendant une demi-heure. L'objectif déclaré porte sur l'optimisation d'anticorps thérapeutiques et sur la "bioproduction" de différents formats, la seule répétition des prélèvements suffisant à faire classer l'ensemble en souffrance modérée. Toutes sont tuées à la fin de chaque procédure, le porteur indiquant qu'elles ne peuvent être ni réutilisées ni adoptées parce que leur système immunitaire a été modifié de manière pérenne.
Objectifs
Nous cherchons à améliorer et à optimiser les anticorps thérapeutiques pour le traitement de diverses pathologies. Nous cherchons à améliorer la sélection d'anticorps innovants et d'optimiser la bioproduction de différents formats d'anticorps en comparant les choix possibles pour leur activité in vivo. Ceci sera étudié dans des souris humanisées pour des molécules affectants le rôle des anticorps pour une meilleure translation des résultats à l’homme.
Bénéfices attendus
Notre projet vise à améliorer notre compréhension de la fonction effectrice d'anticorps à visée thérapeutique pour améliorer le traitement de diverses maladies humaines. La comparaison d’anticorps produits sous différents formats avec différentes modalités servira à mieux maîtriser leur développabilité dès les premières phases de développement et d'optimiser la bioproduction de formats d'anticorps.
Procédures
- Injections sous-cutanées, intradermique, intraveineuse, intramusculaire, intrapéritonéale et intranasale sur animaux vigiles : quelques secondes. 1-2 injections par animal. - Prélèvement sanguin sur souris vigiles : quelques secondes. 5-6 prélèvements par animal. - Prélèvement sanguin sur souris anesthésiés : quelques minutes. 1 prélèvement par animal.
Impact sur les animaux
Au cours de ces expériences, il n’est pas théoriquement envisagé de douleur ou effet indésirable majeur du fait de la nature des produits injectés (anticorps ou protéine). Les prélèvement répétés de sang représentent la nuisance principale dans ce projet. Il est également possible que les animaux présentent une légère irritation au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention suivi de l’introduction d’une aiguille. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée. La sévérité globale des procédures est considéré comme modérée uniquement du fait de la répétition des prélèvements sanguins au cours des protocoles.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure car ils ne peuvent être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car leur système immunitaire aura été modifié de manière pérenne durant les procédures, impactant leur capacité de réponse à d’autres stimuli.
Remplacement
Le recours à l’utilisation d’animaux est justifié par le fait que les mécanismes moléculaires du système immunitaire sont difficiles, voire impossible à étudier in vitro, en raison de l'implication de plusieurs organes et de l'absence d'un système circulatoire intact. Les thérapies objets d’investigations, ne peuvent pas être remplacées par des modèles in vitro: nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente.
Réduction
Le recours à des lignées consanguines de souris permet entre autres de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental, et de ne pas prolonger les explorations dès lors que sont initiées et mesurables les conséquences biologiques des interactions entre les anticorps et leurs récepteurs. Les nombres d’animaux utilisés lors des expériences sont minimisés, avec la contrainte d’obtenir des données statistiquement significatives. Une analyse de variances sera réalisée entre les groupes.
Raffinement
Mesures prises pour minimiser les atteintes au bien-être des animaux. Il n’est pas attendu d’effet secondaire délétère pour la santé des animaux. L'état général des animaux et le point d'injection seront surveillés quotidiennement. La procédure sera interrompue si des signes généraux sont observés. Une légère irritation peut survenir au niveau des sites d'injection, qui sera contrôlée chez la souris. En outre, les souris peuvent souffrir d’une légère hypothermie transitoire (2 à 3°C de perte de température centrale pendant 20-30 min) après les injections d'antigènes et d'anticorps. La température des souris sera surveillée pour détecter toute perte de température anormale et des critères d'évaluation appropriés ont été fixés. Aucun effet à long terme n'est attendu pour cette procédure. Si l’animal présente une posture prostrée, un poil hérissé ou une perte de poids de plus de 10-15% le raffinenement sera renforcé avec du gel hydrique ou une réhydratation sous cutanée pour prévenir/traiter les signes cliniques. Si l’animal présente une hypothermie prolongée de plus de 30 min suite à une injection ou un prélèvement, les cages pourront être chauffées avec des chaufrettes. Les soins adéquats à apporter à l'animal seront déterminés par le vétérinaire. L’animal sera mis à mort si aggravation des signes clinique malgré le traitement.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. Nos procédures expérimentales ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information biologiquement pertinente. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte à adulte » : entre 6 et 15 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs. Les animaux ne sont pas utilisés à un âge plus avancé (au-delà de 15 semaines), afin que leur masse ne soit pas trop importante et ne nécessite l’injection de doses d’anticorps plus importantes.
L’impact de l’inflammation induit par Lipopolysaccharide d’Escherichia coli et Porphyromonas gingivalis sur la mégacaryopoèse dans la moelle osseuse.
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Injectées d'une toxine bactérienne dans l'abdomen, prélevées de 20 microlitres de sang à la queue sous anesthésie gazeuse, 144 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le dernier jour, sous anesthésie profonde, la peau du crâne est ouverte pour observer la moelle osseuse au microscope à travers l'os, pendant trois heures. Le porteur anticipe pour cette étape un risque d'hypothermie, un dessèchement des yeux et une douleur liée à la durée de l'anesthésie, et attribue aux cycles répétés d'anesthésie et de réveil une nuisance modérée. Toutes les souris sont tuées par prélèvement de 800 microlitres de sang à l'aorte abdominale ou à la suite de la chirurgie crânienne, gestes qu'il qualifie de terminaux.
Objectifs
Les plaquettes sanguines, qui jouent un rôle vital dans l’arrêt des saignements, sont produites dans la moelle osseuse à partir des mégacaryocytes, des cellules remarquables par leurs grandes tailles et leur noyau polyploÏde. Les processus de différenciation et de maturation vers la lignée mégacaryocytaire (mégacaryopoïèse) s’effectuent sous l’influence du microenvironnement médullaire, incluant notamment des macrophages qui ont pour rôle principal la phagocytose. Des observations récentes au laboratoire mettent en évidence l’existence, dans la moelle osseuse, des nombreuses interactions entre les mégacaryocytes et les macrophages et leur implication dans la mégacaryopoïèse et la production éventuelle de plaquettes. Les macrophages jouent un rôle essentiel dans l’initiation, le maintien et la résolution de l’inflammation. De plus, on sait que les conditions de stress telles que l’inflammation ont un impact significatif sur le phénotype et la fonction des macrophages. Ainsi, il sera intéressant d’étudier l’impact de l’inflammation sur l’interaction entre les macrophages et les mégacaryocytes dans le microenvironnement de la moelle osseuse avec un accent particulier sur son influence sur la mégacaryopoïèse et la production de plaquettes.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre l’impact de l’inflammation sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension du rôle des macrophages dans la maturation des mégacaryocytes et la formation des plaquettes notamment dans les maladies inflammatoires permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par des mégacaryocytes dans les conditions pathologiques, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements adaptés chez les patients avec l’inflammation systémique et risque de thrombose. Les données recueillies concernant l’effet induit par l’infection permettront de mieux comprendre les mécanismes impliqués à la fois dans le développement des maladies parodontales et leur implication dans la perturbation de l'homéostasie de la moelle osseuse et sur la mégacaryopoïèse et à la production de plaquettes sanguines ainsi que des pathologies associées par exemple thrombose afin de pouvoir, par la suite développer de nouvelles thérapeutiques. La mise en évidence de nouveaux mécanismes, notamment l’identification de nouveaux récepteurs et/ou molécules, permettra de mieux comprendre les interactions entre les maladies parodontales et les maladies générales, ces bactéries ayant été retrouvées, à distance au niveau d’organes tels que le foie, le cœur et les vaisseaux, et la moelle notamment. Les mécanismes impliqués semblent mettre en jeu une activation exacerbée, locale et à distance, de la réponse immune innée induisant une sécrétion amplifiée de médiateurs de l’inflammation aboutissant à la destruction tissulaire. L’amélioration des connaissances mécanistiques et moléculaires permettra à terme d’améliorer les stratégies de prise en charge des patients atteints de comorbidités et de développer de nouvelles approches pharmacologiques spécifiques.
Procédures
Les injections en IP se font en une fois et les prélèvements 20µL de sang à la queue se font sous anesthésie courte à l'isoflurane 2% de 10 minutes en début et en fin d'expérience. La dissection du crâne et l'immobilisation de l'animal sous le microscope se fait le dernier jour de l'expérience, sous anesthésie profonde. Injection en ip pour l'anesthésie profonde en 1x. Injection sc de l'analgésique : 1x Anesthésie gazeuse au masque 2% 10 minutes pour les étapes de prélèvements à la queue et 0.5% 3h pour l'observation au travers du crâne le dernier jour. Chirurgie crâniale : sous anesthésie profonde en ip pour 30 minutes. Le prélèvement de sang de 800µl à l'aorte abdominale sous anesthésie profonde est terminal. Tous les animaux seront mis à mort en fin d'expérimentation.
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvements de sang (seulement une fois) présentent un risque léger de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés au LPS (toxine bactérienne) ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère. En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie au travers du crâne de l'animal anesthésié, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de l'expérimentation puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales que ce soit par prélèvement à l'aorte abdominale ou suite à une chirurgie craniale.
Remplacement
Cette approche in vivo permettra de confirmer les résultats obtenus par l’approche in vitro ayant permis de mettre en évidence des preuves de concept et l’identification de nouveaux mécanismes moléculaires associant bactériémie et l’inflammation systémique car il n’est pas possible de reproduire de manière fidèle la complexité des interactions tissulaires et cellulaires de la moelle osseuse in vitro. Un modèle expérimental d’injection intra-péritonéale permettra de mimer la situation clinique observée à savoir la bactériémie associée avec l’inflammation systémique. Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la complexité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie des mégacaryocytes et la production des cytokines, diffèrent fortement dans des mégacaryocytes en culture par rapport à ceux observés in vivo.
Réduction
Le nombre d’animaux sera réduit par l’emploi de méthodes statistiques adaptées. Les mécanismes seront dans un premier temps évalués in vitro dans des cultures cellulaires pour déterminer les cibles d’intérêt physiopathologiques et thérapeutiques. A la fin des expériences les animaux seront euthanasiés et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris déterminé permettra d’obtenir des résultats statistiques solides. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).
Raffinement
Le raffinement se fera par une prise en compte du bien-être animal (enrichissement du milieu comprenant la mise à disposition de languettes de papier et d’un large tube en carton. Ce tube est utilisé comme refuge ou bien déchiqueté par les rongeurs comme substrat permettant, en complément des languettes de papier et de la litière, la composition d’un nid et soins quotidiens aux animaux) et par l’établissement de points limites permettant de limiter la douleur et la souffrance de l’animal. Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. Les moyens de raffinement des expérimentations sont les suivants : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Le milieu est enrichi avec de la frisure de papier, des carrés de cellulose et des bâtonnets de coton afin de permettre aux souris de confectionner leur nid et structurer leur environnement. Des croquettes sont déposées sur le fond de la cage pour favoriser le comportement de fouissage. - Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. Lors de la chirurgie pour les expériences intra vitales sous anesthésie une analgésie par injection sous cutanée de buprénorphine et de lidocaïne est apportée.- Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont sacrifiés avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Quand un score de 4 est observé, la souris est mise à mort par inhalation progressive de CO2. Quand un score de 2 est observé, une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine. De nombreux outils ont été développés pour suivre chez cet animal la production des plaquettes sanguines à partir de leur précurseurs MKs. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Le prélèvement à l'aorte se fera sur des souris adultes sans distinction entre 8 et 35 semaines, il est connu que la moelle des souris plus agées change et présente plus de cellules graisseuses de type adypocyte interférent dans nos études. Par contre l’approche d’imagerie intravitale requière des animaux à un stade de développement jeune (de 4 à 8 semaines) car ils ont l’os du crâne suffisamment fin pour laisser passer la lumière.
Impact d’une délétion d’un marqueur de l’insuffisance rénale chez les souris atteintes par la maladie de Dent
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Pour savoir si la suppression d'un marqueur de lésion rénale ralentit la maladie de Dent, 1 505 souris vont être utilisées, dont 130 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles passent cinq jours en cage à métabolisme individuelle, subissent une mesure de filtration rénale sous anesthésie suivie de deux heures d'observation, une mesure de composition corporelle en tube clos et un prélèvement sanguin que le porteur décrit comme pouvant provoquer une hémorragie, voire la mort. Le groupe suivi jusqu'à dix mois repasse cette série entière à quatre, sept et dix mois. Les souris écartées faute du bon génotype sont tuées sans prélèvement, et le poids, l'apparence et le comportement relevés chaque jour en cage à métabolisme servent à fixer le moment de la mise à mort.
Objectifs
La maladie de Dent de type 1 est une maladie rénale rare caractérisée par une perte urinaire de protéines et de calcium, la présence de calculs rénaux, et une insuffisance rénale progressive. Jusqu'à présent, il n'existe pas de traitement spécifique pour cette maladie. Une souris modifiée génétiquement présentant les mêmes traits cliniques observés chez les patients a été générée. Cette souris présente dans l’urine et des reins de fortes quantités d’un marqueur de lésion rénale mais connu comme jouant aussi un rôle actif dans l’apparition de dommages rénaux. L’objectif de ce projet est de déterminer si ce marqueur joue un rôle actif aussi dans la maladie de Dent, et si sa délétion permet de ralentir la progression de la maladie et freiner l’apparition de l'insuffisance rénale.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’évaluer l’importance d’un marqueur de lésion rénale dans l’évolution de la maladie de Dent 1, une pathologie conduisant à l’insuffisance rénale. Il n’existe pour le moment que des traitements symptomatiques de la maladie, en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par la maladie de Dent. En faisant appel à l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés, celui-ci aura un impact significatif sur la santé humaine car il permettra d’apporter de nouvelles perspectives conduisant au développement de pistes thérapeutiques, en vue d’améliorer la fonction rénale des patients atteints par cette pathologie.
Procédures
Un premier lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 mois, une mesure non invasive de composition de la masse corporelle sera effectuée en plaçant les souris dans un tube clos pour la mesure (environ 2 minutes). Ensuite, une mesure de la filtration rénale sera effectuée impliquant une anesthésie gazeuse, la pose d’un capteur de fluorescence maintenu par un adhésif adapté, une injection intra-veineuse du traceur fluorescent (environ 10 minutes) puis un suivi sur animal vigile d’environ 2 heures. Après, ces souris seront placées en cage à métabolisme individuelle dans une enceinte spécifique permettant de prélever l’urine durant 5 jours (3 jours d’habituation et 2 jours de d'expérience). A l’issue de cet hébergement, un prélèvement sanguin de faible volume sera réalisé sur souris vigiles (environ 1 minute). Ensuite, les animaux seront soit euthanasiés (groupe 4 mois) ou retourneront en stabulation en attendant la prochaine phase d’analyse (groupe 10 mois). En effet, le groupe 10 mois, repassera par la même série d’analyses précédemment décrites à 7 mois et à 10 mois avant euthanasie et prélèvements. Un second lot de souris recevra ou non un traitement dans leur nourriture en croquette. Ces souris ne changeront plus de régime alimentaire jusqu'à la fin de leur vie. A 4 ou 10 mois, les organes seront récupérés après l’euthanasie effectué sous anesthésie et analgésie. Des animaux auront potentiellement un phénotype dommageable. Durant l’élevage une biopsie sera nécessaire pour effectuer l’identification génétique de ces animaux (quelques secondes sur animal vigile).
Impact sur les animaux
Les souris transgéniques utilisées présentent un phénotype dommageable avec une pathologie rénale pouvant induire une diminution de la filtration rénale, une augmentation de l’excrétion de solutés tels que les protéines et le calcium, augmentation de la fibrose rénale qui n’entraînent pas de douleur. Une biopsie sera nécessaire afin d’identifier génétiquement les animaux qui seront utilisés. Celle-ci est susceptible d’entrainer une douleur légère de courte durée. Une partie des animaux recevront un traitement incorporé dans leur croquette habituel, lors du changement de régime cela pourrait causer un léger stress et entrainer une diminution de la consommation en raison de la néophobie des souris. Les souris seront placées dans un tube clos pour la mesure de la composition corporelle pouvant engendrer un léger stress le temps de la mesure de résonance magnétique. Les souris seront anesthésiées et reçoivent une injection intraveineuse pour réaliser la mesure de l’activité de leurs reins. Cette intervention est susceptible de générer une hypothermie et un risque de détresse respiratoire ainsi qu’une douleur au réveil au site d’injection. Les souris seront placées en cage à métabolisme, ce type d’hébergement peut générer un stress en raison du changement d’environnement. Les souris subiront un prélèvement de sang qui est susceptible de causer une douleur de courte durée associée à la piqûre de l’aiguille, mais pouvant également causer une hémorragie dans de rare cas, voire la mort.
Devenir
L’euthanasie est requise pour réaliser des prélèvements en vue des analyses pour répondre à la question scientifique. Une autre partie des animaux sera euthanasié sans prélèvement en fin de période de reproduction ou en raison de l’absence du gène d’intérêt après l’identification génétique.
Remplacement
Dans la mesure du possible, le remplacement des animaux pour des méthodes alternatives (par exemple des cellules en culture) est préférable. Toutefois, seules des études sur des animaux nous permettront de déterminer l’effet des traitements sur leur phénotype rénal (notamment les modifications du débit de filtration glomérulaire, des contenus urinaires et plasmatiques, les altérations histologiques et moléculaires des cellules rénales) en comparaison avec celui des animaux non traités.
Réduction
Ce projet a une durée de 5 ans, et nécessitera la génération de 1505 souris (couvrant l’ensemble des demandes). Nous avons calculé le nombre d’animaux au plus faible grâce à un calcul de puissance et de notre expérience passée. Pour une interprétation fiable des résultats il sera nécessaire de procéder à des tests statistiques robuste. Pour raffiner nos animaux au maximum nous réaliseront le plus d’expérience possible par animal. Les souris exclues des procédures en raison d’un génotype non conforme ou non pertinent pour les procédures ou le maintien de la lignée pourront être réaffectées à d’autres projets au sein de l’animalerie ou de l’équipe, notamment pour la récupération d’organes ou comme animaux de réforme ; si aucune réaffectation n’est possible, elles seront euthanasiées.
Raffinement
Durant leur hébergement en stabulation et en élevage, les animaux auront un accès libre à la nourriture et à de l’eau filtrée, et seront placés dans des cages ventilées. L’environnement des animaux sera enrichi avec du nid végétal, des cylindres en carton, des bouts de bois et/ou des maisons. L’hébergement en cages à métabolisme sera lui aussi réalisé dans l’établissement utilisateur. Par ailleurs, la détermination quotidienne du poids, de l’apparence physique et du comportement des animaux durant leur hébergement en cages à métabolisme nous permettra de définir les points limites nécessitant une euthanasie de l’animal. De plus, la mesure de leur débit de filtration glomérulaire sera effectuée sous anesthésie avec réveil. Pour le prélèvement de leurs reins, les animaux recevront une anesthésie sans réveil. Par ailleurs, la gestion de la douleur sera prise en compte avec la mise en place d’une grille de score, de la définition de points limites et la réalisation des certaines procédures sous anesthésie et analgésie. L’ensemble des expériences sera mené en présence de personnels hautement qualifiés dans des locaux d’hébergement respectant les standards en vigueur. Au moment du pucage, les animaux vigiles sont prélevés d’un bout d’oreille à l’aide d’un poinçon d'oreille afin d’éviter une manipulation supplémentaire. Ces manipulations ont lieu dans une pièce dédiée, au calme. Le geste est effectué sur un animal très jeune afin de limiter la douleur et car il a une cicatrisation rapide. Le geste est parfaitement maitrisé par les zootechniciens et est fait rapidement avec un poinçon adapté et désinfecté après chaque animal. L’animal est surveillé immédiatement après cet acte pour s’assurer qu’il ne saigne pas et est bien repris en charge par sa mère. Le bout d’oreille est envoyé à l’analyse de génotypage.
Choix des espèces
Nous avons choisi de mener nos expériences chez la souris, car seuls des modèles animaux nous permettront d’évaluer l’effet d’une invalidation d’un marqueur de lésions rénales visant à ralentir l’évolution de la maladie. Nous utiliserons des souris mâles contrôles et transgéniques âgés de 4, 7 et 10 mois afin d’évaluer l’effet de l’invalidation d’un marqueur de lésions rénales sur l’évolution de la maladie. Nous utiliserons aussi des femelles contrôles et transgéniques suivies à 4, 7 et 10 mois afin de s’assurer que leur phénotype ne diffèrent pas de celui observé chez les femmes portant la maladie.