Autre recherche fondamentale

Irradiées, puis greffées sous anesthésie avec des cellules souches sanguines de souris ou humaines, 720 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées à l'issue pour que soit quantifiée la proportion de cellules greffées dans leur moelle et leur sang, chacune ayant subi jusqu'à trois prises de sang au cours de sa vie. Le projet vise à améliorer des protocoles de thérapie génique destinés à la drépanocytose et à la bêta-thalassémie, en testant des gènes thérapeutiques, de sélection, "suicides" ou activateurs de prolifération. Le porteur écrit que l'irradiation non létale n'est pas censée provoquer de douleur, et décrit par ailleurs une irradiation létale des souris immunocompétentes dont seule la greffe assure la survie.

Objectifs

Au laboratoire nous développons de nouveaux vecteurs thérapeutiques permettant de modifier plus efficacement les cellules souches sanguines pour optimiser les conditions de culture, de modification et de sélection des cellules « corrigées » qui seront injectées, afin d’améliorer les protocoles de thérapie génique chez l’humain dans le cadre de maladies génétiques. L’objectif de ce projet consiste à étudier l’effet de gènes thérapeutiques, de gènes de sélection, de gènes « suicides » ou de gènes activateurs de la prolifération cellulaire ayant un effet sur le processus physiopathologique des maladies de l’hémoglobine telles que la béta-thalassémie et la drépanocytose. Pour cela nous devons réaliser des études précliniques de transplantation dans des modèles murins de deux maladies (la drépanocytose et la béta-thalassémie), ainsi que dans un modèle murin immunodéficient (n’ayant pas de système immunitaire) qui permet la prise de greffe de cellules souches sanguines humaines.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont l’amélioration des protocoles de correction (des cellule souches sanguines défectueuses) et de transplantation des cellules souches sanguines corrigées pour des thérapies géniques qui pourront être appliqués à l’humain dans le cadre de maladies de l’hémoglobine ou de greffes de cellules souches sanguines.

Procédures

Chaque animal sera soumis à une irradiation, étape nécessaire à une bonne prise de greffe de cellules souches hématopoïétiques/sanguines (soit 3 min environ pour les souris immunodéficientes et 2 fois 5 min environ pour les souris immunocompétentes). Les animaux seront également transplantés avec des cellules souches hématopoïétiques/sanguines murines ou humaines. L’injection de CSHs qui ne dure que quelques secondes est réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à un prélèvement sanguin une fois par mois et trois fois maximun durant la vie de l’animal. Ce geste ne dure que quelques secondes.

Impact sur les animaux

Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) ont un risque de développer des infections diverses en lien avec des pathogènes (virus, bactéries). L’irradiation non létale de ces souris n’est pas censée provoquer de douleur ou d’altération majeure de leur santé. Une perte de poids peut être observée dans de rares cas mais elle est transitoire (une semaine environ). Seule une infection potentielle peut s’avérer dangereuse mais elle est limitée au maximum grâce au maintien des animaux dans un environnement stérile et à un traitement antibiotique. L’irradiation létale des souris immunocompétentes nécessite une greffe de cellules souches hématopoïétiques pour assurer leur survie. Suite à l’irradiation, une perte de poids peut être observée mais elle est transitoire (une semaine environ). Les prélèvements sanguins peuvent générer du stress dû à la contention de l’animal ainsi qu’une légère et brève douleur au niveau de l’œil.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de quantifier la proportion de cellules souches sanguines murines ou humaines présentes dans la moelle et le sang des souris et de les caractériser.

Remplacement

La prise de greffe au cours de la transplantation des cellules souches sanguines/hématopoïétiques (CSHs) est un phénomène complexe pour lequel il n’existe aucune méthode alternative in vitro permettant de mimer les processus physiologiques de guidage, d’implantation, de survie et de différenciation de ces cellules. La transplantation chez l’animal est le seul outil permettant d’évaluer la capacité des CSHs cultivées et modifiées par des vecteurs thérapeutiques à se loger au niveau de la moelle osseuse et reconstituer l’hématopoïèse (processus physiologique de production des cellules sanguines) à long terme. Par ailleurs il n’existe pas de protocole in vitro permettant de différencier les cellules érythroïdes humaines ou murines en globules rouges parfaitement matures. Les souris sont donc utilisées à la fois pour déterminer si des CSHs ont été génétiquement modifiées par les vecteurs de transfert de gènes mais également à terme, par l’étude de l’effet des vecteurs de thérapie génique sur la fonction des globules rouges.

Réduction

Pour limiter le nombre d’animaux, nous évaluerons d’abord l’effet des conditions de culture et/ou protocoles de modification des cellules dans des systèmes de culture in vitro afin de vérifier qu’ils ne génèrent pas de toxicité cellulaire. Le recours à l’animal est ensuite indispensable à l’étude de l’effet des procédures de culture sur la capacité des cellules à reconstituer le système hématopoïétique (de production de toutes les cellules sanguines). Notre expérience dans le domaine de la greffe des cellules souches sanguines dans le modèle murin ainsi que les résultats de la littérature nous indiquent que le nombre minimal d’animaux requis par groupe est de 6 animaux pour rendre des résultats statistiquement significatifs.

Raffinement

Les souris immunodéficientes (sans système immunitaire) sont élevées en conditions stériles. Les changes des cages sont réalisés sous poste de sécurité microbiologique afin de réduire au maximum les risques de contact avec des agents infectieux. L'eau de boisson est une eau en bouteille du commerce et qui est stérilisée. Toutes les manipulations des animaux sont réalisées avec des gants aseptisées à l'alcool. Les cages des animaux disposent de cotons (enrichissement) qui ont été au préalable stérilisés. Pour limiter au maximum les nuisances sur le bien-être des animaux, la greffe de cellules souches sanguines sera réalisée sous anesthésie grâce à un mélange anesthésique/analgésique. Durant les 15 jours suivant la greffe cellulaire les souris seront examinées par le porteur du projet 3 fois par semaine et une grille de suivi sera remplie en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu. Des points limites ont été déterminés afin de mettre en place un traitement approprié ou d’envisager l’euthanasie si un des critères d’arrêt est atteint. Afin d’éviter toute infection, les souris seront traitées par antibiothérapie durant ces 30 jours. Au bout d’un mois, les souris seront observées par le porteur de projet une fois par semaine en plus de la visite journalière des techniciens animaliers afin de pouvoir intervenir rapidement en cas d’effet inattendu.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux de petite taille, qui montrent de grandes similarités en termes de mécanismes moléculaires et cellulaires avec l'homme. Elles sont couramment utilisées pour l’étude de l’hématopoïèse après transplantation de cellules souches sanguines. Le projet porte sur quatre lignées murines. Deux lignées sont utilisées comme modèles de pathologies humaines du globule rouge, dans le cadre d’expériences de thérapie génique. Une lignée est utilisée comme lignée receveuse de transplantations effectuées à partir de cellules souches sanguines murines. Une autre lignée de souris immunodéficientes permet la greffe de cellules souches sanguines humaines qui sont capables de reconstituer le système sanguin. Ce système de greffe permet l’étude de l’efficacité de vecteurs de thérapie géniques sur les cellules souches sanguines humaines provenant de donneurs sains ou de patients atteints de drépanocytose ou de béta-thalassémie. Dans ce projet les animaux sont utilisés à l’âge de 10-12 semaines, moment où la prise de greffe est optimale.

Des capsules contenant des tiques sont collées sur le dos de souris préalablement infectées par un parasite du sang, et y restent trois à quatre jours pendant que les tiques se gorgent. 20 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour récupérer leur sang, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une injection intraveineuse inocule Babesia divergens, suivie de prélèvements sanguins quotidiens pendant trois à cinq jours et d'une anémie légère attendue. Chaque souris est isolée en cage individuelle parce qu'elles retirent les capsules de leurs congénères et mangent les tiques, et le porteur présente ce modèle comme un moyen d'éviter le recours aux bovins, "beaucoup plus contraignant".

Objectifs

La babésiose est une maladie parasitaire cosmopolite due à l'infection par des parasites sanguins du genre Babesia. De nombreuses espèces de vertébrés peuvent être affectées par cette maladie, transmise par les tiques, et certaines espèces de Babesia présentent un grand intérêt en tant que responsables des zoonoses émergentes. En Europe, des publications récentes montrent clairement que l'incidence annuelle de la babésiose augmente à la fois chez l'homme et chez l'animal. Le piroplasme bovin Babesia divergens est souvent associé à la babésiose humaine en Europe et est transmis lors d'une piqûre de la tique Ixodes ricinus. Chez la tique, le parasite doit envahir des cellules differents, se transformer et migrer à l'intérieur de la tique afin de réussir à atteindre les glandes salivaires, afin de pouvoir infecter un nouveau hôte vertebré. Pour se faire, certaines protéines produites par le parasite sont essentielles. Malheureusement, il y a très peu d’information disponible sur le développement de Babesia chez la tique, malgré le développement récent de modèles in vivo et in vitro qui permettent l’infection des tiques. Il est donc essentiel de décrypter ces mécanismes, ce qui permettra d'identifier des cibles potentielles pour contrôler cet agent pathogène dans le vecteur et ainsi bloquer la transmission. Notre objectif est de développer un système expérimental qui nous permettra d'observer l’interaction du parasite Babesia divergens pendant leur migration vers les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus, et de détecter la production des protéines facilitant l'invasion des cellules des glandes salivaires. Jusqu'à présent, les outils permettant l’infection des tiques et le suivi de l’infection sont très limités, et seule la collection des tiques gorgées chez des bovins infectés est disponible. La possibilité d’infecter des souris immunodéprimées avec Babesia a été démontré, nous voulons maintenant explorer le développement temporel et spatial de Babesia chez la tique en établissant un modèle murin in vivo de Babesia divergens.

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle d’infection de Babesia divergens chez la souris permettra la caractérisation du développement du parasite pendant son développement et migration vers les glandes salivaires de la tique Ixodes ricinus, sans avoir besoin d’un modèle expérimental bovin, beaucoup plus contraignant. Des modèles similaires ont fait leurs preuves dans l’étude de Plasmodium falciparum, parasite responsable du paludisme chez l’Homme qui ne pouvait pas être entretenu hors son hôte humain avant l'utilisation des souris immunodéficientes. L’identification des cibles moléculaires chez le parasite permettra le développement des techniques pour le contrôle de l’infection, soit en bloquant la migration du parasite chez la tique, soit en inhibant leur capacité infectieuse lors de la piqure à l'hôte. Cependant, il n’y a pas d’information ou presque à propos des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’invasion des cellules des glandes salivaires. Les résultats obtenus ouvriront de nouvelles pistes pour le développement de stratégies visant à bloquer la transmission de la piroplasmose.

Procédures

Une seule injection intraveineuse (une minute) pour l'inoculation des parasites, ainsi que des prélèvements sanguins par la veine caudale ou saphène (1-2 minutes) seront faits une fois par jour pendant 3-5 jours afin de suivre la parasitémie chez les souris immunodéficientes infectées avec le parasite. Ensuite, les souris seront anesthesiées à l’aide de l’isoflurane par inhalation avant la pose de capsule contenant les tiques. La procédure de pose dure 5 minutes en moyenne. La capsule sera enlevée au bout de 3-4 jours.

Impact sur les animaux

La contention de la souris pendant 1-2 minutes lors du microprélèvement sanguin, peut être à l’origine d’une détresse chez l’animal. Le placement des capsules de contention (5-8 minutes), l'hebergement individuel, l’attachement et le gorgement des tiques sur l’animal (5 jours) peuvent aussi être source de stress. La réplication du parasite (parasitémie) peut être à l’origine d’une anémie legère sans autre signe clinique.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour récupération du sang total.

Remplacement

Ce projet vise à nourrir des tiques sur des souris immunodéprimées préalablement infectées avec Babesia divergens, afin d'évaluer le développement du parasite chez la tique. Il n'existe pas de modèle in vitro pour remplacer l’infection de la tique Ixodes ricinus par des parasites viables capables de migrer dans l’appareil digestif de la tique. Ce modèle permet d'assurer le meilleur suivi individualisé lors de l’inoculation de B. divergens chez la souris, avant le repas sanguin de la tique. Ils existent des systèmes de gorgement et d’infection artificielle des tiques mais ces systèmes ne permettent pas un taux d’infection capable d’assurer la transmission du parasite lors de la transformation de la larve de tique en nymphe. La seule autre alternative efficace pour la transmission de B. divergens à la tique est avec l’utilisation des bovins ou des gerbils.

Réduction

Le nombre d'animaux a été comptabilisé pour être le minimum nécessaire afin d’obtenir la quantité de tiques gorgées qui nous permettront de suive nos analyses. L'analyse statistique des résultats ne concerne que les tiques, ce qui permet réduire le nombre de souris. Pour assurer la collecte d'au moins 60-75 tiques gorgées au total, nous avons besoin de 3 souris immunodéprimées que seront utilisés pour le repas sanguin des larves, et 2 souris pour le repas sanguin des nymphes. Grace aux microprélèvements sanguins chez la souris, nous pourrons suivre la parasitémie sur un même individu, sans avoir besoin de multiplier le nombre des souris.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par lot de 2-3 dans leurs conditions classiques avec l’enrichissement nécessaire à leur bien-être (carré de coton, maison en plastique pour les souris). Nous suivrons les animaux tous les jours, deux fois par jour, afin de surveiller leur état général, de contrôler l'apparition de symptômes éventuels, et d’arrêter l'expérience si nécessaire par mise à mort des animaux. Les animaux seront mis à mort en cas de signes de detresse aiguë (comportement stéréotypé, abattemet sévère, incoordination). Lors du repas sanguin des tiques sur les souris, chaque souris sera hébergée en cage individuelle car elles sont capables d'enlever les capsules du dos des autres souris et de manger les tiques. Leurs cages seront particulièrement enrichies afin d’assurer leur bien-être en ajoutant des materiaux qui stimuleront leur comportement exploratoire (carrés de coton, nids, rouleau de carton), et même si elles sont seules elles pourront voir les autres souris des cages voisines. Pour réduire le stress de l’animal, nous allons habituer les souris à être manipulées dès leur arrivée, une à deux fois par jour. Le placement des capsules sur le dos de l'animal a été optimisé pour minimiser le désagrément chez l'animal et maximiser les résultats expérimentaux. Pour ceci, les souris seront anesthésiées pendant tout le temps de pose de la capsule. Aussi, nous allons appliquer une crème anesthesique locale (lidocaïne) 30 minutes avant du microprélèvement de sang.

Choix des espèces

Nous utiliserons une lignée des souris immunodéficientes. Ces souris pourront être infectées par le parasite Babesia divergens, ceci sera capable de se multiplier dans leurs globules rouges. Après la transformation de la tique de larve à nymphe, nous repartirons les tiques sur deux nouvelles souris pour un nouveau repas sanguin afin de stimuler la migration des parasites vers les glandes salivaires de la tique. Pour ceci, nous utiliserons des souris immunocompétentes. Toutes les souris auront 7-8 semaines, avec l’adaptation des animaux à leur environnement pendant une semaine avant le début de l'expérimentation.

Deux injections d'hépatocytes humains, une greffe de cellules de foie sous anesthésie, puis des administrations répétées de candidats médicaments par voie intraveineuse, intrapéritonéale, intramusculaire, sous-cutanée ou par gavage. 5 000 souris immunodéprimées, greffées dès l'âge de trois à quatre semaines pour qu'un foie humanisé s'y développe, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue au motif qu'elles ne recouvreront pas leur état de santé. Le modèle est proposé aux laboratoires pharmaceutiques pour l'évaluation de la toxicité hépatique, et le porteur retient la souris parce qu'elle est "plus acceptable éthiquement que les primates non-humains". Rien n'est dit des molécules qui seront administrées ni du nombre d'études prévues, et les atteintes attendues se résument à une perte de poids, une prostration ou des difficultés à se déplacer, la mise à mort intervenant à 25 % de poids perdu.

Objectifs

Les unités de recherche académiques et les laboratoires pharmaceutiques dépendent en grande partie des modèles murins pour évaluer l'efficacité et la toxicité de nouveaux candidats médicaments. La souris foie humanisée constitue le modèle de choix dans le cadre de la recherche dans le domaine des maladies infectieuses hépatiques (HBV, HCV), du carcinome du foie et de la toxicité métabolique. En effet, l'évaluation de la toxicologie préclinique est l'étape la plus critique du développement d'un médicament, ce faisant la distribution, le métabolisme et l'excrétion (ADME) d'un médicament chez l'homme ont un besoin urgent d'être mieux estimé.

Bénéfices attendus

L'évaluation de la toxicologie préclinique est l'étape la plus critique du développement d'un médicament. Environ 70% des programmes de développement de médicaments échouent en raison d'une toxicité ou de problèmes inattendus lors de la validation de phase 1 sur l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion (ADME) chez l'homme. Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie qui présente une architecture et un fonctionnement complexe qui ne peut être reproduit in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophyles,...). La souris foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les maladies virales et le cancer.

Procédures

2 injections d'hépatocytes humains par voie intraveineuse, gerffe des cellules du foie sous anesthésie, 1 injection sous-cutannée d'anagésique, injections de candidats médiacaments par voir intrapéritonéale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse ou par gavage.

Impact sur les animaux

Des nuisances peuvent être induites par l'injection des hépatocytes humains, la greffe des cellules du foie, l’administrations de traitements, les effets potentiellement toxiques des composés à visées thérapeutiques et/ou les prélèvements sanguins. Cette douleur peut se manifester, entres autres, par une perte de poids, une hypo- ou une hyperactivité, une prostration ou des difficultés à se déplacer.

Devenir

Les animaux sont euthanasiés selon les procédures en vigueur car ils ne recouvreront pas leur état de santé et de bien-être général.

Remplacement

L'évaluation de la toxicologie préclinique est l'étape la plus critique du développement d'un médicament. Environ 70% des programmes de développement de médicaments échouent en raison d'une toxicité ou de problèmes inattendus lors de la validation de phase 1 sur l'absorption, la distribution, le métabolisme et l'excrétion (ADME) chez l'homme. Il n'existe à ce jour, aucune alternative performante capable de prédire l'activité/toxicité d'un candidat médicament agissant sur le foie qui présente une architecture et un fonctionnement complexe qui ne peut être reproduit in vitro ou chez d'autres animaux (zébrafish, drosophyles,...). La souris foie humanisée constitue donc un modèle scientifiquement valide pour le développement et la mise au point de traitements innovants visant à lutter contre les maladies virales et le cancer.

Réduction

Dans ce projet, un nombre maximum de 5000 souris seront humanisées Chaque étude préclinique visant à tester l'efficacité d'un candidat médicament nécessite entre 50 et 100 animaux ( Au minimum 4 groupes seront nécessaires pour la bonne conduite de chaque étude préclinique (3-5 doses du candidat médicament, contrôle négatif, contrôle positif,...). Les études précliniques des candidats-médicaments nécessitent l’utilisation de 8 à 10 individus par group testé. Ce nombre nous permettre d’avoir des résultats statistiquement interprétables et éviter de refaire les études et ainsi limiter le nombre d’animaux totale utilisés.

Raffinement

Les souris seront monitorées quotidiennement et pesée hebdomadairement pour s'assurer de leur état général. Une perte de plus de 25% de leur point initial (sera considérée comme une raison de mise à mort. De même, si un animal présente des signes de prostration, de difficultés locomotrices ou des difficultés à s'alimenter, il sera mis à mort immédiatement. Les animaux seront hébergés dans une animalerie de classe A2 par 5 à 6 animaux par cage ventilée. Les animaux bénéficent d'une période d’acclimatations dans leurs cages de 24h avant le début de l'expérimentation. À leur entrée dans l’animalerie, les souris bénéficieront d’une période d’acclimatation de minimum 5 jours. Les animaux sont hébergés avec à un cycle lumière-obscurité de 12h / 12h (07 :19h). Les animaux sont acclimatés à la présence de l’expérimentateur qui les pèse et les examine tous les jours. L’eau de breuvage (stérile) ainsi que la nourriture (stérile) sont fournies ad libitum sauf si le protocole nécessite une période de jeune. La durée de ce jeune ne pourra jamais dépasser 6 heures par semaine. L’eau ne sera jamais retirée des cages. Pour réduire et éviter le stress et assurer le bien-être des animaux, chaque cage est enrichie avec des objets (cabane en carton) et la litière de chaque cage est changée régulièrement.

Choix des espèces

La souris permet de re-créer un foie présentant les caractéristiques tissulaires et fonctionnelles du foie humain. De plus les cellules hépatiques humaines pourront être infectées par des virus humains spécifiques et le métabolisme du foie humain pourra être reproduit dans une espèce facilement manipulable, plus acceptable éthiquement que les primates non-humains et bien caractérisée au niveau génétique. Animaux post-sevrages ou adultes. Le protocole de greffe des hepatocytes ne peut être réalisé que sur de jeunes animaux (trois-quatre semaines), cela est nécessaire pour que le le foie humanisé puisse se développer. L'effiocacité/toxicité des animaux sera quant à elle réalisées sur des animaux adultes afin de normaliser les résultats précliniques

Un fragment de peau est retiré du dos de chaque souris sous anesthésie générale, un anneau de silicone fixé autour de la plaie, puis le pansement changé et la plaie mesurée tous les jours sous anesthésie gazeuse. 114 souris vont être utilisées ainsi, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, le porteur indiquant que des infections peuvent apparaître et que des signes de douleur peuvent se manifester pendant toute la durée de l'expérience. Le mécanisme étudié, une sénescence déclenchée par la rupture de l'enveloppe du noyau sous contrainte mécanique, a été découvert sur des cellules en culture, ce qui n'empêche pas le porteur d'affirmer que ni les modélisations mathématiques ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire les paramètres en jeu. L'effectif de 114 animaux n'est justifié que par le recours à des "outils statistiques", et toutes les souris sont tuées pour analyse des plaies après leur mort.

Objectifs

Comprendre et exploiter les mécanismes de réparation des plaies cutanées pourrait avoir des implications importantes dans le développement de thérapies visant à optimiser le processus de cicatrisation survenues dans des épisodes cliniques aigus (brûlure, choc mécanique,) et chroniques (eczéma, psoriasis…) qui touchent une grande partie de la population. Malgré l’importance des processus de réparation tissulaire, ceux-ci sont encore mal connus. Des données chez l’homme et chez la souris décrivent le rôle central de la sénescence pour la réparation tissulaire. La sénescence est un phénomène biologique qui se produit lorsque les cellules de notre corps cessent de se diviser et de fonctionner correctement. Cependant, il a été montré que la sénescence favorise la régénération tissulaire en limitant la prolifération cellulaire excessive, en éliminant les cellules endommagées et en créant un environnement favorable à la cicatrisation. Récemment nous avons découvert un nouveau mécanisme d’induction de la sénescence cellulaire. Ce mécanisme est déclenché à la suite de la rupture de la membrane du noyau en réponse à des forces mécaniques appliquées sur les cellules. L'objectif du projet est alors de déterminer si ce mécanisme d’induction de la senescence est impliqué dans la réparation des plaies cutanées.

Bénéfices attendus

Jusqu'à présent, il a été décrit qu’à la suite d’une blessure, des cellules sénescentes se forment. Ces cellules jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies. Cependant, on ne sait pas encore clairement ce qui déclenche le mécanisme " de sénescence". L'étude du rôle potentiel de la protéine TREX1 dans l'induction de la sénescence après une blessure pourrait dévoiler une nouvelle cible thérapeutique pour améliorer la réparation tissulaire survenue, par exemple, à la suite de brûlure ou choc mécanique.

Procédures

Quelques jours avant l’excision cutanée, les animaux seront manipulés quotidiennement afin de limiter le stress dû au contact avec l’expérimentateur. Un fragment de la peau sera retiré sous anesthésie générale et un anneau de silicone sera fixé autour de la plaie (durée de l’anesthésie : 20 min). Les souris seront ensuite surveillées, les pansements changés et les plaies mesurées tous les jours sous anesthésie gazeuse (durée de l’anesthésie : 10 min).

Impact sur les animaux

À la suite de l’excision tissulaire, des infections peuvent apparaitre au niveau des plaies et des signes de douleurs peuvent se manifester tout au long de l’expérience.

Devenir

Les animaux seront mis à mort pour des analyses post-mortem

Remplacement

Lorsqu’une plaie survient, des cellules sénescentes tels que les myofibroblastes (des cellules spécialisées qui jouent un rôle crucial dans la cicatrisation des plaies et la réparation des tissus se forment aux alentours. Ces cellules devenues sénescentes sécrètent des signaux et des facteurs qui inhibent la prolifération des cellules voisines. Tous ces facteurs élargissent le champ d'attraction de l'état de cicatrisation orchestré par plusieurs types cellulaires. Chaque organe, voire chaque partie d'organe, présente un microenvironnement particulier lié à la fois aux cellules qui y sont présentes, la façon dont elles communiquent ensemble, et surtout de tout ce qu'il s'est passé depuis la formation de cet organe (infections, lésions…). Ni les modélisations mathématiques, ni les systèmes in vitro ne permettent de reproduire tous ces paramètres, ce qui nous oblige donc à utiliser des animaux.

Réduction

Le nombre d’animaux nécessaires pour ce projet a été calculé à l’aide d’outils statistiques pour limiter au maximum le nombre d’animaux en permettant l’obtention de résultats statiquement significatifs.

Raffinement

Les animaux seront manipulés sur plusieurs jours avant le début des expériences afin de limiter leurs stress. Lors de la chirurgie, les animaux seront anesthésiés et recevront des anesthésiques locaux pour gérer la douleur. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement afin de surveiller leur bien-être et de surveiller les éventuels signes de souffrance ou de stress. Les plaies seront mesurées tous les jours pour contrôler la vitesse de cicatrisation et l’état général de celles-ci (propreté, aspect...). Les pansements recouvrant la plaie seront changés tous les jours afin de limiter les risques d’infection. Toutes ces mesures ainsi que le nettoyage de la plaie nécessitant d’anesthésier les souris, elles seront espacées d’au moins deux jours si les premières expériences montrent que cela est possible. Une grille de score a été établie afin d’évaluer quotidiennement l’état des souris et des points limites adaptés ont été définis. Si la souris présente des signes de douleur de la buprénorphine sera administrée. Si une infection de la peau est détectée, celle-ci sera d’abord traitée à l’aide d’antibiotique et d’antiseptique, ce qui ne devrait pas impacter le processus de fermeture de la plaie. Si aucune amélioration ou à l’inverse qu’une aggravation de l’aspect de la plaie est observée, cela constitue un point limite. Ce suivi des souris s’applique à toute procédure.

Choix des espèces

Le rôle de la sénescence dans la réparation tissulaire a été bien décrit chez la souris. Les mécanismes de sénescence sont similaires chez la souris et l’homme. En plus, des données de notre laboratoire montrent que le mécanisme de sénescence induit par la protéine d’intérêt est conservée chez les cellules de souris comme chez les cellules humaines. De plus, le modèle d’excision cutanée murin utilisé dans ce projet a été montré comme mimant le processus de réparation cutanée humain, ce qui pourrait déboucher sur des données applicables cliniquement.

Comparer la qualité des sources de protéines végétales et animales passe ici par la privation alimentaire, et 720 rats en croissance vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque rat est isolé en cage individuelle pendant toute la période expérimentale, placé deux fois vingt-quatre heures en cage métabolique et deux fois trois jours en cage de calorimétrie, radiographié deux fois sous anesthésie gazeuse et soumis à deux prélèvements sanguins de 500 microlitres à la queue. Une injection de valine marquée précède la mise à mort de trente minutes, le temps de mesurer la synthèse protéique. Le porteur affirme que la mesure des effets d'un régime pauvre en acides aminés sur la croissance "empêche le remplacement" par des modèles cellulaires, et présente l'isolement comme atténué par le fait que les rats entendent et sentent leurs congénères.

Objectifs

La qualité de l’apport alimentaire en protéines des régimes alimentaires dépend de leur capacité à satisfaire les besoins en acides aminés (AA) indispensables (AAI) tout au long des cycles de vie. C’est une question majeure de sécurité nutritionnelle, principalement dans les pays en voie de développement, où l’apport protéique total est modéré, voire bas. Plus généralement, la connaissance de la qualité de l’apport alimentaire en protéine est primordiale pour comparer les différentes sources de protéines, notamment dans le cadre des discussions sur le rééquilibrage des sources alimentaires végétales et animales, et la recherche de sources alternatives de protéines. La composition en AAI est variable selon les sources protéiques. En effet, les protéines d'origines animales ont un profil homogène et équilibré en AAI, alors que les protéines de céréales et les protéines de légumineuses (comme le gluten) sont déficientes en certains AAI. Les profils de référence de besoin en AAI, utilisés pour l’évaluation de la qualité protéique, initialement déterminés à partir de données de bilan azoté, ont été révisés à la hausse (Organisation pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/Organisation mondiale de la santé (OMS),2007) sur la base de nouvelles méthodes, rendant plus sélectifs les critères de qualité des protéines. Cependant, ces valeurs révisées restent discutées. Ainsi, lors de son rapport sur le besoin en protéines et AA en nutrition humaine, le comité (FAO/OMS) a conclu qu’aucune méthode actuelle d’estimation du besoin en AAI n’est entièrement fiable et qu'iI est donc primordial de proposer de nouvelles approches complémentaires pour préciser les valeurs des besoins et d’évaluer le statut nutritionnel protéique des différentes populations. Pour cela, la FAO a recommandé le recours à l’usage d’outils tels que la métabolomique (ensemble des métabolites), qui a notamment été appliquée avec succès pour estimer le besoin en d’autres micronutriments. L’objectif de ce projet est d’identifier les variations des profils du métabolome urinaire et plasmatique comme biomarqueurs spécifiques de la déficience en AAI et à évaluer l’efficacité de la supplémentation pour valider les biomarqueurs identifiés. Ce projet fait suite à deux projets précédents pour lesquels nous avons identifié et validé des biomarqueurs urinaires pour trois des neuf AAI. Ce projet se déroulera sur 2 sites, dont une plateforme pour évaluer leur dépense énergétique et la composition corporelle.

Bénéfices attendus

L’identification et la validation de biomarqueurs du statut en AAI permettra, à terme, de mieux définir les besoins en acides aminés indispensables. Cela servira à affiner les politiques nutritionnelles et à mieux évaluer la qualité des sources protéiques. De plus, cette étude nous renseignera sur les effets d’une supplémentation en ces acides aminés indispensables après une phase de déficience. Ces effets n’étant que peu rapportés dans la littérature, ces informations seront très utiles, notamment pour l’étude de la sous-nutrition chez l’enfant avec retard de croissance.

Procédures

Durant la période expérimentale , les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire. Les animaux seront placés deux fois pendant la période expérimentale en cages métaboliques pendant 24h pour collecter les féces et les urines, et deux fois en cage de calorimétrie pendant 3 jours pour la mesure de dépense énergétique. La densité minérale osseuse et la longueur du tibia seront analysés par radiographie deux fois au cours de l'expérience après anesthésie gazeuse (anesthésie à l'isoflurane 2% pendant 10-15min). Deux prélèvements sanguins seront effectués au niveau de la veine de la queue de 500μl chacun .A la fin de l'expérimentation, les animaux seront mis à mort et une injection de valine 13C sera réalisée 30 minutes avant l’euthanasie (150μmol/100g poids corporel), dans le but de mesurer la synthèse protéique.

Impact sur les animaux

Durant la période expérimentale, les animaux seront placés en cage individuelle pour permettre la mesure précise de leur prise alimentaire et de leur dépense énergétique (cages de calorimétrie indirecte), ainsi que la collecte des urines et fécès (cages métaboliques), ce qui peut engendre un stress modéré dû à l’isolement des animaux. Les animaux seront transportés à la plateforme 3 jours avant d'effectuer les mesures, afin d’évaluer leur dépense énergétique par calorimétrie indirecte et leur composition corporelle. La plateforme se situe à plusieurs km de l’unité de rechercheset le transport des animaux sera réalisée en voiture ce qui peut engendrer un stress modéré. Aussi, les prélèvements sanguins lors de la procédure 2 sont susceptibles d’induire de la douleur et un stress modéré. Une injection sera réalisée 30 minutes avant la mise à mort, dans la veine caudale, sous anesthésie gazeuse dans le but de mesurer la synthèse protéique. L’anesthésie gazeuse permettra de réduire la douleur engendrée par l’injection.

Devenir

Tous les rats seront euthanasiés en fin de procédure pour réaliser des analyses sur différents tissus cibles.

Remplacement

La nécessité de mesurer les conséquences de l'ingestion d’un régime à faible teneur en AAI sur le comportement alimentaire et les paramètres de la croissance (gain de poids et composition corporelle) empêche le remplacement de l'expérimentation animale par des modèles cellulaires ou moléculaires. Les résultats de ce projet permettront de mettre en place une étude clinique chez l’enfant dénutri. Ainsi, les objectifs de ce projet ne peuvent être atteints sans avoir recours à l’animal, le rat étant un modèle pour l'humain, en particulier pour la nutrition.

Réduction

A partir des données issues d’une étude précédente, nous avons déterminé qu’un effectif de 10 rats par groupe est le nombre minimal d’animaux nécessaires pour garder une puissance statistique satisfaisante. Cette étude inclue 6 lots, correspondant à chaque AAI à étudier. L’expérimentation comprendra 80 animaux pour chaque AAI étudié.

Raffinement

Le projet impose l'hébergement des rats en cages individuelles (répondant aux normes en vigueur) pour la mesure précise de la consommation alimentaire. Les rats demeurent dans la même pièce que leurs congénères, avec lesquels ils continuent à échanger par vocalises, et ils les voient et les sentent, ce qui modère l’impact de l’isolement. De plus, les cages seront enrichies au moyen de différents objets (tunnel, d’une tasse renversée, …) . De plus, un enrichissement social est prévu : les animaux seront placés en cages collective tous les jours pendant 2 h (durant les mesures de poids corporel et de gaspillage alimentaire). Les prises de sang sont réalisées par un expérimentateur expérimenté pour cet acte technique. Des aiguilles spécifiques permettant un écoulement plus efficace du sang en sortie d’aiguille sont utilisées, ce qui permet de limiter la durée et le stress engendré par les prises de sang. Les animaux seront transportés à la plateforme en voiture pour réduire la durée du stress provoqué par le transport. De plus, un enrichissement social est prévu pour le transport : Les animaux seront regroupés en fonction des régimes en cages collectives de transport avec de l’eau en gelée et de la nourriture à disposition. La manipulation régulière des animaux par les mêmes expérimentateurs pour les mesures du poids et de la prise alimentaire permet de suivre de manière rapprochée l’état de santé des animaux et de détecter des modifications éventuelles de leur état physique ou de leur comportement. Enfin, des points limites seront appliqués, au-delà desquels les animaux seront temporairement ou définitivement sortis des procédures.

Choix des espèces

Comme l’humain, le rat a un régime alimentaire très diversifié, il est omnivore. De plus, l’anatomie et la physiologie de son système digestif présentent des similarités suffisamment importantes avec ceux de l’être humain pour qu’une extrapolation des résultats obtenus soit envisagée. A tel point que l’Organisation des Nations Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture (Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO) recommande les études chez l’homme, le porc ou le rat pour étudier la qualité des protéines. Notre projet s’inscrit complètement dans ce cadre. Nous utiliserons ainsi des rats en croissance comme modèle de l'enfant en croissance.

Le premier des trois porcs reste sous anesthésie générale jusqu'à quatre heures, le temps que quatre opérateurs s'exercent à poser des cathéters dans une à trois veines ou artères chacun. Ces 3 porcs vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Le projet se présente comme un progrès de raffinement au sens de la directive 2010/63/UE, avec une anesthésie plus courte et un risque infectieux réduit, et le porteur décrit la pose échoguidée comme "très peu invasive" et les prélèvements suivants comme "totalement indolores". Le premier porc est tué à la fin de l'intervention parce que de nombreux vaisseaux y ont été cathétérisés, que l'opération a duré et que l'asepsie n'y est pas complètement maîtrisée, les deux autres au terme de trois semaines, leurs muscles, foie et reins pouvant être récoltés.

Objectifs

Dans le cadre de la directive 2010/63/UE relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques, retranscrit en droit français par le décret no 2013-118 du 1er février 2013, le raffinement des techniques utilisées en expérimentation animale est souligné. Le but de ce projet est d'améliorer la technique de pose de cathéter veineux central ainsi que d'autres voies d'accès sanguines sur 3 porcs, grâce à un appareil d'échographie, pour réaliser par la suite des études de cinétique tout en minimisant au maximum la souffrance pour les animaux. De plus ce projet permettra de former des opérateurs à cette nouvelle technique (4 opérateurs) La 2e partie de ce projet permettra de vérifier le bon maintien des cathéters et de réutiliser deux animaux pour réaliser une cinétique plasmatique comprenant une association d'antibiotiques classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Cependant les posologies actuelles ne sont pas optimales pour avoir un traitement le plus efficace possible. Cette 2e procédure permettra ainsi de compléter les données déjà obtenues lors d'une précédente saisine afin d’améliorer l’analyse des résultats. Cette 2e procédure permet donc d'optimiser l'usage de 2 de ces 3 porcs, suite à la formation sur la pose des cathéters, par la mise en place d'une cinétique de prélèvement sanguin. La répétition de ces prélèvements confirmera la fonctionnalité des cathéters et le bon maintien des bandages grâce à une évaluation à moyen et long terme.

Bénéfices attendus

Les bénéfices de la mise en place de cette nouvelle technique de cathéter central sont multiples : - réduction de la durée d'anesthésie des animaux (environ 30-45min contre plus de 2h avec la technique chirurgicale) - diminution du risque infectieux car il n'y a pas d'ouverture chirurgicale, le seul geste étant le passage de l'aiguille et du cathéter au niveau du cou. Celui-ci n'étant pas fixé au vaisseau comme lors de la technique précédente, il peut être retiré facilement en cas d'infection. Amélioration globale du bien-être des animaux grâce aux points précédents. Concernant les prélèvements sanguins de l'association d'antibiotique, les données récoltées permettront par la suite de proposer une posologie plus adaptée lorsque le recours à cette association d’antibiotique est nécessaire en élevage agricole.

Procédures

Pour le premier porc, une anesthésie générale sera effectuée afin d'effectuer l'ensemble des poses de cathéter sur chaque site recherché. La durée dépendra du temps d'apprentissage de chaque intervenant en fonction de leur maitrise et de leur expérience mais ne dépassera pas 4 heures. Les 2 porcs restant ayant reçu une pose de cathéter central au niveau de la veine jugulaire externe auront une anesthésie générale d'une durée moyenne de 30-45 min. Le placement du cathéter central de façon écho-guidée, permet de réduire la durée de l'anesthésie et de minimiser le risque infectieux. Cette procédure peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le cathéter posé, les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière, et auront lieu sur une période de 56h. Puis les porcs seront gardés au maximum 2 semaines afin d'évaluer quotidiennement la fonctionnalité des cathéters. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes. Les animaux seront hébergés durant les deux semaines de prélèvement dans une salle commune avec box individuel disposant de séparation ouverte favorisant les relations sensorielles (contact visuel, contact olfactif et tactile groin à groin) entre chaque animal tout en évitant d’abimer ou détériorer les cathéters.

Impact sur les animaux

La procédure de pose de cathéter sera réalisée sous anesthésie générale et avec des conditions d'asepsie stricte. Une fois le cathéter posé les prélèvements de sang et l'entretien des cathéters seront totalement indolores et donc non générateurs de stress. Il n'est pas attendu d'effet indésirable sauf un éventuel risque d'infection en cas d'erreur d'asepsie et/ou de mauvais entretien des cathéters (risque très faible). Pour éviter tout problèmes respiratoires durant l'anesthésie générale, un contrôle permanent sera effectué par un assistant expérimenté et complété par un monitoring respiratoire. Un tapis chauffant est associé durant l'ensemble des actes chirurgicaux afin de maintenir la température corporelle de l'animal. L'association d'antibiotique utilisée sera une spécialité vétérinaire disponible sur le marché et la dose sera conforme à ce qui est indiquée dans la notice de ce médicament, donc sans effet toxique attendu.

Devenir

Le premier porc sera mis à mort lors de la fin de l'intervention chirurgicale, car beaucoup de vaisseaux sanguins ont été cathétérisé, que l’intervention a été longue, sans une complète maitrise de l’asepsie. Les deux autres porcs seront mis à mort à l’issue des 3 semaines d’expérimentation dans des conditions éthiques, et des tissus d’intérêt (muscle, foie reins) pourront être récoltés.

Remplacement

Un entrainement et une formation avec un expérimentateur aguerri à la technique avec échographe a déjà été effectué pour 2 opérateurs, et d'autres entrainements sur des mannequins/fantômes sont prévus pour maintenir le geste de l'échographe lors de la pose de cathéter. Cependant, il est nécessaire de pratiquer cette technique in vivo sur un faible nombre d'animaux afin d'asseoir les gestes techniques et évaluer l'efficacité de cette méthode tout en maintenant et maitrisant les règles sur poste chirurgicale : asepsie, anesthésie et d'analgésie. De plus la maitrise des bandages ne peut se réaliser que sur animaux vivant. Ce contrôle nécessite une supervision des fixations du bandage sans en gêner l'ensemble de ses mouvements à court terme puis long terme par l'augmentation de la masse corporelle de l'animal. La durabilité de l'ensemble de ces gestes doit être contrôler et évaluer à moyen et long terme. La réalisation de ces contrôles servira à la réalisation d'une cinétique plasmatique d'une combinaison d'antibiotique, procédure qui ne peut pas être remplacée par des méthodes in vitro.

Réduction

Le nombre minimal d'animaux (3 porcs) a été défini pour permettre une manipulation de l'ensemble des opérateurs (4 opérateurs, entre une et 3 veines et ou artères par opérateur). Concernant la cinétique plasmatique, le nombre d'animaux est faible mais complète des données déjà générées. De plus après administration intraveineuse, la variabilité inter-animale est bien moindre que par voie extravasculaire et un nombre suffisant de prélèvements dans le temps seront réalisés. Il n'y aura pas de statistiques réalisées les cinétiques étant descriptives.

Raffinement

Les animaux recevront une pré-anesthésie en intramusculaire puis anesthésie gazeuse initiée avec un masque puis relayée par intubation intratrachéale. Utilisation d'un anesthésique local au niveau du point d'insertion cutané des cathéters. La pose de cathéter sous échographie est très peu invasive et l'ensemble des anesthésiants ont un effet analgésique suffisant pour ce type de procédure. Un anti-inflammatoire sera utilisé en cas de manifestation de douleur de l'animal après la pose des cathéters. Les porcs seront hébergés ensemble lors de la phase d'acclimatation (5-7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d'arrachement. Cependant, les barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : jouets à mâcher en caoutchouc et jouets à mâcher suspendus (de type disque en caoutchouc, chaine) sur support amovible. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat qui sera vérifié régulièrement et changé s'il est trop souillé. Un suivi-post anesthésie individuel des animaux sera effectué. Les injections et prises de sang seront indolores grâce à la pose des cathéters. Des sessions d’interactions positives sont régulièrement effectuées lors des prélèvements sanguins par des caresses et grattages, ce qui permet d’améliorer le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Il s'agit de l'espèce cible utilisée au laboratoire pour les études de cinétique plasmatique. Les porcs auront un stade de 60 jours correspondant à un poid de 20kg à leur arrivée. Les porcs de ce poids sont généralement utilisé dans nos projets de cinétiques. De plus à ce stade, les animaux sont plus facilement manipulables, permettant d’assurer la sécurité des animaux et des opérateurs.