Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
Etude de nouveaux médicaments dans le traitement des infections par des bactéries résistantes aux antibiotiques
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
Une partie des souris utilisées est génétiquement déficiente pour une réponse immunitaire, ce qui permet de mesurer l'action des molécules testées sur un organisme privé de cette défense. 8 455 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement d'organes, aucune ne pouvant être réutilisée après avoir reçu des bactéries ou des molécules. Jusqu'à 3 370 d'entre elles subissent une instillation dans chaque narine sous anesthésie générale, avec un risque d'arrêt cardiaque si le liquide atteint les poumons, ou un gavage pouvant blesser l'œsophage, 2 240 reçoivent jusqu'à trois injections en vingt-quatre heures et 1 040 un prélèvement de fèces quotidien pendant quatorze jours. Le porteur écrit que la souris présente une "remarquable similitude (99%)" avec le génome humain, et que le modèle insecte, sur lequel ces molécules ont déjà été testées, ne suffit pas pour une validation préclinique.
Objectifs
Les bactéries résistantes aux antibiotiques représentent l'une des plus grandes menaces de ce siècle. Il est impératif d’une part de protéger les antibiotiques actuels et d’autre part d’accélérer la découverte de nouveaux antibiotiques. Notre projet vise à caractériser de nouveaux antimicrobiens ciblant un nouveau mécanisme d’action, par une approche multidisciplinaire alliant recherche fondamentale et translationnelle. Notre laboratoire a identifié et caractérisé une protéine bactérienne comme une nouvelle cible thérapeutique dans la lutte contre les infections bactériennes. L’objectif du projet est de caractériser de nouveaux antimicrobiens en utilisant cette protéine comme cible moléculaire. Cette approche constitue une nouvelle voie thérapeutique puisque contrairement à la plupart des antibiotiques actuels, nous avons identifié des molécules capables de cibler des protéines importantes spécifiquement pour les bactéries pathogènes au cours d’une infection. Cette approche devrait permettre de préserver la grande majorité des bactéries non pathogènes présentes normalement au niveau de notre intestin, et ainsi de perturber le moins possible l’équilibre de notre microbiote. Un criblage ciblé de 5 millions de composés chimiques a permis la sélection de 105 inhibiteurs potentiels ciblant spécifiquement la fonction de notre protéine bactérienne ciblée. Des études préliminaires ont été menées pour déterminer l'efficacité et la toxicité de ces inhibiteurs sur des modèles in vitro, sur cellules eucaryotes et dans des modèles d’infection chez l’insecte et la souris. Toutes ces étapes ont permis d’identifier un candidat médicament prometteur. Ce candidat a été ensuite modifié chimiquement pour obtenir 5 molécules optimisées plus solubles et correspondant à des critères chimiques plus adaptés pour effectuer des tests physiologiques. Ces 5 molécules améliorées doivent désormais être testés in vivo chez la souris pour valider leur efficacité contre des bactéries pathogènes présentant un intérêt thérapeutique élevé. À la fin du projet, nous visons à obtenir au moins une molécule candidate préclinique avec un potentiel thérapeutique élevé. Ce projet répond donc à un besoin médical et sociétal et devrait permettre de trouver des alternatives aux antibiotiques actuels pour lutter contre les phénomènes d’antibiorésistance.
Bénéfices attendus
Nous proposons d'utiliser un modèle mammifère pour valider l'efficacité et la toxicité des candidats médicaments que nous avons préalablement identifiés. Sur la base de nos résultats préliminaires très prometteurs, notre objectif est de tester l'efficacité de ces inhibiteurs sur des bactéries pathogènes présentant un intérêt thérapeutique élevé et de valider l'innocuité des molécules vis-à-vis de l'hôte. Nous visons à obtenir des résultats robustes qui aboutiront à au moins une molécule candidate préclinique avec un potentiel thérapeutique élevé. Ce projet répond à un besoin médical et sociétal et devrait permettre de trouver des alternatives aux antibiotiques actuels pour lutter contre les phénomènes d'antibiorésistance.
Procédures
Interventions : Prélèvement de fécès : 1 fois par jour sur 14 jours, durée des prélèvements : 5 min (1040 souris). Instillation nasale dans chaque narine après anesthésie générale, durée de l'intervention 10 à 20 min (Nombre total de souris peut varier selon si cette méthode d’infection est conservée, nombre maximum : 3370 souris). Injection en vigile (3 injections maximum sur 24h), durée de l'intervention 1 à 5 min (nombre maximum : 2240 souris). Imagerie in vivo sous anesthésie générale, durée de l’intervention 20 à 30 min (274 souris). Gavage : contention de l’animal pendant 1 à 2 minutes (Nombre total de souris peut varier selon si cette méthode d’administration est conservée, nombre maximum : 3370 souris). Les méthodes d’anesthésies sont identiques pour chaque procédure et voie d’administration. Pour l’anesthésie par inhalation d’isoflurane, cela nécessite une contention de l’animal pendant 1 à 2 minutes.
Impact sur les animaux
Les infections bactériennes sont sublétales et peuvent entrainer des effets indésirables sur les souris, tels que perte transitoire de poids, tremblements ou défaut de locomotion pendant tout le temps de la procédure. La toxicité des nouveaux candidats médicaments sera étudiée dans la procédure 1 du projet, il est possible qu’ils aient un impact sur la santé de la souris tels que perte transitoire de poids, tremblements ou défaut de locomotion pendant tout le temps de la procédure. Aucun effet n’est attendu sur la texture des selles (diarrhée…). Les voies d’administration des molécules seront par instillation intranasale, par gavage (per os), par injection intrapéritonéale et intraveineuse dans le sinus rétro-orbitaire. Les injections peuvent engendrer une douleur liée à la piqûre et un stress. Les animaux pourront subir un stress transitoire pour la contention pour les injections IP et le gavage bien que le geste ne dure que quelques secondes car maitrisé. Les injections à l'œil peuvent engendrer une douleur liée à la piqûre et un stress. Les instillations nasales peuvent éventuellement présenter un risque d’arrêt cardiaque si le liquide arrive dans les poumons. Le gavage peut entrainer un risque de traumatisme de l’œsophage ou une fausse route. Pour les prélèvements de fèces et les pesées, les animaux pourront subir un stress transitoire de quelques minutes dans le pot ou sur la balance. Pour la prise de température les animaux pourront subir un stress transitoire de quelques secondes pour la contention et la gêne due au thermomètre rectal.
Devenir
Les souris ayant reçu des bactéries ou des molécules ne peuvent pas être réutilisées et seront euthanasiées à la fin de chaque protocole pour prélèvement d'organes.
Remplacement
Notre projet se base sur de nombreux résultats préliminaires qui ont permis de valider l'innocuité des molécules et leur efficacité sur des modèles in vitro et sur un modèle in vivo d'insectes. Toutes ces étapes préalables permettent de réduire le nombre de souris nécessaires pour valider l'efficacité et la toxicité des médicaments candidats les plus prometteurs. Ce projet vise à obtenir de nouveaux médicaments qui pourraient être utilisés pour des études précliniques. En raison de son application en thérapeutique humaine, les données doivent obligatoirement être validées dans un modèle mammifère d'infection.
Réduction
En plus de nos résultats préliminaires in vitro et in vivo chez l’insecte, une étude précédente a déjà permis de déterminer les bactéries d’intérêt et les paramètres optimums d’inoculation des bactéries chez l’animal. Ils ont permis d’identifier 1 candidat médicament. Des analogues de ce candidat médicament ont été synthétisés chimiquement ce qui a permis d’obtenir une famille de ce candidat médicament dont 5 dérivés ont été retenus pour être testés dans la présente DAP. Les conditions optimales déterminées à partir de l’étude précédente sont exploitées dans cette présente étude pour analyser l’effet antimicrobien des 5 nouveaux candidats pendant l’infection pour l’efficacité simple ou combinée des molécules contre 3 pathogènes d’intérêt médical. Le meilleur candidat sera testé pour sa spécificité. Le nombre d’animaux a été calculé grâce à une estimation de taille d’échantillon adaptée au plus juste pour permettre une évaluation de l’innocuité des molécules et leur efficacité. Le nombre total de souris nécessaires à cette étude est de 8455.
Raffinement
Le protocole expérimental préconise l’anesthésie des animaux pour limiter la douleur. D’autre part, l'état de santé des souris sera contrôlé quotidiennement pendant toute la durée de la procédure à l'aide d'une grille de score. Cela permettra de décider d’une euthanasie prématurée en cas de comportements anormaux des animaux suite à l’infection traduisant un mal être. Les marqueurs classiques de la santé animale seront surveillés, tels que le poids, le comportement général, la récupération et des signes de détresse (animal prostré, poil hirsute…). Les animaux seront hébergés dans les conditions standard d’habitat avec enrichissement comprenant des maisons en carton, des nids composés de lanières de papier ou des carrés de cotons, des bâtons de bois et des hamacs surtout pour les cages de mâles où il y a plus de compétitivité et un besoin d’isolement plus important. Les animaux seront regroupés à plusieurs par cage pour respecter le caractère social des souris.
Choix des espèces
La souris, avec sa remarquable similitude (99%) avec le génome humain, est une espèce de référence et un modèle largement utilisé dans le domaine de la Recherche et Développement pharmaceutique. Les souris développent naturellement des pathologies qui imitent les maladies humaines. Dans ce projet la seule utilisation du modèle insecte in vivo n’est pas suffisante pour la sélection de molécules et pour une validation préclinique de cibles. D’une part, tous les pathogènes ne peuvent pas être testés chez l’insecte, d’autre part, ce modèle est limité de par son immunité (uniquement innée), et enfin, pour toute validation de molécules d’intérêt biomédical, un modèle mammifère est nécessaire. L’utilisation du modèle souris est nécessaire pour notre projet et le plus opportun car les données préliminaires menant à ce projet ont été validées à l'aide de modèles murins. L’utilisation d’animaux déficients pour la réponse immunitaire de stress nitrique (iNOS synthase) permet d’étudier la spécificité des candidats médicaments vis-à-vis du système immunitaire de l’hôte. Cette étude est indispensable pour connaitre et, éventuellement, pouvoir limiter les effets non spécifiques des médicaments et permettre un traitement ciblé au site d’infection. Des souris âgées de 6-8 semaines sont utilisées pour le projet. L’âge des souris, après le sevrage, assurera la présence d’un microbiote et d’une immunité développée.
Analyse des mécanismes de colonisation et de dissémination de Enterococcus faecalis
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
1 066 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 736 dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré et 20 sous anesthésie sans réveil. 576 d'entre elles reçoivent un antibiotique par injection trois jours de suite, puis un gavage quotidien pendant vingt-cinq jours, avec dix pesées et dix prélèvements de fèces sur la même période. L'objectif est de comprendre comment un entérocoque du microbiote intestinal prolifère et franchit la barrière intestinale, avec l'espoir de limiter à terme l'usage des antibiotiques en santé humaine et animale. Le porteur affirme qu'aucune autre approche ne permet aujourd'hui de "mimer" ces interactions et qualifie l'utilisation d'animaux vivants d'"outil essentiel".
Objectifs
Le microbiote intestinal forme un écosystème en équilibre composé de plusieurs milliards de bactéries représentant des milliers d’espèces. Si son effet bénéfique en santé humaine a été démontré, il est également considéré comme un réservoir de pathogènes opportunistes souvent résistants aux antibiotiques. Par exemple, les entérocoques sont des bactéries inoffensives du tractus digestif de l’être humain et des animaux. Bien qu’habituellement inoffensives chez l’être humain en bonne santé, certaines souches d’entérocoques sont à l'origine d'infections opportunistes chez des patients fragilisés. Nous cherchons à comprendre les mécanismes qui permettent aux entérocoques de proliférer au niveau intestinal et de disséminer dans l’organisme après avoir franchi la barrière intestinale. L’ensemble de ces recherches vise à générer des connaissances pour développer de nouvelles stratégies pour contrôler les agents pathogènes multi-résistants. L’objet de cette demande vise à caractériser les mécanismes par lesquels un pathogène opportuniste réussit à proliférer au niveau intestinal et à se répandre dans l’organisme après avoir franchi la barrière intestinale. Nous utilisons en première intention des approches de microbiologie classique sur la bactérie pathogène et des modèles cellulaires simplifiés. Le cas échéant nous avons besoin d’analyser les mécanismes l’infection de la bactérie d’intérêt dans un modèle complexe prenant en compte les interactions entre cette bactérie, l’organisme et le microbiote intestinal. Nos études reposent sur une modulation du microbiote intestinal en jouant sur sa composition à la suite d’un traitement antibiotique, et du système immunitaire de l’organisme en jouant sur son efficacité. Elles reposent également sur des analyses du pathogène en recherchant ce qui lui est nécessaire pour infecter et survivre dans l’organisme.
Bénéfices attendus
Une majorité des infections humaines est causée par des pathogènes multirésistants. La compréhension des mécanimes à l’origine de ces infections est un défi majeur. L’ambition de notre projet de recherche est de produire de nouvelles connaissances fondamentales afin d'améliorer notre compréhension des mécanismes qui permettent aux bactéries pathogènes présents dans le microbiote intestinal de causer une maladie. Nous nous intéressons en particulier à un entérocoque pathogène mais nous souhaitons tirer parti de notre savoir-faire pour renforcer la barrière contre d'autres pathogènes résistants aux antibiotiques. Ce projet représente donc un fort potentiel pour générer des connaissances permettant de développer de nouvelles stratégies préventives, thérapeutiques et de diagnostic contre ces agents pathogènes multirésistants, afin de limiter à terme l'utilisation d'antibiotiques en santé humaine et animale. Les bénéfices du projet seront i) de fournir des bactéries commensales qui pourront être utilisées pour permettre un retour à l’équilibre du microbiote intestinal chez les individus présentant un déséquilibre par exemple chez les personnes fragilisées ou âgées et ii) de fournir des gènes présents chez les bactéries multirésistantes pour proposer de les cibler et de diminuer leur pouvoir pathogène.
Procédures
Les interventions soumises aux animaux sont les suivantes : - 1066 souris vigiles seront pesées au moins une fois. Parmi elles, 576 souris seront pesées 10 fois pendant 25 jours ; 460 seront pesées, soit deux fois sur une période de 72h maximum soit 9 fois sur une période de 21 jours. - 576 souris vigiles recevront une injection (durée < 1 minute), 1 fois par jour pendant 3 jours consécutifs, et un gavage 1 fois par jour, pendant 25 jours, (durée < 1 minute). - Les fèces seront prélevées sur 10 fois sur 576 souris vigiles sur une période de 25 jours. - 20 souris vigiles recevront deux injections < 1 minute - 10 souris vigiles recevront une injection < 1 minute - 460 souris anesthésiées recevront une à quatre injections, (durée < 1 minute), et un gavage, 1 fois (durée < 1 minute)
Impact sur les animaux
Les effets indésirables de l’anesthésie pourraient être l’hypothermie et l’abolition des réflexes comme pour avaler ou cligner des yeux. Les injections ainsi que la collecte de sang sont à l’origine d’une douleur peu intense et localisée au point d’injection. La fréquence des gavages et les prélèvements de fèces occasionnent un stress léger dû à la contention ou à l’isolement de la souris dans un pot le temps du prélèvement. L’utilisation de l’antibiotique pendant trois jours génère un inconfort digestif qui disparaitra après l’arrêt du traitement (pas de diarrhée constatée à l’issue du traitement avec cet antibiotique).
Devenir
Euthanasie pour analyses sur organes post-mortem
Remplacement
Les approches expérimentales chez la souris permettent d’intégrer la complexité des interactions entre le microbiote intestinal, l’organisme et le pathogène. A ce jour, aucune autre approche n’est disponible pour remplacer ce type de modèle et « mimer » ces interactions. Les expériences réalisées in vitro et dans les modèles cellulaires bien que complémentaires à cette étude ne pourront remplacer un modèle intégrant la complexité des interactions entre les cellules de l’organisme, le pathogène opportuniste et le microbiote. Il permet également d’intégrer la complexité des interactions entre organes et au niveau cellulaire et métabolique et immunologique. L’utilisation d’animaux vivants est par conséquent un outil essentiel à la caractérisation des mécanismes moléculaires pour la découverte de nouveaux antimicrobiens.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux, nous avons estimé le nombre d’individus à utiliser par groupe sur la base de nos précédents travaux et de la littérature. Dans les deux modèles d’infection que nous proposons d’utiliser, notre critère de jugement est lié à la quantité de bactéries présentes dans l’organisme. Nous avons évalué que le nombre total d’animaux par groupe nécessaire est égale à 32 et 20 pour obtenir des résultats significatifs.
Raffinement
Nous veillerons à ce que la réalisation de ce projet soit conforme aux exigences de raffinement liées à l’expérimentation animale. Les souris seront hébergées en petit nombre. Elles seront hébergées par 2 à 4. Les souris bénéficieront d’un enrichissement de leur environnement avec du papier cellulose, des maisons en carton et des bâtons à ronger (pour les procédures dont la durée > 48h) dans chaque cage car il diminue le stress de l'animal et facilite la thermorégulation de l'animal. Tout au long des procédures, les souris seront pesées et examinées régulièrement pour détecter des signes de détresse (changements dans la respiration, poil rêche comportement inhabituel, posture voûtée, perte de poids). Le temps de manipulation des souris vigiles sera minimisé au maximum afin de limiter le stress et l’angoisse des souris. Les gavages seront réalisés sur souris vigiles pour éviter les fausses routes et réalisés avec un volume réduit et des canules de gavage fines et courtes bien adaptées au modèle murin et à la taille de l’animal. Les gavages seront réalisés par la même personne, formée à cette technique, tout du long du protocole pour limiter le stress des animaux. Du gel oculaire sera déposé pour pallier aux effets de l’anesthésie. Le jour des prélèvements d’organes, les souris seront manipulées à distance des cages où seront hébergées les autres souris en attente d’être manipulées. Des points limites ont été définis.
Choix des espèces
Le modèle murin présente, en plus de qualités propres en terme d'expérimentation, plusieurs avantages pour l’étude des infections par des bactéries pathogènes car les pathologies sont similaires à celles que l’on peut observer chez l’être humain. Les différentes bactéries pathogènes étudiées sont capables de coloniser le tractus gastro-intestinal des souris, de proliférer et de disséminer via la circulation sanguine à la suite d’une rupture de l’équilibre du microbiote intestinal post-antibiotique comme cela est observé chez l’être humain. Dans cette étude conformément à nos travaux antérieurs, des souris « jeunes adultes mâles et femelles » âgées au minimum de 6 semaines seront donc utilisées. A cet âge, le microbiote intestinal est installé et le système immunitaire est fonctionnel. Leur poids devra être supérieur ou égal à 18 g.
Génotypage et identification de rongeurs génétiquement altérés
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Rats : 2800
Triés selon leur génotype, les rongeurs qui ne correspondent pas au projet visé sont tués dès le sevrage quand aucune autre utilisation n'est trouvée. 40 000 souris et 2 800 rats vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Entre le cinquième et le douzième jour de vie, chaque animal est immobilisé pour un tatouage par perforation des phalanges ou des coussinets et pour l'amputation de l'extrémité de la queue, geste de cinq secondes qui peut entraîner un saignement, une infection, ou le rejet du nouveau-né par sa mère. Le porteur annonce que 500 rats non transgéniques seront proposés à l'adoption, sur les 42 800 rongeurs concernés.
Objectifs
La recherche fondamentale, dans de nombreux domaines, nécessite encore l’utilisation d’animaux pour des sujets d’étude requérant l’observation d’interactions entres les organes et systèmes vivants. L'objectif de cette demande est d’identifier et de déterminer l'ensemble des caractères génétiques d’animaux génétiquement modifiés ou altérés. Ces animaux sont élevés à des fins scientifiques, suite à des demandes d’établissements externes pour réaliser leurs études. Ce projet décrit l’identification et le génotypage de souris et rats transgénique dans le but de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation et les reconnaitre individuellement - sélectionner les animaux reproducteurs et les identifier individuellement - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements ou de tissus pour des études hors du vivant.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de ce projet sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt. L’identification par tatouage permet : - d’identifier individuellement les animaux, - d’identifier les animaux de manière permanente, - d’éviter le recours à une méthode d'identification plus invasive. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables,- de minimiser les risques de contaminations entre échantillons, - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - Le tatouage par perforation des phalanges et/ou des coussinets : réalisé une fois, durée d'une minute maximum - La biopsie de queue qui consiste en l’amputation de l’extrémité de la queue : réalisée une fois, durée de 5 secondes. Ces deux gestes provoquent une légère douleur. L’animal est maintenu en contention pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure.
Impact sur les animaux
La procédure de génotypage décrite dans cette DAP est composée de deux actes techniques invasifs : - le tatouage au niveau des phalanges et/ou des coussinets - la biopsie de queue, qui consiste en un prélèvement de l’extrémité de la queue. Ces deux gestes provoquent une légère douleur. L’animal est maintenu en contention sécuritaire pendant les deux actes et donc tout au long de la procédure ce qui est une source de stress. Dans certains cas, très rares, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : - Saignement - Rejet du nouveau-né par la mère - Infection au niveau de la queue
Devenir
Le devenir des animaux diffère ensuite selon les résultats du génotypage : a/ ils sont sélectionnés pour un projet, pour la formation ou pour le maintien des compétences (inclus dans d'autres DAP), b/ ils sont conservés pour l’entretien des colonies, c/ ils sont mis à mort pour prélèvements de tissus post mortem, d/ ils sont mis à mort dès sevrage si leurs caractéristiques ne répondent pas aux besoin du projet et si aucune autre utilisation n’est possible.
Remplacement
La recherche fondamentale, dans de nombreux domaines, nécessite encore l’utilisation d’animaux pour des sujets d’étude requérant l’observation d’interactions complexes et fines entres les organes et systèmes vivants. A ce jour, les prélèvements salivaires et pileux pour génotypage ne sont pas suffisamment fiables sur les équipements robotisés. Il n’existe donc pas d’autres méthodes aussi performantes que les tatouages et la biopsie de queue. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de recommencer à nouveau les gestes (prélèvement et tatouage). Il est donc indispensable de recourir à une méthode de génotypage fiable. Une erreur de génotypage se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : - une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement contraire à la réduction, ; - des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement).
Réduction
Le responsable de l’établissement établi les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de ne produire que les animaux nécessaires et éviter des surnuméraires non utilisés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’établissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté et formé. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel adapté permettant de limiter les infections, d’effectuer un geste rapide et précis tout en respectant les conditions d'aspesie. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Les cages y sont amenées les unes après les autres afin de réduire autant que possible le stress des animaux. Enfin, dès que la procédure est terminée, les animaux sont remis en présence de leur mère dans des cages collectives enrichies : maison rouge, nid... et observés quotidiennement. De plus, des mesures précoces sont mises en place au sein de l'animalerie pour tous les rongeurs pour s'assurer du bien-être des animaux tout au long de leur vie. Dans le cas de rats non transgéniques, ils seront proposés à l’adoption (particulier ou association spécialisée).
Choix des espèces
Le choix de la souris et du rat comme modèle d’expérimentation se justifie par son utilisation très fréquente dans le milieu scientifique, notamment dans la recherche fondamentale. Il se justifie également par la connaissance approfondie de son génome,ses similitudes avec le génome humain et le grand nombre de pathologies humaines qu'il est possible de modéliser. Pour toutes les lignées, les rongeurs sont identifiés et génotypés entre 5 et 12 jours. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables.
Méthode de génotypage invasif pour l’élevage de modèles de souris transgénique
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système urogénital
84 000 souris vont être utilisées sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, pour un projet dont l'objet unique est le génotypage des lignées transgéniques élevées par le laboratoire. À trois à six jours de vie, chaque souriceau est immobilisé moins de trois minutes et l'extrémité de sa queue est coupée, un second prélèvement pouvant être fait à l'oreille avec une pince emporte-pièce. Le porteur reconnaît un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme, et indique qu'une méthode de génotypage sur le poil est à l'essai. Les souris ne portant pas le génotype recherché servent pour partie à l'apprentissage de la contention avant d'être tuées, les autres partent vers les projets de recherche du laboratoire ou vers le renouvellement des accouplements.
Objectifs
Les projets de recherche du laboratoire impliquent l'utilisation de plusieurs lignées de souris transgéniques qui nécessitent un élevage pour augmenter les effectifs de souris dont le génotype est adapté aux protocoles mis en place. Nous hébergeons et produisons environ 30 lignées différentes de souris génétiquement modifiées avec la nécessité parfois de créer de nouveaux modèles comme par exemple, des croisements de deux lignées génétiquement modifiées existantes. Le génotypage est une étape indispensable au bon déroulé des projets du laboratoire et doivent être réalisés précocément pour la mise en place ultérieure des protocoles expérimentaux.
Bénéfices attendus
Les recherches menées à l'unité grâce à l’utilisation d’animaux transgéniques ont des objectifs multiples : - accroitre les connaissances sur les mécanismes conduisant aux maladies rénales - développer des traitements, des outils et des approches plus efficaces contre l'insuffisance rénale - étudier la génétique des maladies rénales rares héréditaires et acquises - comprendre les mécanismes de formation des calculs rénaux. Ces thématiques sont d'une importance cruciale en matière de santé publique. Par ailleurs, la méthode utilisée pour la caractérisation du génome permet de sélectionner les animaux d’intérêts et ainsi constituer des groupes expérimentaux stables de manière précoce.
Procédures
Une contention de moins de 3 minutes pour la biopsie. Prélèvement d'une petite partie distale de la queue . Et si besoin d'un deuxième prélèvement il sera éffectué au niveau de l'oreille avec une pince emporte pièce adapté à la souris .
Impact sur les animaux
La manipulation et la contention des souriceaux induisent un léger stress. Un risque de rejet des nouveau-nés par la mère ou de cannibalisme est possible. Le prélèvement à la queue induit une brève douleur lors du prélèvement et un saignement est possible . Eventuel infection possible au niveau du prélèvement mais reste très rare .
Devenir
Les animaux ne portant pas le génotype d'intérêt seront pour une première partie utilisés pour de l'apprentissage à la contention et l'autre partie sera euthanasiée par une méthode réglementaire . Les autres animaux portant le bon génotype seront utilisés dans les projets de recherche ou pour des renouvellement d'accouplements, l'élevage étant en continue .
Remplacement
En raison notemment de la complexité du tissu rénal qui comporte des dizaines de types cellulaires et au vu de l'état encore embryonnaire de la recherche sur les organoides, l'étude des maladies rénales requiert l'obtention de tissu rénal prélevé sur l'animal. Il n'existe pas de méthode alternative in vitro pour analyser l'évolution de la défaillance chronique progressive d'organes. Les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles pour étudier des mutations, des invalidations ou des surexpressions de gènes d'intérêt. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain , en particulier pour les étapes du développement embryonnaire.
Réduction
Le génotypage précoce des souriceaux permet de conserver uniquement les animaux avec le génotypage d’intérêt et de constituer des lots expérimentaux avant le sevrage des animaux, pour l’utilisation future dans des projets autorisés de l’unité . Dans le cadre de l'apprentissage à la contention nous utilisons une partie des animaux qui ne sont pas utilisés dans les projets de recherche. Compte-tenu de la nature du projet, aucun test statistique n’est utilisé. Le nombre d’animaux total a été calculé sur la base des productions des années antérieures. Le projet requiert l’utilisation de 84000 animaux sur une période de 5 ans en utlisant trente lignées différentes pour l'élevage.
Raffinement
Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux sont stabulés en portoirs ventilés ,dans les zones d’hébergement un contrôle de la température et de l’hygrométrie est effectué tous les jours , un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau . Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et disposent d’un enrichissement de nidification. La manipulation et les prélèvements sont effectués conformément aux bonnes pratiques vétérinaires. Un transfert d’odeurs est réalisé sur les gants de l’opérateur pour minimiser le risque de rejets des nouveaux- nés par la mère ou de cannibalisme . Une surveillance quotidienne est réalisée pour vérifier la bonne santé des animaux et les points limites définis.Une mise au point d'une autre méthode moins invasive est en cours d'essais pour du génotypage sur le poil .
Choix des espèces
Les équipes de recherche de l'unité travaillent sur des modèles souris génétiquement modifiées. Par conséquent, la plateforme animalerie est chargée de la production de ces souris et de la collecte des échantillons d’ADN (biopsie de queue) de manière précoce dans le but de caractériser le génome. Pour les besoins des activités de recherche, une identification et un génotypage précoces sont requis. Les deux interventions sont réalisées à l’âge de 3 à 6 jours post natal.
Influence de l’alimentation sur le remplacement des dents chez le cichlidé Astatoreochromis alluaudi
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système musculosquelettique
Pour mesurer la durée du cycle de remplacement des dents pharyngiennes lors d'un passage à une alimentation dure, 65 cichlidés Astatoreochromis alluaudi vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque poisson est anesthésié par balnéation puis reçoit une injection de marqueur dans l'abdomen, l'ensemble durant une dizaine de minutes, avant d'être tué en fin de projet pour que ses mâchoires soient prélevées et coupées. Les individus qui développent ensuite une hydropisie, des écailles hérissées ou un trouble de la vessie natatoire sont mis à mort par surdose d'anesthésique. Le porteur justifie le choix de cette espèce du lac Victoria par le fait qu'elle est la seule à avoir déjà fait l'objet d'études documentant cette plasticité dentaire, ce qui la rend selon lui "absolument unique" pour le projet.
Objectifs
Le but du projet est de déterminer la durée du cyle de remplacement des dents pharyngiennes chez une espèce de poissons de la famille des Cichlidés mangeur d'escargots non obligatoire afin de mieux comprendre la plasticité dentaire et élaborer des modèles de plasticité dentaire. Cette espèce possède un profil alimentaire varié. Comme beaucoup d'espèce elle possède une machoire pharygienne abritant des dents de différentes formes. En fonction de son alimentation, les dents sont remplacées et la forme des nouvelles dents change. Une alimentation constitué d'aliments durs entraine l'apparition de plus de dents en forme de molaire par exemple. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. Au cours d'un précédent projet, nous avons pu évaluer avec succès la durée du cycle de remplacement lors d'une prise alimentaire standard. Dans la présente demande, nous souhaitons afiner les résultats obtenus en réalisant une étude pour étudier le cycle de remplacement dentaire lors d'une transition alimentaire vers une alimentation dure contenant des escargots.
Bénéfices attendus
Afin d'explorer les mécanismes sous-jacents à la plasticité des modèles numériques de la réponse d’un bourgeon dentaire aux forces mécaniques liées à l’alimentation. Ce projet permettra en particulier de déterminer si le cycle de remplacement des bourgeons dentaires est modifié lors d'une transition d'une alimentation constituée essentiellement d'aliments mous vers une alimentation contenant des aliments durs. Ce projet aura des implications importantes pour notre compréhension du rôle de l'alimentation dans la mise en place des dents. Il permettra l'établissement de modèles numériques permettant d'étudier le développement dentaire.
Procédures
Les animaux seront anesthésiés individuellement par balnéation et recevront une unique injection dans l'abdomen afin d'injecter un produit qui marquera les dents et permettra de suivre les dents qui n'ont pas été remplacées et de déterminer la longueur du cycle de remplacement des dents. L'intervention durera une dizaine de minutes en incluant l'anesthésie, l'injection et le reveil.
Impact sur les animaux
Faibles. Le projet implique de réaliser, en début de protocole, des injections dans l'abdomen qui peuvent présenter dans de rares cas des séquelles. Une vigilance particulière sera donc apportée lors de la récupération des animaux après ces injections. Après ces injections, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation (hydropisie, écailles hérissées). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou de détresse seront mis à mort par surdose d'anesthésique. Pour le reste du projet, les animaux sont conservés en groupe sociaux et nourris suivant des régimes alimentaires différenciés mais équivalents à ceux qu'ils adoptent dans le milieu naturel. Les animaux présentant des signes de stress seront isolés. Un intérêt particulier sera porté sur les animaux présentant des signes de refus alimentaires ou d'amaigrissement. Ces animaux seront sortis de l'expérimentation.
Devenir
L'analyse de la forme des dents nécessite de prélever les mâchoires des animaux et de réaliser des coupes qui seront analysées au microscope. Ceci nécessite donc la mise à mort de l'ensemble des animaux utilisés dans le projet.
Remplacement
Des approches numériques existent pour l'étude du développement dentaire malheureusement elles ne sont adaptées qu'aux mammifères. Nous souhaitons développer des modèles numériques équivalents mais qui soient adaptés aux espèces que nous étudions. Pour développer ces modèles, il est nécessaire de poursuivre des études in vivo pour fournir les données nécessaires à leur élaboration. Une fois établis, ces modèles pourront être utiliser pour étudier le développement dentaire d'autres espèces de vertébrés.
Réduction
Le nombre d'animaux a été calculé pour fournir analyse statistique satisfaisante Un approche statisitique sera utilisée pour mettre en évidence d'éventuelles différences de longueur de cycle entre les dents positionnées au centre et celles positionnées en périphérie de la machoire en fonction du régime alimentaire suivi. Tous les tests du projet seront initiés en même temps ce qui permet de mutualiser les contrôles d'injections et de réduire le nombre total d'animaux nécessaires de 10 animaux.
Raffinement
L'injection dans l'abdomen en début de protocole sera réalisée sous anesthésie et les poissons seront placés dans des bacs de réveil et surveillés lors de leur sortie d'anesthésie. Par ailleurs, les Astatoreochromis sont maintenus en groupes sociaux dans des bacs qui leur permettent d'exprimer leurs comportements naturels. Afin de favoriser le bien-être des animaux, les aquariums disposent d'un substrat (sable) qui permettent aux animaux d'exprimer leur comportement fouisseur. De même, afin de limiter les possibilités d'agression par les individus dominants, de nombreuses cachettes (gouttières renversées, pots en terre) sont mises à disposition des animaux. Les animaux disposent d'une alimentation variée proche de celle de leur milieu naturel. Autant les régimes alimentaires à base de nourriture molle que ceux à base d'escargots correspondent à des régimes alimentaires que les animaux adoptent dans leurs biotopes d'origine. Les animaux nourris d'escargots reçoivent en plus au minimum un repas constitué d'aliments variés pour éviter tout risque de dénutrition ou de carence. Les animaux sont observés quotidiennement en semaine et les animaux malades ou stressés sont isolés et placés dans un environnement différent. Après l'injection dans l'abdomen, les animaux seront placés dans des bacs d'observation durant 24h pour détecter tout signe d'inflammation au site de l'injection. Les signes de déséquilibres seront observés après l'injection (gonflement, écailles hérissées), ainsi que les signes pouvant indiquer une atteinte de la vessie natatoire (flottabilité positive ou négative). Les animaux présentant des signes d'inflammation ou d'atteinte à la vessie natatoire seront mis à mort par une surdose d'anesthésique en balnéation.
Choix des espèces
En moins de 200 000 ans, une grande variété de morphologies dentaires s’est mise en place chez les espèces cichlidés des grands lacs africains à la suite de radiations adaptatives parallèles. L’Astatoreochromis alluaudi est une espèce de cichlidé du lac Victoria et des cours d’eau environnant ; chasseur d'escargot non obligatoire il possède un profil alimentaire varié. Sa mâchoire pharyngienne inférieure est particulièrement plastique et change en fonction de son alimentation. En particulier, une modification du régime alimentaire incorporant des escargots entiers provoque des changements morphologiques au niveau des dents pharyngiennes. Cette espèce est la seule à avoir fait l'objet de plusieurs études expérimentales qui ont permis de documenter ce phénomène. De ce fait, Astatoreochromis alluaudi est une espèce absolument unique pour la réalisation de ce projet. 65 animaux seront utilisés d'une longueur standard de 6 à 8 cm (soit agés environ d'un an). A cet âge, l'injection dans l'abdomen est devient simple à réaliser et les machoires restent de taille raisonnable pour réaliser l'acquisition des données d'imagerie.
Optimisation des traitements antibiotiques dans des modèles souris d’infections bactériennes
- Recherche appliquée
- Maladies infectieuses
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
320 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles reçoivent sous anesthésie une injection rétro-orbitaire de staphylocoque doré multirésistant, puis jusqu'à six injections intrapéritonéales d'antibiotiques par jour sur animal vigile, pendant deux à cinq semaines. L'infection du sang et des articulations ainsi provoquée entraîne douleur et troubles du déplacement, et les prélèvements réalisés après la mise à mort servent à compter les bactéries restantes. Sur le remplacement, le porteur écrit que les modèles cellulaires ne permettent pas d'étudier l'élimination des bactéries dans une infection générale et que le "modèle animal est indispensable" au projet.
Objectifs
Le staphylocoque doré est une bactérie responsable d'infections graves. Certaines bactéries sont dites multi-résistantes car résistantes à plusieurs familles d'antibiotiques et posent de nombreux problèmes thérapeutiques. Nous proposons une approche innovante avec l'association de deux antibiotiques qui leur permet un meilleur accès au site infecté pour traiter les infections graves à staphylocoque doré multi-résistant. Il a été identifié plusieurs combinaisons antibiotiques dont l'action est efficace en laboratoire. Ce projet vise à tester ces combinaisons d'antibiotiques dans des modèles souris d'infections sévères du sang et des articulations.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier de meilleures stratégies thérapeutiques contre les infections sévères à staphylocoque. Le projet déterminera l’efficacité de nouvelles combinaisons d'antibiotiques administrées de manière à mieux accéder directement au site de l'infection.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à une anesthésie d'une durée de 5 à 15 minutes. Tous les animaux seront soumis à une injection intraveineuse rétro-orbitaire d'une durée de 5 secondes réalisée sous anesthésie. Les animaux recevront des injections sous-cutanées d'analgésiques tous les 3 jours, soit un total de 5 à 12 injections selon les études menées (2 à 5 semaines). Les injections sous-cutanées d'une durée d'environ 5 secondes seront réalisées sur souris vigiles. Les animaux seront soumis à des injections intrapéritonéales quotidiennes d'antibiotiques au nombre de 2 ou de 6 selon l’étude menée. Les injections intrapéritonéales d'une durée d'environ 5 secondes seront réalisées sur souris vigiles.
Impact sur les animaux
Le développement des bactéries sera susceptible de générer un stress chez l’animal dans les 24h qui suivent l’inoculation. L'infection est susceptible de générer douleur et problèmes de déplacement.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue des deux procédures. Des prélèvements post-mortem seront effectués pour quantifier le nombre de bactéries et évaluer l'efficacité des différents traitement antibiotiques.
Remplacement
Les modèles cellulaires ne permettent pas l'étude de la clairance bactérienne et de l’efficacité des traitements antibiotiques dans des modèles d’infection systémique. Aussi, le modèle animal est indispensable à ce projet et permettra également de mesurer l’impact des différentes molécules à court terme sur le microbiote intestinal. Les combinaisons d’antibiotiques qui seront testées ont démontré leur efficacité dans des modèles simples de culture.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisé a été réduit au minimum en homogénéisant strictement les conditions expérimentales. Nous utilisons des animaux de même sexe et même âge obtenus chez le même fournisseur afin de limiter au maximum la variabilité expérimentale.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes sociaux, avec nourriture et eau ad libiditum, dans un environnement enrichi avec maisonnette en carton et coton compacté. Ils seront observés quotidiennement, jours fériés et week-end inclus, par les expérimentateurs, pour détecter tout signe anormal de douleur, de souffrance ou de stress et nous avons raffiné la méthodologie par l’introduction de points limites entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
La souris est un modèle animal pertinent qui permet de reproduire l'infection du sang et des articulations. Le modèle souris permet d'étudier les différents organes impliqués dans la physiopathologie de l'infection humaine. Nous utiliserons des souris juvéniles de 7 semaines car elles disposent d'un système immunitaire mature.
Prélèvements planctoniques – un inventaire de larves de poissons côtier (façade atlantique française)
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Autres poissons : 2995
Capturées au filet à plancton par des plaisanciers puis comprimées au fond de la poche pendant la remontée, la plupart des larves de poissons meurent avant même d'arriver sur le pont. Les 5 % encore vivantes sont plongées dans un flacon d'eau de mer posé sur de la glace, pour un choc hypothermique létal. 3 000 larves, dont 5 loups de mer et 2 995 individus d'autres espèces, sont tuées de cette façon sur cinq ans sans jamais reprendre conscience, pour dresser un inventaire des espèces côtières de la façade atlantique. Le porteur écrit ne définir aucun point limite puisque tous les individus sont mis à mort dès la capture, et présente la collection de référence ainsi constituée comme un "remplacement" futur qui évitera de recapturer des animaux.
Objectifs
Le projet de recherche participatif écocitoyen « Objectif Plancton » vise à étudier le plancton des côtes de la Bretagne. Ce projet à dimension régionale réunit scientifiques, plaisanciers, médiateurs scientifiques et grand public pour contribuer à la connaissance de la biodiversité marine, notamment les larves de poissons. L’objectif est d’identifier et d’impliquer les citoyens dans la collecte des données, en analysant leurs pêches. Les dernières recherches sur les larves de poissons dans cette zone datent de la fin des années 1960 et il apparaissait donc nécessaire d’actualiser ces données bien anciennes. L’objectif est de connaître la diversité des espèces des larves de poissons présentes dans cette zone marine aujourd'hui pour pouvoir détecter des changements potentiels dans le futur. Les espèces sont inventoriées et caractérisées, d’une part d’un point de vue morphologique, et d’autre part d’un point de vue génétique. Objectif Plancton permet ainsi d’élaborer un suivi spatio-temporel de ces larves de poissons et d’analyser à terme les fluctuations de ce zooplancton en lien avec le changement global en milieu côtier.
Bénéfices attendus
Nous organisons la collecte de plancton par des plaisanciers, afin d’impliquer le grand public dans la démonstration de l’importance du plancton dans le fonctionnement écologique et la diversité de l’océan. Par ailleurs, cette initiative citoyenne représente une opportunité unique d’échantillonner simultanément différents points d’un même écosystème (les scientifiques en mission ne peuvent échantillonner qu'une seule station à la fois). Après l’echantillonage deux types d’identification sont réalisés : à partir d’observations réalisées à la loupe binoculaire et avec une analyse génétique. Les larves et œufs de poissons sont déterminés, autant que possible, à l’espèce sur la base de critères morphologiques. Les spécimens sont également analysés à partir d’une identification génétique. Ainsi, une larve non-identifiée morphologiquement peut être reconnue grâce à son ADN. Une fois identifiés, les spécimens sont inventoriés et vont alimenter la collection patrimoniale. C’est la première collection d’ampleur de larves de poissons osseux marins de la façade atlantique nord-est pour cette collection. Entre 2015 et 2022 ce sont environ 1300 larves qui ont été récoltées. Ces larves correspondent à 34 espèces appartenant à 20 familles différentes. Ce projet doit se poursuivre pour permettre de documenter objectivement (protocole standardisé) les changements en cours de la composition en espèces, et identifier les effets des changements environnementaux du milieu. Les poissons marins ont une fécondité élevée (de l'ordre de 10 000 à 10 000 000 œufs par femelle) et pondent des œufs en pleine mer. Des cohortes d'œufs fécondés éclosent et passent par différents stades de durée variable. Les agents de mortalité (prédation, famine, changements environnementaux) agissent à chaque étape. Ces facteurs naturels sont les principaux facteurs qui réduisent le nombre d’individus atteignant le stade juvénile voire adulte.
Procédures
sans objet
Impact sur les animaux
Les larves de poissons prélevées meurent majoritairement sous l’effet de la pression de l'eau qui les compriment au fond du filet. Environ 5% des larves sont encore vivantes au moment de la remontée du filet, elles sont immédiatement soumises à un choc hypothermique létal (~ 3 – 5°C) en les plaçant dans un flacon d’eau de mer sur de la glace.
Devenir
L'objectif du projet est de dénombrer les poissons de chaque espèce selon leurs stades de développement. Seules les identifications basées sur des analyses morphologiques et/ou génétiques des larves de poissons sont précises, ce qui nécessite leur mise à mort. En effet, les méthodes d'analyses indirectes et non létales (ADN environnemental, photographie d'échantillons) n'offrent pas une précision suffisante pour identifier aussi précisément les larves de poissons.
Remplacement
Le projet vise à réaliser l’inventaire des larves de poissons à différents points de prélèvements sous différentes conditions. Les mesures d’analyses indirectes (ADN environnemental, photographie d’échantillons) ne permettent pas de dénombrer les individus par espèce et leur stade de développement – données essentielles pour caractériser les animaux planctoniques à suivre dans le temps. Ces spécimens collectés et sélectionnés alimentent par ailleurs des collections de références stockées pour le long terme qui sont et pourront étre étudiées sans nécessiter de recapturer des animaux (« Remplacement » futur).
Réduction
Les campagnes d’inventaire sont calibrées et programmées de manière à répondre aux besoins de l'étude. Il s’agit d’une date de prélèvement à différentes saisons (avril, juin et septembre) avec quinze prélevements par campagne, ce qui nous permet d’évaluer la qualité et la quantité de larves de poissons à différents moments de l’année. Ces trois dates de collecte sont choisies en fonction de la représentativité des larves de poissons dans le plancton selon les saisons. En général, une forte activité planctonique est observée du printemps à la fin de l’été. Pour ce projet, plusieurs zones et périodes de forte activité planctonique (avril, juin et septembre) ont été sélectionnées afin de ne pas manquer le « pic » annuel. Moins de collectes entraveraient la réalisation des objectifs définis, tandis que davantage ne serait pas utile pour atteindre les objectifs fixés. Il est important d'avoir un certain nombre de larves (ca. 600) par an pour obtenir des résultats fiables et des statistiques solides. Normalement, pour un suivi sur les larves de poissons, un filet double est utilisé pour obtenir un échantillon à des fins d’analyse, tandis qu’un deuxième sert de contrôle (et est très souvent même non analysé). Nous avons choisi de réduire notre prélèvement à un seul filet avec un seul collecteur (avec une ouverture de filet plus petite - 50 cm de diamètre - que celle qui est normalement utilisée dans les études sur les larves de poissons ≥ 60 cm). Ces filets à plancton ne prélèvent qu’une fraction pendant un temps donné (15 min à 2 nœuds). Un tel échantillon représente une quantité négligeable par rapport à l'ensemble. Le protocole est réduit dans le temps en été. En raison d'une forte densité planctonique en été, la durée d'échantillonnage est réduite à 10 minutes. C'est déjà un échantillon représentatif et cela évite que les filets soient surchargés. Sur la base des prélèvements passés, j’estime que 600 larves autonomes de poissons sont prélevées par an. Soit une estimation de 3000 larves de poissons sur 5 ans.
Raffinement
De la capture à la mort, les larves sont maintenues dans la même eau de mer (celle du lieu de capture), assurant ainsi le maintien des animaux dans des conditions physico-chimiques constantes. Après la capture, l’échantillon est immédiatement maintenu à 4 °C pour induire une hypothermie, qui représente un choc thermique létal efficace pour l’ensemble des larves de poissons. Nous ne définissons pas de point limite de souffrance/douleur, puisque dans tous les cas, la totalité des individus est mise à mort dès la capture.
Choix des espèces
L’objectif de ce projet est de connaître la biodiversité des larves de poissons présentes dans des habitats côtiers et étudier ses changements à long terme. Seule l'étude des espèces sauvages vivant dans leur habitat naturel permet d’atteindre les objectifs scientifiques fixés. Le projet vise à étudier les larves de poissons. Après le stade sac vitellin les larves de poissons deviennent autonomes. Dans les échantillons, nous observons différents stades de larves de poissons, et environ 80% d’entre elles sont autonomes. Il est plus pertinent et étique, avec moins d’impact sur la population de faire un suivi sur les larves plutôt que directmenet sur les adults. En plus de l’objectif principal qui est d’identifier la biodiversité, un suivi sur l’ichtyoplancton a été démontré comme étant un bon indicateur de la taille d’une population, mais aussi d’un écosystème sain ou stressé.
Etat sanitaire des populations d’anguilles européennes de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes) et développement d’outils non létaux d’évaluation.
- Conservation des espèces
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Les anguilles qui présentent une faible vivacité ou un comportement anormal au réveil sont tuées sur place. Vingt anguilles européennes, espèce classée en danger critique d'extinction, vont être capturées par pêche électrique et utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, puis relâchées à leur lieu de capture. Chaque individu subit sous anesthésie des mesures biométriques et trois prélèvements, mucus cutané, sang et lavement intestinal, en trois à quatre minutes. Le nombre de vingt individus, dix par an sur deux ans, repose sur l'expertise des spécialistes du projet, le porteur indiquant qu'aucune étude comparable publiée ne permettait de le calculer.
Objectifs
La population de l’anguille européenne, Anguilla anguilla, a subi un fort déclin sur l’ensemble de son aire de répartition depuis les années 1980. Il est en effet estimé que cette population a diminué de plus de 90% lors des dernières décennies. Par suite, bien que non protégée, c’est une espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008. Les causes du déclin de l’anguille sont multiples : perte et dégradation des habitats, pêche, pollution, introduction de parasites exotiques et modification des courants océaniques due aux changements climatiques. Tous ces facteurs impactent simultanément la population de l’anguille européenne, mais l’importance de leur contribution respective ne peut pas encore être déterminée. Ce projet a donc pour objectifs : 1) de décrire l’état sanitaire des sous-populations d’anguilles de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes), 2) de développer des outils innovants (non létaux) d’évaluation de cet état, objectif fondamental et essentiel pour autoriser la pérennisation des suivis à long terme sur cette espèce, et 3) de préciser l’état écologique des lagunes et des cours d’eau prévus dans le projet. Ces résultats devraient permettre de faire le lien entre l’état sanitaire des anguilles et le niveau de pressions anthropiques s’exerçant sur les habitats aquatiques continentaux afin de proposer des mesures de restauration adaptées à cette espèce et à ces habitats.
Bénéfices attendus
Les résultats devraient permettre de préciser l'état écologique des lagunes côtières et des cours d'eau prévus dans le projet (i.e. niveau de pression anthropique), et de faire le lien avec l’état sanitaire des anguilles, évalué à partir de méthodes non létales, afin de mieux comprendre les causes de son déclin, et plus généralement de la biodiversité aquatique. L'anguille étant une espèce indicatrice de la qualité du milieu aquatique, particulièrement sensible aux contaminations chimiques et aux infestations parasitaires (parasites introduits), le projet permettra de proposer des mesures pertinentes et spécifiques de gestion de cette espèce et de ses habitats, ciblées sur ces pressions anthropiques. Enfin, la démarche et les résultats obtenus dans le projet pourront être transposés à d’autres habitats similaires de Méditerranée voire même d’Europe.
Procédures
Chaque animal sera soumis à des mesures biométriques et à 3 prélèvements non létaux sous anesthésie (1 seule fois par animal) : mucus cutané, sang et lavement intestinal (durée 3 à 4 minutes maximum en tout).
Impact sur les animaux
Les nuisances ou effets indésirables attendus seront à priori assez réduits et concernent : 1) la collecte des anguilles par pêche électrique susceptible d’engendrer du stress, et 2) les prélèvements non létaux (mucus cutané, sang et lavement intestinal), effectués sous anesthésie et potentiellement susceptible d’occasionner une légère gêne au réveil des anguilles.
Devenir
Tous les animaux seront relâchés dans leur milieu d’origine au niveau de leur lieu de capture à la fin de la procédure expérimentale après leur réveil.
Remplacement
Le projet visant à décrire l’état sanitaire des sous-populations d’anguilles de Méditerranée occidentale (rivières et lagunes) et de développer des outils innovants (non létaux) d’évaluation de cet état, il n’est pas possible d’utiliser des méthodes de remplacement de cette espèce.
Réduction
Le projet prévoit de collecter, anesthésier et relâcher des individus d’une rivière en vue d’effectuer leur biométrie et de développer des outils non létaux d’évaluation de leur état sanitaire. Nous avons réduit au maximum le nombre d’individus à collecter (en tout 20 anguilles au stade jaune, 10 par an sur 2 années consécutives) pour obtenir des résultats représentatifs et fiables de l’état sanitaire/de stress des anguilles fréquentant cet habitat dans le cas de cette approche innovante. Ce nombre a été déterminé à partir de l’expertise des différents spécialistes impliqués dans le projet en l’absence d’études similaires déjà publiées qui auraient pu être utilisées pour estimer la variabilité attendue des résultats et donc pour calculer la taille minimale de l’échantillon.
Raffinement
Plusieurs mesures seront prises pour limiter l’inconfort, le stress et la souffrance des individus depuis leur collecte jusqu’à leur relâcher. Au moment de la pêche électrique, la collecte des anguilles se fera à l’aide d’une épuisette à maille suffisamment fine et souple pour ne pas les blesser, et en pratiquant des gestes précautionneux pour ne pas les stresser tout en permettant une collecte rapide. Après anesthésie, les anguilles seront toujours maintenues humides (permet la respiration cutanée qui existe chez l’anguille) et leurs yeux seront protégés contre l’exposition à la lumière directe du soleil pour les mesures biométriques et les prélèvements prévus dans le projet. Les anguilles seront ensuite surveillées jusqu’à leur réveil complet avant de les relâcher dans leur milieu d’origine. Cependant, en cas d’apparition de signes suspects au réveil (faible vivacité, comportement anormal), elles seront immédiatement euthanasiées.
Choix des espèces
Bien que non protégée, l’anguille européenne est une espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008. Parmi les multiples causes pressenties à l’origine de son déclin, la perte et la dégradation de ses habitats, notamment par les contaminations chimiques et biologiques, font l’objet des préoccupations actuelles. Dans ce contexte, il convient de faire le lien entre l’état sanitaire des anguilles et le niveau des pressions anthropiques s’exerçant sur les habitats aquatiques continentaux (lagunes et rivières) afin de proposer des mesures de restauration adaptées à cette espèce et à ces habitats. Les individus qui feront l’objet de ces prélèvements sont des anguilles au stade jaune (stade de croissance immature de l'anguille), stade adapté à notre étude car particulièrement exposé aux contaminations chimiques et biologiques en raison d’un comportement benthique et d’un séjour long dans son habitat aquatique continental.
Régénération de tissu adipeux à l’aide de matrices en polymères et d’hydrogels résorbables
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Tests réglementaires
- Toxicologie et autres tests de sécurité
Rats : 750
Cochons : 84
Deux heures d'anesthésie par mini-porc pour l'implantation, puis un suivi par IRM à un, trois, six et neuf mois et à un an : 840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Des matrices en polymères et des hydrogels leur sont implantés sous la peau ou dans une chambre d'ingénierie tissulaire, avec un prélèvement sanguin pendant la chirurgie, pour mettre au point une reconstruction du sein et de l'hypoderme destinée à remplacer implants en silicone et transferts de graisse. Le porteur annonce des risques de rejet, d'inflammation locale et de toxicité, et prévoit l'explantation ou la mise à mort selon la gravité de l'état de l'animal. Le choix des espèces tient à la ressemblance de leur peau avec la peau humaine et à leur taille, qui permet de tester plusieurs conditions sur un même individu.
Objectifs
Actuellement, les solutions cliniques pour la reconstruction des couches profondes de la peau et du sein à l'aide de tissu adipeux présentent des limitations significatives. Les procédures de transfert de graisse autologue peuvent entraîner des complications au site donneur et ne garantissent pas des résultats prévisibles. L'introduction de corps étrangers comme les implants mammaires en silicone comporte des risques potentiels pour la santé et nécessite une surveillance à long terme. Les approches de reconstruction cutanée après une atteinte profonde se concentrent sur l'utilisation de greffes de peau, négligeant l'hypoderme et limitant ainsi la reconstruction complète. Ce projet vise à développer une approche novatrice et biocompatible pour la régénération du tissu adipeux. Cette solution repose sur l'utilisation synergique d’une matrice en polymères et d'hydrogels cellularisés, offrant ainsi une alternative esthétique et fonctionnelle prometteuse pour les patient(e)s. Le premier objectif est d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels utilisés dans cette approche. Il est essentiel de s'assurer que ces matériaux ne provoquent pas de réactions indésirables et qu'ils favorisent la régénération du tissu adipeux. Utilisant un modèle animal, nous chercherons à comprendre les interactions complexes entre les adipocytes, l'hydrogel, la matrice polymère, et l'organisme hôte. Cette étape est cruciale pour optimiser la compatibilité et l'intégration des matériaux dans le corps. Nous évaluerons également la possibilité d'utiliser des cellules souches humaines dans la combinaison hydrogel/matrice, en utilisant un modèle de souris immunodéprimées. Cette approche permettra de simuler au mieux les conditions humaines et d'évaluer l'efficacité de la régénération tissulaire. Afin d’étudier l’influence des matériaux sur un modèle de rongeur qui permet de tester des matériaux de taille moyenne, le rat sera employé pour une première comparaison des différentes combinaisons. Une fois la meilleure combinaison hydrogel/matrice sélectionnée, nous réaliserons des tests sur le porc, un modèle animal plus proche de l'homme en termes de physiologie et de composition cutanée. Cette étape sera cruciale pour valider l'efficacité clinique. Ce projet est porteur d'un potentiel majeur pour l'innovation en chirurgie plastique et reconstructrice, et il pourrait révolutionner les pratiques à l'échelle mondiale.
Bénéfices attendus
Ce projet de recherche vise à déterminer les combinaisons optimales d'hydrogels et de matrices pour la régénération du tissu adipeux, avec des implications majeures à la fois sur le plan clinique et scientifique. Il offre la possibilité d'améliorer considérablement les options de reconstruction mammaire et cutanée actuellement disponibles, en limitant les inconvénients des méthodes traditionnelles et en garantissant une meilleure biocompatibilité et performance.
Procédures
Ce projet se déroule en plusieurs étapes. Après une période d'acclimatation d'au moins une semaine, tous les animaux (840 souris, 750 rats et 84 mini-porcs) seront anesthésiés par inhalation (15 minutes pour les rongeurs et 1 heure pour les mini-porcs). Pour les rats, le pelage sera tondu dans les zones d'implantation (10 secondes). Pour tous les animaux, les zones d'implantation seront désinfectées à l'aide d'un désinfectant (10 secondes). Pour la procédure ayant pour but d'évaluer la biocompatibilité des hydrogels, une injection en sous-cutanée sera effectuée (10 min, 130 souris et 130 rats). Pour obtenir un tissu adipeux vascularisé reconstruit, une combinaison de chambres d'ingénierie tissulaire (pour la reconstruction du sein, 250 souris, 250 rats, 80 porcs) ou de matrices 3D (pour la reconstruction de l'hypoderme, 250 souris, 250 rats, 24 porcs) sera associée à des hydrogels cellules ou à de la graisse (durée totale de l'anesthésie : 30 minutes par rongeur ou 2 heures par mini-porc). Pendant la chirurgie, un prélèvement sanguin sera effectué. Afin d’avoir un applicatif clinique, il est nécessaire d’évaluer si la cryopréservation des construits permet d’obtenir la même performance que des construits préparés extemporanément, de ce fait 150 souris et 130 rats seront implantées avec des construits ayant bénéficié de différentes méthodes de cryopréservation. Toutefois, la procédure appliquée à ces animaux est identique à celles expliquées précédemment. Pour les souris et les rats, un essai de survie cellulaire in vivo sera suivi longitudinalement par bioluminescence. À cette fin, les animaux seront placés sous anesthésie gazeuse (10 minutes). Pour les rats et les porcs (utilisant une chambre d'ingénierie tissulaire pour la reconstruction du sein), le suivi longitudinal de la croissance du lambeau sera effectué par IRM à 1, 3, 6, 9 mois et 1 an après l'implantation. Pour cela, les animaux seront sous anesthésie gazeuse (durée de la procédure : 30 minutes par animal).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables pouvant être constatés sont une irritation ou une inflammation locale à proximité du matériau, des risques de rejet ou de toxicité locale et systémique. Afin de limiter les risques, de nombreuses expériences in vitro ont été effectuées, ne montrant pas de signe de toxicité. De plus, des mesures sont mises en place et les animaux feront l’objet d’une vigilance quotidienne et rigoureuse pour détecter tout signe de souffrance ou d’approchement de point limite. Un contrôle du site opératoire sera réalisé lors de chaque visite quotidienne. La prise pondérale sera évaluée deux fois par semaine. Un traitement antidouleur sera administré, et si nécessaire, des mesures telles que l'explantation ou la mise à mort de l'animal seront envisagées en fonction de la gravité de son état.
Devenir
Du fait de notre protocole, nos animaux ne peuvent pas être replacés. Il est nécessaire de mettre à mort nos animaux pour réaliser nos prélèvements histologiques.
Remplacement
Nous avons employé une variété de techniques in vitro pour évaluer l'impact de nos polymères sur le destin des cellules, y compris leur survie et leur différenciation ainsi que sur l'angiogenèse en utilisant la membrane chorioallantoïque de poulet comme modèle. Toutefois, afin de déterminer pleinement les performances de nos biomatériaux en matière de régénération tissulaire, il est impératif de procéder à des essais in vivo. Ces expériences permettront de prendre en compte la complexité d'un système physiologique réel, incluant notamment les réponses inflammatoires, la formation de tissu cicatriciel, et les processus naturels de guérison. Les études in vivo nous fourniront ainsi des données cruciales pour optimiser notre technique avant de franchir l'étape des études cliniques.
Réduction
Une étude pilote sera réalisée dans un premier temps afin de vérifier que les conditions expérimentales choisies sont adéquates. Les études in vitro précédemment réalisées ont démontré l’efficacité des différents polymères résorbables quant à leur influence sur la survie et la prolifération cellulaire ainsi que sur la différenciation adipocytaire. Elles ont permis une sélection des polymères permettant le maintien des adipocytes et favorisant la néovascularisation. Elles ont également pu donner une idée du temps de résorption des polymères dans un liquide physiologique reconstitué à 37°C. Les expériences seront réalisées de manière séquentielle, ce qui permettra de limiter le nombre de répétition en fonction des résultats des groupes précédents. En fonction des résultats, les tests statistiques adéquats seront utilisés pour analyser les résultats.
Raffinement
Afin de limiter au minimum toute souffrance, stress ou angoisse des animaux, ces derniers seront hébergés selon les recommandations établies à raison de maximum 5 animaux par cage pour les souris et en hébergement unique pour les rats et les mini-pigs. Cet environnement est enrichi (balle pour le mini-pig par exemple) et dans des conditions classiques de stabulation (température régulée, cycle jour/nuit). Avant toute manipulation, les animaux seront acclimatés de 7 à 10 jours dans leur salle d’hébergement. Les animaux seront manipulés individuellement avant la mise en place de l’expérimentation et dans une pièce séparée des autres animaux afin réduire leurs stress et angoisse. Lors de l’expérimentation, les animaux seront anesthésiés avant toute procédure pouvant provoquer un stress, une angoisse ou une souffrance. Les animaux seront ensuite suivis quotidiennement, de manière à pouvoir détecter le plus rapidement possible tout signe de souffrance ou d’angoisse. En cas de souffrance (modification de l’apparence, prostration, poil hérissé, perte de poids…), un traitement analgésique sera envisagé. Des points limites adaptés pour chaque procédure seront définis avant l’expérimentation et dans le cas où ceux-ci seraient atteints ou que le traitement analgésique n’aurait pas d’effet, les animaux seront mis à mort selon la méthode définie (avec anesthésie au préalable). La mise à mort sera réalisée à distance des autres animaux.
Choix des espèces
Le porc et le rat sont des espèces appropriées pour étudier les processus de régénération de la peau car les structures anatomiques et physiologiques de leurs peaux sont celles qui ressemblent le plus à celle des humains. Le rat est un animal que nous avons fréquemment utilisé dans nos études précédentes et dont le modèle est maitrisé. De plus, notre équipe maîtrise maintenant la levée des lambeaux chez ces espèces pour nos modèles de régénération du sein. La taille du porc et du rat nous permet de tester plusieurs conditions sur un seul animal et ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Notre intérêt s’est porté sur les souris standards, immunodéprimées utilisées dans une étude de reconstruction de la peau humaine et humanisées qui permettent d’évaluer le comportement de cellules/tissus humains en présence de nos biomatériaux. Les souris sont âgées de 8 semaines et pesant 20 à 23 grammes afin que les souris aient atteint leur maturité sexuelle. Utiliser des souris matures permet d'avoir une taille adéquate pour réaliser l'implantation. Les rats adultes sont agêes de 15 semaines minimum afin d'avoir une réserve de graisse sous-cutanée suffisante pour réaliser les implantations et permettre de tester plusieurs conditions expérimentales sur un même animal. Pour les porcs, nous utiliserons deux types d'animaux : des porcs 45 à 55kg pour la reconstruction de la peau afin d’éviter d’avoir un hypoderme trop épais (car la zone à reconstruire serait trop importante et peu représentative d’un hypoderme humain) et des porcs de 70 kg pour la reconstruction du sein afin que la taille de l’animal soit compatible avec l’implantation de chambre équivalente à celle que l’on pourrait implanter chez l’humain.
Étude pilote sur l’effet de la couleur et de l’ultrastructure de la peau des ectothermes sur la thermoregulation par absorption de radiation infrarouge
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
Capturés dans des populations semi-naturelles entretenues par le laboratoire, puis acclimatés deux semaines en terrarium individuel, 10 lézards vivipares adultes vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chacun subit une seule biopsie de peau dorsale de 1,5 mm sous anesthésie locale, d'une minute environ, avant trois semaines de surveillance puis un retour dans son enclos d'origine. Le porteur anticipe un stress lié à la capture et à la manipulation, une douleur localisée et un risque d'infection. Il revendique un raffinement face à l'usage courant du domaine, qui consiste à tuer les animaux pour prélever leur peau, et affirme qu'aucune alternative non animale n'est disponible, les modèles informatiques manquant précisément des données que ce projet doit produire.
Objectifs
Ce projet a pour but de réaliser une étude pilote pour : 1. Évaluer et mettre au point une méthode pour réaliser des biopsies de la peau des lézards sans mise à mort, 2. évaluer et mettre au point les méthodes de microscopie électronique qui permettront d’analyser les échantillons prélevés et 3. évaluer la variation naturelle existante au niveau de la structure de la peau des lézards afin de développer des études futures. L’objectif de ce projet est de raffiner la procédure de prélèvement qui a pour finalité l’étude de l’adaptation des espèces au changement climatique à travers des changements de la structure et de la couleur de leur peau. Cette question fait partie d’un intense débat au sein de la communauté scientifique qui vise à prédire si et comment la coloration des espèces animales sera affectée par le changement climatique et pourrait en partie aider les espèces les populations naturelles à s’adapter à celui-ci.
Bénéfices attendus
Cette étude pilote aidera au développement des projets futurs pour comprendre l’adaptation des espèces ectothermes (c'est à dire espèces à "sang froid") au changement climatique. La coloration externe des animaux, particulièrement les mélanines - pigments qui colorent la peau des humains et de la plupart des animaux -, est supposée jouer un rôle clé dans l’efficacité d'absorption de la chaleur du soleil (radiation infra-rouge). En produisant des couleurs plus ou moins foncées, les mélanines sont supposées affecter la vitesse à laquelle les radiations solaires sont captées. Cette hypothèse est centrale pour comprendre comment la coloration peut aider les espèces à s’adapter au changement climatique et quelles seront les conséquences à moyen et long terme du changement climatique sur la biodiversité et les écosystèmes. Bien que la coloration animale soit supposée être sous sélection du réchauffement du climat, le sens de la réponse, à savoir si des températures plus chaudes favoriseraient plutôt des individus de couleur claire que foncée, est fortement débattu. Au centre de ce débat, il existe un manque de compréhension sur comment les mélanines et d’autres composantes de la peau influencent l’absorption de chaleur, ce que le projet proposé peut aider à comprendre grâce à un développement méthodologique.
Procédures
Les animaux seront soumis une seule fois à un prélèvement de la peau dorsale, par biopsie, avec anesthésie locale. La durée estimée est de 1 minute.
Impact sur les animaux
Nous estimons que la procédure pourrait entrainer un stress lié à la capture et la manipulation des animaux, une douleur légère et localisée pendant et après la biopsie de peau, et un risque d’infection à cause du prélèvement des échantillons de peau. En prévision et afin de limiter ces dommages potentiels, nous avons conçu l’étude en laissant un temps d’acclimatation pour réduire le stress (deux semaines après la capture), en minimisant la surface de peau échantillonnée (1.5 mm de diamètre), en utilisant de l’anesthésie locale durant la procédure, du matériel stérile pour la biopsie de la peau, et des soins (désinfection de la peau avant et après la biopsie et application de cicatrisant , et une période de 3 semaines pour contrôler la récupération des animaux avant de les relâcher). Ces mesures seront couplées à des stratégies de réduction du stress lors de l’hébergement des lézards dans l’animalerie avant et après la procédure (i.e., bonnes conditions d’hébergement, accès à la nourriture, l’eau, et abris).
Devenir
À la fin de l’étude et une fois leur état de santé vérifié, tous les individus seront relâchés dans leurs populations semi-naturelles d’origine.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation d’un modèle animal pour cette étude. Un modèle non-animal potentiel consisterait à utiliser des modèles informatiques pour prédire comment la structure de la peau peut changer avec différentes températures ambiantes. Cependant de tels modèles ne sont pas réalisables pour le moment, car les informations nécessaires à leur développement manquent et dépendent de la collecte de données, telles que celles qui seront obtenues grâce à la procédure proposée ici. Un autre modèle potentiel serait de collecter des échantillons de peau sur des animaux morts de cause naturelle. Cependant cette approche n’est pas faisable étant donné que la structure de la peau se dégrade rapidement après la mort et qu’elle est détruite par les méthodes de préservation communément appliquées (conservation dans l’éthanol, formol ou congélation). Bien qu’aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne puisse être appliquée, la procédure que nous proposons de tester dans notre étude pilote n’est pas la procédure communément suivie pour étudier la structure de la peau des ectothermes, qui implique de tuer les animaux avant de collecter leur peau. Nous proposons ici de collecter un petit échantillon de peau par biopsie, une procédure plus légère et beaucoup moins invasive déjà appliquée avec succès sur des reptiles dans une étude récente.
Réduction
Nous avons déterminé le nombre d’individus nécessaires à cette étude (N=10) pour pouvoir tester les différentes méthodes de microscopie et estimer la variabilité des traits étudiés. Trois échantillons seront initialement utilisés pour raffiner la méthode de fixation qui permettra d’obtenir des coupes de bonne qualité et exploitables avec les 3 méthodes de microscopie que nous souhaitons utiliser (microscopie par transmission électronique, microscopie électronique à balayage et microscopie RAMAN). Les 4 restants seront traités ultérieurement avec la méthode sélectionnée, et nous aurons ainsi un total de 5 échantillons d’individus différents pour estimer la variation naturelle des différents paramètres à mesurer pour réaliser des études futures à partir de la moyenne et la variance des traits.
Raffinement
Nous avons implémenté plusieurs mesures d’amélioration durant les différentes phases du projet. D’une part, les conditions dans lesquelles les animaux sont hébergés, dans les mésocosmes (prairies humides clôturées pour pouvoir faire les suivis des individus) ainsi que dans l’animalerie avant et après la procédure, sont optimales pour l’espèce et offrent des éléments indispensables à la diminution du stress. La taille des enclos correspond à la biologie de l’espèce. Des pierriers et des tas de bois, pour se cacher et thermoréguler, ainsi que des points d’eau sont présents dans chaque enclos. La majorité de la surface des enclos est constituée de zones végétales denses ressemblant à des zones humides, caractéristiques de l’habitat naturel de l’espèce. Un système d’ombrage permet de réduire la température lorsque celle-ci devient trop importante. Les enclos sont arrosés 30 minutes par jour pour éviter tout stress hydrique. Les lézards utilisés dans ce projet (10 individus) seront ramenés au laboratoire et maintenus individuellement dans des terrariums de taille supérieure à celle requise pour cette espèce et offrant les éléments indispensables à la diminution du stress des animaux (source de chaleur et d’UV, zone humide et fraiche, abris). Chaque lézard sera nourri avec 2 grillons par jour, grillons régulièrement enrichis en vitamines. La santé des animaux sera surveillée avec des observations quotidiennes (activité des animaux) et des mesures hebdomadaires (suivi du poids). Ces conditions de captivité sont optimales. Durant la procédure proposée, les mesures d’amélioration comprennent l’utilisation d’anesthésique local, de matériel de biopsie stérile (et spécialement conçu pour la biopsie de peau) et de désinfectant, ainsi que le suivi de la cicatrisation de la peau pendant au moins trois semaines suivant la biopsie. Les lézards seront exclus de la procédure s’ils présentent des points incluant une apathie forte, des défauts de mues importants, ou une perte de masse de 25 à 30 % associée à une diminution d’appétit.
Choix des espèces
L’espèce animale utilisée ici est le lézard vivipare Zootoca vivipara (Jacquin 1787). Il s’agit d’un lézard de la faune française étudié depuis trente ans dans les populations naturelles. Cette espèce est intéressante pour comprendre l’écologie de vertébrés ectothermes comme les reptiles ou les amphibiens terrestres, une majeure partie de la biodiversité. Dans le monde, 20% des reptiles sont menacés d’extinction, pourtant leur écologie reste peu étudiée et comprise. Il devient donc urgent de mieux comprendre le comportement de ces espèces à l’aide de modèles solides. L’espèce Zootoca vivipara est optimale car son écologie est bien connue et son génome est séquencé, ce qui en fait un modèle unique pour l’écologie fondamentale et appliquée des vertébrés ectothermes. L’espèce n’est pas menacée en Europe (classée comme espèce à préoccupation mineure par l’Union Internationale de la Conservation de la Nature) même si elle est sensible aux dégradations de son milieu, et plusieurs études montrent que les populations naturelles de cette espèce sont en péril à cause de changement climatique. Les individus utilisés seront des adultes uniquement (2 ans et plus) afin de réduire les sources connues de variation de couleur associée à l’âge.
Production d’anticorps polyclonaux sur souris
- Production de routine
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Tests réglementaires
Trois à cinq injections d'antigène, des séries de cinq jours d'instillations nasales, des gavages répétés puis jusqu'à quatre prélèvements sanguins à la mâchoire : 750 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées par ponction cardiaque terminale. L'objet est la production d'anticorps polyclonaux destinés à des activités de recherche ou de diagnostic, un consommable de laboratoire fabriqué dans le corps de ces souris. Le porteur indique que l'inoculation peut provoquer une hyperthermie, une forte inflammation locale, une ulcération ou une nécrose au point d'injection. Il qualifie pourtant ces mêmes gestes de douleur "légère de courte durée".
Objectifs
Produire sur des souris de très bons anticorps polyclonaux spécifiques avec une haute affinité dirigée contre des protéines d'intérêt, pour des activités de recherche ou de diagnostic pour lesquels ils n’existent pas des alternatives accessibles. Éventuellement : Utiliser les cellules B pour préparer des hybridomes et/ou extraire les séquences des portions variables des chaines légères et lourdes des anticorps.
Bénéfices attendus
De nombreuses analyses de diagnostic ou de recherche nécessitent de détecter, de visualiser ou de quantifier une protéine dans un échantillon biologique. La plupart d'entre elles reposent sur l'utilisation d'anticorps qui reconnaissent spécifiquement la protéine d'intérêt. Ces anticorps sont produits en immunisant un animal contre la protéine.
Procédures
- 3 à 5 iInjections sous-cutanées, intradermique, intramusculaire, intrapéritonéale ou espacées de 14 à 21 jours sur animaux vigiles : quelques secondes - 3 à 5 series de 5 jours d’iInstillations intranasales (20ul) sur animaux anesthésiés espacées de 14 à 21 jours : 6 à 10 min - Gavage avec sonde gastrique sur vigiles : jusqu’à 3 séries de 5 jours consécutives espacées de 21 jours: quelques secondes - Prélèvement sanguin (retro mandibulaire) sur souris vigiles (100ul, J-7, J24, J45 ou 48 et éventuellement J66 et J87: quelques secondes - Prélèvement sanguin (cœur) sur souris anesthésiés (acte terminal) animaux : quelques minutes
Impact sur les animaux
Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention. Pour ce geste les animaux sont susceptibles d’éprouver une douleur légère de courte durée.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure pour un prélèvement sanguin terminal afin de répondre à l’objectif scientifique.
Remplacement
La production d'anticorps polyclonaux de forte affinité dirigés contre un antigène résulte de la stimulation de différentes populations leucocytaires qui ne peut être reproduite de façon satisfaisante et efficace in vitro. L’initiation de la réponse immunitaire dans les souris naïves est unique pour chaque antigène et possible grâce à l’expression d’une grande diversité d’anticorps par les cellules B in vivo. Cette diversité est assurée par la recombinaison de différents segments de gènes qui ensemble composent les anticorps (germline répertoire). Au début d’une immunisation, certaines de ces anticorps (cellules B) vont se lier à l’antigène avec une affinité souvent très faible, mais suffisante pour initier une réaction immunitaire. Lors de cette réactions les cellules B reconnaissant de l’antigène vont se multiplier et commencer à secréter des anticorps. Au fur et à mesure de l’immunisation et des boosts, les cellules B accumulent des mutations aléatoires dans les gènes codant pour les anticorps, permettant ainsi d’augmenter (ou diminuer) de manière significative l’affinité des anticorps produits. Ce processus nécessite des interactions des plusieurs types cellulaires dans des tissues immunitaires et ne peuvent pas être reproduits in vitro ni prédit de manières satisfaisant par des méthodes in silico.
Réduction
Dans la très grande majorité des cas, un lot de 5 animaux sera suffisant pour obtenir la quantité d'anticorps nécessaire pour les travaux scientifiques. Dans certains cas (échec de l'immunisation ou besoin de très grandes quantités d'anticorps), il peut être nécessaire de répéter l’immunisation 2 ou 3 fois. Nous estimons que le nombre de demandes de production d'anticorps polyclonaux portera sur un total d'environ 30 antigènes et donc 150 animaux par an.
Raffinement
Il se peut que l'inoculation d'une protéine (ou l'adjuvant utilisé) induise une réaction inhabituelle plus générale (hyperthermie) ou intense (forte inflammation locale, ulcération, nécrose). Pour cette raison, l'état général des animaux et les points d'injection seront surveillés pendant les 48h premières heures, puis régulièrement. Le protocole d'immunisation sera interrompu si des signes généraux sont observés. Les soins adéquats seront apportés à l'animal (anti-inflammatoires, antibiotiques, soins locaux…). L’animal sera mis à mort si aggravation des signes cliniques malgré le traitement. Les injections et les prélèvements sanguins de petit volume ne requièrent qu'une contention, une préparation aseptique et une anesthésie locale et une réhydratation sous-cutanée. Le prélèvement terminal (grand volume) sera réalisé sous anesthésie générale.
Choix des espèces
L’espèce utilisée est la souris de laboratoire. Le recours à des lignées consanguines de souris permet de réduire le nombre d’animaux par groupe expérimental. Les souris de laboratoire restent des modèles dont la pertinence biologique et biomédicale est établie. De plus, l’utilisation de lignées de souris génétiquement modifiées permettra d’évaluer plus précisément les mécanismes moléculaires et cellulaires de la pathologie humaine. L’ensemble des animaux expérimentaux seront utilisés au stade « jeune adulte » : entre 6 et 12 semaines au début de l’expérience, âge à partir duquel le système immunitaire est mature et ne subit plus de changements majeurs.
Compréhension des mécanismes immunitaires associés à des nanoparticules d’ARNm en fonction de leur voie d’administration chez la souris naïve
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système respiratoire
- Tests réglementaires
- Autres tests de tolérance et d’efficacité
2 055 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un vaccin à ARNm par voie intranasale, par voie oro-trachéale avec introduction d'un cathéter dans la trachée, ou par voie intramusculaire, puis quatre séances d'imagerie hebdomadaires sous anesthésie et quatre prélèvements de sang au sinus submandibulaire, en contention et vigiles. Un lot pilote de 30 souris sert uniquement à entraîner les intervenants à ce geste de prélèvement. Aucune maladie n'est induite, les souris sont tuées pour prélever poumons, nez, rate, ganglions et sang, et le porteur inscrit ces travaux dans une "production souveraine" de vaccins et l'ambition française de se placer "à l'avant-garde" des biothérapies.
Objectifs
Les récents succès des vaccins à base d’ARN messager (ARNm) contre le SARS-Cov2 ont validé le potentiel thérapeutique de cette classe de médicament. Le projet RNAvac a pour objectif de produire une nouvelle génération de vaccins ARNm en développant des technologies innovantes afin de lever les limitations des vaccins à ARNm démontrées par leur courte durée de protection induite nécessitant de fréquents rappels et leur inefficacité à bloquer les infections au site d’entrée du virus chez les personnes vaccinées. Il vise à étendre leur utilisation pour le traitement d’autres pathologies, comme le cancer. Pour relever ce défi, un consortium de 11 laboratoires académiques s’est structuré pour accélérer la production de vaccins innovants afin de les déployer pour lutter contre d’éventuels épidémies virales et traiter les cancers muqueux dont les besoins médicaux sont loin d’être satisfaits. L’ambition est d’accélérer la production française de ces vaccins innovants afin de les déployer en cas de menaces sanitaires (virus NIPAH, West Nile …), d’épidémies récurrentes (grippe…), et d’améliorer le traitement des cancers, qui reste un besoin médical non satisfait. Plus spécifiquement, ce projet vise à décrire et comparer les réponses immunitaires induites par différents vaccins à ARNm en fonction de leur voir d’administration, soit intra-pulmonaire, soit intra-nasale chez la souris saine.
Bénéfices attendus
Ce projet fait partit d’un consortium de grande envergure qui vise à développer de nouvelles générations de vaccins ARN messager pour lutter contre d’éventuels épidémies virales et traiter les cancers dont les besoins médicaux sont loin d’être satisfaits. Les éléments de rupture qui seront apportés par le projet sont : une approche de formulation originale de vaccins avec des ARNm bioproduits plus efficaces et moins couteux, une stratégie innovante de stabilisation d’ARNm, l’administration par voie mucosale de vaccins ARNm et le double ciblage ARN/antigène vers les cellules dendritiques pour favoriser la réponse immunitaire mémoire post-vaccinale. Le consortium s’appuie sur plusieurs infrastructures nationales et un réseau de start-ups et d’entreprises, des centres hospitaliers universitaires, qui vont faciliter le transfert technologique pour l’industrialisation et vers le patient. L’ambition long-terme est d’accélérer la production souveraine de ces vaccins innovants afin de les déployer en cas de menaces sanitaires, d’épidémies récurrentes et d’améliorer le traitement des cancers, qui reste un besoin médical non satisfait. En conclusion, ce projet s’inscrit pleinement dans l’ambition de la France de se positionner à l’avant-garde des technologies de biothérapie et de bioproduction à base d’ARNm.
Procédures
1a_Administration des ARNm par voie intranasale : sous anesthésie générale, 1 fois, 20secondes 1b_Administration des ARNm par voie oro-trachéale : sous anesthésie générale, 1 fois, 1min 1c_Administration des ARNm par voie intramusculaire : en contention, animal vigil, 1 fois, 1min 30secondes 2_Mesure de la bioluminescence/fluorescence émise par les nanoparticules d’ARNm: sous anesthésie générale, 1 fois/semaine (total = 4) , 5min 3_Prélèvement de sang : en contention, animal vigil, 1 fois/semaine (total = 4), 2min
Impact sur les animaux
Aucune pathologie modèle ne sera testée chez l’animal. Il s’agit ici d’évaluer l’immunogénicité de différentes formulations d’ARNm en fonction de leur voie d’administration. Des données préliminaires in vitro obtenues dans les laboratoires collaborateurs vont nous permettre de limiter le nombre de doses à tester pour les différentes formulations d’ARNm, à celles présentant la plus faible toxicité minimisant ainsi les nuisances. Les nuisances associées aux administrations des formulation d’ARNm comprendront : le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et la douleur associée à l'introduction d'un cathéter dans la trachée pour la voie orotrachéale; le stress généré par l'anesthésie à l'isofluorane et l'administration d'un bolus par la voie intranasale; le stress généré par la contention et la douleur associée au prélèvement submandibullaire.
Devenir
L’objectif de ce projet est d’améliorer nos connaissances dans les réponses immunitaires associées aux aARNm en fonction de leur voie d'administration. Ceci, afin d’améliorer leur transposabilité vers une utilisation clinique. Ainsi, à l’issue de chaque procédure, les animaux seront euthanasiés et des prélèvements (lavages nasaux, broncho-alvéolaires / prélèvements des poumons, nez, sang total, rate, ganglions drainant) seront réalisés afin d’analyser les dynamiques des populations immunitaires.
Remplacement
Ce projet est la suite de résultats obtenus sur des modèles in vitro dans des équipes collaboratrices. Jusqu’à présent, aucun système in vitro ne permet de reproduire les caractéristiques/processus associés aux réponses immunitaires mucosales et le modèle murin constitue un modèle expérimental pertinent et nécessaire pour envisager des essais cliniques chez l’Homme. Les modalités d’administration de biothérapies (intranasale, intratrachéale ou intramusculaire) sont très bien décrites chez la souris et sont maitrisées par notre équipe. L’utilisation de la souris permettra de mimer les phénomènes immunitaires observés chez l’Homme. Les outils transgéniques, permettant une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires mis en jeu dans l’immunogénicité à long terme induit par les ARNm sont disponibles chez la souris. Enfin, l’étude de la mécanistique immunitaire induit par les ARNm délivrés par voie pulmonaire est possible chez la souris grâce à des outils appropriés disponibles au laboratoire.
Réduction
Le nombre d’animaux est optimisé en réalisant un maximum d’analyses sur chaque animal (cellules immunitaires, cytokines, expression des gènes, histologie, …). Les modèles murins et les différentes modalités d’administration sont maitrisés par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point. De plus, les expériences sont organisées avec des témoins choisis de sorte à limiter la répétition d’expériences. Des données ont déjà été générées permettant de réduire le choix des doses et des temps d’analyses. L’utilisation d’imagerie non-invasive (via l’utilisation de formulations d’ANRm fluorescent/luminescent) permettra un suivi longitudinal des animaux, limitant leur nombre. 1 lot pilote de 30 animaux a été inclus afin d'entraîner les intervenant à la maîtrise du geste de prélèvement de sang par ponctions au niveau du sinus submandibulaire. Ceci permettra d’augmenter le robustesse de ce geste et donc de réduire le nombre d’animaux.
Raffinement
Une attention particulière sera apportée à l’observation, au cours des expérimentations envisagées, des points suivants: (1) une perte de poids de l'animal, et/ou (2) détérioration générale de l'état sanitaire de l'animal et altération sévère des comportements physiologiques (prostration, refus de se nourrir ou de boire, poil hirsutes) et/ou (3) symptômes évidents. Ces symptômes, incluant des éléments physiques, physiologiques et comportementaux permettront d'établir un score clinique permettant de déterminer objectivement la poursuite ou non de l'expérimentation sur l'animal.
Choix des espèces
L'utilisation d'animaux dans cette étude est indispensable, car les réponses vaccinales font (1) intervenir un certain nombre de cellules immunitaires différentes et (2) dépendent de l’organe considéré et donc de la voie d’administration. L’utilisation des modèles cellulaires a déjà démontré que certaines formulations augmentent la traduction des ARNm. Cependant, des études chez l’animal sont nécessaires pour tenir compte des interactions de l'organisme avec les formulations et les ARNm de différentes structures. L’utilisation de la souris se justifie également d’un point de vue technique avec la disponibilité au sein du laboratoire de l’ensemble des réactifs/kits/consommables spécifiques de cette espèce permettant de caractériser les réponses immunitaires à long terme associée aux ARNm. Des animaux âgés de 6-8 semaines seront utilisés. Des individus plus jeunes (âges inférieurs à 6 semaines) sont à proscrire du fait du développement incomplet de leur système immunitaire, ce qui pourrait perturber l’évaluation des traitements. Des individus plus vieux (âges supérieurs à 12 semaines) sont également à proscrire du fait d’un poids souvent élevé incompatible avec gestes techniques procédures.