Autre recherche fondamentale

Gavés une fois d'une dose de pyréthrines ou de pipéronyl butoxide diluée dans de l'huile végétale, après quatre heures de jeûne suivies de six autres, 50 rats Wistar mâles passent 72 heures en cage métabolique individuelle pour que leurs urines et leurs fèces soient recueillis à huit reprises. La procédure implique un niveau de souffrance modéré, et c'est le séjour en cage métabolique et le jeûne de dix heures qui la classent ainsi, non la substance testée. Le projet vise à décrire pour la première fois le devenir des pyréthrines chez un mammifère, préalable annoncé à une biosurveillance humaine. Tous les rats restent vivants et sont ensuite réutilisés en travaux pratiques d'enseignement, sans que le RNT dise ce qui leur arrive à ce stade, ni pourquoi seuls des mâles sont utilisés au-delà de la mention de "recommandations en vigueur".

Objectifs

L'étude des expositions alimentaires aux résidus de pesticides est un réel enjeu de santé publique. En étudiant comment les substances circulent dans notre organisme, sont transformées et sont éliminées (toxicocinétique) et en développant des méthodes pour mesurer ces produits de transformation (métabolites), on peut mieux estimer les risques liés à l'exposition. Les Pyréthrines sont des produits utilisés en agriculture biologique, fabriqués à partir de fleurs de pyrèthre de Dalmatie ou de certains chrysanthèmes. Leur mécanisme d’action cible le système nerveux des insectes, mais peut aussi être toxique pour les poissons. Aucune étude sur le devenir des pyréthrines chez les mammifères n'est disponible. Seule une étude réalisée chez l’Homme rapporte la présence de deux métabolites pouvant être ceux des pyréthrines. Ainsi cette étude a pour objectif de confirmer que ces deux métabolites identifiés sont bien spécifiques à l'exposition aux pyréthrines et d’en étudier la toxicocinétique, ce qui n’a jamais été réalisé. Cette étude représente une étape préliminaire au développement de méthodes de biosurveillance aux pyréthrines chez l’Homme, que ce soit pour les professionnels de l’agriculture ou la population générale. D’autre part, le Pipéronyl Butoxide (PBO) est une substance qui, lorsqu'elle est combinée avec des insecticides, les rend plus puissants en empêchant les insectes de s'en débarrasser facilement. Le PBO est le plus souvent utilisé avec les pyréthrines et les pyréthrinoïdes (dérivés synthétiques des pyréthrines). Ce projet vise également à évaluer la toxicocinétique du PBO chez le rat car à ce jour peu de données sont retrouvées dans la littérature scientifique (1 seule étude disponible ne permettant pas de caractériser les métabolites). Une meilleure connaissance de la toxicocinétique du PBO permettra d’identifier les métabolites formés et de mettre au point leur dosage. Les deux substances étudiées ici présentent des dangers potentiels pour la santé humaine telle des affections des systèmes endocriniens, nerveux et reproducteur. Il est donc primordial pour la prévention de la santé de l’ensemble de la population de mieux connaître leurs toxicocinétiques.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de caractériser la toxicocinétique et de caractériser les métabolites des Pyréthrines et du PBO. A notre connaissance, la toxicocinétique des pyréthrines n'a jamais été décrite dans la littérature. Celle du PBO n'a été réalisée que dans une seule étude mais elle n'a pas permis de caractériser les métabolites. Une meilleure connaissance de ces paramètres permettra d'adapter les mesures de prévention pour la santé des populations.

Procédures

Après 7 jours d’acclimatation à l’animalerie, les rats seront placés en cages métaboliques pendant 24h afin de les acclimater à la cage métabolique. Au 8ème jour, les rats seront mis à jeun pendant 4 heures puis une dose de pyréthrines ou de PBO leur sera administrée en une seule fois par gavage (durée du geste : 15 à 20 s). La substance d'intérêt sera diluée dans un volume d’huile végétale adapté selon le poids du rat. Le jeûne sera maintenu pendant 6 heures supplémentaires après le gavage. La durée de mise à jeun de 10 heures au total permet d’éviter la variabilité interindividuelle de l'absorption de substances en raison d'une consommation alimentaire variable d’un individu à l’autre. L’eau sera disponible à volonté durant cette période de jeûne. Après le gavage, les rats seront replacés en cages métaboliques pendant 48 heures, afin de pouvoir recueillir les fèces et urines à 30 minutes, 1 heure, 3 heures, 6 heures, 9 heures, 12 heures, 24 heures et 48 heures, ceci dans le but d’étudier la vitesse d’élimination des substances et des métabolites identifiés.

Impact sur les animaux

Ce protocole nécessite un séjour des rats de 72 heures en cage métabolique (24h d'acclimatation à la cage métabolique et 48h pour l'étude et le recueil des fèces et urines). L'acclimatation de 24h en cage métabolique est nécessaire dans le cadre de notre étude pour ne pas influencer les excrétions d'urines et de fèces qui seraient liés au stress lié à la mise en cage métabolique juste après le gavage des animaux. De plus, une mise à jeun pour une durée totale 10 heures (4 heures avant et 6 heures après le gavage) est nécessaire afin de diminuer la variabilité inter-individuelle d'absorption. Ces éléments classent la procédure en classe de gravité modérée selon les recommandations réglementaires.

Devenir

50 rats Wistar seront utilisés lors de cette étude et soumis à une procédure de gravité modérée. Tous les rats seront maintenus en vie à la fin de la procédure et seront réutilisés pour d'autres projets (enseignement/travaux pratiques).

Remplacement

L'étude de la toxicocinétique des Pyréthrines et du PBO ne peuvent pas être évaluées sur des cellules ou tissus isolés car il est nécessaire d’étudier la réponse d’un organisme entier à ces substances. De plus, le recours à l’expérimentation animale permet de maîtriser les apports en pyréthrines et PBO en phase d'exposition ainsi que tous les facteurs qui pourraient influencer ces paramètres.

Réduction

Le nombre d’animaux s’appuie sur les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques relatives aux études de toxicocinétique chez les rongeurs. Ce protocole utilise trois doses de Pyréthrines afin d'assurer des résultats scientifiques fiables et robustes tout en utilisant un nombre total d'animaux minimal. Selon une évaluation statistique et ce qui a été décrit dans la littérature scientifique concernant la toxicocinétique du PBO seul et des pyréthrines seules, un nombre minimal de sujets nécessaires a été estimé à dix rats par groupe afin de pouvoir visualiser une différence statistique entre les groupes. Ce protocole n’utilisera que des rats mâles, des animaux de sexe féminin ne seront pas utilisés. Le choix du sexe est fait en fonction des recommandations en vigueurs.

Raffinement

Ce protocole ne fait appel qu'à des procédures légères ou modérées. Les rats seront observés quotidiennement et pesés 1 fois par semaine. Les rats seront nourris avec un régime standard qui permet de couvrir l’ensemble des besoins nutritionnels et caloriques des rats. Ils seront hébergés dans des cages à 25°C et 30-50% d’hygrométrie, dans un environnement contrôlé dépourvu de pathogènes, avec une alternance jour/nuit de 12h. La nourriture et l’eau de boisson seront fournies ad libitum, sauf pendant la période de jeûne. Les rats seront traités selon les règles éthiques de l’expérimentation animale. L’ensemble du projet est mené par un personnel compétent en expérimentation animale qui maîtrise parfaitement les gestes techniques nécessaires. Les animaux bénéficieront d'une surveillance quotidienne avec des critères d'observation stricts définis. Au-delà du non-respect d’un certain nombre de ces critères, ils seront considérés en souffrance et sortiront de l'étude.

Choix des espèces

Le modèle rat a été choisi comme préconisé par les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques. De plus, le modèle de rat Wistar correspond à l'espèce la plus pertinente et la moins susceptible de ressentir de la douleur, de la souffrance ou de l'angoisse de façon durable et sans qu'il soit possible de la soulager. Aucun modèle in vitro ne permet d'atteindre les objectifs fixés, le rat est un modèle approprié et bien validé pour ce genre d’étude. De plus, l'étude sur le Pipéronyl Butoxyde a été réalisée sur un modèle de rat. Réaliser cette étude dans des conditions similaires permettra de comparer et d’enrichir les données décrites dans la littérature scientifique avec l’analyse des résultats de cette étude. Les rats seront âgés de 6 semaines pesant environ 250g au démarrage de l'étude. Les rats seront âgés de 7 semaines à la fin de l'étude. L'âge des animaux s'appuie sur les lignes directrices de l'OCDE n°417 pour les essais de produits chimiques relatives à l'étude de la toxicocinétique chez les rongeurs. Suite à une décision de l'équipe, les rats utilisés dans cette étude sont le plus jeune possible afin de pouvoir être réutilisés sur un autre projet (enseignements/travaux pratiques).

Le nombre d'injections et de prélèvements dépend du protocole de chaque étude commandée, sans qu'aucun chiffre ne soit avancé. 1 280 animaux vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, cochons, chèvres, moutons, bovins, équidés, lapins, camélidés, poules, dindes et autres oiseaux, répartis en général par groupes de huit. Le porteur estime que 80 % d'entre eux seront tués et 20 % réutilisés, avec 90 % de réutilisation pour les lamas, et reconnaît ne pas pouvoir savoir à l'avance combien seront gardés en vie, cela dépendant des groupes de traitement et de l'accord des autorités. Il annonce des réactions locales possibles, gonflements ou abcès, et une conception "cross over" par laquelle les mêmes animaux reçoivent successivement plusieurs produits à tester après une période de repos.

Objectifs

Les études de pharmacocinétique permettent d'étudier le devenir d'une substance active contenue dans un médicament par exemple après son administration dans l'organisme. Elles permettent notamment de déterminer les paramètres pharmacocinétiques suivants : absorption, distribution, métabolisme et élimination d’un composé, soit dans le sang, soit à d’autres emplacements, et elles sont souvent employées lors des étapes de découverte ou de sélection de candidats du programme de développement d’un médicament. Les études de bioéquivalence ont pour objectif, quant à elles, d'obtenir des paramètres pharmacocinétiques permettant la comparaison de la biodisponibilité d’une substance active entre deux ou plusieurs formulations et/ou entre deux ou plusieurs voies d'administration.

Bénéfices attendus

- Obtenir les informations nécessaires pour le développement de nouveaux médicaments et définir in fine les modalités d'administration du médicament, à savoir la voie d'administration, la dose et le rythme d'administration.- Contribuer à une meilleure compréhension des phénomènes physicochimiques, biochimiques, métaboliques impliqués dans le devenir du médicament dans l'organisme, de sa durée de « vie » et d'action, de ses interactions potentielles.

Procédures

Les animaux seront soumis à différents types d'interventions : des injections et des prélèvements biologiques (sanguins ou autres). Le nombre d'interventions sera dépendant du protocole de l'étude mais chaque intervention sera de courte durée. Un délai adapté au produit administré sera dispensé entre chaque injection. Un temps de récupération sera également dispensé entre chaque prélèvement sanguin ou autre prélèvement biologique. Ce temps de récupération sera réalisé conformément aux recommandations éthiques.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables attendus sur les animaux sont les suivants : stress dû à la contention, stress dû aux injections et aux prélèvements, possibilité d'observation chez les animaux de réactions locales (gonflement, abcès...) et/ou générale (augmentation température, perte de poids, diminution de l'activité...) après les administrations.

Devenir

En fonction de l’étude et des groupes de traitement, des animaux seront mis à mort afin de respecter le principe de précaution conformément à la législation. En fonction de l’étude et des groupes de traitement, des animaux pourront être gardés en vie si la réglementation l’autorise. Exemple pour un vaccin : sauf indication contraire des autorités, en fonction des groupes de traitement, les animaux ayant reçu un produit disposant d’une autorisation de mise sur le marché ou les animaux du groupe témoin (sans traitement, eau physiologique...) seront gardés en vie. Il n'est pas possible de savoir à l'avance exactement le nombre d'animaux qui seront mis à mort ou gardés en vie puisque c'est dépendant des groupes de traitement, de l'accord des autorités etc. Les nombres ont été estimés de la manière suivante : on a considéré pour chaque espèce sauf les lamas que 80 pourcent des animaux seraient mis à mort et 20 pourcent réutilisés. Pour les lamas, nous avons estimé 90 pourcent réutilisés et 10 pourcent mis à mort.

Remplacement

Il n'existe pas de méthodes alternatives pour atteindre les objectifs de ce projet et ainsi obtenir toutes les informations sur le devenir d'une molécule après administration dans l'organisme. Il est nécessaire de réaliser les molécules dans un environnement avec les différents organes et les fluides corporels qui ne peuvent pas être reproduits in vitro. Ce passage sur le modèle animal est donc indispensable dans les étapes de découverte ou de sélection de candidats du programme de développement d’un médicament.

Réduction

Le nombre d'animaux utilisé sera réduit au minimum. En moyenne 2 groupes de 8 animaux sont inclus par étude. Le nombre d'animaux sera déterminé en fonction des besoins pour répondre aux objectifs fixés pour chaque étude. La réglementation en vigueur relative à la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques sera respectée. Dans le but de réduire ce nombre, un design en « cross over » pourra être utilisé. Les animaux pourront recevoir les différents traitements à tester après avoir eu une période de repos. Ce design permet d’utiliser moins d’animaux et de supprimer les variabilités individuelles.

Raffinement

Méthodes de raffinement : 1) Tout au long de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Afin de les maintenir, les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, afin d’augmenter leur bien-être, les animaux seront hébergés collectivement dès que possible et disposeront d’un environnement enrichi. Si, selon les besoins, les animaux doivent être hébergés individuellement, ils auront un contact visuel et/ou olfactif avec leurs congénères et de l'enrichissement compensatoire. 2) Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. L’administration du traitement prescrit devra être réalisée par une personne habilitée. 3) Surveillance accrue de l’animal durant les manipulations. 4) Une période d'acclimatation adaptée sera dispensée avant la 1ère administration et/ou prélèvement, afin de permettre aux animaux de s'adapter à leur environnement et de s'assurer de leur bon état de santé. Grâce à ces différentes méthodes, le bien-être de l’animal sera respecté et sa douleur, souffrance et angoisse seront d’abord réduites puis supprimées. Ainsi, les manipulations seront réalisées dans les meilleures conditions possibles.

Choix des espèces

L’espèce choisie pour ces études doit être l’espèce cible des produits utilisés. Ainsi, selon le produit, les bovins, les porcins, les ovins, les caprins, les équins, les volailles (poules, dindes, canards), les lapins et les camélidés seront choisis. De la naissance à l’âge adulte selon le produit utilisé et l’âge recommandé pour celui-ci. Les animaux inclus seront représentatifs de la population cible du produit testé.

Les souris sont tuées quand la lésion de leur coussinet plantaire atteint 10 mm ou se nécrose, les hamsters avant qu'ils n'aient perdu 20 % de leur poids, seuil précédé de prostration et d'isolement dans la cage. 410 souris et 310 hamsters dorés vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Anesthésiés, ils reçoivent une inoculation de Leishmania, sous la peau du coussinet plantaire pour les souris, avec une lésion qui grossit pendant trois mois et réduit leur mobilité, dans l'abdomen pour les hamsters, chez qui le parasite colonise le foie et la rate. Aucune expérience n'est menée sur eux pour elle-même, ils sont infectés pour que le laboratoire dispose de parasites virulents et de tissus parasités pour ses autres projets, et le porteur écrit que cet effectif "n'exige aucune approche statistique".

Objectifs

Le développement des Leishmanies est complexe et très partiellement élucidé notamment chez les mammifères. Initialement deux populations morphologiquement distinctes ont été distinguées: Un stade de développement ne peut s’établir en dehors des cellules hôtes à l’exception de Leishmania donovani et Leishmania mexicana pour lesquelles il est possible de produire ce stade pouvant se développer en absence de cellules hôtes mammifères. Néanmoins ceux-ci présentent des caractéristiques très différentes de es stades lorsqu’ils sont isolés à partir d’un individu malade. Ce projet permettra de produire un stade de développement de Leishmania major, Leishmania amazonensis, Leishmania tropica, Leishmania infantum et Leishmania donovani et d’avoir accès à des tissus fortement parasités qui pourront être utilisés pour la réalisation des projets scientifiques du laboratoire. En effet ceux-ci sont axés sur la connaissance de la biologie des Leishmanies et de ses interactions avec ses hôtes pour l’identification à terme de nouvelles cibles thérapeutiques. De plus, ce projet propose de comparer différents modes d’administration des parasites ainsi que la faisabilité d’utiliser des mâles et non plus seulement des femelles. La réalisation de ce projet repose sur 4 procédures : (1) et (3) raffinement des modes d’administration des parasites et faisabilité quant à l’utilisation de souris et hamsters mâles pour la production de parasites (2) recours à des souris pour le prélèvement de tissus cutanés et/ou ganglions drainant le site d’inoculation (4) recours à des hamsters dorés pour le prélèvement de leur rate et de leur foie L’inoculation des parasites est réalisée sur animaux anesthésiés. Les animaux sont observés chaque semaine et cette observation est couplée à une mesure du poids des individus. Les animaux sont mis à mort aux points limites définis dans le projet selon les méthodes approuvées.

Bénéfices attendus

Deux bénéfices distincts sont attendus. L’un vise à faire évoluer, si possible, nos modèles expérimentaux pour une amélioration de la santé et du bien-être animal et un raffinement des techniques d’injection. L’autre concerne la connaissance de la biologie des Leishmania et les bénéfices qui en découlent pour la santé humaine et animale. Les parasites du genre Leishmania pathogènes pour l’homme se développent dans deux hôtes distincts, les insectes vecteurs et hôtes, et les mammifères. Le passage d’un hôte à l’autre entraîne une transformation des parasites d’un stade de développement dans l’insecte hématophage à un autre stade de développement dans les cellules des hôtes mammifères et réciproquement. Chez l’homme la multiplication d’un stade de développement au sein des cellules phagocytaires telles que les macrophages provoque à terme la maladie. Aujourd’hui il n’existe toujours pas de vaccination et les traitements actuels sont non seulement toxiques mais deviennent aussi de moins en moins efficaces en raison de l’apparition de parasites résistants au peu de médicaments disponibles. Or les espèces du complexe Leishmania donovani provoquent une leishmaniose viscérale mortelle en absence de traitement efficace tandis que les autres espèces provoquent des lésions cutanées souvent défigurantes à l’origine de stigmatisations sociales importantes notamment chez les femmes. Seule la compréhension du programme complexe de développement de Leishmania pourra nous permettre d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques pour la génération de nouveaux médicaments et de vaccins, et, pour y parvenir il est primordial d’avoir accès à des parasites virulents purifiés à partir d’animaux infectés. A court terme ce projet nous permet donc de travailler avec des parasites biologiquement pertinents pour toutes nos recherches. A long terme les résultats de nos recherches pourront se traduire en avancées majeures dans la prévention et la chimiothérapie des différentes formes de leishmanioses.

Procédures

Pour les hamsters et les souris les animaux sont : 1) anesthésiés pour pratiquer l’inoculation des parasites. Durée de contention de l’animal pour l’injection intrapéritonélae de l’anesthésique inférieure à 30 secondes/animal et la durée de l’anesthésie varie de 15 à 30 minutes. Le temps d’inoculation sous-cutanée des parasites est de l’ordre de 30 secondes/animal. 2) suivis périodiquement (hebdomadaire, à minima à compter du 2ème mois post-injection des parasites) pour l’évolution de la pathologie. Pour les souris, l’animal est maintenu pendant la mesure puisqu’il doit être tenu immobilisé afin de pouvoir mesurer l’épaisseur du coussinet plantaire, lieu de l’injection des parasites et donc du développement de la lésion. Le temps de la contention/mesure est inférieur à 30 secondes/souris. Pour la procédure de raffinement des voies d’injection, les souris pourront être anesthésiées par voie gazeuse afin de permettre les mesures de taille des lésions. Dans ce cas la durée de l’anesthésie sera réduite à 5-10 minutes. Pour les hamsters, ceux-ci sont uniquement déplacés individuellement dans le pot à peser, la totalité de l’intervention étant également inférieure à 30 secondes/hamster. Pour la procédure de raffinement des voies d’injection, les hamsters seront anesthésiés par voie gazeuse et maintenus ainsi pendant la procédure d’imagerie in vivo qui comporte une injection intrapéritonéale. La totalité de cette procédure est évaluée à 45 minutes/individu.

Impact sur les animaux

Les effets attendus sur les animaux dépendent de l’espèce de Leishmania inoculée et du site d’injection. Les Leishmania responsables d’atteintes cutanées telles que L. amazonensis, L. major ou L. tropica lorsqu’elles sont injectées dans le coussinet plantaire des souris vont créer localement une réponse immune. Ceci permettra le recrutement des cellules de type macrophage dans lesquelles les parasites vont pouvoir se multiplier et conduire progressivement à la création d’une lésion non nécrosante quand les parasites sont inoculés à certaines souris. Au cours du temps les effets sur les animaux vont passer de silencieux (pas de signe visible) pendant un mois à progressivement symptomatique. Durant cette période la taille de la lésion va augmenter entraînant une réduction de la mobilité dans le cas d’une injection dans les coussinets plantaires mais sans impact sur l’alimentation et l’hydratation car l’expérimentation est arrêtée avant d’atteindre les points limites et donc ce stade (au plus trois mois après l’inoculation). Les espèces de Leishmania viscérales, L. infantum et L. donovani vont colonisées principalement le foie et la rate des hamsters. Dans ce cas aussi la première phase de la maladie est silencieuse et peut durer de 1 à 3 mois. Au-delà, le premier signe clinique de l’évolution de la pathologie est une stabilisation de la prise de poids suivi d’une perte progressive de poids. Cette perte de poids lorsqu’elle atteint 20% (point limite de l’expérimentation) s’accompagne souvent d’une réduction de la mobilité voire de prostration et d’isolement dans la cage.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure. Ils ne peuvent en effet être ni réutilisés, ni replacés, ni adoptés car la fin de la procédure implique la mise à mort des animaux pour réaliser le prélèvement des lésions ou organes internes sources de parasites.

Remplacement

Quatre limitations majeures sont à noter quant à l’utilisation de parasites maintenus uniquement en culture : (1) il n’existe aucune méthode permettant de générer et cultiver in vitro certains stades de développement de L.major, L. tropica, L. infantum et de L. amazonensis, (2) à terme les subcultures in vitro des diverses espèces de Leishmania à certains stades de développement se traduisent par la perte rapide d’une mécanisme indispensable pour s’établir chez l’hôte mammifère, (3) il est présentement impossible d’obtenir un autre stade de développement à partir de L. donovani maintenues in vitro, (4) certaines formes de L. donovani sont différentes de celles provenant de tissus animaux, elles ne s’établissent pas chez les mammifères modèles – hamsters- auxquels ils sont inoculés.

Réduction

Ce projet est avant tout destiné à la production de Leishmania virulents ou de tissus colonisés par les parasites pour permettre la réalisation des différents projets scientifiques du laboratoire. De fait il n’exige aucune approche statistique pour définir le nombre d’animaux à utiliser. Ce nombre est donc estimé en fonction des projets du laboratoire en sachant que les parasites purifiés à partir de chaque animal sont utilisés pour plusieurs types d’expérience qui sont ainsi planifiées en conséquence. Les animaux infectés devant être mis à mort pour la production de parasites ou de tissus infectés, il est donc impossible de les réutiliser.

Raffinement

Les animaux sont placés dans des cages en portoir ventilés, la nourriture et l’eau de boisson sont stérilisées (irradiation ou autoclavage). Tout le matériel utilisé (seringues, aiguilles, instruments de mesure) est stérile ou décontaminé avant contact avec les animaux. L’infection parasitaire étant silencieuse en termes de signes cliniques pendant les 8 premières semaines, souris ou hamsters sont observés tous les jours par le personnel de l’animalerie au moment du changement des cages ou par l’expérimentateur. A partir du 2ème mois suivant l’injection des parasites, les animaux sont également examinés chaque semaine pour l’apparition et le suivi des signes cliniques de la maladie. Pour les souris inoculées avec les parasites qui cible le derme, l’évolution de la lésion au site d’injection est estimée par mesure de l’épaississement du coussinet plantaire ou bien du site d’injection chaque semaine par l’expérimentateur. Lorsque celle-ci atteint une taille moyenne maximale de 10 mm (point limite dans le cas d’une injection dans les coussinets plantaires) ou en cas de nécrose les souris sont mises à mort. En cas de détérioration de l’état général des souris celles-ci seront mises à mort. Dans le cas des hamsters, les animaux sont pesés chaque semaine pour mesurer l’évolution de la leishmaniose. Les animaux sont mis à mort selon la procédure validée avant d’atteindre le point limite (20% perte de poids). Pour ces deux espèces, l’injection des parasites est réalisée après anesthésie légère des animaux. Durant la procédure, en cas de prostration ou difficulté locomotrice un gel d’hydratation pourra être placé dans la cage tout comme les granulés alimentaires. De même, une litière douce à base de cellulose pourra être substituée à la litière traditionnelle. Dans ce projet plusieurs sites d’injection des parasites seront comparés quant à la production en nombre de parasites et la possibilité de travailler sur les tissus parasités. Dans la mesure où aucune différence liée au mode d’administration ne serait mise en évidence, la voie d’inoculation choisie pour toute la durée du projet serait celle respectant au mieux la santé et le bien-être des animaux.

Choix des espèces

Le choix des modèles souris et hamster est lié à la susceptibilité de certaines de ces espèces vis-à-vis des Leishmania. Certaines lignées de souris consanguines dites sensibles permettent le développement de L. major, L. tropica et L. amazonensis dans les lésions localisées au site d’inoculation. Certaines souris sont préférentiellement choisies pour la production de ces parasites car elles développent rapidement des lésions très riches en amastigotes et non nécrosantes. En revanche le modèle souris est peu adapté pour les espèces de Leishmania viscérales telles que L. donovani ou L. infantum, d’où le choix du hamster qui développe une pathologie proche de celle observée chez l’homme et rend possible la production en nombre des parasites à partir de la rate et le foie des animaux infectés. L. major, L. tropica et L. amazonensis seront inoculées à des souris âgées de 5 à 8semaines. L. donovani et L. infantum seront inoculées aux hamsters entre la 5ème et la 8ème semaine soit avant la stabilisation de la prise de poids pour un animal non traité. En effet, l’un des premiers marqueurs révélateurs de l’initiation des dommages systémiques est la stabilisation dans la courbe d’évolution du poids, le second révélateur de la progression des dommages étant une perte pondérale.

640 souris vont être utilisées, chacune recevant jusqu'à trente-cinq injections dans l'abdomen sur animal vigile et passant jusqu'à quatre semaines isolée en cage calorimétrique. Une partie porte une mutation qui reproduit la progéria humaine, avec chute des poils, disparition de la graisse sous-cutanée et rides, ce que le porteur déclare sans effet sur leur bien-être. Les prises de sang se font également sur animal vigile, l'anesthésie modifiant la protéine étudiée, et toutes les souris sont tuées à l'issue pour prélèvement d'organes. Le bénéfice avancé, valider une piste thérapeutique contre une maladie qui tue les enfants atteints vers treize ans, reste au conditionnel, tandis que les injections et l'isolement sont, eux, programmés.

Objectifs

La progéria est une maladie qui reste indétectable à la naissance, mais elle commence à se manifester très tôt, souvent dès la première année de vie. Les enfants affectés présentent des signes qui évoquent un vieillissement prématuré et accéléré, tels que la rareté des cheveux (alopécie), une peau fine, ridée, dépourvue de graisse, ainsi que des ongles peu développés. Par ailleurs, ces enfants connaissent une croissance lente, des problèmes osseux et musculaires, et un retard dans la pousse des dents. Ils souffrent également de douleurs articulaires et font face à des problèmes cardiovasculaires, mais il est important de noter que leurs capacités intellectuelles ne sont généralement pas affectées. Malheureusement, le pronostic de cette maladie est très sombre. Le décès survient en général entre l'âge de 6 et 20 ans, principalement à cause de problèmes cardiovasculaires, comme l'athérosclérose, une dégénérescence des artères, des crises cardiaques ou des accidents vasculaires cérébraux. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. Nous souhaitions démontrer que, dans des modèles de souris appropriés, l'inhibition d’une protéine par différentes méthodes (neutralisation de la protéine par des anticorps monoclonaux de haute affinité ou par des auto-anticorps polyclonaux), pourrait retarder le vieillissement prématuré dans des modèles murins de la progéria de Hutchinson-Gilford.

Bénéfices attendus

La progéria provoque un vieillissement prématuré du patient. L'espérance de vie des enfants atteints de cette maladie se situe aux alentours de 13 ans. C’est pourquoi il est important de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Ce projet nous permettra de valider dans plusieurs modèles précliniques une nouvelle stratégie thérapeutique pour traiter la progéria.

Procédures

Un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille sera effectué sur les animaux pour génotypage à raison de quelques secondes par animal effectuée sur animal vigile. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présentent un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle. Les symptômes n’apparaissent qu’aux alentours de la dixième semaine. Toutes les souris seront soumises à des injections intrapéritonéales (injection au niveau de l’abdomen de quelques secondes) (entre 4 et 35 au maximum sur animal vigile) et à un isolement (pour un maximum de deux fois deux semaines soit un total de 4 semaines) en cage calorimétrique. Les prélèvements sanguins (quelques secondes par prélèvement, volume de prélèvement relativement faible pour analyse moléculaire) seront effectués sur animal vigile (anesthésie modifiant les paramètres de la protéine étudiée). A l’issue de la période de maintien ou en cas d’atteinte de points limites, les animaux seront euthanasiés selon une méthode réglementaire afin de réaliser les différents prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les sites des injections ou des prélèvements sanguins pourraient s’infecter. Les manipulations ainsi que le passage en cage calorimétrique pourraient stresser les animaux. Toutes les souris seront soumises à un prélèvement de quelques millimètres à l’oreille, à des injections intrapéritonéales, à des prélèvements sanguins et à être isolées (pour un maximum de 2 fois deux semaines) en cage calorimétrique. Ces injections et ces prélèvements sanguins entrainent un stress lié à la contention et une douleur de courte durée au point d'injection ou de prélèvements. Les isolements peuvent être une source de stress. Les souris transgéniques développant un syndrome de progéria de type Hutchinson-Gilford présenteront un phénotype clinique très semblable à la progéria humaine comme par exemple l’alopécie (accélération de la chute des poils), la perte du gras sous-cutanée, ou encore les rides sans que cela n’affecte le bien-être des animaux ou implique de soin ou de suivi spécifique au modèle.

Devenir

Tous les animaux du projet seront euthanasiés afin de prélever les différents organes pour analyses biochimiques, histologiques, métaboliques.

Remplacement

Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez la souris afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude macroscopique et systémique de la progéria.

Réduction

Ce projet prévoit l’utilisation d’un maximum de 640 souris. Les expérimentations seront regroupées au maximum afin de réduire le nombre d'animaux contrôles. Plusieurs tissus seront prélevés et soumis à diverses analyses (immunologiques, histologiques ou de biologie cellulaire et moléculaire) pour extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Ces tissus seront également partagés avec nos collaborateurs dans le but de réduire le nombre d’animaux utilisés. Pour la réalisation de cette étude, nous utiliserons des groupes de 20 souris (10 femelles et 10 males) pour permettre une évaluation statistique solide des effets analysés.

Raffinement

Les conditions d’hébergement seront conformes à la réglementation et adaptées en accord avec le personnel de l’animalerie (les animaux disposeront de nourriture et d’eau ad libitum ; le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification). Les manipulations seront réalisées dans le souci constant de réduire au maximum l’inconfort et la souffrance des animaux (points limites surveillés, anesthésie/analgésie des animaux, utilisation de lampes chauffantes...). Les animaux seront observés quotidiennement afin de respecter leur bien-être. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale. Le comportement général des animaux sera suivi. Le poids sera mesuré 1 fois par semaine. Des points limites adaptés, suffisamment prédictifs et précoces, seront appliqués afin de limiter la douleur des animaux à leur minimum. Il y aura une vigilance accrue si les animaux ont les mi-clos ou fermés ou s’ils sont isolés. De plus, le personnel impliqué dans ce projet est qualifié sur le plan technique et formé en continu sur les pratiques d’expérimentation animale.

Choix des espèces

Le choix de la souris pour la réalisation des expériences envisagées se justifie par des raisons d’ordres scientifiques et éthiques : - La souris est l’animal dont la génétique est la mieux connue. - Notre centre de recherche utilise principalement des souris ce qui offre de nombreux avantages en termes d’élevage, d’expertise en techniques d’expérimentation animale ainsi que le suivi microbiologique et vétérinaire des animaux. - La souris est le modèle animal le plus couramment utilisé par la communauté scientifique internationale et pour les études précliniques. La méthodologie envisagée est d’une mise en place relativement aisée sur ce type d’animal et nous avons acquis une pratique expérimentale sur cette espèce. Selon les procédures, les animaux seront utilisés à partir de 6 semaines afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.

Mis à jeun douze heures, gavés une fois par voie orale, saignés à l'extrémité de la queue deux minutes plus tard : 640 souris et 320 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, sans anesthésie jusqu'à la mise à mort. Le protocole vérifie si des peptides vecteurs franchissent la paroi intestinale pour passer dans le sang, une technologie que la société veut étendre du cerveau à l'intestin. Le porteur reconnaît un risque de fausse route et de complication respiratoire si le gavage est mal exécuté, et présente le recours aux animaux non-humains comme le "principal désavantage" de sa demande. Tous reçoivent une dose létale d'anesthésique, puis leurs tissus sont prélevés.

Objectifs

Ces dix dernières années, notre société et ses partenaires académiques ont réussi à identifier et développer une stratégie de vectorisation innovante, afin de proposer de l’adressage spécifique de médicaments au niveau du système nerveux central après administration parentérale. Ce transport est réalisé à l’aide de protéines ou peptides cargos qui ciblent spécifiquement les récepteurs membranaires situés aux niveaux des barrières cellulaires de l’organisme, dans notre cas, la barrière Hématoencéphalique (BHE) du cerveau. Le succès de ces travaux et les dernières collaborations internationales ont démontré tout le potentiel de notre technologie sur le développement de nouveaux traitements contre certaines neuropathies. Cet engouement a permis de développer de nouveaux axes de recherches, notamment sur certaines maladies chroniques liées à l’hygiène de vie (Cancers, Diabètes, obésités), devenues le fléau de ces 20 dernières années. C’est dans ce contexte que nous souhaitons relever de nouveaux défis et utiliser notre technologie pour franchir de nouvelles barrières cellulaires de l’organisme, cette fois-ci au niveau intestinal, en améliorant l’adressage de médicaments administrés par voie orale. Il s’agira dans cette demande de démontrer qu’après administration orale chez le rongeur, nos protéines et peptides vecteurs seront capables de résister aux contraintes et attaques du tube digestif (Enzymes, pH), puis de valider leur passage spécifique à travers la barrière épithéliale, de l’intestin vers le sang.

Bénéfices attendus

Nous souhaitons tester le potentiel d’action de nos vecteurs sur de la délivrance systémique par voir orale. Notre objectif sera donc de relever ce nouveau challenge et de transposer notre savoir-faire et technologique sur de l’application « Drug-Delivery » par voie orale. Ainsi, nous pourrions proposer de nouveaux concepts et alternatives thérapeutiques facilitant le quotidien des soignants et des patients par un meilleure accessibilité (traitements devenus trop coûteux ou trop contraignants), conservation et praticité. L’application de notre stratégie de vectorisation pourrait également servir de levier dans bon nombre de pathologies à enjeux de santé publique.

Procédures

Au cours de cette procédure, nous n'aurons pas d'anesthésie, ni d'étape chirurgicale. Les animaux seront uniquement manipulés éveillés et de manière délicate. L'absence de stress est ici un garant du succès et bon déroulement de la procédure. En point final, les animaux seront d'abord mis à mort avant le prélèvement tissulaire final. -Constitution des cohortes d'animaux : Manipulation douce et unique pour la pesée et l'annotation codale des animaux, pour une durée de 2 minutes. -Administration par voie orale : Gestes et manipulations ultra-précis pour réaliser correctement cette étape. Administration simple et unique sans intervention parentérale, pour une durée de 1 minutes. -Prélèvements sanguins intermédiaires : A l'extrêmité de la queue afin d'y collecter quelques gouttes de sang. Geste contentionné expert et précis qui réduit considérablement le stress. Durée Approximative 2 minutes. -Mise à mort pour prélèvements (sédatoin à dose létale + contastation du décès) : Contention manuelle rapide et précise pour réaliser l'injection intrapéritonéale du mélange d'anesthésique à dose létale.

Impact sur les animaux

Les possibles effets ou effets indésirables sont ici listés pour chacunes des manipulations/expérimentations. -Transport et adaptation : Le transport est une source de stress non négligeable dont il faudra tenir compte avant d'envisager les tests. -La stabulation peut engendrer un temps d'adaptation, du stress, ayant un impact sur l’alimentation et le comportement, donc la prise de poids. -Mise à jeun des animaux : Nécessaire à la bonne réalisation de l'étude, les animaux seront mis à jeun 12h avant le début des administrations. Cette phase relativement courte, induira un léger stress transitoire, mais n’aura pas de réel impact sur la santé des animaux. En effet, les données de la littérature démontrent une absence d’effets significatifs sur le poids et l’activité métabolique en cas de mise à jeun inférieure à 18h. -Administration per os (Gavage par voie orale) : Réalisée sur animal éveillé et contentionné manuellement, il est ainsi immobilisé, ce qui génère un certain stress. L'acte de gavage est une gêne évidente mais très brève. Si le geste n’est pas bien réalisé, il y a cependant un risque notable de fausse route et de complication respiratoire. -La manipulation pour la réalisation des prélèvements sanguins intermédiaires : De même que pour le gavage, cette étape sera réalisée sur animal éveillé, après immobilisation en contention spécialisée. L'animal n'aimant pas être coincé, c'est une source de stress (≤2 min). -La manipulation pour l’administration d’une dose létale d’un mélange d’anesthésique : Source de stress au moment de l'injection intrapéritonéale, le geste rapide sera totalement maîtrisé par le manipulateur.

Devenir

L'issue de l'étude étant le prélèvement de tissus, tous les animaux seront mis à mort en point final, par administration d'un anesthésique à dose létale.

Remplacement

Afin de mener à bien notre projet, nous n’utiliserons que nos vecteurs préalablement investigués sur des études in vitro (cellules) ainsi qu’in vivo sur des récents suivis pharmacocinétiques et de biodistributions. Ces premières séries de tests amonts ont notamment permis de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires cibles (cultures cellulaires, mesure d'affinité pour le réceptuer cible), mais restaient insuffisantes pour prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations). Afin de transposer notre modèle de pharmacologie pour de la voie orale nous devrons absolument envisager de réaliser notre administration orale sur le petit animal de laboratoire, ici le rongeur (rat et souris). En effet, la physiologie complexe du tube digestif nous impose l’utilisation de modèle vivo. Des modèles prédictifs ex vivo existent mais nécessitent également le sacrifice d’animaux, sans pour autant intégrer l’ensemble des mécanismes physiologiques périphériques précédemment cités. Afin d’éviter une utilisation encore plus importante d’animaux, notre procédure simple, sur de courtes cinétiques, avec des prélèvements optimisés (intermédiaires et finaux), restera la plus avantageuse en termes de résultats scientifiques pour un nombre d’individus utilisé. Le choix du modèle rongeur se justifie comme étant pour l’heure le 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques, sans trop de contraintes d’hébergement, ni de manipulations. Son utilisation sous forme de faibles cohortes permet d’exploiter au maximum les résultats par l’obtention de données statistiques significatives. Malheureusement, il n’existe pour le moment aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes ces réponses ou suffisamment complexe et informel tel que les organoïdes ou sphéroïdes. Dans notre cas, le principal désavantage de cette demande reste donc le recours indispensable à l’utilisation d’animaux. Il s’agit maintenant de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus à utiliser.

Réduction

Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes de n=4 (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 5 groupes par test et 8 études par an, ce qui représente 160 individus/an (80 mâles + 80 femelles) pour chacun des fonds et espèces utilisées. Tel que largement décrit dans la littérature pour un modèle « oral delivery », nous utiliserons dans un premier temps le modèle souris sur fond albinos, à raison de 160 individus par an. En parallèle nous voudrons vérifier nos données obtenues sur un autre modèle souris, de fond consanguin, pour un nombre équivalent d’animaux (maximum 160/an). En effet ce modèle utilisé dans nos précédentes études Pharmacologiques sera précieux pour de futurs essais sur récepteurs humanisés en vue d’une transposition à l’homme. Enfin, le modèle souris présentant certaines divergences fonctionnelles et un modèle plus développé, sera indispensable dans nos investigations. Nous travaillerons à la suite des deux précédents, sur rats de fond albinos standard, pour un gros maximum de 160 individus/an. Il est important de noter que pour chaque espèce, ce nombre total d’animaux sera mixte à 50/50 entre mâles et femelles (cages séparées). Pour une analyse statistique, le faible « n » (4 individus), sera suffisant et nous orientera vers des modèles non-paramétriques. Sur de l’expérimentation in vivo, tous les paramètres ne sont pas maîtrisés, et sont basés sur des populations aléatoires de souris ou chaque animal présente des variables individuelles. En fin de procédure, une liste ciblée de tissus à prélever nous évitera une utilisation abusive et inutile d’animaux et permettra d’optimiser la procédure sur plusieurs types de post-expérimentations. La réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (Maximum 1 prélèvement caudal/individu ≤50 μl) en cours de cinétique, permet d'obtenir des données précieuses sur le passage systémique de nos candidats, en plus du prélèvement en point final, ce qui va également dans le sens d'une optimisation et réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal (Annexe 2 : grille scores et points limites). Nous porterons une attention particulière à la préparation amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux, laquelle sera au minimum de 14 jours dès réception. 7 jours avant les administrations, les animaux seront sortis de l’hébergement conventionnel pour aller dans une pièce cyclée spécifique rats ou souris (cyclée12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Ils sont maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle à filtre), un maximum de 2 individus par cage (car groupes n=4 mixtes de 2 mâles + 2 femelles), litières (copeaux de bois) et double raffinement (maison en plastique + cartons déchirés). Les animaux y seront visités régulièrement afin d’être sensibiliser à l’expérimentateur. A J0, les manipulations et administrations se feront sur animaux éveillés, il n’y aura pas d’anesthésie en cours d’étude jusqu’à la mise à mort en point final. En cours d’étude, les pesées, administrations et prélèvements intermédiaires de sang seront précis et rapides (≤ 2min). Des points limites seront malgré tout établis, afin de pouvoir répondre à une situation d’urgence. En point final, une injection létale d’anesthésiques en intrapéritonéale permettra une mise à mort rapide des animaux sans stress ni douleur. Nous n’utiliserons ici que des animaux couramment utilisés en recherche pour des études de pharmacocinétiques, sur fonds albinos ou consanguins et non génétiquement modifiés.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études de pharmacocinétiques (groupes de 4 individus). A l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur (souris et rat), reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, Il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques) et une diminution des posologies. Les animaux seront utilisés pour réaliser des cinétiques pharmacologiques périphériques et des échantillonnages de sang et tissus. Pour notre procédure et les trois lignées d’animaux (rat x1 et souris x2) nous utiliserons des animaux dits « jeunes adultes », ayant une moyenne de 8 à 10 semaines pour les souris et 6 à 8 semaines pour les rats. A cet âge, nous limitons les variations inter individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Cet âge présente un poids moyen de 25-27g environ chez la souris et 120-140g chez le rat, ce qui s’avère plus économique et mois risqué en termes de posologies par rapport à des animaux plus âgés (réduction des doses).