Autre recherche fondamentale

4 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour les prélèvements finaux, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est refroidie jusqu'à 32 °C par hypothermie provoquée, avec dix à quinze prises de température rectale espacées de quinze à trente minutes sur trois à cinq heures, une à trois administrations intraveineuses ou sous-cutanées et jusqu'à quatre prélèvements de sang, sans anesthésie ni analgésie. Cette hypothermie sert de signal pour mesurer si des molécules attelées à un médicament franchissent les barrières de l'organisme, sur une lignée dont le récepteur cible a été humanisé. Le porteur écrit travailler "faute d'alternatives de remplacement" et présente la souris comme "le seul système physiologique" intégrant les paramètres qu'il veut mesurer.

Objectifs

Les maladies neurologiques, musculaires et les maladies rares font partie des causes majeures de handicaps sévères dans le monde. À l'heure actuelle, les besoins médicaux actuels restent malheureusement très insatisfaits, sans aucun traitement curatif, ou palliatif. Une des raisons majeures réside dans l’inefficacité de nombreux médicaments à passer la barrière protectrice du cerveau et ainsi à accéder aux régions à traiter. Dans ce contexte, notre avons développé un savoir-faire qui consiste en l’association de molécules à des pro-drogues ou médicaments, capables de passer les barrières biologiques protectrices de l’organisme et ainsi atteindre plus efficacement les tissus cibles (cerveau, muscles…). Notre technologie repose sur une stratégie de cheval de Troie : Nos médicaments sont capables de reconnaître des partenaires spécifiques, au niveau des barrières protectrices de l'organisme et utilisent leurs mécanismes naturels de passage cellulaire pour atteindre le tissu cible. À travers cette demande de projet, nous souhaitons développer et optimiser de nouveaux médicaments afin d’améliorer la délivrance d’agents au fort potentiel thérapeutique. Par différentes voies d'administration, nous tenterons de potentialiser l’effet de nos médicaments, sur une lignée murine humanisée pour le récepteur cible de ce projet.

Bénéfices attendus

Choix d’une lignée murine humanisée pour notre récepteur d'intérêt : La transposition de nos recherches sur un modèle de souris humanisées, permet d’appréhender les futurs développements pré-cliniques de nos molécules et les possibles effets secondaires ou toxicités associées. De plus, elle assure de développer au maximum les études sur le modèle souris avant la phase préclinique et la transposition à l’homme, qui aurait nécessité des séries de tests sur divers modèles animaux. Enfin, le fait de pouvoir humaniser notre cible chez la souris constitue un excellent outil stratégique et scientifique, se traduisant par une réduction importante du nombre d’animaux au sein des études, par un gain de temps considérable (et de coût), tout en réduisant par la suite de potentiels essais sur modèles animaux plus gros. D'un point de vue médical, sur du plus long terme, le potentiel de ciblage thérapeutique de nos médicaments constitue l'objectif majeur de nos recherches, avec à terme, un bénéfice attendu qui pourrait permettre des avancées majeures dans le milieu médical et sur le quotidien des patients.

Procédures

Les manipulations expérimentales seront réalisées sur animaux vigiles et de manière précises et rapides (≤ 2min). Elles incluent : L’annotation des queues au moyen d’un marqueur spécifique permettant l’identification des individus (1 fois /semaine). Les pesées : Une pesée sera réalisée avant chaque administration et une avant l’euthanasie des animaux. La prise de température rectale (10 à 15 prises espacées de 15 à 30 minutes sur une durée de 3 à 5 h). La mise en contention (avant toutes administrations (1 à maximum 3) ou prélèvements intermédiaires (maximum 4). Les administration(s) intraveineuse(s) ou sous-cutanée(s) : 1 à maximum 3. A noter : Dans le cas d’administration répétées, un délai de minimum 24 à 48h sera respecté entre deux administrations. Les administrations intrapéritonéales : 1 seul/individu (euthanasie). Les prélèvements intermédiaires : Des prélèvements sanguins intermédiaires seront réalisés en cours de cinétique (maximum de 4 prélèvements de 50µl/semaine). Cette procédure ne présente pas d’anesthésie, pas d’analgésie, ni de chirurgie avec réveil.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables sont les suivants : Un stress physique peut être induit lors de la mise en contention des animaux, la réalisation des différentes administrations (une ou trois maximum par individu), l’introduction d’une sonde rectale (prise discontinue sur 5h maximum) lors du monitoring de la température et lors de la réalisation de prélèvements sanguins intermédiaires (au maximum 4 prélèvements /individus, n’excédant pas 10% de la volémie sur 7jours). Un stress thermique pouvant quant à lui être généré par l’hypothermie induite (jusqu’à 32°C).

Devenir

En fin de procédure, les animaux seront mise à mort pour réaliser les prélèvements tissulaires et sanguins finaux. Si, en cours de cinétique, un individu atteint un point limite, l'animal sera également mis à mort en urgence après validation du vétérinaire et porteur de projet.

Remplacement

Pour mener à bien nos projets, nous réalisons en amont de nos procédures toute une série de tests in vitro. Cette première série de tests permet notamment de vérifier le maintien des interactions avec les récepteurs cellulaires, mais en aucun cas de prendre en compte l'intégralité des paramètres physiologiques (mécanistiques, immunitaires, métaboliques et d'éliminations) qui conditionnent le succès de nos médicaments. Pour faire face à cette sélection physiologique, nous envisagerons donc de réaliser nos expériences sur le petit animal de laboratoire, ici la souris, 1er modèle animal disponible se rapprochant de l’homme pour l’étude des mécanismes physiologiques in vivo. Il n'existe à l'heure actuelle aucun modèle prédictif de bio-informatique capable d'apporter toutes les réponses aux problématiques de la pharmacocinétique, ou suffisamment informel. Le modèle vivant, ici la souris, reste pour l'instant le seul système physiologique qui intègre la complexité de l'ensemble des paramètres mécanistiques précédemment cités, indispensables à l’étude d’une efficacité pharmacologique chez les mammifères. Dans notre cas, le principal désavantage concerne donc le recours à l’utilisation d’animaux. Il s’agit alors de définir à minima et au plus juste le nombre d’individus. L’utilisation de faibles cohortes d'animaux permettra d’aller en ce sens, tout en allant exploiter un maximum de résultats et par l’obtention de données statistiques significatives.

Réduction

L’optimisation de nos vecteurs en fonction de la voie d’administration permet d'envisager une médication optimisée et réduite (doses moins importantes), limitant de ce fait les possibles effets secondaires non souhaités (Raffinement), mais aussi de limiter le nombre d’individus au sein de la procédure (Réduction). Le nombre total d’animaux sera réparti sur de petits groupes mixtes 4 individus (2 mâles/2 femelles), à raison de maximum 8 groupes par étude et 15 études par an, sur chacune des deux lignées de souris. Aussi, nous n’aurons besoin que de 960 animaux par an (4 *8*15*2), soit un total de 4800 souris sur 5 ans (960*5). Il est important de noter que ce nombre total d’animaux sera mixte (50%mâles et 50% femelles (cages séparées). Le faible nombre d’individus (4, ici) sera suffisant pour obtenir une analyse statistique robuste. Les prélèvements de tissus en fin de procédure, nous permettrons d’optimiser cette dernière sur plusieurs types de post-expérimentations en apportant des données supplémentaires et ainsi, nous permettront d’éviter une utilisation abusive et inutile d’animaux (Réduction). De façon identique, la réalisation de prélèvements sanguins en cours de cinétique permet d'obtenir davantage de données pharmacocinétique, permettant ainsi de renforcer et d’optimiser l’étude et in-fine de réduire le nombre d’animaux.

Raffinement

La formation initiale et l’expérience du personnel sont nécessaires pour appréhender les moindres signes et/ou comportements caractéristiques d’une douleur ou gène chez l’animal. Nous porterons une attention particulière à la préparation en amont de l’expérimentation. Elle regroupe l’ensemble des préparatifs, l’adaptation, le conditionnement et la stabulation des animaux (7 à 14 jours avant expérimentation). 48h à 72h avant les administrations, les souris sont sorties de l’animalerie dans une pièce avec un cycle de lumière obscurité (12h/12h), insonorisée, en armoire ventilée, sous température et hygrométrie contrôlées, avec nourriture et boisson ad libitum. Un maximum de 4 individus de même sexe par cage, maintenus dans un contexte familier (pour les odeurs), dans la même cage (taille standard pour portoir ventilé + couvercle filtrant), litières (copeaux de bois) avec un triple enrichissement. Les animaux sont ainsi isolés du lieu d’expérimentation (odeurs et bruits) pour éviter toute communication de stress et angoisse. Le choix des cinétiques sera également affiné au plus juste pour éviter de longs tests inutiles et de possibles angoisses supplémentaires. De plus, travaillant sur animal sain, la simplicité des administrations uniques ou répétées sur animal vigile et le court laps de temps d’exposition des molécules, nous permettent d’éviter toute apparition potentielle de phénotypes dommageables chez les animaux. Dans cette procédure, nous utiliserons des animaux issus d’élevages extérieurs issus de deux fournisseurs différents.

Choix des espèces

Les rongeurs représentent cette famille de petite taille, facile d'utilisation et d’élevage, pratique pour les études de pharmacologies et comportementales, elle est donc idéale pour la mise en place de premières études précliniques (groupes de 4 individus). À l’heure actuelle, faute d’alternatives de remplacement, le modèle rongeur, ici la souris, reste le seul modèle accessible de « petit mammifère » dont la physiologie est bien connue et relativement proche de l’homme. Par sa petite taille, il devient également très intéressant pour la balance pharmacologie/toxicologie (bénéfices/risques et diminution des posologies). Notre modèle de transposition sur la lignée humanisée est particulièrement avantageux, car il présente une cible humanisée (récepteurs) tout en gardant les avantages cités précédemment. Les données obtenues sur ce modèle permettront notamment une extrapolation plus pertinente au modèle humain, d’envisager un gain de temps dans le développement futur du projet, mais aussi, d’éviter un certain nombre d’études et une utilisation significative d’animaux. Les animaux seront utilisés pour réaliser des suivis pharmacologiques, des échantillonnages de tissus, d'organes ou de liquides physiologiques, ceci à des fins scientifiques. Pour notre procédure, nous utiliserons pour les deux lignées, des animaux dits « jeunes adultes », âgés en moyenne de 8 à 12 semaines. A cet âge, nous limitons ainsi les variations inter-individus qui peuvent avoir un impact sur les mécanismes physiologiques et les modulations de l'expression de certaines protéines. Ce stade « jeune adulte » présente un poids moyen de 27-30g environ, ce qui s’avère plus intéressant en termes de posologies (réduction des doses).

Tuées pour qu'on récupère leur sang et leur rate, 100 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune reçoit cinq injections sous-cutanées d'un peptide mélangé à de l'adjuvant de Freund incomplet, dont le porteur indique qu'il provoque des douleurs articulaires, en plus d'une rougeur, d'une inflammation et d'une élévation de température pendant les 72 heures suivant chaque inoculation. Cinq prélèvements sanguins suivent, puis une thoracotomie et une ponction cardiaque de quinze à vingt minutes. Le porteur qualifie d'"indispensable" le recours à la souris faute de méthode in vitro fiable pour produire des anticorps spécifiques, tout en décrivant l'étape suivante du projet, l'immortalisation des cellules de rate prélevées, comme permettant une production infinie d'anticorps sans utiliser d'autres animaux.

Objectifs

Ce projet vise à développer des anticorps polyclonaux anti peptide et d’en dériver des lignées d’hybridomes monoclonaux sécrétant de façon infinie les anticorps ciblant ces peptides. 25 peptides d’intérêt majeur dans la lutte contre les infections bactériennes ont été identifiés et caractérisés par le laboratoire. La production d’anticorps dirigés contre ces peptides permettra dans un premier temps d’obtenir des outils utiles pour développer nos travaux de recherche et dans un second temps d’envisager leur utilisation dans des tests diagnostiques et dans des biothérapies. Le but final est de diminuer ou remplacer les antibiotiques dans le traitement de maladies infectieuses à germes multirésistants.

Bénéfices attendus

Dans un premier temps, il s'agit d’obtenir des outils pour développer nos travaux de recherches et définir plus précisément le rôle de chaque peptide dans la virulence et la pathogénicité de différents germes tel que Staphylococcus aureus ou Pseudomonas aeruginosa. Dans un second temps nous envisageons leur utilisation dans des tests diagnostiques et dans des biothérapies visant à remplacer les antibiotiques dans le traitement de maladies infectieuses à germes multi résistants.

Procédures

5 injections sous-cutanée à but vaccinal d'une durée de 5 à 10 minutes maximun suivant le temps d'endormissement, 5 prélèvements sanguins de 30 secondes pour un suivi sérologique de la réponse immune. Une thoracotomie et un prélèvement cardiaque d'une durée de 15 à 20 minutes. Toutes ces procédures seront effectuées sous anesthésie générale profonde

Impact sur les animaux

Comme dans la plupart des procédures vaccinales, on s’attend à une rougeur, une inflammation et une douleur au site d’injection pendant les 72h qui suivent l’inoculation ainsi qu’une élévation de la température corporelle. L’utilisation d’adjuvant de Freund incomplet induit aussi des douleurs articulaires.

Devenir

Le but final de ce projet est la production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre des peptides d'intérêt à visée thérapeutique anti-infectieux. Les animaux après vaccination suivront la procédure 2 et seront mis à mort pour récupérer leur sang contenant les anticorps polyclonaux et leur rate contenant les cellules productrices d'anticorps.l'immortalisation de ces cellules spléniques a pour but la génération d'hybridomes sécrétant de façon infinie des anticorps monoclonaux.

Remplacement

Concernant la première étape de ce projet il est indispensable d’avoir recourt à l’animal car il n’existe pas de méthode fiable in-vitro pour la production d’anticorps spécifiques de molécules. Cependant, afin de remplacer les animaux dans la production massive d’anticorps, nous allons procéder à l’immortalisation des cellules productrices de nos anticorps (générées durant la première étape au sein de la rate) pour obtenir des lignées cellulaires stables permettant une production infinie de nos anticorps sans avoir recourt à d'autres animaux.

Réduction

Dans le cadre de la réduction du nombre d’animaux nous utiliserons 4 souris maximum par peptide. Par expérience la quantité d’anticorps polyclonaux obtenue sera suffisante pour nos premiers travaux de recherche. La génération des lignées d’hybridome (sécrétant les anticorps monoclonaux) aura deux impacts sur la réduction des animaux utilisés. Le premier et le plus direct concerne la production en masse des anticorps en culture cellulaire animale et le deuxième est la mise en place après séquençage des régions variables de nos anticorps d’une production d’anticorps recombinant dans un système d’algue éliminant ainsi l’utilisation de sérum de veau fœtal très consommateur d’animaux.

Raffinement

Afin de répondre au principe de raffinement les prélèvements de sang permettant d’effectuer le suivi sérologique de l’apparition des anticorps seront effectués en sub-mandibulaire sous anesthésie générale à l’isoflurane. Les volumes seront limités à 50µl soit environ 2 gouttes. Durant les 72h suivant chaque injection d’immunogène les animaux recevront du paracétamol dans l’eau de boisson. Une surveillance particulière sera effectuée après le premier rappel et jusqu’à la fin de la procédure par la mesure d’un score clinique quotidien basé sur le mouse grimace scale. Pour un score allant de 2 à 3 les animaux seront maintenus sous paracétamol au-delà de 3 les animaux concernés seront mis à mort pour suivre la procédure de prélèvement final. L’ensemble des règles d’hébergement en accord avec l’agrément de notre établissement utilisateur sera évidemment respecté à savoir enrichissement, température, taille des cages, cycle jour/nuit et visite quotidienne.

Choix des espèces

La souris est l’espèce la plus utilisée pour l’obtention d’anticorps. Elle permet d’obtenir une réponse immune avec très peu d’immunogène (facteur souvent limitant par le cout de production et de purification des immunogènes ici des peptides). De plus le myélome permettant l’immortalisation des cellules productrices d’anticorps est murin et facilite donc la création d’hybridomes sécréteur d’anticorps d’intérêt. Les souris auront un âge compris entre 6 et 10 semaines période où le système immunitaire est parfaitement fonctionnel.

50 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage avec un nématode intestinal, puis par injection dans l'abdomen d'un parasite du paludisme, subissent sept prélèvements de sang en vingt et un jours par incision de la queue puis retrait de la croûte de cicatrisation, et reçoivent jusqu'à six injections de traitement. La coïnfection provoque une anémie plus marquée et plus longue qu'une infection isolée, le porteur qualifiant par ailleurs l'infestation par le ver d'asymptomatique. Il conclut que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro, et que les souris ne peuvent pas être réutilisées, leur système immunitaire n'étant plus naïf.

Objectifs

L’objectif du projet est d’identifier des traitements possibles en vue d’améliorer les symptômes de la coïnfection entre nématodes intestinaux et malaria. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les Plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela a des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque Plasmodium infecte un hôte préalablement infecté par le nématode, on constate une aggravation des symptômes par rapport aux cas où les hôtes sont uniquement infectés par Plasmodium. Dans ce projet, nous souhaitons évaluer l’efficacité de certains traitements pouvant contribuer à améliorer les symptômes en cas de coïnfection.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier les mécanismes pouvant jouer un rôle dans l’aggravation des symptômes produits par Plasmodium lors de coïnfections avec un nématode intestinal. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection, on constate souvent une aggravation des symptômes induits par Plasmodium. Notre projet vise donc à identifier des pistes thérapeutiques pouvant améliorer les symptômes observés dans les cas de coïnfection.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des groupes expérimentaux): gavage à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Le nématode produit des infections asymptomatiques (aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté). Très rarement (< 1% des cas), l’émergence des vers peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. Plasmodium yoelii 17X NL est une souche non létale. L’infection produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection). A partir de jour 24 post-infection les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Cependant, en cas de coïnfection on constate des niveaux plus importants d’anémie et un temps de récupération plus long. L’infection avec le nématode est effectuée par gavage (intervention réalisée en quelques secondes), à l’aide d’une sonde souris (rigide). Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau. L’infection avec Plasmodium est effectuée par injection intrapéritonéale (intervention réalisée en quelques secondes). Les traitements avec l’érythropoïétine et l’hémopexine nécessitent trois et six injections intrapéritonéales respectivement. Ces injections seront au minimum espacées d’un jour. Les prélèvements de sang sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs. Deux prélèvements maximum par semaine sont réalisés. Ces différentes interventions ne concernent pas toutes les souris. Un chronogramme fourni en annexe indique les interventions pour chaque groupe expérimental.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’explorer des mécanismes pouvant conduire à l’aggravation des symptômes induits par Plasmodium chez les hôtes coïnfectés et de tester des traitements visant à améliorer ces symptômes. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

Pêchées à l'entrée des estuaires puis élevées quinze à dix-huit mois en aquarium, avec un taux de survie estimé à 30 %, 3 000 civelles sont collectées pour que 720 anguilles européennes entrent dans les procédures, déclarées d'un niveau de souffrance modéré. Chacune est exposée à l'une de quatre doses de bisphénol S et reçoit, sous anesthésie, une intubation gastrique qui l'infeste d'un ver parasite se nourrissant de son sang. Elles sont tuées par groupes vingt, quarante et soixante jours après le début de l'exposition, les surnuméraires étant relâchées dans leur milieu d'origine. L'anguille européenne est classée en danger critique d'extinction depuis 2008, et le porteur en tire argument pour écrire qu'il n'est pas possible de recourir à des méthodes de remplacement de cette espèce.

Objectifs

Dans leurs environnements naturels, les animaux aquatiques sont exposés à une variété de contaminants biologiques et chimiques. Parmi les contaminants biologiques, les parasites affectent par définition la physiologie de leurs hôtes, les obligeant à réallouer leur énergie pour mieux résister. Parmi les contaminants chimiques, les agents plastifiants, tels que les dérivés du bisphénol, sont des polluants émergents potentiels, présents dans les débris plastiques et les eaux usées industrielles, qui contaminent l'environnement aquatique et induisent de multiples problèmes de santé qui nuisent à la survie des animaux exposés. Bien que de nombreuses études aient rapporté les effets de l'un ou l'autre, les mécanismes immédiats qui sous-tendent les effets néfastes induits par les parasites et les polluants organiques, agissant en combinaison, sur les organismes aquatiques n'ont pas encore été tous examinés. Dans ce projet, nous nous concentrerons sur 1) un ver parasite connu pour être pathogène de l’anguille européenne, espèce sentinelle des milieux aquatiques, menacée d’extinction (depuis 2008, UICN) mais non protégée et, 2) un agent plastifiant, le bisphénol S (BPS), polluant émergent particulièrement préoccupant à l’heure actuelle car de plus en plus utilisé dans l'industrie comme alternative au bisphénol A interdit en France dans tous les contenants alimentaires depuis 2015. L'objectif premier du projet est d'étudier les effets du BPS et/ou du ver parasite sur la physiologie de l’anguille européenne afin de répondre aux questions suivantes : 1. L'exposition à des doses croissantes de BPS rend t’elle l'anguille européenne plus vulnérable au parasite supposé impliqué dans son déclin ? 2. L'infestation par le parasite diminue t’elle la capacité de l'anguille à faire face à l'effet du BPS ? Enfin, au delà de l’apport de connaissance scientifique relatif à l’étude de l’impact combiné de ces deux contaminants, notre deuxième objectif est d’étudier le potentiel du mucus cutané de l’anguille (le mucus est la 1ère barrière des organismes aquatiques face à l'environnement extérieur) pour appréhender de manière non létale l'état de santé/stress de ce poisson.

Bénéfices attendus

Le projet permettra de répondre aux exigences et recommandations prévues dans les plans de gestion de l’anguille européenne à savoir : 1) améliorer les connaissances sur les mécanismes induits par une double contamination chimique et biologique des anguilles et identifier la réponse de ce poisson vis-à-vis des 2 contaminants ciblés (BPS et le ver parasite individuellement ou en combinaison), 2) développer des biomarqueurs à partir du mucus cutané de l'anguille afin d'évaluer son état de santé/stress à l'aide de méthodes qui ne nécessitent pas de tuer les animaux et, 3) évaluer la potentielle menace, actuelle ou future, induite par le BPS sur l’anguille afin de proposer des recommandations pour sa conservation (niveau seuil de BPS dans l’environnement).

Procédures

Exposition à 4 doses différentes de Bisphénol S et à une infestation unique par un ver parasite (intubation gastrique), cette dernière étant effectuée sous anesthésie. Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures expérimentales à 3 pas de temps après le début des procédures soit 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou infestation.

Impact sur les animaux

Les nuisances ou effets indésirables auxquels on peut s’attendre seront à priori assez réduits dans la mesure où les doses de contaminants chimique (BPS) et biologique (parasite) utilisées dans les procédures sont des doses relativement faibles et environnementales et que la durée de la procédure est assez courte (60 jours). Cependant, on peut toutefois s’attendre à une légère anémie des poissons infestés par le ver parasite qui se nourrit du sang de l’anguille ainsi qu'à de potentielles modification de comportement, réduction de vivacité ou diminution de l'embonpoint à la plus forte dose du contaminant chimique.

Devenir

Les animaux soumis aux procédures expérimentales seront successivement euthanasiés 20, 40 et 60 jours après le début de l’exposition et/ou contamination.

Remplacement

Ce projet visant à évaluer l’impact de 2 contaminants (chimique émergeant, le BPS, et biologique pathogène, le ver parasite Anguillicola crassus) sur la physiologie de l’anguille européenne (espèce classée en danger critique d’extinction depuis 2008 par l’UICN), il n’est pas possible d’utiliser des méthodes de remplacement de cette espèce.

Réduction

Le taux de survie des juvéniles d'anguille, après collecte et au début de leur mise en élevage en aquarium, estimé à 30%, ainsi que les potentiels échecs des infestations expérimentales par le parasite et/ou des contaminations chimiques nous contraignent à collecter et élever 3000 juvéniles d'anguille pour la bonne réalisation de l’ensemble du projet (720 juvéniles d'anguille feront l'objet des procédures expérimentales). En effet, la nécessité du maintien des civelles en élevage pendant 15 à 18 mois avant la mise en œuvre des procédures expérimentales sont des contraintes fortes qui imposent cette démarche. A la fin du projet, les anguillettes surnuméraires n’ayant pas fait l’objet des procédures expérimentales seront relâchées dans leur milieu d’origine.

Raffinement

Dans le cadre de notre projet, plusieurs mesures seront prises pour limiter inconfort, stress et souffrance des individus depuis leur collecte jusqu’à la fin des procédures expérimentales. La manipulation des juvéniles d’anguille sera effectuée à l’aide d’une épuisette à maille fine afin de ne pas les blesser, en pratiquant des gestes lents et délicats afin de ne pas les stresser tout en permettant une collecte rapide et non traumatisante. Par ailleurs, les juvéniles d’anguille étant grégaires et fuyant la lumière, des tuyaux en PVC alimentaire seront placés dans les aquariums pour que ces jeunes stades puissent s’y regrouper et s’y cacher. De même, un éclairage indirect sera privilégié pendant les temps d’éclairement afin de réduire au maximum tout stress induit par une intensité lumineuse trop forte sur les aquariums et de simuler au sein de ceux-ci des zones moins éclairées, refuges naturels pour ces animaux qui se cachent durant la journée. L’alimentation des juvéniles d’anguille sera également adaptée afin de les habituer progressivement à passer à une nourriture artificielle inerte. De plus, toutes les mesures (poids et taille) ainsi que les infestations expérimentales par le ver parasite s’effectueront sous anesthésie, optimisée pour ces jeunes stades de vie.

Choix des espèces

L'anguille européenne joue un rôle écologique majeur et revêt une valeur économique importante. Suite à la diminution drastique de sa population, elle est classée comme espèce en danger critique d’extinction par l’IUCN (2008) mais non protégée. Parmi les facteurs potentiellement responsables de l'effondrement de sa population figurent les contaminants chimiques (dont le BPS) et biologiques (parasite Anguillicola crassus, pathogène de l’anguille). Dans ce contexte de fort déclin et volonté de contribuer à sa préservation (R(CE) 1100/2007), il convient en 1er lieu de combler le manque de connaissances lié à l’impact de ces contaminants agissant en combinaison (conséquences physiologiques du stress induit). Il devient également urgent de tenter de développer un outil non létal de l'état de santé/stress de ce poisson pour en assurer le suivi en conditions naturelles (développement de protocoles non létaux inscrit dans le Plan de Gestion pour les Poissons Migrateurs 2022-2027, volet anguille). Les individus qui feront l’objet des procédures expérimentales sont des juvéniles d’anguille qui auront été maintenus en élevage pendant 15 à 18 mois après leur collecte dans le milieu naturel. En effet, nous devons collecter des individus d’une même cohorte (même âge) à leur entrée dans les eaux de transition (estuaires, lagunes…) afin qu’elles soient exemptes du parasite, dont nous voulons étudier l’impact, avant le début de l’expérience (dans les conditions naturelles, elles s’infestent dans les eaux de transition). En outre, la période d'élevage de 15 à 18 mois avant le début de l’expérimentation est nécessaire pour permettre aux anguillettes d'atteindre une taille suffisante pour être infestées expérimentalement par le parasite (intubation gastrique).