Autre recherche fondamentale

Injectées dans l'abdomen avec Plasmodium berghei, piquées à la queue tous les deux jours pour un frottis, contenues à la main deux à trois minutes par jour pendant cinq jours pour recevoir un traitement, 160 souris subissent des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. À partir du onzième jour, elles peuvent présenter des signes neurologiques comme une paralysie, et sont alors tuées afin de prélever leurs organes. Quatre d'entre elles servent uniquement à entretenir la souche parasitaire par prélèvement sanguin derrière l'œil, avant d'être tuées elles aussi. Le porteur écrit que les points limites ont été fixés de façon à prendre en compte les signes neurologiques "sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche", et toutes les souris finissent tuées pour l'analyse de leur cerveau, de leur cœur, de leur foie, de leur rate, de leurs poumons et de leurs reins.

Objectifs

L’objectif du présent projet est d’utiliser, pour la première fois, l’approche innovante du MALDI-IMS pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes physiopathologiques d’infections/évolutions palustres en utilisant un modèle murin avec atteinte neurologique. Il est nécessaire de présenter l’approche par MALDI IMS. La spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) permet l'analyse de molécules directement à partir de coupes de tissus, permettant l'étude de la distribution spatiale des composés, qui peuvent être des molécules biologiques telles que des protéines et des peptides, lipides, éléments chimiques, métabolites. Ainsi, la spectrométrie de masse par imagerie (IMS) par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) est capable de déterminer la distribution de centaines de molécules à la fois directement à partir de coupes de tissus. Puisque les tissus sont analysés intacts sans homogénéisation, les relations spatiales des molécules sont préservées. L’objectif du présent projet est donc d’ouvrir de nouvelles pistes sur la compréhension des infections palustres dans un modèle animal en utilisant pour la première fois l’imagerie par spectrométrie de masse MALDI ou MALDI-IMS, mais également de faire la preuve du concept de l’intérêt de cette technologie pour évaluer la distribution d’un traitement anti-palustre et notamment déterminer si la molécule thérapeutique co-localise avec la cible parasitaire, et connaitre les conséquences de ce traitement au niveau des lésions neuronales. Enfin, savoir si la molécule thérapeutique est dégradée au niveau central avec la détection de changements métaboliques. Il est également envisagé d’étudier les effets indésirables du traitement tels qu’une activité hors cible et son effet toxique (eg, altération du fonctionnement d’un organe sain). Outre une analyse sur des coupes de cerveaux, le cœur, le foie, la rate, les poumons et les reins seront prélevés pour les analyses en MALDI IMS

Bénéfices attendus

Ce projet améliorera notre compréhension des partenaires protéiques participant à la formation des obstructions capillaires et il permettra d’identifier des marqueurs protéiques pour le diagnostic précoce d’une atteinte cérébrale. Par ailleurs, il améliorera notre connaissance sur les mécanismes neurodégénératifs de cette atteinte centrale, une analyse spatiale et temporelle de ces marqueurs protéiques semble indispensable. L’imagerie MALDI ou MALDI-IMS est un outil de choix pour répondre à ces attentes. Cette technologie a déjà fait ses preuves pour d’autres pathologies avec atteinte centrale offrant la possibilité d’identifier rapidement et facilement des zones cibles du cerveau ainsi que la bio distribution d’un médicament. La visualisation de la distribution des médicaments dans les tissus a permis d’orienter les chercheurs sur le développement de nouvelles cibles thérapeutiques ainsi que de mieux comprendre les mécanismes physio-pathologiques.

Procédures

Il faudra injecter aux souris avec une souche donnant des atteintes neurologiques (injection intrapéritonéale dure moins d'une minute). Les souris seront piquées pour administrer les traitements par voie intrapéritonéale avec contention (prise manuelle) pendant 3 jours consécutifs après détection des premiers parasites sanguins (la contention et la piqure dure entre 2 à 3 minutes). Les souris subiront également des piqures sans contention au niveau de la queue pour les frottis tous les 2 jours (la piqure à la queue dure moins d'une minute). 4 souris subiront un prélèvement sanguin rétro orbitaire afin d'entretenir la souche mais également assurer l'infection des lots expérimentaux (l'ensemble du rétro orbitaire dure environ 5 minutes). Une pesée sera également réalisée en alternance avec les frottis tous les 2 jours (la pesée dure 2 minutes). Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L’apparition des symptômes est importante pour avoir une chronologie des mécanismes cérébraux impliqués.

Impact sur les animaux

L'infection des groupes « infectés » et « infectés traités » entrainera des atteintes neurologiques, et la mort pour les souris concernées. L'administration des médicaments et les infections obligeront les souris à être manipulées, contentionnées - les souris concernées ne seront pas libre de leur mouvement pendant 1 à 2 minutes (pendant 5 jours consécutifs). Le recueil de la goutte de sang pour les frottis entrainera une piqure et une douleur au niveau de la queue pendant 1 minutes tous les 2 jours. La réalisation des lots expérimentaux grâce aux 4 souris entrainera consécutivement l'anesthésie, le prélèvement rétro orbitaire (5 minutes environ) et l'euthanasie de ces 4 souris. La pesée entrainera une manipulation de moins de deux minutes. Les souris pourront avoir des signes neurologiques à partir de J11 (paralysie par exemple) dès l’apparition des symptômes les souris seront euthanasiées afin de prélever les organes. L'infection des souris entrainera également une perte de poids modérée 1 à 2 grammes pendant 2 jours (3 jours après l'infection).

Devenir

L'étude se portant sur la recherche de marqueurs protéiques et tissulaires propre au paludisme, l'ensemble des souris seront euthanasiées

Remplacement

Les objectifs généraux sont de réaliser pour la première fois, des cartes protéiques permettant de visualiser les variations d’expression et d’abondance protéique en fonction de leur localisation in situ mais également suite à l’atteinte cérébrale par une infection palustre, et enfin étudier les conséquences d’un traitement anti-palustre sur ces répertoires protéiques. Afin de mener à bien ce projet, l’utilisation d’un modèle murin est indispensable. Plasmodium berghei, qui est la souche spécifique du paludisme murin, peut léser, en plus du système nerveux central, un certain nombre d’organes simultanément. La complexité de son cycle ainsi que notre intérêt pour l’analyse de répertoires protéiques, pour une méthode inédite, obligent à l’utilisation d’un modèle animal. Les modèles de cultures cellulaires ne permettront pas de répondre aux objectifs fixés dans le présent projet. Ce projet nécessite donc de travailler sur un organisme entier. Par ailleurs il n’existe pas pour le moment de modèle alternatif complet ou même partiel d’organoïdes, sphéroïdes ou organe sur puce reproduisant la complexité du système nerveux et sa réponse immunitaire face à une infection

Réduction

En accord avec le principe de réduction des effectifs, le nombre de souris par groupe sera calculé par rapport au nombre statistique d’échantillon nécessaire à une analyse en MALDI-MSI (triplicate) tout en tenant compte de la prévalence de la forme neurologique dans ce modèle et de la contribution des deux sexes. Nous avons trouvé un effectif minimum de 6 souris par groupe. Nous prenons 8 individus par groupe infecté pour les deux expériences car si n< 6 l’analyse des données sur les souris restantes ne sera pas possible et demanderait de recommencer la manipulation. Ces nombres ne compromettent pas les objectifs du projet en permettant l’utilisation de tests statistiques appropriés.

Raffinement

En accord avec le principe de raffinement, les signes de souffrance seront systématiquement recherchés et évalués. Une attention particulière sera portée à l’enrichissement des rongeurs, de manière à limiter l’anxiété des animaux. Des abris, des morceaux de cartons et des éléments à ronger seront placés dans les cages et les souris seront habituées à la manipulation. N’ayant pas trouvé de donnée contraire dans la littérature scientifique sur l’utilisation d’anesthésiant dans le cadre du MALDI MIS toutes les mesures correctives possibles nécessitant une analgésie ou une anesthésie seront utilisée afin de soulager les signes de douleurs. Les animaux sont hébergés en groupe afin de maintenir les interactions sociales. Des points de soin (point of care) et des points limites ont été mis en place afin de prendre en compte les signes neurologiques sans compromettre le suivi et l'acquisition des données de recherche.

Choix des espèces

Afin d’atteindre les objectifs de cette étude, une modèle animal comprenant un parasite du genre Plasmodium et un hôte permissif pour ce parasite afin de développer des atteintes centrales proches du paludisme cérébral humain est indispensable. Ce modèle doit permettre de mettre en évidence les molécules protéiques impliquées dans l’initiation et maintien d’une atteinte parasitaire centrale mais également de l’effet « recovery » du traitement anit-palustre. Le système « souris + P. berghei » est un modèle reconnu pour l’analyse de l’invasion centrale par le parasite ainsi que pour évaluer un composé à activité antipaludique. Nous choisirons des souris C57BL6J pour leur aptitude à développer aussi bien les formes cérébrales que de fortes parasitémies. Les souris C57BL6 seront des individus adultes âgés de 6 à 7 semaines à l’arrivée dans l’animalerie mais de 8 à 10 semaines au début des expériences. Cela est dû à la phase de stabulation et d’habituation a la manipulation. Cet âge est compatible avec les procédures expérimentales du projet. Cet âge correspond à l’âge de maturité sexuelle (adulte).

Infestés volontairement par deux espèces de nématodes gastro-intestinaux, 40 agneaux subissent des prises de sang à la jugulaire deux fois par semaine et des prélèvements du contenu du rumen par une sonde enfoncée dans l'œsophage. Ils relèvent d'un niveau de souffrance modéré et passent des périodes en case individuelle sur caillebotis, parfois enfermés dans une chambre respiratoire pour mesurer le méthane qu'ils émettent. Le porteur écrit que l'infestation parasitaire n'entraîne aucune douleur ni nuisance, tout en fixant comme points limites une anémie sous 18 % d'hématocrite, une perte de 15 % du poids en trois semaines et l'apparition de diarrhées. Tous sont abattus à la fin de l'essai pour compter les parasites de leur tube digestif et analyser leur muscle, la qualité de la viande figurant parmi les résultats attendus d'un aliment destiné à la commercialisation.

Objectifs

L’objectif de cette étude est de tester un prototype d’aliment contenant un sous-produit de l’agro-industrie chez des agneaux en croissance, parasités et non parasités par des nématodes gastro-intestinaux (NGIs). Des mesures de quantités ingérées, de digestibilité, d’émission de méthane entérique, de bilan azoté, de performance, de parasitisme et de qualité de la viande seront réalisées in vivo ou après abattage. Une de nos hypothèses de travail est que le parasitisme augmente indirectement la production de méthane chez les ruminants. Nous chercherons donc à savoir dans quelle mesure le parasitisme par les NGIs augmente les émissions de méthane tout en affectant négativement la santé digestive des animaux. La seconde hypothèse est que la présence de métabolites secondaires bioactifs en concentration suffisante dans la ration contribue à moduler les fermentations ruminales, réduire l’émission de méthane et perturber la biologie des NGIs. Dans ce cadre, nous testerons un prototype d’aliment incluant un sous-produit de l’industrie de la vigne (issus de l’économie circulaire et locale) riche en composés polyphénoliques et préalablement sélectionné pour sa capacité à réduire à la fois les émissions de méthane et le parasitisme (études in vitro réalisées au préalable afin de choisir le meilleur sous-produit parmi 16 d’entre eux, sous-produits ayant un effet à la fois sur les larves et œufs de 2 espèces de NGIs et la production de méthane). Dans notre étude, des analyses de composition du microbiote ruminal et de la qualité de la viande seront également réalisées pour accéder aux mécanismes d’action et aux performances des animaux, respectivement. Tous les ingrédients présents dans le prototype d’aliment testé ont une autorisation de mise sur le marché en tant que complément alimentaire.

Bénéfices attendus

Les résultats attendus sont dans un premier temps une réduction des émissions de méthane et une perturbation de la biologie des NGIs chez les animaux alimentés avec le prototype d’aliment riche en polyphénols. Ce prototype est formulé pour garantir une bonne productivité des agneaux (gain de poids des animaux), et une bonne qualité de la viande (à travers le profil en acides gras du muscle notamment). De par la présence du prototype riche en polyphénols, il est aussi attendu des changements dans la composition du microbiote ruminal entre les animaux parasités et non parasités et ceux alimentés avec ou sans le prototype. L’aspect innovant de ce projet est lié à la valorisation de sous-produits de l’agro-industrie dans l’alimentation animale, mais aussi à la compréhension du lien entre la production de méthane, le parasitisme et le microbiote ruminal. A moyen terme, cette expérimentation a pour but de mettre sur le marché un aliment qui pourrait conduire à prévenir le parasitisme, réduire l’utilisation des anthelminthiques de synthèse, améliorer la santé des animaux, contribuer à réduire les émissions de gaz à effet de serre, en promouvant l’économie circulaire et locale à travers la valorisation de sous-produits non utilisés pour l’alimentation humaine. D’un point de vue sanitaire, les anthelminthiques de synthèse sont les médicaments couramment utilisés en médecine vétérinaire pour gérer les infestations parasitaires. Cependant, des métabolites ou des molécules non dégradées se retrouvent dans les produits dédiés à la consommation humaine (viande, lait, fromage), et peuvent impacter indirectement la santé humaine. Pour certaines molécules, des conséquences environnementales ont aussi été signalées. Des temps d’attente sont donc à respecter avant de commercialiser et consommer ces produits animaux. De plus, ces dernières années, une multiplication des résistances aux anthelminthiques de synthèse est observée dans les élevages ovins et caprins. Pour pallier à ces problèmes, l’exploitation dans la ration de métabolites secondaires bioactifs comme les polyphénols (flavonoïdes, tanins) naturellement présents dans certaines ressources végétales est une méthode alternative prometteuse à l’emploi des traitements chimiques. Ces métabolites sont en effet connus pour impacter et affecter les parasites et donc à terme améliorer la santé des animaux.

Procédures

Les prises de sang se feront deux fois par semaine après trois semaines de la phase 3 et pendant la phase 4, à hauteur de 5mL. Le contenu ruminale par sonde oesophagienne sera prélevé entre chaque phase, entre 5 et 10mL. Les fèces seront collectées, à une quantité minimale de 3 grammes pour les analyses de parasitologies.

Impact sur les animaux

La procédure de mesure d'ingestion et de digestibilité implique une période de mesures individuelles en dispositif de case individuelle sur caillebotis en bois (qui sera soit placée dans la chambre respiratoire, soit placée au sol). Ce dispositif individuel peut entrainer du stress aux animaux lié à leur isolement partiel malgré une installation dans une même pièce. Pour pallier à ce stress, des phases d’habituation au dispositif seront mises en place. De plus, la stalle permet aux agneaux de se lever et de se coucher sans entrave et leur disposition permet aux animaux de se voir, se sentir et de s’entendre. Le contenu ruminal sera prélevé par sonde œsophagienne. Ce prélèvement peut engendrer du stress physique, une douleur ponctuelle et une diminution de l’ingestion L’ensemble de ces manipulations dure 1 à 3 minutes par animal et sera réalisée par du personnel compétent. Les prises de sang seront réalisées à la veine jugulaire. Même si les prélèvements se feront à une fréquence faible (deux fois par semaine) par du personnel expérimenté, il est possible de provoquer des hématomes, induisant une douleur légère. L’acte d’infestation parasitaire n’entraine aucune douleur ou nuisances à l’animal. Les 2 espèces de NGIs utilisées dans le protocole sont naturellement présentes dans les élevages et pourraient avoir des conséquences pathophysiologiques différentes. L’espèce de l’abomasum (Haemonchus contortus) est hématophage et peut provoquer avant tout une anémie ; l’espèce intestinale (Trichostrongylus colubriformis) peut induire des lésions des muqueuses et des perturbations de la physiologie digestive (mal digestion/mal absorption) pouvant conduire à des diarrhées. Une perte d’appétit et une perte de poids dues à la présence de ces parasites peuvent se traduire par des changements de comportements et aussi par des signes cliniques (anémie, diarrhée).

Devenir

Tous les animaux seront abattus à l'issue de la procédure afin de permettre des prélèvements de contenus ruminaux et intestinaux (pour quantification et étude des parasites présents et des différents stades associés), ainsi que des prélèvements de tissus musculaires.

Remplacement

Plusieurs essais in vitro ont été réalisés en amont de cet essai pour choisir le sous-produit à tester in vivo (essais de fermentation ruminale in vitro pour évaluer le potentiel de réduction des émissions de CH4 et essai in vitro pour évaluer le potentiel anthelmintique sur 2 espèces de parasites). L’étude in vivo est indispensable pour étudier le lien entre le parasitisme et les émissions de méthane (aucun essai in vitro ne regroupe les deux aspects) ainsi que les effets sur la croissance des agneaux et sur le microbiote ruminal. La mesure in vivo de digestibilité est la méthode de référence pour quantifier la digestibilité des fourrages et des rations. Des méthodes alternatives (in vitro) existent pour classer différents aliments en fonction de leur digestibilité mais sont moins fiables. La mesure de digestibilité in vivo est incontournable pour une caractérisation fine et l'établissement utilisateur a obtenu l'accréditation du comité d’éthique régional. De nombreuses mesures ne sont possibles qu’en expérimentation in vivo : bilan azoté (analyses sur les urines, les fèces et le sang), mesures de parasitologie (évaluation individuelle indirecte de la charge parasitaire par analyses coproscopiques sur les fèces et suivi de l’anémie par prise de sang), étude des performances zootechniques (gain de poids) et de la qualité de la viande sur la carcasse. De par son caractère générique, les résultats qu’il permet d’obtenir sont le plus souvent extrapolables aux autres catégories de ruminants (bovins, caprins, brebis et agneaux).

Réduction

Le nombre d’animaux a été optimisé et réduit au minimum pour : - S’assurer d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour des analyses statistiques fiables des paramètres de parasitologie (mesure de coproscopie individuelle) et de pathophysiologie (hématocrite) sur les animaux infestés - Tenir compte de la variabilité individuelle observée dans la composition du microbiote digestif - Assurer des répétitions pour obtenir la puissance statistique nécessaire pour arriver à faire le lien entre infestation parasitaire et émission de méthane - Etudier et différencier les effets avec et sans le prototype d’aliment riche en polyphénols, mais aussi avec et sans infestation parasitaire. Comme la variabilité entre animaux est plus importante pour l'ingestibilité que pour la digestibilité (la variabilité entre animaux de l’ingestibilité est de l’ordre de 9 % alors que celui de la digestibilité est de l’ordre de 3 %), il est recommandé d’utiliser un minimum de 8 animaux. Ce nombre est aussi le minimum d’individus requis pour interpréter les données liées aux infestations par les NGIs. Des conséquences cliniques trop sévères associées aux parasites pouvant entrainer le retrait de l’expérimentation d’un animal, 2 animaux parasités par période expérimentale seront gardés en réserve, alimentés avec et sans le prototype d’aliment riche en polyphénols. 4 comparaisons seront réalisées d’un point de vue statistique. Une première entre les animaux parasités et les animaux non-parasités nourris sans le prototype, une seconde identique mais nourris avec le prototype, une troisième entre les animaux parasités, avec et sans le prototype, et une quatrième entre les animaux non-parasités, avec et sans le prototype. Des analyses de comparaison de moyennes et de variances sont prévues.

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans un bâtiment d’expérimentation agréé. La taille des stalles de digestibilité est adaptée au gabarit de l’animal, permet aux agneaux de se lever et de se coucher sans entrave. Les animaux peuvent se voir, s’entendre, se sentir et interagir. Ils auront eau et alimentation à volonté, et une pierre à sel afin d'éviter l'apparition de maladies métaboliques ou de carences. Les fèces et les urines seront récoltés tous les jours dans les bacs situés sous le caillebotis, pesés, et échantillonnés. L’état de santé des agneaux sera évalué quotidiennement par un animalier habilité. Tout changement de comportement (abattement, baisse d’appétit), comportement anormal, ou signe subclinique (ex diarrhée) considéré comme points limites sera signalé et pris en charge, consigné dans le cahier d’expérimentation. Des évaluations comportementales et des mesures sanguines et fécales permettront de surveiller la santé globale de l’animal et d’objectiver les conséquences. Les mesures sanguines permettront de contrôler toute anémie importante (hématocrite

Choix des espèces

L’étude vise à tester un prototype d’aliment pour ruminant, qui réduirait le parasitisme et les émissions de méthane. Notre étude a pour objectif de faire le lien entre ces 2 problématiques via un essai in vivo, car aucune expérimentation in vitro n’est possible pour étudier ces 2 paramètres ensemble. D’autres mesures seront réalisées telles que l’ingestion, le gain de poids vif, le bilan azoté et la qualité de la viande : ces mesures sont impossibles à obtenir sans l’utilisation d’animaux. Les ovins sont des petits ruminants très sensibles au parasitisme, c’est pourquoi ils seront notre espèce dans cette étude. Le modèle de l’agneau en croissance permet de se placer au plus près des conditions d’élevage et de mesurer les impacts sur la productivité des animaux à travers leur gain de poids. Agneaux en croissance (entre 3 et 4 mois en début d’essai et 6 à 7 mois en fin de l’essai en fonction des périodes). Ce stade est favorable pour étudier les effets d’un prototype d’aliment sur la performance animale en vue de la commercialisation des carcasses.

980 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une injection de parasites du paludisme, puis un médicament dans l'eau de boisson ou par voie orale, et une goutte de sang prélevée à la queue tous les un à deux jours pendant sept à vingt-et-un jours. Un groupe est anesthésié puis exposé quarante-cinq minutes aux piqûres de moustiques, sans réveil. L'affaiblissement et l'anémie liés à l'infection figurent parmi les contraintes annoncées, et le porteur affirme qu'aucun système de culture continue de Plasmodium berghei ne permet de remplacer la souris pour les manipulations génétiques du parasite.

Objectifs

L'objectif du projet est de caractériser les mécanismes d'infection par Plasmodium, l'agent du paludisme, à l'aide d'un modèle murin d’infection par Plasmodium berghei. Ce parasite peut être étudié à tous les stades du cycle parasitaire, notamment après infection de moustiques Anopheles à partir de souris infectées. Le modèle d’infection de la souris par P. berghei reproduit de nombreux aspects de la biologie des espèces de Plasmodium infectant l'homme, et permet d’étudier le rôle de facteurs parasitaires au cours de l’infection, notamment à l’aide de parasites génétiquement modifiés. Le projet vise à caractériser la fonction de protéines candidates à différents stades du cycle parasitaire.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre d'améliorer notre connaissance des mécanismes fondamentaux d'infection par Plasmodium, en identifiant des protéines essentielles à différents stades du cycle parasitaire. Les résultats pourraient permettre d'identifier de potentielles cibles pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques contre le paludisme.

Procédures

Un premier groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intraveineuse de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration de médicament dans l'eau de boisson (durée 7 à 10 jours, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 7 à 10 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang par ponction terminale (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés). Un deuxième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 7 à 21 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles). Un troisième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 4 à 5 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une administration orale de médicament (prise unique, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une injection intrapéritonéale d'anesthésiants (1 injection, durée 10 secondes) suivie de l’exposition d'animaux anesthésiés à des piqûres de moustiques (pendant 45 minutes, sans réveil a posteriori). Un quatrième groupe d’animaux sera soumis successivement à une injection intrapéritonéale de parasites (1 injection, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), un prélèvement d'une goutte de sang à la queue ( tous les 1 à 2 jours pendant 5 à 8 jours, durée du geste 10 secondes, sur animaux vigiles), une anesthésie gazeuse (acte unique, durée 10 minutes) suivie d’un prélèvement de sang par ponction terminale (acte unique, durée 10 minutes, sur animaux anesthésiés).

Impact sur les animaux

Stress lié à la contention, douleur de courte durée lors des injections intrapéritonéales ou intraveineuses sur animaux vigiles, stress ou douleur de courte durée lors de l'administration orale de médicament sur animaux vigiles, douleur de courte durée lors des prélèvements sur animaux vigiles, risques associés à l'anesthésie (hypothermie, détresse respiratoire), contraintes liées à l'infection elle-même (affaiblissement, anémie).

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures par des méthodes réglementaires, soit parce que des prélèvements sont nécessaires pour des analyses post-mortem, soit pour éviter d'atteindre des points limites chez les animaux infectés.

Remplacement

Le projet vise à caractériser dans un modèle murin la fonction de protéines du parasite Plasmodium, l'agent du paludisme, à l'aide d'approches génétiques. Il n'existe pas à l'heure actuelle de système de culture continue de Plasmodium berghei in vitro permettant le remplacement du modèle murin pour les manipulations génétiques du parasite et pour les études fonctionnelles (étude de la croissance parasitaire dans le sang et transmission aux moustiques). Par contre, nous utiliserons des systèmes de cultures cellulaires (lignées hépatocytaires) pour l'analyse de l'infection des cellules du foie par les parasites mutants (obtenus à partir de moustiques infectés).

Réduction

Au total ce projet utilisera 980 souris sur une durée de 5 ans. Ce nombre a été réduit au minimum pour permettre de réaliser les prélèvements nécessaires aux études fonctionnelles. La taille des effectifs a été établie à l'aide d'un calcul de puissance pour permettre de détecter un effet significatif par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Afin de contribuer au raffinement des procédures, les animaux sont hébergés avec leurs congénères dans un milieu enrichi (lanières de papier Kraft ou équivalent). Les conditions environnementales des locaux d’hébergement sont réglementaires. Une période d’acclimatation d’une semaine sera observée avant le début des expérimentations. Une période d'habituation sera également respectée dans l'appareil de contention avant les injections intraveineuses sur animaux vigiles, afin de réduire le stress. Certaines procédures sont réalisées sous anesthésie et analgésie pour prévenir la douleur. La présence de points limites définis permettra d'éviter la souffrance liée aux complications de l'infection par Plasmodium berghei. Afin de faciliter l’alimentation et l'hydratation chez les animaux infectés par Plasmodium, la nourriture pourra être donnée sous forme de bouillie ou de gel directement dans la cage. L'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent, pour vérifier l’apparence et l’état clinique des animaux, la prise alimentaire et hydrique ainsi que leur comportement, afin de détecter toute modification suggérant une douleur, une souffrance ou une détresse.

Choix des espèces

La souris est un modèle animal permettant des études fonctionnelles chez Plasmodium berghei, un parasite qui reproduit de multiples aspects de l'infection par les parasites infectant l'homme. Ce modèle est en particulier pertinent pour étudier la fonction de protéines essentielles du parasites lors de l'infection in vivo, dans le but d'identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Dans ce projet, nous utiliserons des souris adultes, âgées de 6 à 10 semaines au début des procédures, conformément aux protocoles classiques utilisés dans ce type d'étude.

90 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par un nématode intestinal par gavage et par un Plasmodium responsable du paludisme murin, puis saignées deux fois par semaine par incision de la queue, la croûte de cicatrisation étant retirée à chaque nouveau prélèvement. L'infection détruit leurs globules rouges et provoque une anémie qui culmine autour du quatorzième jour. Le porteur affirme que les interactions entre l'hôte, le ver et le parasite ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier le rôle d’effecteurs immunitaires spécifiques dans la dynamique de l’infection par un nématode intestinal et un Plasmodium murin lorsqu’ils coïnfectent leur hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection entraine des dynamiques différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, lorsque le deuxième parasite infecte un hôte préalablement infecté par l’autre espèce (indépendamment de l’ordre avec lequel les deux parasites infectent l’hôte) on constate un rebond de la dynamique de l’infection. Dans ce projet, nous souhaitons étudier le rôle que joue la réponse immunitaire de l’hôte dans ce rebond.

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de l’infection quand les hôtes sont coïnfectés par un nématode intestinal et Plasmodium. Ces parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Dans le cas de coïnfection la dynamique des deux parasites est altérée avec des rebonds qui peuvent affecter la santé de l’hôte. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la réponse immunitaire de l’hôte joue dans ces rebonds et par extension dans le risque encouru par les populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes (tous les animaux ne sont soumis à toutes ces interventions, cela dépendant des différents groupes expérimentaux): gavage (une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Cependant, l’infection par Plasmodium produit une lyse des globules rouges entrainant une anémie. Cette anémie est transitoire (culminant entre les jours 14 et 16 post-infection) et après jour 24 les valeurs de concentration de globules rouges par microlitre de sang reviennent à la normale. Le gavage ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois. Les injections intrapéritonéales sont réalisées sur animale vigile et sont réalisées en quelques secondes (volume injecté = 100 µl), la nuisance étant donc limitée à cette phase de contention. Les injections intraveineuses sont réalisées à la veine caudale sur animal vigile à l’aide d’un appareil de contention. La nuisance est attendue est donc également liée au stress engendre par la contention. Cependant, la contention et l’injection durent moins d’une minute. Les prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont réalisés en pratiquant une petite incision à la pointe de la queue pour le premier prélèvement et en ôtant la croute de cicatrisation pour les prélèvements successifs, ce qui ne devrait pas engendre des nuisances particulières. Les collectes de fèces sont effectuées en isolant les souris. L’isolement peut provoquer du stress, cependant les souris ne sont isolées que pendant 1 heure, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort afin de pouvoir prélever les organes en vue d’analyses ultérieures.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer le rôle de la réponse immunitaire dans la dynamique de la coïnfection mettant en jeu un nématode intestinal et un Plasmodium murin. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le Plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans ce projet a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 10 souris par groupe expérimental. Une analyse de puissance montre qu’avec les différences que nous avons observé dans la dynamique de la coïnfection lors d’expériences précédentes, un effectif de 10 souris par groupe confère une puissance de 90% au seuil de significativité de 0.01.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans ce projet. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Dans la mesure du possible, les animaux sont transférés d’une cage à l’autre grâce à la technique du tunnel (au lieu de la préhension par la queue) ce qui a été démontré réduire le stress des animaux. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général. Si une dégradation de l’état de santé est constatée, nous utiliserons une grille quantitative de notation qui permet de définir des points limites suffisamment prédictifs.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

Anesthésiés cinq minutes, amputés d'un morceau de nageoire caudale, puis isolés jusqu'à trois jours pour le génotypage, 910 poissons zèbres subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. D'autres reçoivent une injection de cellules cancéreuses sous anesthésie, au stade larvaire, et sont tués au plus tard huit jours après la fécondation. Le porteur écrit avoir réduit à dix le nombre de poissons reproducteurs, tout en prévoyant qu'un grand nombre d'œufs sera produit puis trié avant cinq jours. Les poissons retenus pour perpétuer les lignées sont gardés en vie jusqu'à un an et demi, puis mis à mort.

Objectifs

La communication intercellulaire est indispensable pour réguler les grandes fonctions de l’organisme. Récemment, une nouvelle voie de communication prend une place croissante dans la plupart des processus physiopathologiques : les vésicules extracellulaires. Ces vésicules de 100nm à 1µm sont relarguées par tous les types cellules dans tous les organismes. Leurs propriétés ouvrent de nouvelles perspectives, aussi bien du point de vue fondamentale que thérapeutique, notamment dans leur utilisation comme marqueurs ou véhicules thérapeutiques. Ces vésicules sont impliquées dans la progression des cancers mais leur étude se fait principalement in vitro, du fait que leur taille limite leur étude et utilisation in vivo. Pour répondre à ce besoin, nous avons développé un modèle de poisson zèbre qui permet de suivre ces vésicules en temps réel, à l’échelle de la vésicule unique par imagerie. L’utilisation du poisson zèbre apparait maintenant comme une solution incontournable pour étudier les vésicules dans la communication entre la tumeur et son micro-environnement, dans une situation la plus physiologique possible que ne permet pas les études in vitro. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées transgéniques pour suivre ces vésicules et manipuler leur production et leur ciblage, en exprimant de façon stable des constructions d’ADN modifié. Nous pourrons alors étudier la communication médiée par ces vésicules entre différents types cellulaires et entre ces types cellulaires, des cellules cancéreuses greffées dans les larves obtenues à partir de ces lignées. L’évolution et le maintien de ces lignées seront suivis afin de parer à l’éventuelle apparition de phénotypes dommageables. Pour cela, une observation macroscopique quotidienne sera réalisée dès la microinjection, puis une vérification du génotype sera réalisée à partir du deuxième mois. Par la suite, pour perpétuer ces lignées, une sélection d’animaux reproducteurs sera réalisée après maturité sexuelle qui apparait vers 3 mois. Ces lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles des vésicules in vivo en temps réel, dans des protocoles expérimentaux effectués dans des embryons de moins de cinq jours post fertilisation. Ce projet permettra alors une meilleure compréhension de la biologie des vésicules, notamment sur leur rôle dans la propagation des cancers et plus particulièrement dans le cancer de la prostate ou le cancer cérébral (glioblastome).

Bénéfices attendus

La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données cruciales sur leur rôle dans la progression tumorale in vivo dans un contexte physiologique (flux sanguin, barrière biologique). Nos études sur les embryons de poisson zèbre permettront également d’établir cet organisme modèle comme un modèle préclinique pour tester in vivo le potentiel thérapeutique notamment en tant que véhicules thérapeutiques dans le cadre des cancers.

Procédures

Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum. Injection de cellules, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes.

Impact sur les animaux

D’après la littérature, aucun phénotype dommageable n’est attendue par l’expression de nos constructions. Bien que peu probable, le ou les phénotypes dommageables pourront se traduire par : l’apparition de malformations de l’animal au cours de son développement (tératogenèse), la formation d’œdème, ou une altération du comportement. Les seules nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.

Devenir

A la fin de la procédure 1, les animaux seront toujours utilisés notamment pour maintenir leur lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort. En ce qui concerne la deuxième procédure, les animaux seront mis à mort après observation de la propagation ou progression des cellules injectées (maximum 8 jours post-fécondation).

Remplacement

Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées transgéniques de poissons zèbres pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaire en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.

Réduction

Dans le but de réduire et selon des calculs de puissance ainsi que des différentes observations concernant le taux d’intégration d’ADN modifié et le pourcentage de survie de nouveaux descendants en général, nous estimons et avons réduit le nombre de poissons à 10, de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées transgéniques restent encore inconnues. Dans le but d’obtenir ces 10 poissons, il faut prendre en compte ces différents paramètres de viabilité et morbidité, ainsi théoriquement, un grand nombre d’œufs seront générés, mais seront triés avant les 5 jours post-fertilisation, pour leur expression de l’ADN injecté, de manière à réduire le nombre de poissons nécessaires. Dès l’obtention des 10 poissons avec autant de mâles que de femelles, le génotypage sera stoppé. Dans le cadre des greffes, nos études utilisent des approches de microscopie qui limitent le nombre de poissons à une dizaine de larves de 6 à 8 jours post-fertilisation par expérience.

Raffinement

Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, nous porterons une attention toute particulière à l’apparition très peu plausible de phénotypes dommageables. Nous effectuerons un enrichissement de milieu, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production de plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du prélèvement de nageoire pour le génotypage, un analgésique et un anesthésique seront utilisés. Nous veillerons également à réduire au minimum la quantité du prélèvement, pour cela nous prélèverons un morceau de 1mm au niveau de la nageoire caudale. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes et bénéficie des mêmes conditions (alimentation en eau donc en oxygène continue) que les poissons hébergés dans le système aquatique. De plus, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage, soit maximum 3 jours.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.