Autre recherche fondamentale

300 rongeurs, 200 souris et 100 rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ce sont des animaux sains, soumis à des examens d'IRM sous anesthésie pouvant durer jusqu'à trois heures avec injection d'un agent de contraste, uniquement pour mettre au point des séquences d'imagerie. Le porteur indique que l'anesthésie provoque hypothermie, dépression respiratoire et cardiovasculaire, et présente pourtant l'IRM comme "en parfaite adéquation avec les 3R". Ces animaux sains sont tués à l'issue, jugés non réutilisables du fait de leur âge et des anesthésies répétées.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre au point, optimiser et développer de nouvelles méthodes d’imagerie par résonance magnétique (IRM) afin d'offrir le plus grand panel d'outil pour la caractérisation, la recherche de biomarqueurs de pathologies. L’IRM, technique d’imagerie biomédicale en perpétuelle évolution, est extrêmement attractive pour les études précliniques et cliniques. Elle est non invasive et non irradiante en parfaite adéquation avec les 3Rs. Elle permet : 1) de remplacer l’utilisation de techniques plus invasives pour l’obtention d’information similaire ; 2) d’avoir des informations anatomo-fonctionnelles complémentaires et/ou inaccessibles par d’autres techniques dans des conditions de bien-être animal sans comparaison. Ces nouvelles informations peuvent être intégrées dans une étude pour la raffiner comme nouveau critère d’inclusion ou d’exclusion. Cela permet d’obtenir une meilleure qualité des résultats qui n’auront pas besoins d’être répétés, réduisant ainsi le nombre d’animaux; 3) un suivi longitudinal individuel des modifications anatomo-fonctionnelles permettant ainsi de réduire très significativement le nombre d’animaux nécessaires ; 4) d’avoir accès à des informations déjà utilisées chez l’homme quotidiennement dans les services hospitaliers, permettant de développer des projets de recherche translationnelle.

Bénéfices attendus

L’IRM est une technique d’imagerie biomédicale non-invasive et non irradiante largement utilisée chez l’Homme. Son utilisation dans les projets précliniques permet de remplacer des techniques plus invasives, de réduire le nombre d’animaux avec des suivis longitudinaux, de raffiner en donnant accès à de nouveaux points limites précoces.

Procédures

Examen IRM sous anesthésie d'une durée maximum de 3h. Injection d'agent de contraste sous anesthésie (durée du geste 1 min max.).

Impact sur les animaux

L’anesthésie entraîne une hypothermie, une dépression respiratoire et cardiovasculaire.

Devenir

Dans la mesure du possible, afin de respecter la règle des 3Rs, les animaux de ce projet seront des animaux sains de réforme non au-préalable utilisés dans un autre projet. Ne pouvant pas être réutilisés au-delà de ce projet du fait souvent de leur âge (animaux de réforme), la répétition de l'anesthésie et surtout la présence d'agent de contraste, ils seront mis à mort à l'issue des procédures.

Remplacement

Des objets tests seront utilisés autant que possible pour limiter l’utilisation des animaux vivants. Malheureusement, à l’heure actuelle, aucun ne reproduit le tissu vivant et les contraintes pour l’IRM de ce dernier (mouvement respiratoire, cardiovasculaire, flux sanguin, hétérogénéité des tissus…). De ce fait, nous sommes contraints de valider nos paramètres sur des animaux vivants.

Réduction

Plusieurs stratégies vont être utilisées pour limiter au maximum le nombre d’animaux dans ce projet consistant à la mise au point de protocole : l’utilisation d’objet test, le passage à l’IRM à plusieurs reprises du même animal et, dans la mesure du possible, nous utiliserons des animaux de réformes.

Raffinement

Les animaux seront anesthésiés et monitorés durant les examens IRM et pour les injections limitant ainsi la douleur. Ils seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, élément pour nidification, baton à ronger). A noter que le tunnel permettra la manipulation des animaux éveillés limitant ainsi le stress de la manipulation. Des points limites ont été définis et adaptés par procédure.

Choix des espèces

L’IRM préclinique est un appareil dédié aux études sur les rongeurs. Le rongeur (souris, rat) est depuis toujours le modèle de prédilection pour la recherche biomédicale, par sa taille, son coût, sa manipulation aisée et son taux élevé de reproduction. Il est utilisé comme modèle standard pour l’étude de la plupart des pathologies. Les organes ayant des tailles et des caractéristiques à l’IRM différentes au cours du développement, les animaux sains utilisés seront à différents stade de développement allant de quelques jours après la naissance à l’état adulte.

10 porcs vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent la pose chirurgicale d'un cathéter dans la veine jugulaire, des gavages sous contention ferme et des prélèvements de sang répétés, pour établir la cinétique d'une association d'antibiotiques utilisée dans la filière porcine. Le porteur souligne une pose "moins invasive" et des prélèvements "totalement indolores" une fois le cathéter en place, et réutilise chaque animal pour deux voies d'administration. Il justifie la mise à mort par le prélèvement des muscles, du foie et des reins pour y doser les antibiotiques.

Objectifs

L'association d'antibiotiques sulfamides/triméthoprime est classiquement utilisée en médecine vétérinaire, notamment dans la filière porcine, pour traiter certaines infections. Le ratio de doses sulfamides/triméthoprime dans la quasi-totalité des spécialités vétérinaires mises sur le marché est de 5:1. Or, ce ratio n’a pas été établi à partir de données animales, mais est une transposition directe du ratio correspondant à l’association sulfaméthoxazole/triméthoprime (SMX/TMP) utilisée chez l’Homme. Un biais majeur de cette transposition réside dans le fait que les vitesses d’élimination des sulfamides (illustrées par leurs temps de demi-vie plasmatiques, t1/2 vie) peuvent être très variables selon l’espèce animale. Chez l’Homme, le SMX et le triméthoprime ont des t1/2 vie assez proches, permettant de maintenir un rapport de concentrations entre les deux antibiotiques constants au cours du temps et de conserver ainsi l’effet synergique entre eux. A l’inverse, chez les animaux de rente par exemple, certains sulfamides ont des t1/2 vie beaucoup plus longs que celui du triméthoprime. Les sulfamides seront alors présents beaucoup plus longtemps chez l’animal, d’où une perte probable de l’effet synergique recherché et par voie de conséquence de l’efficacité de l’association. L’ensemble de ces facteurs questionne la pertinence du ratio 5:1 des formulations vétérinaires, mais aussi les posologies recommandées (doses et/ou intervalles d’administration). Cette procédure expérimentale s’ajoute à une autre demande déjà validée par le comité d’éthique dans laquelle deux associations de sulfamide/TMP (sulfadiazine(SDZ)/TMP et sulfadiméthoxine(SDMX)/TMP), ayant des propriétés pharmacocinétiques distinctes, ont été étudiées chez le porc. L’objectif de cette nouvelle demande est d’ajouter une étude cinétique avec une 3e association (sulfaméthoxazole(SMX)/TMP) pour compléter les données pharmacologiques in vivo déjà obtenues avec les deux précédentes associations, permettant par la suite de consolider l’approche de modélisation pharmacocinétique/pharmacodynamique (PKPD) afin d’optimiser les posologies et schéma d’administration de ces molécules chez le porc.

Bénéfices attendus

La promotion de solutions thérapeutiques à base d’associations – entre antibiotiques ou entre antibiotiques et nonantibiotiques – tient une place importante dans les stratégies de lutte contre l’antibiorésistance. Lorsqu’elles associent 2 antibiotiques, ces solutions doivent viser à limiter l’émergence de résistances et non à élargir le spectre d’activité. Les formulations associant le TMP avec un sulfamide peuvent entrer dans la première catégorie, ce qui en fait une exception « vertueuse » parmi les associations disponibles en médecine vétérinaire dont la plupart ont été développées avec un objectif d’élargissement du spectre. Malheureusement, les formulations TMP/sulfamides destinées aux animaux ont été développées par transfert « aveugle » des données de la médecine humaine relatives à l’établissement d’une synergie, sans tenir compte des spécificités des espèces animales ou de leurs bactéries pathogènes. Les études pharmacocinétiques in vivo couplées au études pharmacodynamiques sur des bactéries pathogènes les plus fréquemment rencontrées vont à terme, permettre d’optimiser l’administration de l’association triméthoprime/sulfamide (doses, posologies) chez le porc.

Procédures

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe grâce à un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et échoguidé. Cette technique utilisant un échographe permet de réduire la durée de l’intervention par rapport à une chirurgie « classique » (de 1h30-2h à 30-45 minutes par animaux) tout en minimisant le risque infectieux (acte moins invasif). Cet acte chirurgical peut être source de stress et de douleur mais une contention maitrisée suivi d’une anesthésie/analgésie adaptée permettra de réduire au maximum ces désagréments. Une fois le catéther posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores, sans contention particulière et réalisé en moins d'une minute. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention ferme quisera effectuée par des opérateurs formés, assurant ainsi la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (entre 3 et 4 minutes).

Impact sur les animaux

Pour réaliser la cinétique plasmatique, un cathéter central sera posé au niveau de la veine jugulaire externe sous anesthésie générale, de façon écho-guidée et en respectant une asepsie rigoureuse. Cette technique permet de minimiser le risque infectieux (acte moins invasif qu’une chirurgie « classique ») ainsi que le temps d’anesthésie de l’animal. Une fois le cathéter posé (avec une rallonge du connecteur), les prélèvements de sang seront totalement indolores et sans contention particulière. Durant l'expérimentation une source de stress viendra des gavages qui nécessitent une contention qui sera effectuée par des opérateurs formés, assurant la sécurité des animaux et des opérateurs et minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Chaque manipulation de contention+gavage ne dure pas plus de quelques minutes (2 à 3 minutes).

Devenir

Chaque porc sera mis à mort à l’issu de l’expérimentation dans des conditions éthiques et les tissus d’intérêts (muscles, foie, reins) seront récoltés pour le dosage des antibiotiques.

Remplacement

Il n’existe actuellement pas de méthodes non-animales de remplacement pour suivre la cinétique plasmatique (tout en incluant les variabilités inter-individuelles) des molécules qui est une étape préliminaire à l’approche PK/PD envisagée.

Réduction

L’utilisation de 5 animaux par voie d’administration (IV ou voie orale VO) soit un total de 10 animaux est un minimum pour pouvoir correctement estimer la variabilité inter-individuelle des paramètres pharmacocinétiques (clairance, etc) par une approche de population (modèle non-linéaire à effet mixte). De plus, l’approche en « cross-over » permet de limiter le nombre nécessaire d’animaux en les ré-utilisant pour tester les deux voies d’administration (IV et VO) pour l’association sulfaméthoxazole (SMX)/TMP en incluant une période de wash-out adaptée pour garantir la fiabilité des résultats. Une fois le modèle PK développé et fiable, il permettra d’étendre l’exploration à d’autres posologies sans la nécessité d’utiliser d’autres animaux.

Raffinement

Les porcs seront hébergés par 2 lors de la phase d’acclimatation (7 jours) puis seront seuls par case (sur caillebotis) après la pose du cathéter afin de limiter les risques d’arrachement. Néanmoins, des barrières entre cases permettent un contact visuel, olfactif et tactile (groin à groin) entre porc voisin. Des jouets seront mis à disposition : balle, ainsi que jouets à macher suspendus. Les prises de sang répétées seront effectuées après la pose chirurgicale de cathéters (avec anesthésie et analgésie suffisante pour les animaux) pour limiter la douleur lors des prélèvements sanguins ainsi que le stress généré. Les cathéters seront protégés avec un bandage adéquat vérifié régulièrement et changé s’il devient trop souillé. Un suivi-post opératoire individuel des animaux sera effectué et une analgésie sera mise en place si nécessaire (paracétamol +/- analgésique de type morphinique) même s’il est peu probable d’avoir un tel recours en raison de la méthode très peu invasive de pose du cathéter. Le début de la cinétique ne se fera qu’au minimum 24h après la pose du cathéter. La contention lors du gavage sera effectuée par des opérateurs formés pour assurer la sécurité des animaux et des opérateurs tout en minimisant les sources d’inconfort pour les animaux. Cependant, des points limites et critères d’arrêt ont été définis afin de permettre une intervention rapide sur les animaux.

Choix des espèces

Il s’agit de l’espèce cible pour l’étude pharmacocinétique de l’association sulfamethoxazole(SMX)/TMP. Au début de l’expérimentation, les porcs seront sevrés, et auront un poids d’environ 25-30 kg. Cet intervalle de poids permet une manipulation aisée des animaux (sécurité des opérateurs, diminution du stress des animaux).

512 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie subit l'ablation chirurgicale du ménisque du genou, l'autre une injection de monoïodoacétate dans l'articulation pour provoquer une arthrose, puis toutes marchent sur un tapis tous les quinze jours pendant quatre-vingt-dix jours afin de mesurer leur douleur. Le porteur précise qu'aucun traitement anti-inflammatoire n'est possible, l'objectif étant justement d'induire l'inflammation, avant la mise à mort pour prélever les articulations. Il teste un complément à base de peptides de collagène marin et de polyphénols, et présente le recours à la souris par ses "faibles coûts" et sa facilité de manipulation.

Objectifs

Les peptides de collagène marin ainsi que les extraits poly-phénoliques de pépins de raisin et d’olive possèdent des bénéfices démontrés et décrits dans la littérature sur l’arthrose. Le but de cette étude est d’évaluer l’effet d’un ingrédient Santé d’origine naturelle, associant peptides de collagène et polyphénols, pour les sujets sportifs et âgés susceptibles de développer une arthrose.

Bénéfices attendus

Trouver un traitement efficace à la diminution du développement de l’arthrose.

Procédures

Dans ce projet, nous évaluerons l’impact de l’association de nutraceutiques, peptides de collagènes et polyphénol, dans la progression de l’arthrose. Les souris recevront dans l'eau de boisson le traitement durant les 90 jours de l'étude. Un modèle d’arthrose post-traumatique, en ôtant le ménisque interne, sera réalisé sur des souris jeunes et âgées. Cette interventions sous anesthésie nécessite 20min par animaux. Un modèle d’arthrose par dégradation des cellules de l’articulation (les chondrocytes) sera également réalisé par injection de monoïodoacétate au niveau de l’articulation choisie du genou. Cette injection necessite la contention de l'animal pendant 1min. Afin d’évaluer les douleurs engendrées par les 2 modèles, les souris seront amenées à se déplacer librement sur un tapis de marche tous les 15 jours durant les 90 jours de l'étude. A la fin de l'étude, un prélevement de sang sera effectué.

Impact sur les animaux

Dans ces modèles murins d’arthrose, le geste chirurgical peut entrainer dans les jours suivants des difficultés chez les souris à se déplacer. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs seront disposés au-dessus des cages. La prise hydrique est évaluée journalièrement. Des mangeoires et igloos seront disposés au fond de la cage.

Devenir

Une mise à mort sera effectuée afin de prélevé les tissus arthrosiques (articulation du genou) chez les souris

Remplacement

Dans un premier temps, une validation objective de l’efficacité biologique sera réalisée sur les différentes formulations de cette association entre peptides de collagène et extraits poly-phénoliques. Pour cela, la toxicité des produits développés seront déterminées in vitro par l’évaluation de leur cytotoxicité sur des chondrocytes (cellules du cartilage présentes dans les articulations), fibroblastes (cellules de la membrane synoviales de l’articulation) et macrophages (cellules de la membrane synoviale de l’articulation, mais également cellules immunitaires recrutées sur les sites inflammatoires dont les articulations arthrosiques). Les études in vivo complémentaires permettront de valider l’efficacité du produit choisi in vitro (seuls ou en association).

Réduction

Nous limitons la répétition inutile des expériences grâce à un échange permanant entre les membres de l’équipe. Nous essayons d’effectuer le maximum d’analyses réalisables sur les mêmes animaux sans altérer la qualité de l’expérience et le bien-être des animaux. Chaque animal sera son propre contrôle. L’arthrose induite sera effectuée sur une seule patte et les résultats seront comparées avec la patte saine, ce qui permet de réduire de moitié le nombre d’animaux nécessaire pour l’étude. Enfin, tous les protocoles expérimentaux sont, une fois validés, mis à disposition de l’ensemble des membres de l’équipe. Le nombre d’animaux utilisé correspond au nombre minimal permettant une interprétation sans ambiguïté des résultats. Les groupes d’animaux constitués de 6 individus permettront une étude statistique

Raffinement

En dehors de la visite quotidienne habituelle des animaux, les souris seront surveillées quotidiennement pendant 15 jours suite à l’intervention au niveau de l’articulation et puis 1 fois /semaine . Dans ces modèles murins d’arthrose, le geste chirurgical peut entrainer dans les jours suivants des difficultés chez les souris à se déplacer. Afin d’éviter la déshydratation des animaux, des biberons avec des embouts longs seront disposés au-dessus des cages. La prise hydrique est évaluée journalièrement. Des igloos et des croquettes seront disposés au fond de la cage pour l’enrichissement et pour faciliter la prise alimentaire. Il n’y a pas de possibilité de réaliser un traitement anti-inflammatoire car le but du modèle est d’induire une inflammation.

Choix des espèces

La souris offre la possibilité de développer de nombreux modèles mimant les pathologies humaines. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèle dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc.) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Souris adultes car l’arthrose se développent majoritairement chez l’adulte : - Souris âgées de 8 à 10 semaines, afin de mimer l’adulte jeune sportif - Souris âgées de 12 à 18 mois, afin de mimer la personne âgée Ces deux populations, adulte jeune sportif et personnes âgées, sont celles les plus susceptibles de développer une arthrose.

610 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par gavage d'un ver intestinal puis par un parasite de la malaria, subissent des prélèvements sanguins trois fois par semaine, puis une ponction cardiaque suivie de la mort par dislocation cervicale. Le porteur décrit une infection le plus souvent asymptomatique et une anémie transitoire liée à une souche de plasmodium "non létale", et tue toute souris dont l'état se dégrade. Il présente la souris comme le "modèle de choix", ces interactions à trois partenaires ne pouvant selon lui être reproduites in vitro, l'étude portant d'abord sur la capacité d'adaptation du ver.

Objectifs

L’objectif du projet est d’étudier l’adaptation à la coïnfection entre un nématode intestinal et un des agents de la malaria murine, en termes de la capacité à réguler la réponse immunitaire de l’hôte. Les infections par des nématodes intestinaux sont toujours très prévalentes dans les pays en voie de développement et on estime que 3 milliards d’êtres humains souffrent d’au moins une infection par des helminthes au cours de leur vie. La carte de prévalence des infections par des helminthes coïncide en grande partie avec celle d’endémicité du paludisme, et en effet on constate que souvent ces populations sont coïnfectées par les deux parasites. La coïnfection peut entrainer des dynamiques très différentes par rapport à celles observées quand les helminthes ou les plasmodiums infectent seuls leurs hôtes et cela peut également avoir des conséquences sur l’état de santé des individus coïnfectés. En particulier, un des paramètres clé déterminant la dynamique de la coïnfection est la capacité des nématodes intestinaux à moduler la réponse immunitaire de l’hôte. Cette capacité d’immunomodulation a pour objectif de favoriser la persistance des vers au sein de l’hôte. Cependant, un hôte dont la réponse immunitaire est sous exprimée devient également plus susceptible à l’infection par d’autres pathogènes. La question que nous souhaitons aborder ici est donc la suivante : Y a-t-il un potentiel d’adaptation du nématode aux conditions de coïnfection qui limite le niveau d’immunosuppression de l’hôte ?

Bénéfices attendus

Ce projet vise à identifier le potentiel d’adaptation d’un nématode intestinal à la coïnfection avec plasmodium en termes de sa capacité à immunomoduler l’hôte. Ces deux parasites infectent des millions de personnes chaque année dans les pays du Sud en voie de développement. On estime que 600.000 personnes décèdent chaque année des suites d’une infection par une des espèces de Plasmodium, essentiellement en Afrique subsaharienne. Ces mêmes personnes souffrent souvent d’infections chroniques par différentes espèces d’helminthes. Notre projet vise donc à contribuer à élucider le rôle que la manipulation de la réponse immunitaire par le nématode pourrait jouer dans le risque encouru par ces populations où helminthes et paludisme sont endémiques.

Procédures

Les animaux sont soumis aux interventions suivantes : gavage (200 µl d’eau de boisson à l’aide d’une sonde souris, une seule fois, durée

Impact sur les animaux

Nous attendons peu d’effets indésirables sur les animaux. Le nématode intestinal produit des infections asymptomatiques dans le sens qu’aucun changement comportemental ou dans l’apparence de l’animal n’est constaté et ceci basé sur de centaines de souris infectées au cours de ces 10 dernières années. Dans des très rares cas, l’émergence des vers adultes dans la lumière intestinale peut provoquer une augmentation de la perméabilité intestinale et un passage de LPS dans le sang. Etant donné que les animaux sont surveillés quotidiennement et deux fois par jours pendant la période d’émergence des vers, si on constate une détérioration de l’état de santé des souris (p.ex. état de prostration) elles sont immédiatement retirées de l’expérience et euthanasiées par dislocation cervicale sous anesthésie à l’isoflurane. La souche de Plasmodium yoelii que nous allons utiliser s’appelle 17X NL où l’acronyme NL signifie « non létal ». Nous avons déjà effectué des infections de C57BL/6JRj avec cette souche de plasmodium et avons pu constater qu’aucune mortalité n’intervient. Le seul symptôme observable associé à l’infection par Plasmodium yoelii 17X NL est une diminution du nombre de globules rouges (anémie). Cette diminution est cependant transitoire (elle se produit entre les jours 14 et 22 post-infection) et après J26 les valeurs reviennent à la normale. Le gavage est réalisé en quelques secondes, à l’aide s’une sonde souris, et ne comporte de nuisances particulières si ce n’est le stress lié à la contention de l’animal. Chaque individu n’est gavé qu’une seule fois avec un petit volume d’eau (200 µl). Les injections i.p. sont réalisées après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Comme pour le gavage, chaque individu ne reçoit qu’une seule injection. Les micro prélèvements de sang à l'extrémité de la queue sont aussi réalisés après application d’un anesthésiant local (lidocaïne). Les prélèvements de fèces sont effectués en isolant les souris (afin de pouvoir identifier l’appartenance de l’échantillon à chaque individu). Cependant, les souris ne sont isolées que pendant 1 heures, étant pour le reste hébergées en groupe (5 souris par cage). Etant donné que deux prélèvements sont effectués par semaine, le temps passé en isolement ne constitue que 1% du budget temps hebdomadaire.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort car ils ne peuvent pas être réutilisés dans d’autres expériences, n’ayant plus une réponse immunitaire naïve par rapport aux parasites utilisés.

Remplacement

L’objectif de notre étude est d’évaluer l’adaptation d’une espèce de nématode intestinal à la coïnfection par plasmodium en termes d’immunosuppression de l’hôte. Ceci met en jeu des interactions complexes entre les trois acteurs (l’hôte, le nématode et le plasmodium) qui ne peuvent pas être reproduites in vitro.

Réduction

L’effectif de souris utilisé dans cette expérience a été calculé afin d’en minimiser le nombre tout en garantissant une puissance statistique suffisante pour obtenir des résultats fiables. Il s’agit en effet de 5 souris par passage pour chaque groupe expérimental, et 15 souris tests dont l’objectif est de vérifier si les paramètres mesurés ont dévié par rapport à la génération initiale. Le nombre de 15 souris est le plus petit possible car 5 souris sont mises à mort pour chaque jour de prélèvement. Afin de réduire ultérieurement le nombre total de souris, nous avons décidé de ne répéter l’expérience qu’une fois. Par ailleurs cette répétition ne concerne que les souris tests et non pas les souris utilisées pour les passages. Au total, avec les répétitions, 610 souris seront nécessaire sur une période de 3 ans.

Raffinement

Plusieurs mesures sont prises pour réduire au minimum l’inconfort et le stress des animaux utilisés dans cette expérience. D’abord, tous les animaux sont hébergés en groupe (minimum 5 individus par cage) afin de permettre l’expression des comportements sociaux. Lors des prélèvements de fèces, les animaux ne sont isolés que pendant 1 heure, ce qui représente 1% du temps hebdomadaire passé en isolement. Toutes les cages sont enrichies et ont du matériel pour la construction de nids. Toutes les manipulations sont effectuées par du personnel expérimenté, dans un environnement calme qui minimise le stress des animaux. Les injections et prélèvements de sang sont effectués après application d’un anesthésiant local pour éviter toute douleur. Enfin, tous les animaux sont surveillés au moins une fois par jour pour évaluer leur état général.

Choix des espèces

La souris est le modèle de choix pour ce type d’expérience. Les parasites sont des parasites spécifiques de souris qui reproduisent assez fidèlement les coïnfections observées chez l’homme entre nématodes intestinaux et malaria. Nous utiliserons des animaux entre 8 et 10 semaines. Il s’agit d’individus adultes avec une système immunitaire complétement développé.

7 300 bars européens vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Aux stades post-larvaires, ils sont exposés pendant 45 jours à un mélange de polluants PFAS dans leur alimentation et à une hausse de la température de l'eau de 5 °C, puis pêchés et tués à douze points de prélèvement. Le porteur décrit un stress léger cumulé qu'il juge modéré, et vise à comprendre les effets combinés du réchauffement climatique et de la contamination chimique. Les bénéfices annoncés restent une référence pour de futures études en écotoxicologie marine.

Objectifs

Le projet vise à acquérir des connaissances sur les effets interactifs des contaminants chimiques et de l'augmentation de la température sur le bar européen. On s'attend à ce que les écosystèmes marins soient affectés par le réchauffement dû au changement climatique et par le nombre croissant de contaminants chimiques bioaccumulés dans l’environnement, tels que les substances per- et polyfluoroalkyles (PFAS). Ces composés désignent un groupe de produits chimiques manufacturés (composés organofluorés) qui sont utilisés dans l’industrie et les produits de consommation en raison de leurs propriétés antiadhésives, résistances aux fortes chaleurs et imperméabilisantes. Ils sont présents dans une grande variété de biens de consommation, tels que les mousses anti-incendie, les ustensiles de cuisine antiadhésifs, les cosmétiques, les emballages alimentaires et les matériaux comme les moquettes, les tissus antitaches et les vêtements hydrofuges. Compte tenu de leurs utilisations, persistance et omniprésence, ces composés sont identifiés dans tous les compartiments de notre environnement (eau, sol, air) et représentent une menace pour l’environnement marin. Ensemble, ces facteurs de stress (tempérarture et contamination chimique) constituent un défi pour les organismes marins et peuvent nuire à leur croissance et à leur développement. Le projet ambitionne d'étudier simultanément la manière dont l'augmentation de la température pourrait influencer la cinétique d’accumulation de ces contaminants, et la manière dont ces facteurs de stress combinés impactent les fonctions physiologiques d'un poisson de climat tempéré. Une exposition en laboratoire des premiers stades de vie du bar (post-larves) dans le cadre d'une élévation de température de l’eau de +5°C seront mises en oeuvre, avec une contamination alimentaire d'un mélange de contaminant. Ce projet se décline en 3 objectifs : i) étudier la façon dont les contaminants sont assimilés par les poissons à 2 températures différentes ; ii) étudier l’influence de la température sur les voies d’élimination des contaminants et iii) étudier l'impact de l’augmentation de la température de l’eau et de la contamination chimique sur la mise en place de l’axe de la reproduction et du développement des bars.

Bénéfices attendus

Cette expérimentation fournira des connaissances et des outils pour une meilleure anticipation et compréhension des changements globaux à venir, et servira de référence pour les études futures en écotoxicologie marine. En particulier, sur la façon dont l'histoire environnementale précoce des poissons peut affecter les fonctions physiologiques des stades ultérieurs dans leur capacité à faire face à l'environnement pollué et au changement climatique.

Procédures

Les poissons seront soumis à une contamination de composés organofluorés dans l’aliment pendant une période de 45 jours. Pendant cette période, 8 points de prélèvements seront réalisés à 0, 4, 8, 14, 21, 28, 35 et 45 jours pour suivre les cinétiques de contamination. Cette exposition sera suivie d'une phase d'épuration pendant 2,5 mois avec également 4 points de prélèvements à 48, 53, 75 et 120 jours. Ces prélèvements nécessiteront la mise à mort des poissons.

Impact sur les animaux

La principale nuisance attendue correspond à un stress léger pendant les 45 jours de contamination dans les 4 groupes expérimentaux de poissons. Un stress léger supplémentaire (moins d’une minute) sera également généré lors des pêches nécessaires pour la réalisation des prélèvements. Compte tenu de ces deux stress cumulés, les nuisances attendues sont modérées.

Devenir

Mise à mort nécessaire pour réaliser les prélèvements.

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative à cette expérimentation animale car nous cherchons précisément à identifier 1/ les cinétiques d’accumulation de contaminants sur des stades précoces (post-larves) dans un contexte de réchauffement climatique ; 2/ paramétrer les effets potentiels de ce multi-stress sur les stades précoces pour appréhender l’impact sur les stades ultérieurs.

Réduction

Des calculs de puissance statistique reposant sur des analyses de variance ont été réalisés. Le nombre d’animaux est estimé afin 1/ d’optimiser les quantités nécessaires pour les différents types d’analyses (chimiques, biochimique et biomoléculaires) ; 2/ de permettre des analyses statistiques fiables malgré la variabilité de la réponse physiologique entre les individus. 3/ le bar étant une espèce grégaire (qui vit en banc), ce nombre correspond au maintien d’une densité minimale compatible avec le bien-être animal et le bon déroulement de l’expérience (i.e. n’induisant pas de perturbations physiologiques pouvant fausser l’étude).

Raffinement

• Un jeûne (minimum 12 heures) sera réalisé avant les manipulations afin d’éviter la régurgitation et le malaise des poissons. • La pêche des poissons se fera à l’aide d’un Becher pour les stades post-larves, puis à l’aide d’une épuisette appropriée à la taille des bacs et des juvéniles. • Au préalable à l’exposition aux contaminants par voie trophique, qui nécessite l’utilisation d’une solution de solvant (méthanol), un test d’appétence a été réalisé sur les recommandations de la cellule SBEA (Structure Bien-Etre Animale) du laboratoire. Aux concentrations utilisées, le méthanol n’altère ni l’appétence de l’aliment, ni la croissance des poissons.

Choix des espèces

Les expériences proposées utiliseront le bar européen (Dicentrarchus labrax) comme modèle animal. Il existe une grande quantité d’informations disponibles concernant la zootechnie, la biochimie, le comportement et l’endocrinologie du bar ce qui permet d’envisager une étude approfondie des effets combinés du réchauffement climatique et de la contamination par des composés poly et perfluoroalkylés (PFAS) sur la physiologie de cette espèce. Le stade post-larves du bar sera ciblé en particulier puisqu’il est démontré que l’exposition à des changements environnementaux aux stades précoces induit des effets à long terme sur les stades ultérieurs. Par ailleurs, ce stade de vie (fin de développement larvaire) correspond au retour des individus à la côte, où une exposition aux contaminants chimiques est plus importante, particulièrement en zone estuarienne.

240 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections répétées d'un anticorps, des injections rétro-orbitaires sous anesthésie, subissent pour certaines une néphrectomie ou la pose de pastilles induisant une hypertension, et passent en cage métabolique, avant d'être tuées pour analyser les reins. Le porteur décrit une douleur minime aux injections intrapéritonéales et les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension induites. Il affirme que les analyses in vitro et in silico ne conviennent pas à l'étude des maladies glomérulaires, testée ici avant un éventuel usage chez l'humain.

Objectifs

Les glomérulopathies sont un groupe de maladies touchant le glomérule. Le glomérule fait partie du rein et est à la base de la filtration du sang et de la production de l'urine. Les glomérulopathies conduisent donc rapidement à l'insuffisance rénale. Un type de cellule du glomérule, les cellules épithéliales pariétales (CEP), joue un rôle majeur dans ces glomérulopathies. En effet, l'activation des CEP est à l'origine des lésions du glomérule qu'on retrouve dans les glomérulopathies. Nous avons à disposition un anticorps bloquant l’activation de ces CEP. Nous voulons tester cet anticorps dans des modèles murins de glomérulopathies afin d’évaluer sa capacité à prévenir l’apparition de l’insuffisance rénale avant une éventuelle utilisation comme médicament chez l'humain.

Bénéfices attendus

Ce projet pourra mettre en évidence l'efficacité d'un nouveau traitement dans deux types de glomérulopathies qui sont deux causes majeures d'insuffisance rénale terminale. Il permettra également de mieux appréhender les mécanismes physiopathologiques de ces glomérulopathies et notamment le rôle des CEP dans celles-ci.

Procédures

104 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti-claudin 1 humaine dans un modèle de glomérulonéphrite proliférative extra-capillaire, le modèle NTS" subiront une injection de l'anticorps d'interêt ou de son contrôle en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 2 ou 3 semaines en fonction de la procédure, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces 104 mêmes souris subiront trois injections en rétro-orbitaire de NTS 3 jours de suite aprés anésthésie à l'isoflurane, cette injection dure 30 secondes. Ces souris seront également mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures et enfin subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, qui dure 2 minutes. Ces 104 souris de la P1 subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 104 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention. 58 souris de la procédure "efficacité de l'anticorps anti claudin 1 humaine dans un modèle d'HSF, le modèle DOCA salt" subiront une uni-néphrectomie et la mise en place de pellet doca salt sous anesthésie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine, cette intervention dure 25 minutes. Ces 58 souris subiront une injection de l'anticorps anticlaudin 1 humaine ou de son isotype en intra périntonéale deux fois par semaine pendant 58 jours, ces injections seront effectués sur animaux vigiles. Ces injections intra péritonéales durent une minute. Ces mêmes 58 souris seront mises en cages metaboliques une fois par semaine pour une durée maximale de 14 heures pendant 6 semaines et subiront un prélévement de sang en intracardiaque sous anésthesie générale gazeuse à l'isoflurane et sédation à la buprénorphine. Ce prélèvement dure deux minutes. Enfin, ces 58 souris subiront une mise à mort par dislocation cervicale après anesthésie à l'isofurane. Pour ces 58 souris, cela fait au total 5 différents types d'intervention.

Impact sur les animaux

Les souris subiront le stress d'être isolées pendant le passage en cage métabolique. Elles subiront une douleur minine lors des injections intra péritonéales. Lors des procédures plus invasives comme les injections rétro orbitaires, la néphrectomie ou la mise en place des pellets DOCA, elles seront anesthésiées à l'isoflurane et analgésiées. Enfin, elles subiront les conséquences physiologiques de l'insuffisance rénale et de l'hypertension artérielle induites par les modèles expérimentaux

Devenir

Etant donné que les reins de ses animaux seront analysés, les animaux de ce projet seront mis à mort.

Remplacement

le modèle animal permet de réaliser des expériences de physiopathologie rénale en prenant en compte tous les paramètres physiologiques qui existent in vivo. Les analyses in vitro ou in silico ne sont pas relevantes en ce qui concerne l'étude des maladies glomérulaires car il existe beaucoup de paramètres physiologiques qui entrent en jeu. Des tests in vitro ont été réalisés afin de sélectionner les clones d'anticorps, ces tests ont permis de mettre en évidence leur spécificité et leur efficacité d'anticorps bloquant.

Réduction

Nous utiliserons le nombre minimum d'animaux requis afin de permettre une analyse statistiquement pertinente des résultats en prenant compte de la variabilité inter et intra expérience. Le calcul des effectifs nécessaires a été fait avec un risque alpha de 5%, une puissance de 95%, une moyenne du groupe contrôle de 12, une moyenne pertinamment différente attendue de 8 dans le groupe traité, une déviation standard de 4 et un ajustement de 10%; ce qui donnait 26 animaux par groupe requis. 3 animaux de plus sont prévus pour pallier les risques du modèle expérimental (mortalité liée à la chirurgie odans le modèle DOCA salt).

Raffinement

Afin de réduire l'angoisse et la souffrance des animaux des mesures seront prises: 1)Une surveillance des animaux, quotidienne par les zootechniciens et bi-hebdomadaire par l'expérimentateur, sera réalisée. Une grille de score d'évaluation de la douleur a été établie permettant d'évaluer la souffrance des animaux et de déterminer des points limites. 2) La procédure terminale sera réalisée sous anesthésie générale gazeuse + buprénorphine . 3)Les procédures invasives tel que les injections retro-orbitaires seront réalisées sous anesthésie générale gazeuse et les souris recevront un traitement analgésiques qui sera renouvelé et poursuivie si les animaux présentent des signes de souffrance. 4)Les souris seront hébergées en groupe et l’enrichissement de leur environnement sera à base de coton déchiquetable, préservant ainsi une activité et un exercice naturel. 5) une double litière sera mise en place pour pallier à la production excessive d'urine par les souris du modèle DOCA salt, et les cages seront changées 3 fois par semaine.

Choix des espèces

Les mécanismes des maladies du rein sont similaires chez l'homme et la souris et ce sont dans les maladies du rein qu'il existe un interet à bloquer l'activation des cellules appelées CEP et donc à utiliser l'anticorps anti claudin 1. Les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 2 à 6 mois car il faut des adultes au système immunitaire mature (>2 mois) et suffisamment jeunes pour ne pas observer des maladies du rein liées au vieillissement.