Autre recherche fondamentale

349 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester si un gène du chromosome X explique la réponse immunitaire plus forte des femelles à la grippe. Des femelles portant une ou deux copies du gène TLR7, et leur descendance, reçoivent un vaccin ou une injection de virus grippal H1N1 sous anesthésie, avec des prises de sang répétées. Le porteur indique attendre les signes classiques de la grippe, perte de poids, perte de motricité, douleur et incapacité à s'alimenter, avant mise à mort pour prélèvement. Il affirme qu'une expérimentation sur animal est "nécessaire" après les travaux in vitro du projet.

Objectifs

La nature et la force de la réponse immunitaire varient entre les femmes et les hommes, ce qui entraîne des différences fondées sur le sexe dans la prévalence, la susceptibilité et les symptômes associés aux maladies infectieuses . Certains gènes du chromosome X (dont le gène appelé TLR7) constituent une ligne de défense essentielle contre les virus à ARN (dont les virus influenza, responsables de la grippe). Les femelles mammifères (XX) ont 2 copies actives du gène TLR7 par cellule, alors que les mâles (XY) n’en ont qu’une. Il a été démontré (chez la souris comme dans l’espèce humaine) que les femelles présentent des réponses immunitaires à l'infection grippale et à la vaccination supérieures à celles des mâles. Nous allons étudier la réponse immunitaire suite à une vaccination grippe ou à une injection de virus grippal chez des souris femelles ayant une ou deux copies du gène TLR7, afin d’étudier la qualité de la réponse immunitaire chez ces femelles ainsi que chez leur descendance.

Bénéfices attendus

Nous allons développer et valider de nouveaux outils génétiques chez la souris pour suivre les cellules immunitaires au cours de la réponse à la vaccination ou à l’infection par des virus de la grippe afin de déterminer si les différences de réponse immunitaires entre mâles et femelles passe bien par le gène TLR7. Globalement, notre projet fournira de nouvelles connaissances sur la nature des mécanismes responsables de la prédominance féminine dans l'immunité induite par TLR7, et pourrait ouvrir des voies pour le développement de nouvelles stratégies vaccinales contre les virus de la grippe et plus généralement contre les virus à ARN.

Procédures

prises de sang (sous anésthésie, entre 1 et 8 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; pesées (animaux vigiles, 1 à 2 par jour selon les procédures, durée 30 secondes); injections de vaccin ou serum (sous anesthésie, entre 1 et 2 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes) ; injection de virus (sous anesthésie, 1 par procédure (de 15 jours), durée de l'anesthésie 10 minutes); anesthésie/euthanasie finale en fin de procédure

Impact sur les animaux

Nous attendons les signes cliniques classiques des infections Influenza A chez la souris : perte de poids, perte de motricité, douleur, incapacité à s’alimenter

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés. ce sont des souris d’élevage, transgéniques, voire infectées par du virus influenza, ce qui requiert une euthanasie systématique en fin de procédure

Remplacement

Afin d’étudier l’effet du nombre de copie du gène TLR7 sur la réponse immunitaire humorale face à une infection virale, une expérimentation animale est nécessaire après les études in vitro (correspondant aux autres workpackages du projet)

Réduction

Des études statistiques seront utilisées dans cette étude afin de justifier la pertinence de nos résultats. Tenant compte de l’expérience des membres du projet ainsi que des données de la littérature, le nombre de souris nécessaire par groupe expérimental pour que nos résultats soient pertinents est déterminé de la façon suivante : 3 souris par groupe et/ou jour post infection pour les autopsies, 5 souris pour un suivi clinique de 14 jours, et 5 souris contrôles non infectées).

Raffinement

Le suivi des animaux sera effectué 1 fois par jour pendant la durée de la procédure, et 2 fois par jour au pic de l’infection. Les animaux seront euthanasiés dès qu’un des points limites sera atteint. Pour les prises de sang et injections (de serum (voie IP), de vaccin (voie IP) ou de virus (voie IN), les souris seront anesthésiées en utilisant le poste d'anesthésie gazeuse (isoflurane).

Choix des espèces

Les souris sont classiquement utilisées pour étudier la réponse immunitaire lors d’infection au virus Influenza. Par ailleurs, nous allons utiliser une lignée murine transgénique produite par notre partenaire dans le projet, et son équivalent sauvage - animaux adultes pour étudier la réponse immunitaire d’animaux en âge de reproduction, et pour obtenir une descendance. - souriceaux pour étudier l’effet des anticorps maternels contre une infection influenza chez la descendance

150 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Répartis en cinquante protocoles de trois animaux, ils reçoivent une injection sous-cutanée d'antigène couplé à l'adjuvant complet de Freund puis trois prélèvements de sang, avant mise à mort à dix jours, pour produire des anticorps polyclonaux vendus à des équipes de recherche. Le porteur reconnaît que l'injection peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et un inconfort. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et présente la production sur animal vivant comme "indispensable", au service d'une activité commerciale répondant aux "besoins" des laboratoires.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole envisagé est particulier, car il vise à récupérer uniquement les anticorps générés lors d'une réponse primaire. Par conséquent, la procédure expérimentale est plus courte que des protocoles classiques d'obtention d'anticorps polyclonaux et ne nécessitera qu'une seule injection. Les anticorps seront récupérés à l'aide de prélèvement d'échantillons de sang, dont les volumes seront adaptés au poids de l'animal en suivant des recommandations. Le protocole durera 10 jours, ce qui est plus court que les protocoles classiques de 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une subtsance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe. Afin de répondre aux besoins exprimés par différentes équipes de recherche, 50 protocoles sont envisagés.

Procédures

1 injection en sous cutanée de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en sous-cutanée couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal et correspondront au maximum à 2% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J10.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'acépromazine, qui possède un effet tranquilisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

320 rongeurs, souris et rats, vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une pompe est implantée chirurgicalement sous anesthésie pour administrer en continu des molécules candidates, avec des prélèvements de sang à la jugulaire sous anesthésie, dans le cadre du développement de médicaments. Le porteur présente cette pompe comme un "raffinement" évitant les injections répétées, tout en reconnaissant des douleurs post-opératoires pendant 48 heures et un risque d'infection au site d'incision. Il affirme qu'aucun modèle in vitro ne reflète l'absorption et le métabolisme d'une molécule dans un organisme vivant.

Objectifs

La recherche et le développement de nouveaux médicaments impliquent la réalisation de tests visant à caractériser les molécules candidates et leur comportement après administration chez l'animal que ce soit dans des études de pharmacocinétique ou d'efficacité. La réalisation de ces tests nécessite parfois d'effectuer des administrations répétées de la molécule à étudier. Les pompes osmotiques sont des pompes miniatures pouvant être implantées chez la souris, le rat ou d'autres animaux de laboratoire lors de protocoles de recherche expérimentale. Ces mini-pompes permettent d’administrer des médicaments, des hormones et d'autres substances à l’étude à des débits continus et contrôlés sur une période allant d'un jour à six semaines, sans recours à des branchements externes, ni à des manipulations fréquentes. Leur fonctionnement automatisé libère le personnel de laboratoire des astreintes liées aux injections répétées durant la nuit ou pendant le week-end et permet de raffiner les techniques d'administration des molécules. Ce projet a donc pour objectif de raffiner ces administrations grâce à la pose d'une pompe Alzet®, cette dernière permettra l'administration en continue de la molécule chez les animaux en évitant par la suite des contentions et des injections répétées, ce qui n'affectera pas leur bien-être.

Bénéfices attendus

L'ajout d'un dispositif à administration lente en continu permettra de raffiner les modèles animaux en réduisant les manipulations / contentions chez l'animal, ainsi que les éventuelles administrations répétées de molécules. L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Procédures

Pour la pose de la pompe Alzet® les animaux seront anesthésiés puis subiront une procédure chirugicale (durée d'intervention 10 minutes pour les procédures 1 & 3 et 20 minutes pour la procédure 2). Les animaux seront anesthésiés pour effectuer les prélèvements de sang plusieurs fois au cours des procédures, l'animal sera alors endormi puis prélevé à la veine jugulaire (durée d'intervention 5 minutes).

Impact sur les animaux

L'installation de la pompe chez l'animal peut entraîner des douleurs post-opératoires les premières 48h. Malgré l'aseptie rigoureuse pratiquée lors de l'étape chirurgicale, il est également possible que l'animal présente de légères complications (infections) au niveau de la zone incisée. Une désinfection locale de la plaie sera alors mise en place (Vétédine) et l'animal placé sous surveillance renforcée.

Devenir

Tous les animaux des procédures seront mis à mort car ils auront subi une administration de molécules et ne pourront donc pas être inclus dans un nouveau protocole expérimental. De plus, pour la plupart des tissus seront prélevés afin d'analyses complémentaires.

Remplacement

La recherche et le développement de nouvelles molécules thérapeutiques impliquent la réalisation de tests chez l’animal pour plusieurs raisons : - Il n’existe pas de modèle in vitro permettant d'intégrer et de refléter les caractéristiques d'absorption, de distribution, de métabolisme et d'élimination d'une molécule donnée au sein d'un organisme vivant. Il existe cependant des modèles cellulaires permettant d'évaluer la cytotoxicité, l'absorption et le métabolisme de molécules in vitro. Ces tests permettent d'effectuer un premier criblage de molécules, mais doivent ensuite être confirmés chez l’animal. - Des premières données concernant la pharmacocinétique, le métabolisme et la tolérance des molécules in vivo doivent être apportées avant de passer au stade clinique de développement de ces molécules (tests cliniques chez l’Homme). L'ensemble de ces données aident à la prédiction du comportement d'un médicament lors d'une administration chez l'Homme.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire dans chaque lot a été défini de façon à obtenir une puissance statistique suffisante pour pouvoir interpréter et valider les résultats d'expérience.

Raffinement

La pose d'une pompe va permettre un meilleur confort de l'animal puisqu'il implique une réduction du nombre de contentions et d'administrations répétées chez ce dernier. Les expérimentateurs qui effectueront la chirurgie de la pose de la pompe sont exclusivement des personnels formés à la chirurgie et maîtrisent les bons gestes garantissant l'aseptie pendant la chirurgie ainsi que le bien-être animal en pré, per et post opératoire. Le milieu sera enrichi dans les cages (igloo, bûchettes, cotons pour nidification). Afin de minimiser le poteniel de souffrance et /ou de détresse chez les animaux, des points limites précis et spécifiques ainsi que des critères d'arrêt des souffrances seront mis en oeuvre tout au long du projet.

Choix des espèces

Les multiples homologies de séquences entre le rat, la souris et l'Homme rendent ces modèles prédictifs du comportement des molécules après administration. Il est ainsi d'un grand intérêt pour le criblage de nouvelles molécules. De plus, ces espèces présentent certains intérêts pratiques décisifs : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une très bonne adaptation aux conditions expérimentales. Les animaux seront utilisés au stade de jeunes adultes (4-10 semaines) car il s'agit du stade auquel ils sont les plus susceptibles de fournir des résultats satisfaisants. Il permet d'allier à la fois maturité sexuelle, hormonale et immunitaire. Ces modèles animaux sont ainsi adaptés aux études d'efficacité de nouvelles molécules thérapeutiques.

1 890 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit l'ablation chirurgicale de 40 % d'un tissu adipeux sous-cutané, suivie d'injections d'une molécule orientant la cicatrisation ou la régénération, avant prélèvement d'organes. Le porteur décrit un suivi du bien-être adapté à l'inflammation provoquée par la chirurgie. Sur le remplacement, il affirme que l'étude de la régénération d'un organe ne peut se faire que sur des animaux vivants, les hypothèses étant d'abord testées in vitro et in silico.

Objectifs

La réparation tissulaire d’une lésion peut conduire à l’activation de deux processus : la régénération qui correspond à la restauration de la structure du tissu et de sa fonction, ou la cicatrisation qui est caractérisée par un dépôt excessif de matrice extracellulaire(MEC) affectant l’architecture globale du tissu et sa fonction. La faculté de régénérer certains membres ou organes est retrouvée chez les vertébrés non mammifères ou chez des organismes inférieurs tels que la salamandre, le poisson zèbre ou encore le planaire. En revanche, chez les mammifères, les capacités régénératrices sont restreintes à une courte période périnatale. Cette perte de capacités régénératrices post-natales chez les mammifères adultes suggère la mise en place de mécanismes inhibant la régénération au profit des processus cicatriciels. Notre projet consiste désormais à explorer comment les propriétés mécaniques de la matrice extracellulaire contrôlent les processus de régénération chez les mammifères. Ce projet sera développé sur un modèle de lésion du tissu adipeux (lipectomie) chez la souris, puisque notre équipe a déja démontré la capacité de ce tissu à régénérer, sous certaines conditions bien maîtrisées.

Bénéfices attendus

La compréhension du mécanisme de régénération, en particulier la maîtrise de la production de MEC, pourrait permettre d’améliorer la réparation tissulaire chez le mammifère adulte, y compris l'homme, afin de rétablir les fonctions tissulaires après lésion.

Procédures

Tous les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale permettant d'initier le modèle lésionnel. Il s'agit d'une lipectomie : résection partielle (40%) d'un seul tisu adipeux sous-cutané, réalisée en 10 minutes. Puis tous les animaux seront injectés (maximum 1 minute) avec une molécule pharmalogique afin d'orienter l'issue du modèle vers la régénération ou la cicatrisation et d'en étudier les mécanismes moléculaires et cellulaires. Celles ci n’excèderont pas 200 μL par voie sous-cutanée ou par voir intra-péritonéale, et leur fréquence (1seule par jour) pourra varier selon les molécules, de J0 à J4, ou bien tous les 3 jours pendant la durée du protocole.

Impact sur les animaux

L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux sur l’état global de santé des animaux, et sera adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures, tels que l'inflammation générée par la chirurgie. Les protocoles sont réfléchis afin d’être le moins douloureux possible pour l’animal (mode et volume d’injection, durée du traitement…) et les études antérieures nous ont permis de mieux appréhender les points limites pour le bien-être des animaux.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour prélevements d'organes.

Remplacement

Même si l’étude de la régénération d’un organe ne peut se faire qu’’en utilisant des animaux vivants, de nombreuses hypothèses sont au préalable testées in vitro et in silico. Le recours à l’animal est donc restreint uniquement aux expériences indispensables.

Réduction

Chaque étude est discutée avec l’ensemble de l’équipe de recherche afin de garantir la pertinence de chaque expérience et d’établir un protocole d’étude adapté à l’obtention de résultats fiables permettant d’atteindre l’objectif, et en évitant la répétition des groupes contrôles indispensable à la validation des résultats. D'après notre expertise le nombre minimum d'animaux pour obtenir des résultats reproductibles et statistiquement interprétables est de 5 animaux par groupe, et doit être répété 3 fois pour obtenir une significativité des résultats. Ce sont également les résultats des simulations dans notre modèle in silico qui nous permet de ne réaliser que les expérimentations les plus pertinentes.

Raffinement

Les conditions d’expérimentation font l’objet d’un travail de raffinement continu dans le but d’aboutir à des procédures de travail définies, et avec une procédure de suivi du bien-être animal adaptée aux expériences. En effet, les animaux ne seront jamais seuls en cage afin de respecter le caractère grégaire de la souris. Nous proposons aussi d’enrichir l’environnement des souris, favorisant le bien-être de l’animal. L’expérimentation fait l’objet d’une procédure de suivi du bien-être des animaux, adaptée à l’expérience et aux potentiels effets indésirables des procédures, sur l’état global de santé des animaux. Les protocoles sont réfléchis afin d’être le moins douloureux possible pour l’animal (anesthésie gazeuse, mode et volume d’injection, durée du traitement…) et les études antérieures nous ont permis de mieux appréhender les points limites pour le bien-être des animaux. La surveillance des souris sera réalisée tous les jours. Ceci permettra de proposer des soins adaptés, de sortir de l’étude, ou bien d’euthanasier les animaux en cas de comportements anormaux ou de souffrance (points limite : perte de poids, prostration, poil hirsute).

Choix des espèces

Afin d’étudier les processus de régénération, il est indispensable d’étudier les mécanismes mis en place au cours du temps, après lésion tissulaire. Notre laboratoire a montré que le fond génétique, ou bien les récepteurs aux opioïdes jouaient un rôle majeur dans la balance régénération/cicatrisation. Afin d’en étudier les effets de ces paramètres, nous disposons au laboratoire ou par l’intermédiaire de collaborations plusieurs lignées transgéniques de souris tout à fait pertinentes pour mener à bien notre étude. C’est pourquoi l’ensemble de ce projet nécessite l’utilisation de l’espèce mus musculus. Les animaux seront utilisés à l’âge de jeune adulte (de 6 à 8 semaines) afin d’utiliser des animaux à maturité sexuelle. Les procédures décrites dans ce protocole ont déjà été validées sur des animaux de cet âge et les résultats ont été publiés.

320 porcs vont être utilisés, la moitié tuée à l'issue et l'autre renvoyée en élevage, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié est opérée sous anesthésie pour la pose d'un cathéter jugulaire et d'un capteur de température, subit des prélèvements sanguins de 140 ml par cinétique et une exposition à des chaleurs de 30 à 35 °C, pour étudier les effets des vagues de chaleur sur l'élevage porcin. Le porteur indique qu'une hyperthermie au-delà de 41,5 °C entraîne l'euthanasie et héberge chaque porc seul dans une loge de 2 m². Il précise que 160 porcs équipés d'un cathéter ne seront "pas commercialisables" et destine les résultats à la filière porcine.

Objectifs

Le dernier rapport du GIEC confirme les tendances globales d’une augmentation de la température moyenne et de la fréquence d’évènements extrêmes (anomalies thermiques de type vagues de chaleurs, sécheresses prolongées, tempêtes, etc..) dans le futur. Il est maintenant acquis que les perturbations bioclimatiques dues au changement climatique auront un impact sur les systèmes de production via des effets cumulés sur les ressources alimentaires, sur l’environnement sanitaire et sur les performances et le bien-être des animaux. A moyen et long termes, l’adaptation des systèmes d’élevage au changement climatique est donc un enjeu majeur pour garantir la durabilité des exploitations et des filières animales. Chez le porc, les effets d’une exposition prolongée à la chaleur sont bien connus. La réduction des performances est en grande partie liée à une réduction de la consommation d’aliment qui est considérée comme une adaptation pour réduire sa production de chaleur métabolique. Contrairement aux effets d’une exposition prolongée, les effets à court, moyen et long termes d’un stress thermique aigu de type vague de chaleur sont peu décrits chez les porcs. Par ailleurs, nos premiers résultats indiquent qu'il est nécessaire de mettre en place des stratégies d'adaptation spécifiques pour limiter les effets à court et long terme des vagues de chaleur estivales. L'objectif de ce projet est de conduire des études pour poursuivre la caractérisation des effets d'un stress thermique aigue sur la physiologie, le bien-être et les performances des porcs et de tester des stratégies alimentaires pour atténuer ces effets et améliorer la récupération des animaux dans les semaines suivant la ou les vagues de chaleur.

Bénéfices attendus

Au-delà de la production de connaissance sur un sujet émergent et important pour la filière porcine, les résultats de ces essais devraient nous permettre de faire des préconisations auprès des différents acteurs de la filière (firmes services, fabricants d'aliment, éleveurs)

Procédures

Opérations chirurgicales sous anesthésie générale (durée =1 heure) pour équiper les animaux d'un cathéter veineux et d'un capteur de température interne. 50 % des animaux déclarés dans la demande d'autorisation de projet seront concernés. Prélèvements de sang en cinétique via le cathéter jugulaire (durée totale de 6 heures) : nous allons réaliser une cinétique de prélèvements 5 fois pendant l'essai. Pour chaque cinétique, 20 prélèvements de 7 mL seront effectués au cours de 24 h, soit un volume total de 140 mL par porc à chaque cinétique, correspondant à 3 % du volume circulant. Tous les animaux équipés d'un cathéter sont concernés. Prélèvements de sang via le dispositif vacutainer : dans les essais consacrés à la mesure des performances et du comportement des animaux. Dans ce cas, nous effectuerons au maximum 3 prélèvements par porc durant un essai (durée d'un prélèvement < 1 min). A chaque fois, 10 mL de sang sont prélevés. Seuls 50% des animaux déclarés dans la demande d'autorisation de projet sont concernés. Prélèvements de salive : 3 prélèvements/jours 5 fois pendant l'essai à l'aide d'un tampon à mâcher (durée du prélèvement = 2 min). Tous les animaux déclarés dans la demande d'autorisation de projet sont concernés.

Impact sur les animaux

Une partie des effets indésirables attendus sur les animaux est liée à leur exposition à la chaleur (de 30 à 35°C, selon les essais). Le suivi en continu de la température interne et les mesures ponctuelles du rythme des ventilations pulmonaires nous permet de détecter très rapidement les animaux en hyperthermie grave (>41,5°C pour la température interne et > 200 ventilations/min pour le rythme ventilatoire). Quand ces points limites sont atteints, les animaux sont d'abord mis hors expérience et relogés dans des conditions thermoneutres. En cas d'hyperthermie persistante, les animaux sont euthanasiés. Par ailleurs, pour des raisons liées à l'expérimentation et à la nécessité de réalisée des mesures individuelles non compatible avec un élevage en groupe (consommation d'aliment, comportement alimentaire, rythme des ventilation pulmonaires, prises de sang sériées), il est nécessaire d'héberger les animaux (60 kg en moyenne) individuellement durant toute la durée des essais dans des loges de 2 m². Dans ces conditions, les animaux ont la liberté de se mouvoir et de voir et d’interagir avec ces congénères logés dans la même salle via des "fenêtres" à barreaux (0.5*0.5) localisées dans les parois qui séparent deux loges. Enfin, le dernier risque identifié est celui lié à l'anesthésie (anesthésie gazeuse avec un mélange d'oxygène / isoflurane) pour implanter les dispositifs de contrôle de la température interne et les cathéters à la jugulaire. Le protocole de monitoring des animaux en place dans l'unité expérimentale (suivi de la spo2, rythme cardiaque) permet d'appréhender ce risque. Les prélèvements de sang et de salive étant réalisés par du personnel compétent dans le cadre de procédures où les points limites sont définis, nous ne nous attendons pas à des nuisances particulières liées aux différents prélèvements.

Devenir

Sur les 320 porcs, 160 animaux ne seront pas commercialisables car équipés d'un cathéter et de par la nécessité de réaliser des prélèvements de tissus une fois l'animal euthanasié.

Remplacement

Le remplacement n’est pas possible car l’utilisation d’animaux est inhérente au type d’étude (mesure des impacts du changement climatique et en particulier des vagues de chaleur estivales et test de stratégies d'adaptation) impact de la conduite alimentaire sur les réponses des porcs charcutiers aux vagues de chaleur).

Réduction

Dans chaque étude du projet, nous avons réduit le nombre d’animaux au minimum statistique en fonction des mesures effectuées. Le nombre de sujets nécessaires/traitement expérimental à inclure dans une étude afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs pour une puissance de test donnée a été calculé en utilisant une procédure mathématique adaptée pour deux caractères d'intérét majeur (l'ingestion rapportée au poids métabolique et la température interne). Ces calculs basés sur la moyenne et l'ecart type des 2 caractères mesurés à partir des essai précédents indiquent qu'il est nécessaire de mesurer au moins 8 animaux/traitement pour mettre en évidence des différences significatives entre nos traitements. En d'autres termes, sur une étude de 32 animaux, 4 traitements pourront être testés.

Raffinement

Toutes les mesures seront réalisées par du personnel formé et expérimenté. Les animaux bénéficieront d’un suivi très proche par les techniciens en expérimentation ainsi que par les différents intervenants. Toute intervention potentiellement douloureuse ou stressante sera contrôlée, et les animaux suivis dans les minutes ou heures qui suivent. En cas de souci de santé, le vétérinaire sera consulté et les animaux traités en conséquence. Le suivi des animaux via un capteur de température embarqué en remplacement d'une prise de température manuelle, nous permet de limiter les interactions avec les animaux et le stress engendré par ce type de mesure tout en améliorant la qualité de la mesure. Le recours à une cathéterisation veineuse pour faire des cinétiques sanguines permet de réduire significativement le niveau de stress induit par un prélèvement ponctuel de sang qui demande une immobilisation de l'animal au lasso nasal. En accord avec le principe d'amélioration, des points limites sont fixés pour chaque interventions sur les animaux. Ces points limites declanchent automatiquement une ou des décisions pour minimiser la souffrance des animaux selon un plan de prise en charge détaillé prévue au moment de la rédaction du plan de l'étude. Ce plan inclus notamment des critères explicites et détaillés de décisions, qui seront utilisés pour déterminer si l'animal sera retiré de l'étude, soigné ou euthanasié.

Choix des espèces

- Le porc ne peut pas être remplacé par une espèce modèle compte tenu de la spécificité de ses réponses de thermorégulation (le porc ne possède pas de glandes sudoripares actives). - Nous avons choisi de travailler sur le porc en croissance finition car ce stade représente la plus grande partie des effectifs animaux au sein d'un élevage de porc et est connu pour être très sensible à la chaleur (en particulier en finition) - Nous avons choisi de travailler sur des animaux croisés et à la fois sur les mâles entiers et les femelles pour produire des résultats compatibles avec les populations en production. - Nous travaillerons sur des animaux avec un poids vif moyen minimal de 60 kg ce qui correspond au poids vif moyen des porcs en élevage commercial.

24 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une chirurgie abdominale de quarante minutes qui dérive le canal lymphatique, puis un gavage d'une formule riche en oméga-3 et une collecte de lymphe pendant six heures en cage individuelle. La dérivation étant irréversible, tous sont tués en fin de protocole, leurs organes servant aussi à d'autres analyses. Le porteur relie ce travail à des recommandations nutritionnelles et à la "valorisation" de matrices alimentaires pour les consommateurs.

Objectifs

Une meilleure compréhension de la biodisponibilité des nutriments permet de fixer des recommandations nutritionnelles appropriées pour un effet santé. Les données scientifiques relatives à l'amélioration de la biodisponibilité des oméga-3 sont éparses. Ce projet vise à déterminer l'ensemble des facteurs susceptibles d'améliorer l'absorption intestinale et la biodisponibilité des oméga-3 pour des effets santé avérés. Il s'agit d'un sujet de fond qui permettra d'acquérir des données scientifiques originales utiles à la valorisation des nutriments lipidiques dans des matrices alimentaires innovantes ciblant la santé et le bien-être des consommateurs.

Bénéfices attendus

Ce sujet permettra d'acquérir des données scientifiques pour valoriser des nutriments lipidiques d'interet tels que les omega-3 pour des bienfaits santé et le bien-être des consommateurs. Egalement ces données permettront d'acquérir des arguments scientifiques pour appuyer les recommendations et besoins nutritionnels chez l'Homme. C'est un sujet de santé publique en lien avec les recommendations nutrtionelles.

Procédures

La technique chirurgicale de dérivation du canal lymphatique est réalisée sur les animaux et dure environ 40 minutes sous anesthésie générale. Les animaux reçoivent une seule intubation gastrique de l'une des formules lipidiques riches en oméga 3. Cette manipulation ne dure pas plus de 30 secondes , sous la réalisation de personnel qualifié. Les animaux sont ensuite placés en cage individuelle où ils disposent à volonté d'eau tout au long de l'expérimentation. La lymphe s'écoule et recueillie au travers de la canule placée a demeure vers un tube entreposé dans la glace sur les 6 heures suivantes.

Impact sur les animaux

La technique de micro chirurgie implique une incision large de l'abdomen. Après la pose d'une sonde à demeure, l’animal est suturé. Au reveil cela peut induire une douleur à l’animal, ce qui est anticipé par l’injection en amont et après la chirurgie d’un anti douleur ( analgésique). En outre, le recueil de la lymphe, nécessite une immobilisation de l'animal dans une cage individuelle, le temps de l'expérimentation (6 heures post prandial). Pour éviter tout stress, les animaux sont isolés au calme sous une température de 24°C. Enfin, l’administration des formules lipidiques, par gavage gastrique peut induire un stress chez l’animal. Ces volumes sont calculés de sorte à ne pas dépasser 1mL par animal pour limiter le temps de manipulation. En outre, la manipulation de gavage est réalisée par les techniciens de laboratoire, formés, habilités à le faire et qui en l’occurrence maitrisent parfaite le geste technique pour limiter tout stress à l’animal.

Devenir

L'intervention permet de dériver le canal lymphatique. Or après dérivation il n'est pas possible de replacer le canal lymphatique dans le circuit général, et sans quoi les animaux ne peuvent pas vivre "naturellement". Ceci implique l'euthanasie de l'ensemble des animaux en fin de protocole expérimental.En outre les organes sont également recueillis en vue d'autres études et pour limiter le nombre d'animaux en rechercher expérimentale pour du prélevement d'organes.

Remplacement

L'absorption intestinale et le métabolisme des lipides ne peuvent être directement estimés chez l'Homme. Le rat est le modèle de choix dans ce type d'étude car il les systèmes digestif et intestinal sont semblables à ceux observés chez l'Homme. Les méthodes alternatives type cultures cellulaires ne peuvent être envisagées car elles ne présentent pas à ce jour les mêmes caractéristiques que celles observées chez le rat et l'Homme. Notamment les cellules intestinales utilisées en recherche sont issues de cellules cancéreuses et ne présentent pas les caractéristiques impliqués dans l'absorption intestinale des lipides chez l'Homme et le rat.

Réduction

La taille de la population cible est calculée à partir de données avec une marge d’erreur, acceptable de 5% et un niveau de confiance : 95% . Cette ta taille l’échantillon est calculée via un logicile qui prend en compte les données. En conséquence, une taille d'échantillon totale de 8 rats par groupe a été obtenue.

Raffinement

Pour éviter toute douleur liée à l'intervention, les animaux recoivent un analgésique pour prévenir de la douleur juste avant l'intervention. Une grille de suivi et d'évaluation de la douleur est mise en place pour chaque animal en post chirurgie. Selon le score obtenu dans cette grille, de nouvelles injections d'analgésique peuvent être réalisées afin de limiter la douleur aux animaux. Les animaux sont placés dans des cages individuelles jusqu'au réveil où ils disposent d'eau à volonté, dans une pièce d'isolement au calme, dont la température est maintenue à 24°C pour leur éviter tout stress.

Choix des espèces

Le modèle rat est le modèle le plus utilisé dans les études d'absorption et de métabolisme des lipides dans l'organisme, en vue d'une extrapolation chez l'Homme. Ce modèle a l'avantage de possèder les mêmes systèmes digestif et enzymatiques que ceux observés chez l'Homme. D'autre part depuis près de 30 ans nous avons cumulés des données obtenues à partir de ce modèle, ce qui nous permet de poursuivre nos investigations sur la base de précédentes études mais aussi de mettre en régard nos données à celles d'autres travaux de recherche à l'internationnal. Les animaux sont reçus à 8 semaines au stade de jeunes adultes. Nos études reflètent l'absorption de lipides d'interet chez les adultes ( pour la population saine adulte en général) et nos animaux sont des jeunes mâles adultes. Les animaux sont acclimatés 1 semaine avant de rentrer dans le protocole expérimental.

170 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. On leur prélève un morceau de nageoire caudale sous anesthésie pour génotypage, puis on les isole jusqu'à trois jours, dans le but de créer des lignées génétiquement modifiées rendant fluorescentes des vésicules extracellulaires. Le porteur indique que les poissons sont réutilisés pour maintenir la lignée et gardés en vie jusqu'à leur an et demi, avant d'être mis à mort. Il conclut qu'aucune méthode de remplacement in vitro n'est possible parce que le projet repose sur la modification du génome d'un organisme vivant.

Objectifs

Les vésicules extracellulaires sont des petites particules qui sont sécrétées naturellement pas les cellules de l’organisme. Bien que ces vésicules semblent intervenir dans un grand nombre de mécanismes physiopathologiques, leur caractérisation dans des organismes vivants est encore très limitée, notamment du fait de leur petite taille, ce qui entrave leur utilisation en tant que marqueur ou véhicule thérapeutique. Pour permettre cette caractérisation, l’utilisation du poisson zèbre apparait comme un modèle prometteur du fait de son développement rapide et en dehors de leur mère, mais également de sa transparence au stade embryonnaire, qui rendent possible la visualisation de ces vésicules en temps réel chez l’animal vivant. Notre projet aura pour but de générer différentes lignées de poissons zèbres qui exprimeront un marqueur de ces vésicules qui sera fluorescent, jouant ainsi le rôle d'une étiquette, ce qui permettra de visualiser directement ces vésicules dans les différents tissus de notre choix (muscles, vaisseaux sanguins, neurones...) puis de les suivre dans tout l'organisme. Nous réaliserons la sélection des individus présentant l’étiquette fluorescente dans le tissu d’intérêt et par technique de génotypage, respectivement. Ces nouvelles lignées permettront ensuite de caractériser les propriétés biologiques et fonctionnelles de ces vésicules chez l’animal, pour chacun des tissus choisis.

Bénéfices attendus

La création de ces nouvelles lignées contribuera à une meilleure compréhension de la biologie des vésicules extracellulaires chez l’animal et fournira des données importantes sur leur potentiel thérapeutique.

Procédures

Prélèvement de morceau de nageoire caudale, en une fois, sous anesthésie pendant 5 minutes. Isolement pour génotypage, en une fois, pendant 3 jours maximum.

Impact sur les animaux

Lors de ce projet, les nuisances attendues seront le stress de l’anesthésie, la douleur liée au prélèvement pour le génotypage.

Devenir

Les animaux seront réutilisés à la fin de la procédure pour maintenir la lignée et donc perpétuer les futures générations. Cependant, les animaux seront gardés en vie jusqu’à leur un an et demi, après cela, ils seront mis à mort.

Remplacement

Ce projet repose sur la création de nouvelles lignées de poissons zèbres dont le génome sera modifié pour l’étude du comportement des vésicules extracellulaires en temps réel chez un organisme vivant. En ce sens, aucune méthode de remplacement in vitro n’est possible pour cette question.

Réduction

Selon des tests statistiques, nous avons réduit le nombre de poissons à 10 de manière à toujours avoir 90% de chance d’obtenir des différences significatives. Nous estimons que des groupes de 10 animaux seront suffisants pour la durée de ce projet, bien que la morbidité et viabilité de ces nouvelles lignées de poissons restent encore inconnues.

Raffinement

Afin d’améliorer la qualité de vie des animaux, un enrichissement de milieu sera mis en place, notamment par l’utilisation d’un fond imagé lors des accouplements, mais également par l’approvisionnement en plancton une fois par jour, en fonction de la production en plancton au sein de l’animalerie. De la même manière, afin de limiter la souffrance et/ou stress de l’animal lors du génotypage, un analgésique (lidocaïne) et un anesthésique (benzocaïne) seront utilisés. Un système d’hébergement spécifique au génotypage sera également mis en place et relié au système aquatique, de manière, à ce que les poissons soient séparés les uns des autres mais qu’ils puissent se voir au travers de parois transparentes. Enfin, le temps d’isolement sera le plus court possible, c’est-à-dire le temps de la réalisation des techniques de génotypage.

Choix des espèces

Le poisson zèbre est un modèle animal où son développement rapide et en dehors de leur mère permet de réaliser facilement des manipulations génétiques pour l’obtention de lignées dont le génome a été modifié. Du fait de la transparence des embryons, l’observation des organes internes à l’échelle de l’organisme entier est facilitée. Cette caractéristique ainsi que la taille de ce modèle sont un grand avantage pour la visualisation des vésicules extracellulaires (notamment dans les fluides biologiques) et de leur interaction avec des tissus récepteurs. Les poissons seront utilisés jusqu’à leur un an et demi de manière à pouvoir vérifier le génotype de ces poissons, à partir de leur deuxième mois, lorsqu’ils auront une taille suffisamment grande ; mais également pour perpétuer les lignées dont le génome a été modifié, par reproduction sexuée.