Système cardiaque

92 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance déclaré léger à modéré. Une première phase pharmacologique porte sur 30 rats ensuite réutilisés dans d'autres projets, une seconde induit chirurgicalement un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère pendant 90 minutes avec suivi par IRM, ces animaux étant mis à mort à 24 heures pour prélèvement du cerveau et du coeur. Le projet teste un facteur de croissance censé réduire les lésions de l'AVC. Le porteur indique que l'AVC ischémique n'induit pas de douleur en soi et affirme que l'imagerie in vivo et le mécanisme d'action rendent l'animal vivant nécessaire.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aigüe d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation). La recanalisation artérielle entraîne une restauration du flux sanguin au sein d’un territoire qui en était privé. Cette reperfusion du tissu cérébral est nécessaire, mais elle déclenche des cascades pathologiques qui contribuent aussi aux séquelles de l’AVC. L’un des enjeux du développement de nouvelles approches thérapeutique dans l’AVC, en complément des traitements actuels, serait de combattre les dommages liés à la reperfusion. L’objectif de ce projet est de déterminer si une protéine d’intérêt appelé Hepatocyte Growth Factor (HGF) permet de diminuer la taille et les conséquences de l’AVC. Il s’agit d’un élément majeur en santé publique car la taille de l’AVC est directement reliée au handicap et à la mortalité. Les données de la littérature sont croissantes depuis une dizaine d’année. Notre hypothèse est en faveur d’une diminution de la taille de l’infarctus et une amélioration de la fonction cérébrale lorsque HGF est utilisé dans l’AVC.

Bénéfices attendus

A ce jour, aucun traitement visant à protéger le tissu cérébral (neuroprotection) n’a démontré d’efficacité chez l’Homme. Ce projet de recherche a pour objectif de tester un nouveau traitement de neuroprotection dans les premières heures suivant la survenue d’un AVC liée à l’occlusion d’une artère cérébrale. La molécule testée a déjà montré des bénéfices dans l’attaque cardiaque. Si notre étude apporte des preuves d’efficacité, un essai clinique pourrait être mis en place rapidement pour évaluer cette nouvelle approche thérapeutique chez les patients. L’évaluation de nouveaux traitements dans un modèle d’AVC ischémique chez le rongeur est une étape nécessaire pour pouvoir concevoir correctement de futurs essais cliniques.

Procédures

Ce projet multisite se découpera en 2 procédures : 1) Etude pharmacologique de N Acetyl Heparin sous anesthésie gazeuse profonde à l’isoflurane - classe légère : La veine caudale est cathétérisée puis le produit est injecté par voie intraveineuse à différentes posologies, soit uniquement en bolus, soit par bolus puis perfusion continue pendant une heure (anesthésie de 10 minutes pour les injections en bolus seul, de 1h10 pour les injections en bolus puis anesthésie). Les animaux auront des prises de sang régulières, par voie caudale, de 50 μL : avant injection de NAH, à 10 minutes, à 1h puis à 24h (le prélèvement réalisé à une heure chez les animaux ayant uniquement un bolus intraveineux et celui réalisé à 24h seront réalisés après anesthésie locale caudale). 2) induction chirurgicale de l’AVC et administration des traitements - classe modérée : - (H0) Induction chirurgicale de l’AVC - (H1) Examen IRM basal afin de vérifier la bonne efficacité de la ligature artérielle - (H1,5) : le filament est laissé en place pendant 90 minutes (ischémie), après quoi il est retiré (reperfusion), et l’animal peut être définitivement suturé à l’aide de fils stériles. Le traitement est administré par voie intraveineuse (cathéter caudal) 5 minutes avant la reperfusion (HGF, NAH ou NaCl). Les animaux sont anesthésiés pendant 1h30. La durée de la chirurgie en elle-même est d’environ 30 minutes. - (H23) Examen fonctionnel : Evaluation du Neuroscore - (H24) Examen IRM final : imagerie IRM à 24h sous anesthésie générale. Les animaux sont anesthésiés une quinzaine de minutes pour l’acquisition des différentes séquences.

Impact sur les animaux

L’induction d’un AVC ischémique chez le rat nécessite une procédure de classe modérée avec une chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes. L’AVC ischémique n’induit pas de douleur en soi (de même que chez les patients, le parenchyme cérébral étant dépourvu d’innervation). Une des complications, rare, est l’œdème cérébral malin. Par ailleurs, le modèle animal induit des déficits sensoriels et moteurs reproduisant la physiopathologie humaine. Les cerveaux et les cœurs seront prélevés en fin de procédure afin d’évaluer les mécanismes d’action du traitement sur le cerveau et, à distance, sur le coeur. Un nombre total de 92 rats au maximum seront utilisés au cours de ce projet (phase 1 + phase 2), afin de disposer d’une étude statistique robuste.

Devenir

Les animaux issus de la phase 1, utilisés pour l’étude pharmacologique de N Acetyl Heparin, pourront être réutilisés dans d’autres projets de recherche utilisant des rats. Les animaux issus de la phase 2 seront mis à mort à 24h afin de pouvoir analyser les mécanismes d’action en jeux. Les différentes techniques d’analyse nécessitent d’utiliser le cerveau et le coeur des rats après sacrifice des animaux pour analyses en laboratoire.

Remplacement

Ce projet s’appuie sur des données expérimentales déjà publiées. En effet l’activation des cellules cérébrales par la protéine HGF les protégeraient de la mort cellulaire. L’utilisation d’animaux vivants est justifiée d’une part par le rôle central de l’imagerie « in vivo » dans nos procédures, grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie par résonance magnétique (IRM) dédiés aux petits animaux, afin de reproduire la prise en charge de l’AVC chez l’Homme ; et d’autre part le mécanisme d’action de NAH qui n’est pas reproductible « in vitro ».

Réduction

Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. L’imagerie « in vivo » permet un suivi longitudinal sans avoir à mettre à mort des animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Tous les animaux utilisés lors de la phase 1 seront réutilisés dans d’autres projets. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé par un biostatisticien. Nous avons utilisé un test satistique spécifique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

La chirurgie et les examens d’imagerie sont entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec couverture analgésique adaptée. Les animaux sont surveillés de façon rapprochée avec utilisation de grilles de score pour évaluer le bien-être et prise de poids quotidienne (même en l’absence de chirurgie). Ils ont un accès facilité à la nourriture et à l’eau en période post-opératoire.

Choix des espèces

Le rat (souche Sprague-Dawley) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation. De plus nos méthodes d’imagerie et d’évaluation neurocomportementale sont bien validées entre nos mains chez le rat et pour cette souche. Il s'agira de jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre. Cette fourchette de poids est par ailleurs celle utilisée dans les études antérieures et sur lesquelles s’appuient notre retour d’expérience et nos statistiques.

Livrées "supposées gestantes" au deuxième jour de gestation, 4 664 rates vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, pour provoquer chez elles une prééclampsie, une hypertension de la grossesse, et tester sur elles des traitements. Elles subissent une chirurgie, la pose d'une pompe osmotique sous la peau ou la ligature des artères utérines, 18 heures en cage à urine, douze jours de mesures quotidiennes de la pression par brassard à la queue, une méthode que le porteur dit "légèrement stressante", et des injections sous-cutanées quotidiennes pendant quatre à douze jours ou une injection intraveineuse. Toutes sont tuées au CO2 dans le dernier tiers de leur gestation, pour récupérer leur sang par ponction cardiaque, leurs fœtus, leurs placentas et leurs reins. Le porteur affirme qu'il est "indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d'un organisme entier", aucune méthode in vitro ne reproduisant selon lui la prééclampsie.

Objectifs

La prééclampsie est une maladie qui survient pendant la grossesse et qui provoque une hypertension artérielle chez la mère. Les complications pouvant être graves pour la mère et le fœtus, la prééclampsie peut nécessiter le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Les femmes ayant souffert de prééclampsie et les adultes nés prématurément ont un risque augmenté de maladies cardiovasculaires. Il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie. Des études cliniques ont mis en évidence une augmentation (avant même le diagnostic) de la vasopressine (ou AVP) et une diminution de l’apeline circulant dans le sang des mères atteintes de prééclampsie, suggérant fortement que l'AVP et l'apeline jouent un rôle dans le développement de la maladie. De plus, des études chez le rongeur suggèrent un rôle spécifique d’un récepteur, le V2R, dans la maladie et montrent que l'administration préventive d'apeline améliore les symptômes liés à la prééclampsie. Le premier objectif sera donc de comprendre le rôle de l'AVP et de l'apeline dans la physiopathologie de la prééclampsie chez le rat. Pour cela, i) nous évaluerons le rôle de chacun des récepteurs de l'AVP dans la prééclampsie en comparant le modèle préexistant par infusion d'AVP (qui active les trois récepteurs de l'AVP) à un nouveau modèle par infusion de dDAVP (qui a une affinité très élevée pour le V2R), et ii) nous étudierons le rôle du récepteur de l'apeline dans la prééclampsie en utilisant l'antagoniste MM 54, et nous décrirons le rôle de chaque ligand endogène du récepteur de l'apeline. Le second objectif sera d'évaluer le potentiel impact thérapeutique d’un antagoniste du V2R ou/et d’un agoniste du récepteur de l'apeline chez le rongeur atteint de prééclampsie. Pour ce faire, nous utiliserons des peptides qui ne traversent pas la barrière placentaire, c’est-à-dire sans risque pour le fœtus, et qui présentent une haute affinité et une sélectivité absolue pour le V2R ou le récepteur de l'apeline.

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la prééclampsie qui demeure, à ce jour, incertaine. En particulier, ce projet va clarifier le rôle des récepteurs de la vasopressine et l’apeline dans la prééclampsie. Malheureusement, il n’existe pas de traitement spécifique de la prééclampsie, ce qui nécessite le déclenchement prématuré de l’accouchement, entraînant des risques potentiels pour le nouveau-né. Ce projet va donc chercher à développer une stratégie thérapeutique contre la prééclampsie.

Procédures

Les animaux seront soumis à une seule intervention chirurgicale qui consistera soit en une intervention courte de 5-10 minutes de pose d’une pompe osmotique sous-cutanée soit en une intervention plus longue de 20 minutes de ligature des artères utérines. Les animaux seront également soumis à un seul prélèvement urinaire qui aura lieu durant 18 heures dans des cages spéciales permettant de recueillir les urines. Les animaux seront aussi soumis à un enregistrement de la pression artérielle par une méthode non-invasive (une fois par jour pendant 30 minutes maximum) durant une période de 12 jours consécutifs. Enfin les animaux seront soumis soit à des injections sous-cutanées répétées (une fois par jour) s’étalant sur 4 à 12 jours maximum, soit à une seule injection intraveineuse.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables relatifs aux chirurgies (implantation d’une pompe osmotique sous-cutanée ou ligature des artères utérines) sont potentiellement une douleur relative à la chirurgie, une infection et/ou une mauvaise cicatrisation au niveau du site chirurgical. Ces effets débuteront lors de la chirurgie, soit 7 jours après la livraison des rates gestantes, et ne devront pas s’étendre au-delà de 72h après la chirurgie. Pour éviter ces effets indésirables la zone sera désinfectée abondamment avec de la Vétidine, un analgésique local injectable sera appliqué au niveau du site chirurgical (Lidocaïne/Laocaïne) et un antidouleur global à action diffuse par voie sous-cutanée (Buprénorphine) sera injecté. Cependant, si une infection est décelée et perdure au-delà de 72h, l’animal sera exclu de l’étude et pris en charge par le vétérinaire de l’installation. Les effets indésirables relatifs au geste quotidien d’injections sous-cutanées sont potentiellement une douleur au niveau du site d’injection et un stress lié à la contention des animaux. Ces effets débuteront 7 jours après la livraison des rates gestantes jusqu’au dernier tiers de leur gestation. Pour éviter ces effets indésirables i) une pommade analgésique local sera appliquée, au préalable, sur le site d’injection, ii) la localisation du site d’injection variera quotidiennement et iii) les injections seront faites dans une pièce au calme sans passage. Les effets indésirables liés aux molécules administrées (inhibiteur de nitrique oxyde synthase, antagoniste du récepteur de l’apeline, AVP, dDAVP, antagoniste du récepteur de l’AVP, agoniste du récepteur de l’apeline) sont décrits dans la littérature et dans nos précédentes études « preuve de concept » et de « toxicité ». Les doses sélectionnées dans ce projet ont été choisies afin de ne pas induire d’effets indésirables chez les animaux.

Devenir

Les rates seront mises à mort durant le dernier tiers de leur gestation par euthanasie gazeuse au CO2 à la fin de chacune des procédures expérimentales afin de récupérer du sang par ponction cardiaque et des tissus d’intérêts (fœtus, placentas, reins) pour des analyses complémentaires.

Remplacement

Nous avons étudié in vitro des molécules d’intérêts pour traiter la prééclampsie (antagonistes du récepteur de l’AVP de type 2 et agonistes du récepteur de l’apeline) afin de sélectionner le plus petit nombre possible de molécules à tester in vivo. Il est indispensable de mener cette étude in vivo au niveau d’un organisme entier car il n’existe pas de modèle in vitro de prééclampsie et car cette étude s’inscrit dans le cadre d’une phase préclinique d’un nouveau traitement d’une pathologie chez l'Homme.

Réduction

Le projet s’intéresse au développement de la préécleampsie dont le paramètre caractéristique est la pression artérielle. Or, la pression artérielle est un paramètre très variable. De ce fait, le nombre minimum d’animaux par groupe calculé afin d’obtenir la puissance statistique nécessaire s’élève à 8 rongeurs par condition différentes. Une des procédures expérimentales a pour but de mesurer la capacité des molécules d’intérêt à passer la barrière materno-fœtale et donc de sélectionner les molécules non-toxiques pour l’embryon, c’est-à-dire celles ne franchissant pas cette barrière. Les résultats sont considérés comme statistiquement significatifs à partir de 5 rongeurs par type d’analyse pour cette procédure. Pour réduire le nombre d’animaux, les doses de molécules thérapeutiques qui vont être étudiées ont été sélectionnées grâce à des études in vitro et in vivo antérieures afin d’être réduites à leur stricte minimum. De plus, nous allons essentiellement réaliser notre étude sur des modèles déjà publiés et bien décrits dans la littérature de prééclampsie, ce qui permettra de réduire le nombre d’animaux à utiliser pour la mise au point de modèles. Enfin, si une des doses de molécule étudiée parait adéquate, toutes les doses indiquées ne seront pas nécessairement testées afin de réduire le nombre d’animaux utilisés.

Raffinement

Dès leur arrivée, les animaux seront hébergés en groupe dans un milieu enrichi pendant 7 jours. Une surveillance quotidienne des animaux par des personnes habilitées et formées sera effectuée. Pour réduire ou supprimer la douleur et le stress relatifs aux administrations sous-cutanées quotidiennes, une pommade analgésique sera appliquée localement sur le site d’injection, la localisation du site d’injection variera quotidiennement et les injections seront réalisées dans une pièce au calme sans passage. Afin de diminuer la douleur occasionnée par les chirurgies, une analgésie locale injectable par voie sous-cutanée (laocaïne) sera utilisée accompagnée par un analgésique global à action diffuse par voie sous-cutanée (buprénorphine). Pendant toute chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante à 37°C, leur rythme respiratoire sera observé avec attention, et ils seront réhydratés avec du sérum physiologique. À leur réveil, les animaux seront remis dans une cage propre en groupe dans un milieu enrichi et étroitement surveillés. Pour réduire ou supprimer la douleur relative aux enregistrements de pression artérielle, nous utiliserons une méthode non-invasive qui consiste à mesurer la pression artérielle et le rythme cardiaque des rongeurs à l’aide d’un brassard placé au niveau de la queue des rongeurs. Cette méthode non-invasive est toutefois légèrement stressante pour l’animal. Pour réduire ou supprimer le stress relatif à cette méthode nous entrainerons donc les animaux quotidiennement entre le treizième jour et le vingtième jour de gestation pendant un temps n’excédant pas 30 minutes par jour. Enfin, bien qu’il n’y ait pas, à priori, de douleur, de souffrance et d’angoisse associées à l’administration des composés, une étroite surveillance quotidienne des animaux sera réalisée à l’aide d’une grille de scoring associée.

Choix des espèces

Le rat est une espèce pertinente pour l’étude de la prééclampsie car plusieurs modèles préexistants ont déjà été publiés et sont largement décrits. De plus, nous avons déjà étudié chez le rat dans des études « preuve de concept » et dans des études de « toxicité » les molécules d’intérêts que nous souhaitons utiliser pour traiter la prééclampsie. Les animaux utilisés seront des rates gestantes. Les rates seront commandées et livrées supposées gestantes au deuxième jour de gestation. Les rates seront ensuite utilisées 7 jours après leur livraison, soit entre le neuvième jour et le vingtième jour de gestation, c’est-à-dire jusqu’au dernier tiers de leur gestation.

92 rats vont être utilisés dans des procédures légères puis modérées, 62 tués à 24 heures pour prélèvement du cerveau et du cœur et 30 réutilisés dans d'autres projets. Une chirurgie occlut une artère cérébrale par un filament pendant 90 minutes avant reperfusion, avec examens IRM sous anesthésie et injection d'une protéine, le facteur de croissance hépatocytaire, censée limiter les dégâts. Le porteur rappelle qu'aucun traitement de neuroprotection n'a démontré d'efficacité chez l'humain et renvoie un éventuel essai clinique au conditionnel. Il indique que le mécanisme d'action testé n'est pas reproductible in vitro.

Objectifs

L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la troisième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aigüe d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation). La recanalisation artérielle entraîne une restauration du flux sanguin au sein d’un territoire qui en était privé. Cette reperfusion du tissu cérébral est nécessaire, mais elle déclenche des cascades pathologiques qui contribuent aussi aux séquelles de l’AVC. L’un des enjeux du développement de nouvelles approches thérapeutique dans l’AVC, en complément des traitements actuels, serait de combattre les dommages liés à la reperfusion. L’objectif de ce projet est de déterminer si une protéine d’intérêt appelé Hepatocyte Growth Factor (HGF) permet de diminuer la taille et les conséquences de l’AVC. Il s’agit d’un élément majeur en santé publique car la taille de l’AVC est directement reliée au handicap et à la mortalité. Les données de la littérature sont croissantes depuis une dizaine d’année. Notre hypothèse est en faveur d’une diminution de la taille de l’infarctus et une amélioration de la fonction cérébrale lorsque HGF est utilisé dans l’AVC.

Bénéfices attendus

A ce jour, aucun traitement visant à protéger le tissu cérébral (neuroprotection) n’a démontré d’efficacité chez l’Homme. Ce projet de recherche a pour objectif de tester un nouveau traitement de neuroprotection dans les premières heures suivant la survenue d’un AVC liée à l’occlusion d’une artère cérébrale. La molécule testée a déjà montré des bénéfices dans l’attaque cardiaque. Si notre étude apporte des preuves d’efficacité, un essai clinique pourrait être mis en place rapidement pour évaluer cette nouvelle approche thérapeutique chez les patients. L’évaluation de nouveaux traitements dans un modèle d’AVC ischémique chez le rongeur est une étape nécessaire pour pouvoir concevoir correctement de futurs essais cliniques.

Procédures

Ce projet multisite se découpera en 2 procédures : 1) Etude pharmacologique de N Acetyl Heparin sous anesthésie gazeuse profonde à l’isoflurane - classe légère : La veine caudale est cathétérisée puis le produit est injecté par voie intraveineuse à différentes posologies, soit uniquement en bolus, soit par bolus puis perfusion continue pendant une heure (anesthésie de 10 minutes pour les injections en bolus seul, de 1h10 pour les injections en bolus puis anesthésie). Les animaux auront des prises de sang régulières, par voie caudale, de 50 μL : avant injection de NAH, à 10 minutes, à 1h puis à 24h (le prélèvement réalisé à une heure chez les animaux ayant uniquement un bolus intraveineux et celui réalisé à 24h seront réalisés après anesthésie locale caudale). 2) induction chirurgicale de l’AVC et administration des traitements - classe modérée : - (H0) Induction chirurgicale de l’AVC - (H1) Examen IRM basal afin de vérifier la bonne efficacité de la ligature artérielle - (H1,5) : le filament est laissé en place pendant 90 minutes (ischémie), après quoi il est retiré (reperfusion), et l’animal peut être définitivement suturé à l’aide de fils stériles. Le traitement est administré par voie intraveineuse (cathéter caudal) 5 minutes avant la reperfusion (HGF, NAH ou NaCl). Les animaux sont anesthésiés pendant 1h30. La durée de la chirurgie en elle-même est d’environ 30 minutes. - (H23) Examen fonctionnel : Evaluation du Neuroscore - (H24) Examen IRM final : imagerie IRM à 24h sous anesthésie générale. Les animaux sont anesthésiés une quinzaine de minutes pour l’acquisition des différentes séquences.

Impact sur les animaux

L’induction d’un AVC ischémique chez le rat nécessite une procédure de classe modérée avec une chirurgie réalisée sous anesthésie générale d’une durée de 30 minutes. L’AVC ischémique n’induit pas de douleur en soi (de même que chez les patients, le parenchyme cérébral étant dépourvu d’innervation). Une des complications, rare, est l’œdème cérébral malin. Par ailleurs, le modèle animal induit des déficits sensoriels et moteurs reproduisant la physiopathologie humaine. Les cerveaux et les cœurs seront prélevés en fin de procédure afin d’évaluer les mécanismes d’action du traitement sur le cerveau et, à distance, sur le coeur. Un nombre total de 92 rats au maximum seront utilisés au cours de ce projet (phase 1 + phase 2), afin de disposer d’une étude statistique robuste.

Devenir

Les animaux issus de la phase 1, utilisés pour l’étude pharmacologique de N Acetyl Heparin, pourront être réutilisés dans d’autres projets de recherche utilisant des rats. Les animaux issus de la phase 2 seront mis à mort à 24h afin de pouvoir analyser les mécanismes d’action en jeux. Les différentes techniques d’analyse nécessitent d’utiliser le cerveau et le coeur des rats après sacrifice des animaux pour analyses en laboratoire.

Remplacement

Ce projet s’appuie sur des données expérimentales déjà publiées. En effet l’activation des cellules cérébrales par la protéine HGF les protégeraient de la mort cellulaire. L’utilisation d’animaux vivants est justifiée d’une part par le rôle central de l’imagerie « in vivo » dans nos procédures, grâce à l’utilisation d’appareils d’imagerie par résonance magnétique (IRM) dédiés aux petits animaux, afin de reproduire la prise en charge de l’AVC chez l’Homme ; et d’autre part le mécanisme d’action de NAH qui n’est pas reproductible « in vitro ».

Réduction

Chaque animal est son propre contrôle, ce qui permet d’augmenter la puissance statistique des résultats tout en limitant le nombre d’animaux. L’imagerie « in vivo » permet un suivi longitudinal sans avoir à mettre à mort des animaux à intervalles donnés pour faire la même observation. Tous les animaux utilisés lors de la phase 1 seront réutilisés dans d’autres projets. Le nombre d’animaux nécessaire a été calculé par un biostatisticien. Nous avons utilisé un test satistique spécifique pour calculer le nombre d’animaux nécessaire.

Raffinement

La chirurgie et les examens d’imagerie sont entièrement réalisés sous anesthésie profonde avec couverture analgésique adaptée. Les animaux sont surveillés de façon rapprochée avec utilisation de grilles de score pour évaluer le bien-être et prise de poids quotidienne (même en l’absence de chirurgie). Ils ont un accès facilité à la nourriture et à l’eau en période post-opératoire.

Choix des espèces

Le rat (souche Sprague-Dawley) est utilisé en première intention car c’est sur cette espèce qu’ont été décrites les techniques d’occlusion endoluminale (via un filament carotidien), ne nécessitant pas de craniotomie et permettant un excellent contrôle de la recanalisation. De plus nos méthodes d’imagerie et d’évaluation neurocomportementale sont bien validées entre nos mains chez le rat et pour cette souche. Il s'agira de jeunes adultes (poids de 250-300g). L’occlusion de l’artère cérébrale moyenne est réalisée via un filament dont le diamètre est calibré en fonction du poids de l’animal. Il est donc capital pour la réussite du modèle et l’inclusion des animaux que le poids soit strictement contrôlé. Les animaux jeunes sont préférés car la variabilité du modèle est moindre. Cette fourchette de poids est par ailleurs celle utilisée dans les études antérieures et sur lesquelles s’appuient notre retour d’expérience et nos statistiques.

1 040 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une greffe de lobes thymiques sous la capsule du rein par chirurgie, d'autres une irradiation létale suivie d'une reconstitution du système sanguin, et le projet emploie aussi des embryons et des nouveau-nés. Le porteur indique des douleurs et un stress dans les jours suivant la chirurgie, une anémie et un possible passage de bactéries après irradiation, avec une perte de poids attendue pendant deux semaines. Il affirme qu'aucun système in vitro ne peut remplacer l'étude d'un système immunitaire complexe et retient la souris pour sa proximité avec l'humain.

Objectifs

Le thymus produit en permanence des lymphocytes T qui sont essentiels à la protection contre les agents pathogènes de l'environnement. Cette fonction repose sur la génération d'un répertoire diversifié de récepteurs d'antigènes qui devront être sélectionnés pour éviter l'auto-reconnaissance (tolérance). Les premières cellules hématopoïétiques qui colonisent le thymus présentent une capacité unique à générer des cellules inductrices du tissu lymphoïde (LTi) et des cellules T invariantes qui, ensemble, sont nécessaires au développement normal de l'architecture thymique. La fonction thymique est assurée par un ensemble de sous-ensembles de cellules épithéliales qui fournissent les conditions nécessaires au développement et à la sélection des lymphocytes T. En effet, le déclin de la production de cellules T au cours du vieillissement ou dans certaines conditions pathologiques résulte de la perte de fonction de ces cellules épithéliales. Nos résultats récents et nos données préliminaires ont montré que, pendant la vie embryonnaire, les cellules T invariantes et les LTi proviennent d'une vague transitoire unique de progéniteurs. Cependant, à l'heure actuelle, le programme de développement de ces progéniteurs hématopoïétiques embryonnaires reste largement inconnu et le rôle des cellules T invariantes et des LTi thymiques dans l'établissement du système immunitaire adulte et dans le maintien de la tolérance n'a pas été caractérisé à ce jour. Identifier l'origine des cellules qui façonnent l'architecture thymique est essentiel pour comprendre la fonction thymique normal et, par conséquent, pour développer des stratégies visant à inverser l'involution thymique. Les objectifs de ce projet sont les suivants : 1. Identifier les événements moléculaires spécifiques qui se produisent dans le temps et l'espace au cours du développement embryonnaire et qui conduisent à la génération de LTi et de cellules T invariantes, 2. Caractériser le rôle de ces cellules dans la maturation des cellules épithéliales thymiques et 3. Étudier leur rôle dans l'établissement et le maintien de la tolérance périphérique et leur implication dans l'involution thymique.

Bénéfices attendus

Le projet vise à comprendre les aspects fondamentaux de la biologie du thymus et en particulier, les propriétés moléculaires et fonctionnelles des sous-ensembles lymphoïdes qui assurent le développement normal de l'architecture thymique. Les connaissances acquises auront des impacts majeurs sur la santé publique : a) Meilleure compréhension de la tolérance immunitaire b) Amélioration des réponses immunitaires c) En raison de leur rôle important dans l'intégrité et l'homéostasie des tissus, la compréhension des voies de développement menant à la génération des premières cellules lymphoïdes pourrait offrir de nouvelles stratégies pour contrer le remodelage tissulaire négatif dans les maladies inflammatoires chroniques. d) L'augmentation sans précédent de l'espérance de vie observée au cours du siècle dernier a des implications cruciales pour les politiques et pratiques sociales, économiques et sanitaires. L'un des principaux facteurs affectant la santé des personnes âgées est le déclin des réponses immunitaires lié à l'âge, qui contribue à une incidence plus élevée du cancer. L'involution du thymus est un facteur important contribuant au déclin immunitaire associé à l'âge. La lenteur de la récupération des lymphocytes T après une greffe de moelle osseuse ou d'autres immunodéficiences acquises revêt une importance majeure. Ceci est également important chez les patients ayant subi une greffe de moelle osseuse, où la lente récupération des cellules T est principalement attribuée à l'involution des cellules épithéliales thymiques après le conditionnement et la chimiothérapie. Dans ce projet, nous allons étudier les premières interactions entre les thymocytes et les cellules épithéliales qui pourraient avoir un impact sur la dynamique des compartiments épithéliaux thymiques tout au long de la vie.

Procédures

Il y a deux types de procédures prévues qui peuvent générer une souffrance modérée. Le premier est une greffe de lobes thymiques sur la capsule du rein qui implique une chirurgie (20-30 minutes) et l’autre ces les effets de l’irradiation létale (10 minutes) en vue de reconstitution du système hématopoïétique (intervention durant 1 heure et 2 heures). Les souris nouveau-nées seront injectées avec des précurseurs hématopoïétiques à jour 0 ou 1 et gardées pendant 8 semaines (l’injection de nouveau nés prends 3-5 secondes et les nouveau-nés sont rendus à la mère en une heure maximum). Les animaux adultes reconstitués avec des cellules hématopoïétiques, puis traités avec FTY720 et 80 avec PBS contrôle, ou traités avec des anticorps (5-10 secondes par intervention).

Impact sur les animaux

Les souris qui sont transplantées avec des lobes thymiques sous la capsule du rein sont soumises à une chirurgie et des douleurs et du stress sont attendues dans les deux ou trois jours qui suivent la chirurgie. L’irradiation létale pour une reconstitution du système hématopoïétique engendre une anémie post-transplantation.. L’irradiation affecte aussi l’épithélium du système digestif et un passage de bactéries dans la circulation est possible. Malgré ces traitements il y a une période de deux semaines post-irradiation où on peut s’attendre à voir des effets sur le comportement et perte de poids chez les souris.

Devenir

Tous les animaux ayant subi des greffes, des reconstitutions ou des traitements seront mis à mort à la fin de l’expérience car ne peuvent pas être réutilisés, replacés ou adoptés.

Remplacement

Il n’y a pas d’alternatives de remplacement non-animales dans ce domaine. Le système immunitaire est hautement complexe et constitué de différents types cellulaires qui ensemble conditionnent l’état de santé ou de déficit immunitaire ou auto-immunité. Il n’y a donc aucun système in vitro qui puisse remplacer les expériences in vivo. Dans la même logique il faut donc effectuer des expériences dans des animaux vivants.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu pour le projet est basé sur un minimum de 4 expériences par groupe avec 6 souris par expérience en chaque groupe. Dès que possible les organes prélevés chez les souris seront partagés entre différents chercheurs pour limiter le nombre d’animaux utilisés. Les données seront analysées utilisant des tests T et ANOVA. Les mâles servant à générer les embryons et les souris nouveau-nées sont mutualisés entre les différentes procédures de ce projet voire d’autres projets quand cela est possible.

Raffinement

Les animaux soumis à des interventions chirurgicales seront surveillées trois fois par semaine, au minimum, des mesures d’analgésie seront aussi mises en place. Les souris seront hébergées dans des cages avec de l’enrichissement (igllos) et nous serons attentifs à toute amélioration possible des conditions d’hébergement. Les souris qui sont transplantées avec des lobes thymiques sous la capsule du rein sont soumises à une chirurgie et des douleurs et du stress sont attendues dans les deux ou trois jours qui suivent la chirurgie. Un traitement d’analgésie est prévu dans ces expériences. L’irradiation affecte aussi l’épithélium du système digestif et un passage de bactéries dans la circulation est possible. Un traitement antibiotique prévient l’effet néfaste de cette éventualité. Malgré ces traitements il y a une période de deux semaines post-irradiation où on peut s’attendre à voir des effets sur le comportement et perte de poids chez les souris. Elles seront donc surveillées de près pendant toute cette période et les souris atteignant les points limites définis seront mises à mort.

Choix des espèces

La souris comporte tous les composants-clés du système immunitaire inné et acquis, et de ce fait est un bon modèle pour l'étude des réponses immunitaires chez les mammifères. Le fonctionnement et les molécules du système immunitaire des souris sont bien caractérisés et largement comparables au système immunitaire humain. En conséquence, les résultats expérimentaux sont très probablement transférables aux humains. De plus, il existe un grand nombre de lignées de souris mutantes, knockout et transgéniques, qui permettent des études mécanistiques approfondies. En outre, les pathologies intestinales et la régulation homéostatique du nombre de cellules présentes chez les souris sont bien décrites. Les résultats des expériences que nous programmons fourniront des pistes importantes quant à la fonction des lymphocytes dans l’établissement du système immunitaire. Les souris seront des souris adultes de 6 à 8 semaines ; nous utiliserons des embryons de souris entre les jours 13 et les jours 18, seconde moitié de la gestation ; nous utiliserons aussi des nouveau-nés. L’étude des embryons et nouveau-nés est nécessaire pour comprendre les mécanismes qui gèrent l’établissement du système immunitaire.