Système cardiaque

Ce projet est une prestation : une plateforme fournit sur commande à des chercheurs, qu'elle désigne comme ses clients, du sang, de la moelle osseuse, du lait, du sperme ou des humeurs de l'œil prélevés sur des primates. 1 000 primates vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, 800 macaques à longue queue, 150 ouistitis, 40 macaques rhésus et 10 singes vervets, gardés ensuite en hébergement ou réutilisés dans d'autres projets. Capturés par un tunnel et immobilisés dans un sabot de contention, ils subissent prises de sang, ponctions de moelle et de liquide céphalo-rachidien, prélèvements d'humeur vitrée, biopsies et lavages des bronches, et les petits sont séparés de leur mère jusqu'à six heures pour la collecte du lait. Le porteur écrit que ces interventions "diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain".

Objectifs

L’accès à des échantillons biologiques de primates non humains (PNH) est un élément clé dans le développement préclinique. Ils permettent de valider in vitro différentes hypothèses scientifiques et de tester l’efficacité ou la toxicité de candidats médicaments. Autrement dit, utiliser des échantillons de PNH 1) permet de réduire l’utilisation d’animaux de laboratoire en les remplaçant par l’utilisation in vitro de cellules (plusieurs produits testés avec les cellules d’un seul animal) ; 2) rend le développement d’un médicament plus fiable, grâce à une sélection objective de l’espèce animale la plus proche de l’homme. Les prélèvements sont réalisés sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. De plus, un hébergement spacieux en groupe sociaux et un enrichissement du milieu adapté sont fournis à ces animaux. Anesthésie, analgésie, hébergement en groupe sociaux et enrichissement participent ainsi au principe de raffinement. La réalisation de prélèvements biologiques suit donc parfaitement la règle des 3R, tant dans son concept que dans sa réalisation. Pour les besoins de la recherche scientifique , l'objectif de ce projet est de proposer et fournir à la communauté scientifique la fourniture d’échantillons biologiques (sang et dérivés sanguins, cellules, tissus, fluides…). Le besoin en prélèvements biologiques/cellules de PNH est dépendant de projets extérieurs à la plateforme

Bénéfices attendus

D’un point de vue scientifique, les prélèvements de sang, moelle osseuse, liquide céphalo-rachidien, urine, humeur aqueuse, humeur vitrée, sperme, biopsies cutanées, biopsies musculaires, lait et liquide bronco-alvéolaire peuvent avoir de nombreuses utilisations. On peut notamment citer parmi les utilisations faites par les utilisateurs de ces prélèvements : (i) des recherches sur les cellules primaires pour développer de nouvelles molécules de biothérapie en oncologie ou contre les maladies inflammatoires ; (ii) des pré études de sécurité pour mettre en place avec les doses adaptées les futures études de toxicologie sur les primates non humains ; (iii) des comparaisons avec le sang humain afin d’étudier la compatibilité des résultats obtenus sur les primates non humains lors de leur application chez l’Homme (iv) des études de bioanalyses pour le développement de médicaments ; (v) des recherches pour découvrir de nouvelles molécules pour inhiber l’immunité innée pour le traitement des maladies à médiation immunitaire.

Procédures

Les interventions réalisées sur les animaux dans ce projets diffèrent peu d'interventions de don du sang ou de prélèvements diagnostics menés chez l'humain. De plus, contrairement à ce qui est fait chez l'Homme, ces procédures sont ici réalisées sur animaux anesthésiés et analgésiés. Pour les prélèvements de sang, un prélèvement vigil pourra être effectué dans le seul cas où l'anesthésique affecteraits les analyses ou les expériences menées par le chercheur. L'ensemble de interventions sont des prélèvement biologiques : prise de sang, prélèvement de LCR, moelle osseuse, urine, lait, sperme et humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lavage broncho-alvéolaire. Le nombre des interventions dépend des demande des utilisateurs mais sont toujours réalisées en respectant les procédures définissant des intervalles de prélèvements et de volume maximaux afin de préserver la bonne santé et le bien être de l'animal.

Impact sur les animaux

La réalisation des prélèvements biologiques nécessite au minimum la capture et la contention des animaux. Ces deux actes sont stressants car réalisés de manière contrainte. La capture consiste à diriger les animaux vers un tunnel de capture installé dans chaque animalerie. Une fois dans le tunnel de capture, les animaux peuvent être triés et dirigés vers le sabot de contention au bout du tunnel équipé d’un fond de contention. Le fond de contention permet de manière sécurisée (i) d’attraper le bras de l’animal afin de pouvoir le tenir et le sortir en vigil du tunnel à l’aide de gants de contention, ou (ii) d’accèder à sa cuisse afin de pouvoir effectuer une injection intra-musculaire du produit anesthésiant. A noter que l’habituation des animaux ainsi que le renforcement positif permet de réduire la durée et l’intensité du stress de capture. Ces méthodes de raffinement sont appliquées le plus souvent possible. Les effets post-prélèvements peuvent également représenter une nuisance en termes de récupération physiologique et/ou physique des animaux. Il s’agira au maximum des effets secondaires liés à l’anesthésie (somnolence, nausée). Toutes les nuisances sont considérées comme légères. De plus, des mesures de raffinement sont mises en place propres à chaque type de prélèvements. A noter que -pour le prélèvement de lait, les petits sont séparés de leur mère pour une durée de 6h maximum engendrant un stress de séparation. Cette séparation sera la plus courte possible et n’entraine pas d’effet à long terme sur le petit. Des mesures particulières sont mises en place afin de limiter le stress immédiat des petits due à cette séparation comme la présence d’une peluche pour s’agripper si le petit est seul ou la mise en groupe des petits s’ils sont plusieurs. - pour le prélèvement de sperme, le mâle est séparé de son groupe la veille pour obtenir le meilleur prélèvement possible. Cette séparation engendre un stress chez l’animal. Afin de réduire au maximum ce stress, le temps de séparation est limité à 24h maximum et le mâle est relâché dans son groupe dès que possible. Le contact visuel avec le groupe est maintenu si possible.

Devenir

Les procédures de prélèvements biologiques étant des procédures très légères, les animaux sont gardés en hébergement standard ou pourront être réutilisé pour d'autres projets scientifiques.

Remplacement

Dans la mesure où les produits de synthèses ne permettent pas encore de reproduire toutes les réactions des différentes cellules visées dans ce projet, l’utilisation d’animaux en tant que donneurs non terminaux reste indispensable. Les prélèvements biologiques réalisés sur animaux vivants proposés dans ce projet permettent justement de remplacer l’utilisation d’animaux vivants « entiers » par des produits biologiques issus de ces animaux permettant ainsi d’éviter l’injection de composants en tests à ces animaux et de multiplier les essais réalisés sur les produits biologiques testés sans multiplier le nombre d’animaux utilisés.

Réduction

L’utilisation de produits biologiques à la place d’animaux entiers permet en soi de réduire le nombre d’animaux utilisés à des fins scientifiques puisqu’un même animal peut être réutilisé pour le prélèvement de plusieurs produits biologiques, dans la limite des volumes et de la fréquence maximale permettant à l’animal de retrouver son état de santé et de bien-être général entre chaque prélèvement. Concernant les prélèvements biologiques eux-mêmes, ceux-ci sont réalisés après une demande spécifique validée d’un demandeur (en général client chercheurs). Les animaux ne sont pas prélevés systématiquement s’il n’y a pas de demande pour la fourniture de produits biologiques qui ne seraient pas utilisés. Dans la mesure du possible, toutes les demandes sont couplées afin de limiter le nombre d’interventions pour un même groupe d’animaux hébergés ensemble et réduire le stress lié à la capture dans une même animalerie. Ainsi tout est fait pour prélever un minimum d’animaux pour satisfaire les demandes des chercheurs.

Raffinement

La plupart des prélèvements est réalisée sur des animaux anesthésiés en suivant les recommandations de prélèvement correspondant aux bonnes pratiques chez l’Homme. Dans les rares cas où l’anesthésie n’est pas réalisée (pour les prélèvements sanguins uniquement : demande spécifique de l'utilisateur : interraction de l’anesthésique avec leur recherche), il est jugé que le dommage engendré par la réalisation du prélèvement en vigil ne diffère pas de celui engendré par l’anesthésie (douleur de la piqure d’une aiguille + stress d’un prélèvement vigil vs douleur de la piqure d’une aiguille + réveil, respectivement). De plus, tous les animaux disposent d’un hébergement répondant à la règlementation en vigueur, avec accès extérieur (volume supplémentaire par rapport à la réglementation) le cas échéant et en groupes sociaux. Les animaleries intérieures et extérieures sont équipées d’enrichissements du milieu adaptés à chaque espèce (au minimum perchoirs, reposoirs, barrières visuelles, matériaux variés, jouets, litière). En ce qui concerne les méthodes de prélèvements des produits biologiques, des mesures de raffinement spécifique (dont analgésie si nécessaire) sont mises en place pour chaque procédure.

Choix des espèces

De nombreuses thématiques de recherche sont menées sur les PNH et peuvent nécessiter l’utilisation de produits biologiques (ici sang et dérivés, LCR, moelle osseuse, urine, humeurs oculaires, biopsies de peau ou musculaire, lait, liquide broncho-alvéolaire, sperme) soit pour des études préliminaires soit comme témoin négatif en comparaison aux produits récoltés lors de l’expérimentation. Les espèces PNH choisies sont celles utilisées le plus couramment en recherche biomédicale et pour lesquelles la communauté scientifique dispose du plus de données bibliographiques et de connaissances (Macaques cynomolgus, rhésus, singes verts et ouistitis). L’espèce prélevée est choisie sur demande du chercheur. Animaux de tous âges en fonction des demandes des utilisateurs. Les volumes prélevables sont ajustés en fonction de l’âge et du poids de l’animal.

420 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, toutes tuées à l'issue. Certaines reçoivent dès la naissance trois injections dans l'estomac ou l'abdomen en trois jours, d'autres, adultes, dix injections abdominales de tamoxifène en deux semaines. Une partie subit ensuite une prise de sang derrière l'œil et des mesures de pression artérielle par brassard sur la queue, après deux semaines d'accoutumance. Le projet doit établir le rôle d'une protéine des vaisseaux, ARHGEF18, et renvoie au long terme les retombées annoncées, de nouveaux médicaments contre l'anévrisme intracrânien. Des souriceaux sont tués à six et à quatorze jours de vie pour l'analyse de leur rétine.

Objectifs

La physiologie vasculaire est fortement influencée par la circulation sanguine qui génère des contraintes mécaniques variables sur la paroi des vaisseaux. Les artères sont principalement soumises à un fort flux sanguin générant de fortes contraintes de cisaillement sur les cellules endothéliales tapissant l’intérieur des vaisseaux. Ces contraintes participent à la production de facteurs vaso-actifs et à la quiescence des cellules endothéliales. Une modification de ces contraintes ou une perte de sensibilité des cellules endothéliales impactent la fonction de ces dernières. Aujourd’hui il est reconnu que les contraintes de cisaillements participent à certains processus développementaux et leur modification ou mauvaise perception par les cellules endothéliales contribue à de nombreuses pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose ou l’anévrisme intracrânien. Mieux comprendre comment les cellules endothéliales perçoivent ces forces contribue, à terme, à l’identification de nouveaux axes de recherche pour prévenir, détecter et traiter les maladies cardiovasculaires. Grâce au travail réalisé in vitro, nous avons identifié une protéine mécano-sensible, ARHGEF18, contrôlant différentes fonctions endothéliales : l’adhésion, la prolifération et l’inflammation. Maintenant que nous avons déterminé la pertinence d’ARHGEF18 in vitro, nous souhaitons comprendre son rôle dans un système intégré plus complexe. Cela nous permettra de valider son impact sur les fonctions identifiées in vitro et d’identifier sa contribution exacte dans la physiologie vasculaire.

Bénéfices attendus

La rupture d'un anévrisme intracrânien, responsable de ~36 000 cas d'hémorragie sous-arachnoïdienne dans la communauté européenne, est l'une des principales causes de mort subite chez les jeunes sujets "sains" (pic d'âge entre 50 et 60 ans) avec un impact socio-économique considérable. Actuellement, il n'existe pas d'outils diagnostiques permettant de prédire le devenir d'un anévrisme intracrânien chez un individu donné, ni de médicaments permettant de limiter ou de prévenir la croissance de l'anévrisme intracrânien et sa progression vers la rupture. Les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'initiation, de la croissance et de la rupture d'un anévrisme intracrânien sont encore inconnus. Malheureusement, il n'y a que peu de laboratoires travaillant sur la physiopathologie de l'anévrisme intracrânien. Le projet pour lequel cette saisine est déposée contribuera à répondre au besoin urgent d'améliorer la prise en charge des personnes atteintes d'anévrisme intracrânien. En identifiant le rôle d’ARHGEF18 dans la réponse aux forces mécaniques des artères cérébrales, ce projet facilitera la découverte de cibles thérapeutiques pertinentes pour prévenir la progression de la maladie, diminuer le risque de rupture et optimiser l'évaluation du risque pronostique pour prévenir les hémorragies aiguës. Les résultats obtenus pourront donc avoir un impact spécifique à long terme en ouvrant de nouvelles voies pour le développement de nouveaux médicaments. Une des perspectives de ce projet est le développement de nouveaux modulateurs pharmacologiques ciblant ARHGEF18 ou les voies de signalisation associées. Les résultats générés auront également, à long terme, un impact sociétal. De nos jours, la rupture d'anévrisme intracrânien est redoutée parce qu'elle est une cause de mort subite, et parce qu'elle survient sans symptômes cliniques préalables. La plupart des diagnostics sont faits sur la base de découvertes fortuites suite à une IRM. Les patients diagnostiqués savent qu'ils ne disposent d'aucun traitement préventif et non invasif. Par conséquent, ces patients vivent avec un stress permanent. Faciliter le diagnostic et offrir une perspective de traitement pharmacologique à ces patients soulagera leur anxiété et leur détresse.

Procédures

Procédure 1: injection intra-gastrique ou intra-péritonéale chez le nouveau-né: 3 injections sur 3 jours. Chaque injection dure moins d'une minute par animal. Procédure 2: injection intra-péritonéale chez l'adulte: 5 injections/semaine sur 2 semaines (cad 1injection IP/jour/5j/2semaines, à raison d'une minute par injection et par souris). Procédure 3: prélèvement rétro-orbitaire chez l'adulte. Le prélèvement est réalisé une seule fois et ne dure pas plus de 5 minutes. Procédure 4: prise de pression artérielle systolique chez l'adulte (tail cuff). 2 semaines d'acclimatation + 3 mesures définitives. Chaque cycle de mesures dure en moyenne une vintaine de minutes.

Impact sur les animaux

Les procédures liées à ce projet sont réalisées en routine dans le laboratoire par du personnel qualifié. Nous n'attendons pas, à priori, de nuisances particulières. Toutefois, les risques potentiels sont: Injection de tamoxifen: les injections intrapéritoéales répétées (2x5jours) peuvent entrainer une irritation au site d'injection. C'est pourquoi une alternance Droite/Gauche est prévue, pour palier à ce problème. Prélèvement rétro-orbital: une douleur post-prélèvement peut survenir, c'est pourquoi un analgésique local à base de lidocaïne est appliqué après le prélèvement.

Devenir

Procédure 1: Lot 0: mis à mort après la fin d'entrainement Lot 1 : jusqu’à 6 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 2 : jusqu’à 14 jours de vie pour analyse de la rétine par immunofluorescence Lot 3 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire) Lot 4 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4. Procédure 2: Lot 5 : jusqu’à 10 semaines de vie pour prélèvement d'organes (culture cellulaire). Lot 6 : seront utilisés pour la procédure 3 et 4 Procédure 3: Lot 4 et Lot 6 entièrement pour la procédure 4. Procédure 4: Mise à mort des Lots 4 et 6 pour prélèvement d'organes en vue d'analyse histologique.

Remplacement

Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites. Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.

Réduction

Réutilisation : Les mêmes animaux serviront pour la prise de pression et le prélèvement sanguin. Il est impossible de réutiliser les animaux des groupes de prise de pression et de prise de sang pour l’isolation des cellules endothéliales car ces animaux seront trop vieux au moment de leur euthanasie et leur cerveau sera utilisé pour des marquages immunofluorescents. Réduction : Le modèle et les techniques seront mis en place par des personnes ayant déjà plusieurs années d’expérience ce qui permettra la réduction du nombre d’animaux utilisés. Aucune étape de mise au point n’est nécessaire pour les procédures décrites.

Raffinement

Raffinement : Toutes les procédures seront réalisées avec les analgésiques adéquates dès que nécessaire.

Choix des espèces

Le modèle murin est le seul permettant la délétion inductible et tissu-spécifique de la protéine étudiée ainsi que la complexité nécessaire pour l’étude du rôle de la protéine sur le fonctionnement du système cardiovasculaire. Le but de cette saisine est d’établir le rôle d’ARHGEF18 dans le développement vasculaire et son homéostasie. Par conséquent, la recombinaison chez les animaux sera faite à deux stades : post-natal (procédure 1) ou à l’âge adulte (procédure 2). Pour la partie développementale, les animaux seront utilisés à P6 et P14. Pour la partie homéostasie vasculaire qui s’étudie à l’âge adulte, les souris seront utilisées entre 7 et 13 semaines (procédures 3 et 4).

58 ouistitis vont être utilisés, puis réutilisés dans d'autres protocoles, dans des procédures déclarées d'un niveau de souffrance léger. Chaque primate subit une fois par an des séances d'imagerie cérébrale et cardiaque sous anesthésie et un prélèvement sanguin, pour étudier le vieillissement cardio-cérébral. Le porteur présente ces interventions comme non invasives et indique que les animaux peuvent être inclus dans plusieurs protocoles au cours de leur vie. Il justifie le recours au primate par la possibilité d'études longitudinales sur un même individu et par le "besoin" d'un organisme vivant intègre.

Objectifs

Le vieillissement est un processus multifactoriel caractérisé par des modifications physiologiques à l’origine d’un déclin fonctionnel progressif, qui peut être à l’origine de plusieurs maladies chroniques, notamment cardiovasculaires et neurodégénératives. Ces maladies altèrent la qualité de vie et en limitent la durée. L’étude des processus de vieillissement est largement réalisée sur des espèces animales non primates, mais des différences fondamentales dans le processus de vieillissement entre les non-primates et les humains ont entravé la transposition directe des résultats à l'homme. Le marmouset (ouistiti commun, Callithrix jacchus), petit primate non humain (~350 g) à la durée de vie plus courte (~10 ans), a été proposé comme un modèle de vieillissement. Ce singe partage avec l'homme des traits génétiques, physiologiques et comportementaux similaires. Il présente un déclin de la fonction cardiaque, les caractéristiques des maladies neurodégénératives et de la neuroinflammation dans le cerveau, ainsi que des altérations cognitives. Le marmouset constitue un modèle adapté aux études sur le vieillissement: durée de vie compatible avec des analyses longitudinales, accès à un nombre raisonnable d’animaux élevés dans les mêmes conditions environnementales et alimentaires. Notre projet est destiné à intégrer les résultats issus de deux approches chez le marmouset: (1) identifier les signatures protéomiques plasmatiques liées à l'âge et au sexe (2) caractériser les phénotypes cardiaques et cérébraux (phénome cardio-cérébral) liés à l'âge chez les marmousets des deux sexes, afin de déterminer la relation entre le protéome circulant et le phénome cardio-cérébral en fonction de l'âge et du sexe. Etant donné que le concept de différences entre les sexes domine dans les processus de vieillissement chez les humains, il est essential de prendre en considération les mécanismes qui régissent les différences entre le sexe et l'âge pour, à terme, détecter, prévenir, ralentir ou même inverser les phénotypes associés à l'âge. L'IRM multimodale sera utilisée pour évaluer les fonctions ventriculaires cardiaques, mesurer les flux sanguins cérébraux et la perfusion cérébrale. Nous déterminerons la contribution des changements liés à l'âge et au sexe dans les phénotypes cardio-cérébraux, d’une part en comparant différents groupes de singes (vieux vs jeunes; mâles vs femelles), d’autre part en réalisant un suivi longitudinal individuel.

Bénéfices attendus

Des simulations numériques seront développées à partir des données expérimentales anatomiques et physiologiques que nous aurons recueillies chez le marmouset. Les modèles numériques marmouset seront comparés et corrélés au modèle homme que nous avons obtenu dans le cadre d’un autre projet, afin de valider : 1. les hypothèses que nous proposons sur le rôle du système cranio-spinal dans le vieillissement cérébral, 2. la transversalité effective de ce modèle animal à l’homme. Le couplage d’approches in vivo dans le respect de l’éthique animale et d’approches in silico va permettre d’évaluer les compatibilités homme/animal et d’améliorer notre connaissance des mécanismes de maladies neurodégénératives en particulier. De plus les données de l’analyse protéomique du plasma, les images issues des différentes modalités d’imagerie IRM, obtenues à partir d’une large gamme d’âges et pour les deux sexes, chez les marmousets, représentent un vivier considérable d’informations. De plus, les données biochimiques du plasma pourront être utilisées pour différents domaines de la recherche, non limités au système cardio-vasculaire et au cérébral. Les modèles développés seront disponibles en open source pour garantir une diffusion large au sein des communautés scientifiques et médicales. Cette démarche devrait permettre de réduire le nombre d’expérimentations chez l’animal, et potentiellement d’améliorer, voire développer des protocoles cliniques testables in silico en première approche.

Procédures

Les marmousets seront soumis à deux types d’intervention, 1 fois par an: -imagerie IRM sous anesthésie: une imagerie multimodale cérébrale (IRM 3T) d’une durée de 1,5h et une imagerie multimodale cardiaque (IRM7T) d’une durée de 1,5h (procédure 1) -prélèvement sanguin sous anesthésie (veine fémorale) qui nécessite 5 à 10mn (procédure 2) Les prélèvements sanguins seront réalisés autant que faire se peut lors de l’anesthésie des animaux pour une séance d’imagerie.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales mises en oeuvre (imagerie IRM et prélèvement sanguin sous anesthésie), 2 fois/an ne génèrent pas de douleur et ne causent pas de dommage à l’animal. Les marmousets seront imagés dans la mesure où ils seront aptes à entreprendre le voyage prévu et la séance d’imagerie. Leur état de santé est contrôlé : avec courbe de poids, suivi de comportement de base, surveillance des interactions entre les animaux et de leur état physique par le personnel zootechnique Animalliance en charge de l’animalerie. Les animaux vigiles ne sont jamais soumis à l'isolement et la privation hydrique est limitée au jeûne imposé avant l'anesthésie. Pendant les séances d'imagerie, l'animal est maintenu dans des conditions de température adéquates et sa fréquence respiratoire suivie avec alarmes programmées en cas d’hyper ou d’hypo ventilation. La mise à mort sera pratiquée si des animaux âgés sont en état de souffrance liée à une altération de l’état général très prononcée (procédure valable pour toute l’animalerie marmouset, indépendante de l’étude présente).

Devenir

Les deux procédures expérimentales mises en oeuvre ne génèrent pas de douleur et ne causent pas de dommage à l'animal. Elles ne sont pas invasives et les interventions sur l'animal sont peu fréqentes (2 fois/an). Ainsi au cours même de l'étude, les animaux peuvent être impliqués dans des études comportementales, si ces dernières sont réalisées à intervalles préalablement définis. A la fin de l'étude les animaux peuvent être attribués à d'autres projets.

Remplacement

L’objectif du projet scientifique consiste à chercher, au cours du vieillissement, et en fonction du sexe, des relations entre des modifications dans les flux cérébraux, l'anatomie cérébrale, les fonctions cardiaques et des marqueurs sanguins. L’approche requiert l’intégrité de l’organisme vivant qui fournira à la fois des éléments physiologiques (métabolismes cérébral et cardiaque), anatomiques (taille et forme des structures cérébrales) et biochimiques (marqueurs sanguins). De plus cette étude s’inscrit dans le temps, sur une échelle de plusieurs années au cours desquelles les mêmes animaux seront suivis. Le modèle animal est justifié par la problématique du vieillissement des organes, et de leurs interactions, ainsi que par la nécessité de mesurer des phénomènes dynamiques, tels que les flux sanguins. Le modèle marmouset s’inscrit dans la proximité phylogénétique, anatomique et physiologique avec l’humain. C’est pour l’ensemble de ces raisons que ce projet ne pourrait être réalisé in vitro ou avec un modèle animal rongeur.

Réduction

Le nombre nécessaire et suffisant d’animaux a été établi lors de la conception du protocole expérimental par une approche méthodologique/statistique. L'étude vise à pouvoir exploiter la colonie de marmousets présente au CerCo avec une stratification en fonction de l'âge (jeunes adultes vs adultes âgés) et du sexe. Pour un risque de type I de 0,05 et de type II de 0.10, une modification théorique minimale de 20% des différentes variables avec des déviations standards de 15% nécessite 13 animaux par sous-groupe d'âge (4 sous-groupes : jeunes adultes, adultes, adultes vieillissants et sujets âgés). Si l'erreur de type II est fixée à 0.2 (valeur plus couramment acceptée), 10 animaux par sous-groupe doivent être étudiés. Il faut également considérer l 'éventuelle perte d'animaux. Ainsi, ce nombre est compatible avec la colonie présente dans l'animalerie. Les 4 sous-groupes pourront être regroupés en 2 groupes d’âges (jeunes 6ans). Il faut également considérer que ces animaux, impliqués dans une analyse de type transversal, seront intégrés dans une étude longitudinale, avec une exploration annuelle par imagerie et analyse du protéome sanguin. Les procédures n'étant pas ou peu invasives (prélèvement sanguin sous anesthésie) et à la fréquence d’une fois par an, les marmousets de l'étude pourraient être impliqués en parallèle dans d'autres études non invasives, telles que des études comportementales menées au laboratoire par d’autres chercheurs, dans le respect d’un planning partagé adéquat. De plus à la fin du projet, les animaux pourront être attribués à d'autres études. Les mêmes marmousets contribuent à plusieurs approches : imagerie avec plusieurs séquences d'imagerie et des prélèvements biologiques. Les résultats obtenus à partir des différentes procédures seront analysés séparément mais également fusionnés. Des corrélations seront recherchées entre le phénotype cardio-vasculaire et le protéome sanguin au sein des différents groupes d’âge, en fonction du sexe, afin de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques et neurodégénératifs liés à l’âge, et de l’interaction âge/sexe. En complément de l’analyse catégorielle, la méthode sera étendue à un modèle linéaire généralisé, qui permettra une définition plus fine des variations liées l’âge. Il sera ainsi possible de détecter des âges auxquels des modifications liées au vieillissement normal ou pathologique sont attendues, sans nécessiter une approche expérimentale supplémentaire.

Raffinement

Les interventions sur l’animal sont réduites au minimum (anesthésie), toutes les approches d’imagerie étant non invasives. Les animaux vivent en contact (au moins visuel, olfactif et auditif) avec l’ensemble des congénères de la même pièce. Les durées de séparation (contact physique) avec les congénères de la même cage/volière sont limitées. Les procédures ne génèrent pas d’isolement social ni de douleur. Les déplacements des marmousets entre l’animalerie et les machines IRM sont réalisés avec des animaux anesthésiés (Alfaxan, 0.25ml) pour limiter le stress. Les privations alimentaires et hydriques ne sont appliquées qu’en prévision d’une anesthésie. Les anesthésies (isoflurane ~2% dans O2) sont surveillées (monitoring de la respiration et du rythme cardiaque). Lors des séances IRM, le dispositif dans lequel les animaux anesthésiés sont installés est maintenu à la température de 27.5°C. Le suivi sanitaire des animaux est assuré par le personnel zootechnique : courbe de poids, surveillance de comportement de base et des interactions entre les animaux et de leur état physique. Une vétérinaire peut également être amenée à intervenir si un examen clinique est nécessaire, et décider du maintien de l’animal dans l’étude. En cas de blessures, le traitement consistera en des injections d'antibiotique (Clamoxyl 0.1ml/kg)par animal pendat 5 à 7 j) et d’anti-inflammatoire (Dexadreson ou Diurizone, 0,05 ml/kg soit environ 0,015 ml/animal), qui seront complétées par l’application de pommades antibiotiques (Duphader, Predniderm, Fucidine). Des injections d’un antibiotiqueadapté (metronidazole) et d’antispasmodique (Estocélan 0,1ml/kg soit environ 0,03ml/animal) seront faites aux animaux présentant des problèmes gastriques. En cas de diarrhées, du phosphaluvet est donné (1ml/kg soit environ 0,3ml par animal) sur quelques jours. Un dispositif de protection destiné à réduire le dommage auditif lié au fonctionnement de l’IRM (procédure expérimentale 1) est à l’étude (‘mini-casque’ ou bouchon d’oreilles).

Choix des espèces

Dans le cadre de l’analyse des processus de vieillissement, le marmouset Callithrix jacchus offre la possibilité de réaliser des études longitudinales sur un même animal sur une échelle de temps bien plus courte que chez l’homme (en étant de plus inclus dans plusieurs protocoles d’imagerie). Ce modèle présente l’avantage, en regard d’autres modèles (rongeurs « humanisés », microcèbe), d’une proximité phylogénétique avec l'homme. D'autres travaux au laboratoire s'intéressent aux aptitudes cognitives de ces singes en fonction de l'âge). Ainsi il est possible sur ce modèle de mener des travaux qui permettront d’analyser l’évolution des interactions entre différents biomarqueurs cérébraux, vasculaires, cardiaques et sanguins en corrélation avec les aptitudes cognitives. Une étude comparable en terme de nombre d’animaux, d’espace et de durée de projet relative à la longévité de l’espèce ne peut être envisagée, en conditions de laboratoire, chez le macaque, modèle PNH classique. L'analyse est destinée à définir in fine des marqueurs précoces du vieillissement du système cardio-cérébral. La gamme d’âges devra être suffisamment étendue. Les marmousets inclus dans les études seront des adultes, à partir du stage jeune adulte jusqu'au stade gériatrique. La cohorte participant aux études sera dichotomisée d’une part en adultes jeunes entre 2,5 et 6 ans, et d’autre part en adultes vieillissants et âgés au-delà de 6 ans, puis stratifiée en 4 sous-groupes d’individus: jeunes adultes (2,5-4 ans), adultes (4-6 ans), adultes vieillissants (6-9 ans) et sujets âgés (>9 ans) si la composition de la colonie (âge, sexe, effectif/classe d’âge) de marmousets le permet.