Système cardiaque

3 880 poissons zèbres vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Génétiquement modifiés pour porter des mutations liées à des malformations humaines du visage et du cœur, ils subissent un prélèvement d'un fragment de nageoire sous anesthésie, et le porteur indique que les lignées peuvent présenter des malformations du squelette et de la tête. Des tests comportementaux de nage en réponse à des stimuli sonores et lumineux sont réalisés sur les larves. Il affirme que le recours à l'animal est "indispensable" car les études in vitro ne rendent pas compte du développement en trois dimensions du cœur ou des mâchoires.

Objectifs

Les malformations congénitales, diagnostiquées dans 2-3% des naissances sont un enjeu majeur de Santé Publique. Les malformations du visage et du cœur sont une composante fréquente des syndromes de malformations congénitales humaines et sont donc d'une importance clinique majeure. Les deux impliquent généralement une lourde charge médicale et chirurgicale. De plus, parmi les malformations congénitales humaines, les malformations affectant la forme du visage sont peut-être les plus frappantes en raison des attentes culturelles et des conséquences psychologiques. La majorité des alterations du visage et du coeur sont la conséquence d’un défaut de développement de l’embryon qui est provoqué par la mutation d’un gène. L’objectif de ce projet est d'élucider les mécanismes moléculaires et développementaux qui causent des malformations grâce à l’analyse de poissons zèbres qui portent des mutations dans certains gènes.

Bénéfices attendus

L'étude des poissons zèbres qui portent des mutations dans des gènes récemment identifiés dans des pathologies humaines devrait fournir de nouvelles connaissances sur les mécanismes moléculaires responsables de ces maladies rares et sur le développement normal du visage, du cœur et du cerveau.

Procédures

Les animaux subiront des prélèvements sous anesthésie d'un bout de nageoire, pour l’analyse de l’ADN. La procédure consiste à anesthésier le poisson adulte jusqu’à absence de réflexe au toucher (environ 3 minutes) puis un segment de 3mm de la nageoire caudale est coupé. Le poisson est ensuite placé à nouveau dans l’eau et il se réveille au bout de 1-2 minutes. Les poissons régénèrent spontanément leurs nageoires en quelques jours et il n’y a pas d’effets nocifs à long terme. Cette procédure sera nécessaire pour chaque animal génétiquement modifié et sera effectuée une seule fois au cours de la vie de l'animal.

Impact sur les animaux

Les lignées génétiquement modifiées pourront présenter des malformations du squelette, de la tête (diminution de la taille de la mâchoire, aplatissement de la face) ou des altérations des paramètres de la nage témoignant de problèmes moteurs ou de nutrition (amaigrissement).

Devenir

Procédure 1 : Tous les poissons génétiquement modifiés et âgés entre 20-24 mois (âge à partir duquel ils n’arrivent plus à se reproduire) ou toujours en vie à la fin du projet, seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 2 : À la fin de la procédure qui a pour but l'étude post-mortem de l’ensemble des caractères visibles de poissons mutants, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique. Procédure 3 : À la fin de la procédure, qui a pour but l'observation, sur une brève période, du comportement de nage des larves en réponse à des stimuli sonores et lumineux, les poissons seront euthanasiés par surdosage d’anesthésique.

Remplacement

Notre objectif est de comprendre les mécanismes moléculaires et développementaux qui sous-tendent certaines malformations du visage et du cœur et la déficience intellectuel. Le recours à des modèles animaux est indispensable pour réaliser ces études car les études in vitro ne peuvent pas complètement rendre compte de la complexité des processus mis en jeu, par exemple, le développement complexe en 3 dimensions du coeur ou les interactions entre des populations de cellules qui donneront lieu aux mâchoires.

Réduction

Nous limiterons le nombre d’animaux utilisés aux besoins statistiques de nos analyses. Nous générerons uniquement le nombre d’animaux nécessaires à nos projets. La fécondité élevée chez cette espèce est un avantage, car elle permet d’obtenir beaucoup d’embryons, à partir d’une population restreinte de reproducteurs adultes.

Raffinement

Afin de limiter au maximum la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront avec une surveillance journalière, avec un dénombrement des poissons affectés par symptôme. Compte-tenu des gènes impliqués, des malformations du squelette de la tête ou de la capacité de nager sont attendues parmi les phénotypes spécifiques. De ce fait, ces altérations ne seront pas un critère éliminatoire. Néanmoins l’apparition de symptômes morphologiques (érosion, lésion) ou comportementaux (fort amaigrissement, immobilité) seront suivis et scorés tout au long de la croissance du poisson. Les poissons dépassant les points limites définis seront euthanasiés. La procédure de prélèvement d’un fragment de la nageoire caudale (pour l’analyse de l’ADN) sera réalisée sous anesthésie générale. De plus, un enrichissement du milieu sera effectué par la constitution de groupes sociaux, la mise en reproduction régulière et l’ajout de nourriture vivante.

Choix des espèces

Le poisson zèbre se révèle être un modèle de choix pour l’étude du développement du squelette de la tête et de la mise en place de l’orientation du cœur car ces processus chez le poisson zèbre sont similaires à ceux des mammifères. Le poisson permet du fait de la transparence des embryons et des larves, une observation non invasive des organes et cellules in vivo. Il permet d’établir des lignées génétiquement modifiées. -Pour la sélection des nouvelles lignées, le prélèvement d’un fragment de nageoire caudale pour l’analyse d’ADN sera réalisé sur poisson adulte, car prélever ce tissu aux stades plus jeunes serait trop endommageant. -L'analyse d'orientation du cœur sera réalisée sur des embryons âgés de moins de 5 jours post fertilisation, car l'orientation du cœur est déjà établie avant ce stade. -Les analyses du développement du squelette seront réalisées à trois stades clefs du développement : formation du squelette de la mâchoire à 5-7 jours post fertilisation ; début de la formation du crâne à 4 semaines post fertilisation ; squelette entièrement formé à 3 mois de vie. -L’observation de la taille sera réalisée sur des poissons à trois stades clefs de la croissance du poisson : à 18 jours post fertilisation, un stade larvaire ; à 28 jours post fertilisation, un stade juvénile, lorsque la plupart des caractéristiques adultes ont été acquises, sans maturité sexuelle ; à 11 semaines post fertilisation, un stade adulte. -Les tests comportementaux seront réalisés sur des poissons âgés de 10 jours post fertilisation, une étape à laquelle le développement neurologique est suffisamment mature pour pouvoir tester le comportement en réponse à des stimuli.

450 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le porteur décrit quatre injections d'antigène avec adjuvant, dont l'adjuvant complet de Freund, suivies de prélèvements sanguins et de la mise à mort pour prélever la rate et produire des anticorps monoclonaux. Il indique que ces immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Sur le remplacement, il affirme que l'immunisation animale reste la "méthode de référence" et présente le recours in vivo comme "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Le but du projet est d’assurer la production d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Pour répondre à ce besoin, il est pertinent de mettre en œuvre la méthode de référence, qui consiste à réaliser une fusion cellulaire entre un lymphocyte B et un myélome de souris.

Bénéfices attendus

Les anticorps monoclonaux (AcM) ont permis le développement de remarquables outils de recherche fondamentale, de diagnostic et plus récemment d’agents thérapeutiques. En recherche fondamentale, les AcM représentent des outils essentiels, en biochimie et en histologie pour la réalisation d’immunomarquages (immunohistochimie/ immunofluorescence) permettant la mise en évidence d’antigènes d’intérêts au sein d’un tissu, en biochimie dans des applications de type ELISA ou immunoprécipitation, et en biologie moléculaire pour la révélation de Western Blot. Dans le cadre du diagnostic, les tests de grossesse reposent classiquement sur la capacité d’AcM à détecter la présence de l’hormone Gonadotrophine Chorionique humaine (hCG), une glycoprotéine produite par le placenta. Les AcM sont également essentiels pour le diagnostic de différentes pathologies oncologiques et infectieuses. Les AcM demeurent aujourd’hui les outils de diagnostic tissulaire les plus performants. En parallèle de leur utilisation diagnostique, les développements menés depuis une quarantaine d’années ont abouti à la production de plus d’une vingtaine d’AcM à visée thérapeutique disposant d’une autorisation de mise sur le marché pour diverses applications, dont le domaine de l’oncologie et des maladies inflammatoires. L’ensemble de ces éléments permettent de justifier la pertinence de pouvoir assurer le développement d’AcM pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées, travaillant sur des approches fondamentales ou appliquées (diagnostic/ thérapeutique).

Procédures

4 injections seront réalisées : J00 (IP ou SC en ACF), J07 (AIF en SC ou IP), J14 (AIF en IM ou IP) et J21 une injection en intraveineuse sans adjuvant. Des prélèvements seront effectuée sur animaux vigiles : un pré-immun (qui sera le témoin négatif), un à J14 (suivi immunitaire) et J24 (jour de sacrifice de la souris). Injection IP/ SC ou IM, 30 sec pour la contention qui change à chaque point d’injection effectué + 30 secondes d’injection par point d’injection + 30 secondes de massage de la zone injectée, avec injections en 1, 2 ou 4 points suivant le type d’injection (IP, IM ou SC). Injection intraveineuse : 2 à 3 minutes de contention pour la dilation des veines caudales et 1 minute pour l’IV (l’injection en tant que telle ne prend que quelques secondes), mais la réalisation du geste technique (mise en place, maintien de la queue à demande de maintenir l’animal calme pendant 1 minute environ) Prélèvements, maintien de la souris et prélèvement 5 minutes

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements sont réalisés sur animaux vigiles au niveau de la veine sous-mandibulaire afin de remplacer le prélèvement en rétro-orbitaire.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, les souris ne peuvent pas être réutilisées pour d’autres protocoles, elles sont donc toutes euthanasiées en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcM reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. Toutefois l’isolement de la rate des souris immunisées, afin d’en isoler les plasmocytes sécrétant les anticorps et de les fusionner à des cellules immortalisées, aboutira à l’obtention d’hybridomes permettant la production d’anticorps in vitro sans avoir de nouveau à immuniser un animal.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 souris par protéine immunisée) est adapté au plus juste par rapport à la faible quantité d’antigène. Le nombre d’animaux utilisé est réduit au maximum, il s'agit de n'utiliser que le nombre d'animaux strictement nécessaire afin d’éviter la variabilité interindividuelle

Raffinement

Raffiner : Les souris sont hébergées dans des cages adaptées, proposant des objets d’enrichissement (abri, coton pour fabrication de nid) permettant de stimuler l’activité des animaux et de maintenir leur sociabilisation. Un contrôle des animaux et des sites d’injection est réalisé chaque jour. Cette observation quotidienne par un personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

La souris est l'animal référent pour l'obtention d'AcM. Les cellules de la rate et des ganglions lymphatiques des souris immunisées contiennent des cellules lymphocytaires sécrétant des anticorps contre l'antigène d'intérêt. Ces lymphocytes fusionnés avec des cellules de myélome issues de souris, permettent d'obtenir des AcM dirigés contre l'antigène d'intérêt. Le protocole nécessite des jeunes adultes immunocompétents de 6 à 8 semaines au moment de la première injection, afin d'obtenir une bonne réponse immunitaire. Par conséquent, les souris sont reçues à l’âge de cinq semaines. Elles sont mises pendant une semaine en quarantaine dans une zone d’hébergement dédiée conforme à la règlementation avant le début du protocole

150 cobayes vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent six injections sous-cutanées d'antigène associé à un adjuvant et trois prélèvements sanguins sous anesthésie gazeuse, pour produire des anticorps polyclonaux vendus comme réactifs à des équipes de recherche. Le porteur indique que les immunisations peuvent provoquer des ulcérations aux points d'injection. Il affirme qu'aucune méthode substitutive n'est aussi efficace et que le recours à l'animal vivant reste "indispensable" pour obtenir des anticorps spécifiques.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces immunoglobulines constituent des ressources largement utilisées dans des applications analytiques et thérapeutiques. Les AcP sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ils trouvent des applications en biologie et en biochimie, en tant que ligand de colonne d’immunoaffinité. Ils possèdent également de nombreux emplois en recherche tel que la détection de molécules dans les essais du type enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), les révélations de Western Blot, les procédures immunohistochimiques et d'immunoprécipitation, en immunofluoromicroscopie et en immunoélectromicroscopie. Notre processus de production assure la production d’AcP pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. Les antisérums sont produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, souvent combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. La réponse immunitaire peut par la suite être amplifiée par des injections de rappel d'antigène. On prélève des échantillons de sang de l'animal pour évaluer le niveau de production d'anticorps ; lorsque le titre est suffisamment élevé, on prépare un antisérum en effectuant une prise de sang suivie de l'isolement du sérum puis, si nécessaire, de la purification des anticorps à partir du sérum

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux (AcP) seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. Les anticorps développés de cobaye dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules d’un tissu ou d’un organe. L’utilisation du cobaye interviendra dans des projets particuliers pour lesquels, cette espèce présente un avantage par rapport à d’autres. En effet, les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Le cobaye étant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, il permet l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où les cobayes ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins.

Procédures

Six injections aux cobayes en sous-cutané de l’antigène associé à un adjuvant. Trois prélèvements sanguins seront réalisés, au niveau de la veine saphène sous anesthésie par inhalation de gaz anesthésiant (gaz halogéné). Injection sous-cutanée : 8 minutes dont 4 minutes pour prendre avec délicatesse l’animal, le rassurer et le préparer, 30 secondes par injection et 30 secondes pour masser la zone injectée (4 injections), c’est-à-dire 4 min. Prélèvement : l’endormissement sous anesthésie gazeuse prend 10 minutes pour être effective. Le prélèvement sous anesthésie au masque est réalisé pendant 3 à 4 minutes. Le réveil de l’animal prend 1 à 2 minutes.

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. Il n’y a pas d’opération chirurgicale dans les protocoles. Les prélèvements seront réalisés sous anesthésie.

Devenir

Tous les animaux sont concernés. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des AcP reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Réduction : Le nombre d’animaux (3 cobayes par protocoles) pour l’obtention de réactifs intervenant dans l’obtention des protéines médicaments dans le domaine de l’immunologie, de l’hémostase et des soins intensifs. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole.

Raffinement

Raffiner : L’environnement des cobayes est enrichi pour améliorer leur bien-être (tunnel de jeu, friandises, foin, jouets,…). Les animaux seront particulièrement suivis pendant les 24h suivant les injections, puis quotidiennement pour examiner leur état de santé. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout signe d'inconfort ou de douleur et permet ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Les prélèvements réalisés, sous anesthésie, concerneront de faibles volumes afin de ne pas induire de souffrance chez l’animal. Il s'agit d'un protocole de simple vaccinations avec adjuvants.

Choix des espèces

Les cobayes présentent dans certaines situations des avantages vis-à-vis du lapin, qui est l’animal le plus communément utilisé pour l’obtention d’AcP. Etant phylogénétiquement plus éloigné de la souris que le rat, ils permettent l’obtention d’anticorps anti-protéines de souris. Plusieurs exemples ont montré l’intérêt des cobayes en comparaison d’autres espèces, notamment pour la production d’anticorps dirigé contre l’insuline porcine, où ils ont permis d’obtenir d’une meilleure réponse en comparaison des lapins. Ils permettent également l’obtention d’anticorps ayant une forte capacité à fixer le système du complément. Ils permettent en comparaison des souris de Réduire le nombre d’animaux engagés dans chaque protocole à 3 individus. La production d’anticorps chez le cobaye nécessite de faibles doses d’antigène. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les cobayes entreront en protocole à l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine d’une semaine, sans incident durant ce temps, ils seront aptes à rentrer en protocole.

15 lapins vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent plusieurs chirurgies sous anesthésie générale pour l'implantation puis le contrôle de stents utilisés chez l'humain contre les anévrismes intracrâniens, la dernière intervention n'étant pas suivie d'un réveil. Le porteur indique une anxiété, un stress et des douleurs postopératoires possibles, ainsi qu'un rare risque de paralysie de la patte. Il affirme que l'utilisation d'animaux est "indispensable" car aucune méthode in vitro ne reconstitue ces conditions.

Objectifs

Le projet consiste en l’étude chez le lapin de dispositifs implantables de neuroradiologie interventionnelle utilisés chez l’humain dans le traitement des anévrismes intracrâniens. L'objectif est de comparer quatre types de stents à diversion de flux (des dispositifs médicaux implantables utilisés dans le traitement des anévrismes intracrâniens par voie endovasculaire) sous des régimes différents d’anti-agrégation plaquettaire, et d’analyser l’endothélialisation et le risque thromboembolique de chacun des dispositifs. Une étude clinique rétrospective a suggéré que des stents à diversion de flux « actifs » pouvaient être mis en place sous simple anti-agrégation plaquettaire en phase de rupture d’un anévrisme, avec une occlusion satisfaisante de ces derniers, sans complication ischémique surajoutée. Le but de ce projet sera d'étudier l’endothélialisation des stents par des analyses radiologiques et histologiques, et nécessitera donc l'utilisation de l'animal pour être mené à bien.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra d’effectuer des analyses qui ne sont pas réalisables chez l’être humain afin évaluer la réponse biologique à l’implantation de stents à diversion de flux, ce qui n’a encore jamais été fait de façon indépendante in vivo. L’analyse de la prolifération tissulaire sur le dispositif et sa thrombogénicité, apportera des connaissances supplémentaires et une meilleure compréhension sur les principes du traitement des anévrysmes cérébraux par stents à diversion de flux, permettant d’opter pour les dispositifs les plus fiables pour l’Homme et de les développer.

Procédures

Les animaux seront soumis à un prélèvement de sang 5 jours avant l’implantation du stent, sous anesthésie locale (15 min environ). Un second prélèvement sera fait pendant la première chirurgie, sous anesthésie générale (1 h environ). Une deuxième chirurgie sous anesthésie générale sera effectuée 15 jours plus tard pour le contrôle (45 min environ). Le dernier contrôle à 1 mois demandera également une chirurgie sous anesthésie générale, pour laquelle l’animal ne sera pas réveillé à son terme (1 h environ).

Impact sur les animaux

L’anxiété et le stress sont des effets indésirables attendus avant, et après chaque procédure/prélèvement. Des douleurs peuvent également survenir en contexte post-opératoire, de même qu’une paralysie de la jambe du lapin en cas d’atteinte du nerf (très rare).

Devenir

Les animaux mis à mort à la fin de la procédure afin de prélever les pièces anatomiques à des fins d’analyse en histologie.

Remplacement

Ce projet vise à étudier la prolifération cellulaire et la thrombogénicité sur des stents à diversion de flux dans des conditions proches de ce qui est trouvé chez l'Homme. Aucune méthode alternative in vitro ou ex vivo ne permet de reconstruire un modèle proche de ces conditions. L'utilisation d'animaux dans le cadre de ce projet est indispensable.

Réduction

Une analyse intermédiaire effectuée en OCT (tomographie par cohérence optique, technique d’imagerie permettant d’obtenir des images en coupe du vaisseau) et angiographie à 15 jours après l’implantation des stents permettra d’étudier partiellement le processus d’endothélialisation du stent, et évite d’avoir recours à une analyse histologique intermédiaire qui nécessiterait un sacrifice. Par ailleurs, l’implantation de différents stents chez le même lapin permet de diminuer le nombre de lapins utilisés).

Raffinement

Les animaux seront hébergés dans le respect du bien-être animal. Les animaux seront gardés pendant une période d'acclimatation de 5 jours minimum entre leur entrée dans l’animalerie expérimentale, et leur première entrée en procédure. Leur environnement comportera un enrichissement (bûchettes à ronger...). Les animaux seront suivis quotidiennement et leur état de santé et de bien-être sera évalué tout au long du protocole expérimental. Les animaux seront anesthésiés et analgésiés pendant les procédures chirurgicales et seront suivis au cours de la procédure. Un suivi renforcé sera effectué durant les premiers jours après chaque procédure opératoire. Si un animal présente un signe de douleur ou de souffrance, des analgésiques pourront lui être administrés . Si une infection se présente, un traitement antibiotique adapté au lapin pourra être mis en place. Dans le cas où l'animal présenterait une souffrance, une maladie ou une altération physique sans qu'il soit possible de le soulager efficacement (atteinte d'un point limite), l'animal sera sorti d'expérimentation et mis à mort.

Choix des espèces

Le lapin est un animal dont l’élevage est aisé, et un modèle animal reconnu pour l’étude des anévrismes intracrâniens. La biologie de la néo-endothélialisation des stents est ainsi bien étudiée chez le lapin et similaire aux mécanismes humains. Par ailleurs, la taille des vaisseaux du lapin est similaire à celle des vaisseaux humains, où sont implantés les stents flow-diverter étudiés. Les animaux utilisés seront des adultes de plus de 3 kg pour la taille des artères et la taille des dispositifs du commerce utilisés.

218 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Diabétiques ou non, elles reçoivent des injections de peptides puis subissent des prélèvements sanguins répétés et des tests métaboliques par incision de la queue, pour évaluer la toxicité et les effets de ces molécules sur le diabète et la stéatose hépatique. Le porteur anticipe une possible perte de poids et une atteinte neurologique liées à l'action des peptides sur le cerveau. Il juge "erronée" la corrélation entre viabilité cellulaire in vitro et humain, et affirme qu'un "système animal entier" est "nécessaire".

Objectifs

La prévalence de l'obésite, du diabète de type 2 (DT2) et de la stéatose hépatique non alcoolique (NAFLD) a doublé au cours des 20 dernières années et représente dans la région Grand-Est, environ 1/4 de la population. La prise en charge de ces pathologies, appelées syndrome métabolique, est une priorité en santé publique et mérite un intérêt marqué pour la recherche clinique expérimentale. Il convient de noter le succès relativement limité des médicaments biologiques et chimiques disponibles pour traiter l'obésité pathologique et les maladies associées. Dans ce contexte, nous avons identifié des petites molécules appelées peptides dérivés de l'élastine (PDE) qui sont notamment impliquées dans le développement du diabète de type 2. Ces mêmes peptides activent une molécule présente à la surface des cellules que l'on appelle la neuraminidase-1, NEU-1. Le regroupement de deux NEU-1 (processus de dimérisation) permet l'élimination d'acides sialiques (appelée désialylation) présents sur certaines molécules. Par exemple, la désialylation du récepteur de l'insuline (RI) provoque le développement du diabète de type 2 mais également de la stéatose hépatique. Afin de réduire l'impact de la désialylation induite par NEU-1 sur le développement de ces pathologies, nous avons élaboré une stratégie innovante par l'utilisation de peptides interférents (PI). Ils ont été mis au point et testés sur différents types de cellules. En effet, ils diminuent la dimérisation de NEU-1 et le phénomène de désialylation associé. De ce fait, ces PI pourraient empêcher le développement du diabète de type 2 et de la stéatose hépatique. Il nous semble donc crucial de tester ces molécules sur un modèle animal (souris). Une première approche animale a été menée sur un modèle de souris développant des tumeurs de façon importante et spontanée. Une injection unique de ces molécules a été testée lors de cette première étude et une détection de ces dernières 7 jours après injection a été observée au sein des tumeurs. Cependant aucune donnée sur les effets indésirables de ces molécules et de leur temps d'action n'a été évoquée sur modèle animal. C'est pourquoi nous proposons une étude sur le temps d'action, la dose, la fréquence d'injection ainsi que sur la potentielle toxicité de nos molécules (procédure 1 à 3) avant toute investigation thérapeutique comme l'impact de ces molécules sur le développement du syndrome métabolique induit par l'activation de NEU-1 (procédure 4).

Bénéfices attendus

Ce projet nous permettra, à court terme et à long terme, d’obtenir des données cruciales pour la suite des expérimentations et permettra une avancée importante dans la recherche translationnelle tant en clinique humaine qu’en clinique vétérinaire. En effet, la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale et sous-optimale des peptides interférents fluorescents à injecter. Par la suite, nous connaîtrons, via la procédure 2, la fréquence d’injection optimale afin d’éviter un potentiel effet cytotoxique des peptides fluorescents injectés de façon chronique. Enfin, grâce à la procédure 3, nous pourrons vérifier si une potentielle intolérance pourrait être observée chez des animaux insulino-résistants et qui seront utiles pour la suite des expérimentations. Enfin la procédure 4 nous permettra d’évaluer les effets biologiques des peptides interférents sur l’insulino-résistance et la NASH développée par l’accumulation de PDE observées chez les sujets vieillissants ou diabétiques. Ces PDE et le CRE qui y est associé, ont été décrits comme des inducteurs de maladies cardio-vasculaires (thromboses, athérosclérose, hypertension artérielle…), métaboliques (NASH, insulino-résistance, fibrose adipeuses…), cancer (sein, mélanome, …), … Si les peptides interférents ont un réel effet sur l’insulino-résistance, alors ces peptides pourraient avoir un impact thérapeutique important sur diverses pathologies dont les traitements sont peu convaincants.

Procédures

Procédure 1 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas deux fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédures 2 et 3 : Une semaine après l’arrivée des souris au laboraroire, 100 µL de sang maximum sera prélevé au niveau de la veine caudale à l’aide d’une aiguille 27G sous anesthésie générale. Puis au moins 7 jours plus tard, 100 µL seront de nouveau prélevés. La fréquence de prélèvement ne dépassera pas une fois par semaine et le volume n'excèdera pas 100 µL de sang par prélèvement durant toute la durée du traitement. Ainsi le volume prélevé ne dépassera pas le seuil reglémentaire autorisé (20% du volume sanguin total soit environ 280 µL de sang). Procédure 4 : Etape 1 : Aucun prélèvement n’est effectué. Etape 2 : Une incision de 1 mm au niveau de la queue est réalisée afin de recueillir une goutte de sang (

Impact sur les animaux

Nos données préliminaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) sur cellules, n’ont pas montré de modifications sur la prolifération, la viabilité ou la sénescence cellulaire. De ce fait, l’injection de doses raisonnables de peptides interférents (ne dépassant pas 1 mg/kg) ne devrait pas induire d’effets indésirables. Cependant, dans notre cas, il serait possible que ces injections induisent une perte de poids par manque d’appétit. En effet, NEU-1 a été décrit dans le système nerveux central (hippocampe) mais pourrait aussi être exprimé dans d’autres régions comme l’hypothalamus renfermant notamment le centre de la faim. La présence de NEU-1 dans le système nerveux central et l’inhibition de son activité par les peptides interférents pourraient entraîner une atteinte neurologique associée à une modification du comportement.

Devenir

Les animaux de chaque procédure (procédures 1 à 4) seront mis à mort afin de réaliser des études de biodistribution de la fluorescence et de cytotoxicité organe par organe (procédures 1 à 3), ou des études biochimiques/histologiques (procédures 1 à 4).

Remplacement

Le recours aux modèles in vitro a été réalisé en amont de la demande d’autorisation de projet. En effet, des résultats in vitro ont été obtenus concernant l’étude de la viabilité cellulaire de différentes lignées cellulaires (COS-7, SKBR-3, MCF-7, HepG2) après incubation avec le peptide transmembranaire interférent ou le véhicule seul (micelles de Lithium Dodécyl Sulfate ou LDS qui est un détergent utilisé en biologie). Bien que nous n’ayons observé aucune cytotoxicité de ces peptides et des micelles à 1 µM et 0,1 µM après différents temps d’incubation (10), la corrélation de cette étude de viabilité sur des modèles cellulaires isolés avec l’Homme est erronée d’un point de vue scientifique. Il est donc nécessaire d’étudier la posologie et la potentielle cytotoxicité de ces peptides dans un système animal entier afin d’obtenir des informations clés pour la suite des expérimentations (procédure 1 à 3). En ce qui concerne la procédure 4, à notre connaissance, aucun modèle in silico et in vitro ne peut remplacer un modèle in vivo pour cette application et cette thématique (développement d’un syndrome métabolique, à savoir, l’insulino-résistance et la NASH).

Réduction

Les procédures 1 à 3 ont été réalisées afin de se limiter aux expérimentations jugées absolument indispensables pour la procédure 4. Une réflexion biostastistique (G-Power) a été intégrée à la création de ce projet afin d’éviter qu’une réduction trop drastique ne nuise à la fiabilité des résultats du projet. Ainsi la procédure 1 nous permettra de déterminer la dose optimale à injecter tandis que les procédures 2 et 3 nous permettront de déterminer la fréquence d’injection afin d’atteindre les objectifs fixés dans la procédure 4, tout en garantissant le bien-être animal. L’avantage d'avoir mis au point ces procédures liées est qu'il sera possible et nécessaire d’arrêter le projet si les conditions fixées ne sont pas respectées pour l’ensemble ou l’un des deux sexes, réduisant ainsi le nombre d’animaux. De plus, pour les procédures 1 et 2, nous avons envisagé une prise de sang avant l’injection de peptides interférents afin que chaque individu soit son propre contrôle. En effet, une semaine avant le début des injections, un prélèvement de sang de 100 µL sera effectué pour chaque individu. Ceci permet de réduire le nombre d’individus nécessaire en éliminant un groupe contrôle ne subissant aucune injection. Pour les études de tomographie, un suivi dans le temps est réalisé par individu permettant d’éviter les sacrifices d’animaux aux temps intermédiaires de mesures (1h, 6h, 24h, 3 jours). Pour la procédure 4, comme les informations nécessaires à sa réalisation seront connues (posologie et biodistribution des peptides interférents), le nombre d’animaux sera le nombre minimum nécessaire. De plus, les étapes expérimentales dans cette procédure 4 impliquent de nombreuses méthodologies non invasives, permettant là encore une réduction du nombre d’animaux. Enfin des analyses statistiques seront réalisées à l’aide d’un test Mann-Whitney (test non paramétrique) ou de test de rang de type Wilcoxon qui sont adaptés pour l’étude sur un faible nombre d’individus.

Raffinement

Une période de stabulation sera réalisée à l’arrivée des souris, leur permettant de s’acclimater à leur nouvel environnement. La température et l'hygrométrie du local sont relevés quotidiennement. La nourriture et l’eau seront vérifiées tous les jours et disponibles ad libitum. Les cycles jour/nuit de 12h seront respectés. La litière sera changée deux fois par semaine, voire trois fois en cas de diurèse excessive des souris diabétiques. Les cages aux dimensions réglementaires (30x40cm) présenteront un enrichissement adapté et plusieurs animaux du même sexe y seront hébergées. Lors des phases d’expérimentation, les animaux seront isolés (une souris / boîte) afin de limiter la transmission du stress inter-individu. La manipulation se fera en dehors du champ de vision des animaux en attente d’expérimentation. Pour le bien-être de l’animal, les souris seront anesthésiées (isoflurane 4% pour l’induction et 1,5% pour le maintien) lors de certaines méthodologies (échographie/ tomographie) ou habituées au moins une semaine à l’avance à la contention. Cela devrait réduire le stress au minimum. Une vigilance d’autant plus accrue sera déployée à la suite des injections de peptides fluorescents ou de véhicule seul. En effet, un suivi régulier des animaux (au moins deux fois par jour) sera effectué notamment en déterminant, à l’aide d’une grille de score préalablement définie, le bien-être animal (voir document associé). Toute modification du comportement de l’animal (prostration, anxiété, isolement, troubles de l’équilibre), d’une variation significative du poids (environ 20% de perte ou de gain de la masse corporelle) ou d’une hyperglycémie (supérieur à 600 mg/dl de glucose) seront des points limites clés afin de juger de la nécessité ou non de mise à mort de l’animal. Au cours de l’expérimentation et notamment juste avant les phases de tomographies, de prélèvements de sang, des anesthésiques généraux ou locaux seront administrés. De plus, les ponctions de sang seront réalisées sous anesthésie générale à la suite de la mesure au FMT afin de réduire le temps de manipulation, le stress et la souffrance des souris. Une grille de score définie (voir en annexe) nous permettra de définir l’état dans lequel se trouvent les individus. Des tests neurocomportementaux (Labyrinthe à 8 branches, Labyrinthe en Croix Surélevé, Open Field) pourront être envisagés pour s'assurer qu'il n'y ait pas d'atteintes neurologiques suite aux traitements.

Choix des espèces

Les maladies métaboliques touchent principalement les adultes. Ainsi, afin de se placer dans les conditions les plus représentatives de ce que l'on peut retrouver chez l'Homme, les souris seront âgées de 8 semaines lors de la réception.

819 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit une cryolésion, une brûlure par le froid de degré 4 détruisant le muscle, réalisée sous anesthésie et provoquant une boiterie transitoire, pour étudier le rôle d'une chimiokine dans la réparation musculaire. Le porteur soutient, références à l'appui, que la destruction des terminaisons nerveuses rend la zone insensible, et prévoit un antalgique péri-opératoire. Il affirme qu'aucun système de culture ne pourrait reproduire la complexité des interactions cellulaires impliquées.

Objectifs

L’objectif du projet est de détailler le rôle des isoformes de CXCL12 dans la stabilité de la microvasculature musculaire à l’homéostasie et dans la réparation musculaire après lésion. La microvasculature à l’homéostasie et les étapes de réparation tissulaire seront étudiées dans des souris de phénotype sauvage, dans des souris dont CXCL12 est dépourvu de tous ses sites de fixation à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gatm) et dans des souris n’exprimant pas CXCL12γ qui est l’isoforme ayant de loin la plus forte affinité à la matrice extracellulaire (souris CXCL12gamma). Nous avons des souris portant également la mutation Flk1-GFP qui permet de visualiser directement les vaisseaux sanguins en microscopie confocale. Les lésions musculaires seront créées en suivant le protocole de cryolésion décrit dans le projet dont celui-ci prend la suite. A différents temps post-lésions, les muscles seront prélevés après mise à mort des animaux et étudiés par des méthodes standard d’histologie impliquant des colorations de coupes et des immunomarquages des populations cellulaires impliquées. Ces analyses seront complétées par des quantification d’expression, par qPCR, des isoformes de CXCL12.

Bénéfices attendus

Ces expériences devraient permettre de comprendre de façon plus fine l’implication de CXCL12 dans les processus de réparation musculaire et devraient à plus long terme ouvrir à une meilleure compréhension des mécanismes de régulation de cette chimiokine multifonctionnelle, exprimée dans de nombreux organes et tissus depuis les premières étapes du développement et tout au long de la vie. La très grande similarité entre CXCL12 de souris et CXCL12 humaine (CXCL12 est extrêmement conservée dans l’évolution) est évidemment un atout important dans une perspective translationnelle. Des interventions thérapeutiques ciblées sur un isoforme, dans le cas de processus pathologiques impliquant CXCL12, pourraient permettre de moduler l’action de cette cytokine qu’il est difficile de cibler dans sa totalité du fait de son caractère essentiel.

Procédures

Cryolésion une fois dans leur vie (une intervention réalisée sous anesthésie). L’intervention dure quelques minutes.

Impact sur les animaux

Les mutations sur CXCL12 ou sur flk1 n’entraînent aucun phénotype particulier, en particulier aucune altération visible du comportement ou de la fertilité. Chez l’humain les brûlures par le froid (gelures) de degré 3 (atteinte de toute l’épaisseur du derme) et 4 (destruction musculaire) détruisent les terminaisons nerveuses et s’accompagnent d’une perte de sensibilité. Cf les deux sites web ci-dessous : https://www.mayoclinic.org/diseases-conditions/frostbite/symptoms-causes/syc-20372656 (“Deep (severe) frostbite … [that] affects all layers of the skin as well as the tissues that lie below [makes] the skin turns white or blue-gray and you lose all sensation of cold, pain or discomfort in the area.”) http://www.brulures.be/index.php/degres-de-gravite/fr/ (« les atteintes du 3e degré sont indolores du fait de la destruction des terminaisons nerveuses ») La brûlure que nous appliquons aux souris est de degré 4 et donc après cryolésion les terminaisons nerveuses du tissu sont détruites. Nous pouvons en déduire que, par les mêmes mécanismes que chez l’Homme, il y a une perte de sensibilité au niveau de la cryolésion. Les souris seront protégées de la douleur de l’incision cutanée par une anesthésie générale à l’isoflurane, complétée d’un traitement antalgique péri-opératoire. Il est possible que des douleurs apparaissent à la ré-innervation ou du fait de la réaction inflammatoire. Le risque d’infection secondaire qui accompagne les brûlures graves chez l’Homme est ici très faible parce que la brûlure sera protégée par la peau qui, elle, sera intacte (quoique suturée). Du côté lésé, les souris auront une perte transitoire de la fonction musculaire engendrant une boiterie, qui n’empêchera pas les animaux d’accéder à la nourriture dans la grille.

Devenir

Tous les animaux inclus dans le projet seront euthanasiés.

Remplacement

Nous nous intéressons à la régulation complexe par CXCL12 et ses isoformes d’interactions entre des populations cellulaires différentes (résidentes du tissu et recrutées à partir du sang) permettant la régénération d’un tissu lésé. CXCL12 lui-même peut avoir différentes cibles cellulaires. Aucun système de culture ne pourrait reproduire fidèlement la complexité de l’environnement cellulaire impliqué.

Réduction

Le nombre de souris a été déterminé en comptant 7 animaux par groupe, et en multipliant par le nombre de points d’observation prévus. Le nombre de souris pour chaque groupe a été déterminé sur la base de précédentes expériences. Un effectif de 7 animaux par groupe a été retenu pour permettre de détecter les différences de moyenne attendues entre les deux lignées mutantes, avec une puissance statistique suffisante. Chaque animal fournit un muscle lésé et son contrôle controlatéral, non lésé, et un groupe contrôle présentant le phénotype sauvage est également inclus.

Raffinement

La cryolésion sera réalisée dans le cadre d’une anesthésie gazeuse et d’un traitement antalgique complémentaire. Les animaux seront sur plaque chauffante le temps de l’intervention et des chaufferettes seront utilisées jusqu’au réveil complet. De l’aliment appétent facilement absorbable sera rajouté dans les cages qui seront également enrichies d’un igloo. Les souris seront surveillées quotidiennement par le responsable du protocole à la recherche de signes de complications locales, de douleur ou d’altération de l’état général. Si certains de ces signes apparaissent, des actions adaptées seront mises en oeuvre.

Choix des espèces

Nous travaillons chez la souris car il s’agit d’un petit Mammifère, étudié par de nombreuses unités de recherche (important pour les confrontations avec les résultats antérieurs), pour lequel de nombreux outils existent (anticorps, biologie moléculaire, etc…), génétiquement manipulable, aux temps de génération courts et aux portées nombreuses, permettant d’obtenir rapidement le nombre d’animaux nécessaire pour nos expérimentations. De plus, le CXCL12 murin est homologue à 99% au CXCL12 humain. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes âgés de 6 et 10 semaines. Le choix de cette tranche d’âge résulte des éléments suivants : 1) L’importance de garder les mêmes conditions expérimentales que celles qui ont été utilisées dans une étude antérieure dont celle-ci prendra la suite ; 2) Pour ces deux études, le but est d’étudier des processus de réparation tissulaire et vasculaire à l’âge adulte, sans interférence avec la croissance et la maturation du système immunitaire des premières semaines de vie, ni avec les processus de vieillissement qui surviennent au-delà de quelques mois.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit sous anesthésie une irradiation localisée à forte dose au colorectum, à l'abdomen ou au thorax, jusqu'à 27 Gy, puis est maintenu sept jours avant euthanasie. Le porteur indique que l'irradiation entraîne des douleurs et une perte de poids, la mise à mort survenant si l'animal perd plus de 20 % de son poids. Cette phase vise à mettre au point l'isolement des cellules endothéliales et le choix du modèle d'irradiation.

Objectifs

Le projet que nous présentons ici s’inscrit dans le cadre de ce projet de développement des outils de prédiction des lésions tissulaires radio-induites, basé sur la réponse moléculaire des cellules endothéliales à l’irradiation in vitro en raison de leur rôle dans l’initiation et le développement des toxicités liées aux fortes doses d’irradiation localisée (Annexe 2). Pour évaluer les effets des nouvelles modalités d’irradiation en radiothérapie, notre programme de recherche s’appuie sur les mesures d’un ensemble de paramètres biologiques dans les cellules endothéliales cultivées in vitro comme l’expression de gènes, la sénescence ou le cycle cellulaire, pour comparer des rayonnements ionisants de différentes qualités. Des premières séries expérimentales sur des souris ont permis de confirmer ces différences de réponse pour des débits de dose différents in vivo (12). Pour rendre notre modèle plus robuste, nous souhaitons maintenant collecter et utiliser des données provenant de cellules endothéliales irradiées in vivo. La phase 1 des expériences in vivo est proposée dans ce protocole : il s’agira de mettre au point l’isolement des cellules endothéliales d’organes de souris contrôles et irradiées, condition nécessaire à l’étude de l’expression des gènes et des protéines de ces cellules, afin de comparer les rendements et qualités (notamment la viabilité) des cellules obtenues à partir de trois organes d’intérêt : colorectum, intestin et poumon. En effet, il se peut que certains organes soient mieux adaptés à l’obtention de quantités et de viabilités des cellules suffisantes pour la suite des expériences (cytométrie en flux et séquençage de l’ARN sur cellules uniques). Ce protocole permettra de faire le choix de l’organe pour la suite du projet. Dans la phase 2 du projet, il s’agira d’irradier l’organe choisi lors de la première étape à différentes énergies et différents débits de doses. Cette phase du projet sera proposée dans une future DAP. L’objectif du projet présenté ici (cf. Annexe 3) sera de réaliser des expériences pour choisir, parmi les modèles d’irradiation localisée au niveau du, de l’abdomen (intestin) ou du thorax (poumon), le modèle qui permettra de collecter le plus grand nombre de cellules endothéliales et dans le meilleur état possible (proportion de cellules vivantes supérieur à 80%).

Bénéfices attendus

L’objectif global de notre projet est l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales issues d’organes irradiés in vivo chez la souris. Le projet a pour but de contribuer à une meilleure prédiction des risques de séquelles à long terme liées aux traitements par la radiothérapie. Le bénéfice scientifique attendu de ce projet est la validation et le renforcement de notre modèle d’évaluation des risques de séquelles utilisant des cellules en culture (in vitro) en établissant des liens entre les jeux de données obtenus in vitro et ceux obtenus chez la souris par des analyses mathématiques et bio-informatiques. Une fois établi, notre modèle pourra permettre d’évaluer in vitro les risques sans recourir à l’expérimentation animale. Pour ce qui concerne le projet présenté ici, le bénéfice scientifique attendu est de pouvoir choisir l’organe optimal pour ces études. A plus long terme, le bénéfice attendu de ce projet sera principalement pour l’être humain : par l’établissement d’un modèle de prédiction in vitro du risque de séquelles lié aux nouvelles pratiques de la radiothérapie, nous comptons contribuer à l’amélioration de la qualité de vie des patients après traitement anti-cancéreux, un objectif inscrit dans la stratégie décennale de lutte contre les cancers 2021-2030.

Procédures

Les animaux seront anesthésiés, irradiés localement sous anesthésie, maintenus 7 jours en cage d’hébergement dans les conditions classiques de l’animalerie, puis euthanasiés avant le prélèvement des différents organes (colorectum, intestin ou poumon – les animaux étant irradiés à 2.5 Gy/min, les durées d’irradiation des doses 17, 18 et 27 Gy seront respectivement de 6.8 min, 7.2 min et 13.5 min). Aucune autre manipulation ne sera réalisée.

Impact sur les animaux

Les effets indésirables prévus seront occasionnés par l’exposition aux rayonnements ionisants. Les 3 modèles d’irradiation localisée que nous utiliserons sont bien caractérisés dans notre laboratoire : irradiation au niveau du colorectum, irradiation au niveau de l’abdomen, irradiation du thorax. Le recul acquis par le laboratoire sur ces modèles n’a pas montré de dommage clinique nécessitant l’euthanasie anticipée des animaux. Pour les 3 modèles, l’irradiation entraîne des douleurs et une perte de poids. En revanche, le temps final de l’étude étant assez court (7 jours après l’irradiation), ces protocoles n’entrainent pas la mort des animaux.

Devenir

Euthanasie pour prélèvements sous anesthésie terminale

Remplacement

Il n’existe pas d’alternative non animale à ce jour concernant l’étude de la réponse moléculaire des cellules endothéliales dans leur environnement tissulaire. L’utilisation d’animaux vivants est indispensable à cette étude.

Réduction

Cette étude est une mise au point. Pour les souris contrôles (non irradiées), nous prélèverons 3 organes différents sur le même animal (colorectum, intestin et poumon), ce qui limitera le nombre d’animaux. Dans l’étape 1, il s’agira de comparer les rendements en cellules endothéliales sur ces 3 organes, en condition non irradiée. Dans l’étape 2, le protocole de purification des cellules irradiées sera appliqué à des souris irradiées, en comparaison à des souris non irradiées.

Raffinement

Tous les animaux du projet seront surveillés quotidiennement avec une mesure de poids afin de vérifier que la perte de poids ne dépasse pas 20 % du poids du groupe témoin. Des observations de signes comportementaux et cliniques (absence de mobilité, prostration, diarrhée/constipation, signes de détresse respiratoire) seront effectuées. L’observation des signes comportementaux ou cliniques anormaux pendant plus de 3 jours entraînera une euthanasie anticipée. La connaissance du laboratoire dans les 3 modèles nous indique que les premiers signes apparaissent à J8-J10 post-irradiation, or les animaux seront euthanasiés à J7. Il n’est donc pas attendu de signes cliniques majeurs dans ce projet.

Choix des espèces

Nous avons choisi d’utiliser des souris âgées de 10 à 12 semaines. Ceci correspondant au stade adulte, ce qui permet d’éviter l’hétérogénéité éventuelle liée à l’âge (il s’agit également de la gamme d’âge classiquement utilisée pour ces modèles d’irradiation localisée). La souris est un modèle bien caractérisé et qui est le plus utilisé dans les études précliniques. De plus, c’est un modèle très utilisé au sein du laboratoire dans des protocoles d’irradiation colorectale, intestinale et thoracique pour comprendre le rôle de l’endothélium vasculaire dans les lésions radio-induites. Nous possédons donc un recul important sur les conséquences de l’irradiation pour chacun de ces trois modèles.