Système cardiaque

La quantité d'anticorps commandée par le client détermine le nombre de lapins engagés dans chaque expérimentation, à raison de deux lapins par immunogène. 1 050 lapins vont être utilisés sur la durée du projet, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour développer environ 500 anticorps destinés à la recherche. Chaque animal peut subir jusqu'à vingt-cinq injections intraveineuses, quinze injections intramusculaires, huit injections sous-cutanées, trois injections intradermiques d'une vingtaine de points chacune et dix prélèvements sanguins. Le porteur reconnaît l'existence de méthodes sans animaux comme le phage display, affirme qu'elles "n'apportent pas la même qualité d'anticorps", et indique tuer les lapins en fin de projet pour obtenir "le maximum de sérum".

Objectifs

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Les anticorps seront utilisés principalement dans la recherche académique. Environ 500 nouveaux anti-corps seront développés.

Bénéfices attendus

Le but de chaque expérimentation est le développement et la production d’anticorps polyclonaux et/ou monoclonaux. Nous développons depuis plusieurs dizaines d’années des anticorps pour la recherche. Les résultats obtenu grâces aux anticorps générés par notre entreprise ont participé à l’avancée des connaissances scientifiques à travers plusieurs centaines de publications de nos partenaires. Ce projet s’inscrit dans cette continuité pour poursuivre la génération d’outils biologiques pour la recherche et le développement.

Procédures

- Prélèvements sanguins sur animaux vigiles, environ 5 min, maximum 10 prélèvements. - Injection intraveineuse sur animaux vigile, environ 1 min, maximum 25 injections. - Injection en intradermique (une vingtaine de points environs par inejction), environ 3 minutes, maximum 3 injections. - Injection en sous cutané, environ 1 minutes, maximum 8 injections. - Injection en intramusculaire, environ 1 minutes, maximum 15 injections. - Injection en intraveineuse dans la veine marginale, environ 1 min, maximum 25 injections. -

Impact sur les animaux

La contention lors des prélèvements et des injections peut causer un léger stress. Une inflammation au niveau des sites d’injections peut être observée. Il peut y avoir une légère douleur à l’injection. De par notre expérience Nous ne nous attendons pas à d’autres nuisances, mais nous resterons vigilants à tous effets imprévus

Devenir

Les animaux seront mis à mort en fin de projet afin d’obtenir le maximum de sérum et de pouvoir prélever des organes.

Remplacement

Le remplacement du modèle in-vivo ne peut être envisagé car la réponse immunitaire est un phénomène complexe impliquant la coopération entre de multiples types cellulaires, pour lequel il n’existe pas d’équivalent in-vitro. Bien que des méthodes alternatives émergent (type phage display), ces approchent n’apportent pas la même qualité d’anticorps. La qualité de la banque naïve utilisée et la méthode de screening de cette banque de phages display ne permet pas d’obtenir de anticorps d’affinité suffisante. Pour palier partiellement à ce défaut, cela nécessite d’utiliser des banques dites « immunes » qui nécessitent d’immuniser le lapin et n’apporte aucun bénéfice en termes de remplacement. De plus ces technologies de développement d’anticorps monoclonaux chez le lapin ou la souris, ne sont pas encore complètement matures. Ils nécessitent un matériel particulier et des réactifs adaptés. Les chances de succès sont limitées comme le démonter le nombre d’anticorps en clinque issue de phage display qui reste marginal. Enfin l’obtention d’anticorps polyclonaux ne peux pas être remplacée par un mélange d’anticorps monoclonaux. Cette approche des anticorps multi clonaux ne permets pas non plus d’obtenir la même efficacité.

Réduction

Le nombre de lapins utilisé pour chaque expérimentation est réduit au minimum, mais est déterminé par la quantité d’anticorps attendue par le client. Nous obtenons environ 50 à 60ml de sérum au minimum par lapin, la majorité des projets nécessite plus 100ml. En effet, l’immuno purification par chromatographie d’affinité de ces sérums requiert un volume suffisamment pour obtenir quelques milligrammes d’anticorps c’est pourquoi nous utiliserons 2 lapins par immunogènes.

Raffinement

Les animaux ont un enrichissement dans les cages sous forme de tablette et de palet dans les cages. Les animaux sont habitués au personnel pour réduire le stress. De plus les animaux sont manipulés et caressés régulièrement (2 fois par semaines). Le personnel est formé et sensibilisé à une manipulation douce des lapins pour limiter le stress au maximum. Si l’animal présente une souffrance qui ne diminue pas avec l’arrêt des injections et les soins apportés, et que les points limites sont atteints alors, l’animal sera mis à mort pour éviter des souffrances.

Choix des espèces

Le lapin est l’animal de laboratoire bien adapté au développement d’anticorps pour la recherche. Il montre en effet une très bonne réponse immunitaire humorale. Par ailleurs il permet de récolter une quantité de sérum conséquente suffisante pour les applications en recherche. Nous utilisons des jeunes adultes (lapins âgés de 12 semaines minimum) car c’est chez les jeunes adultes que la réponse immunitaire est la meilleure et par là même la génération d’anticorps.

Modifiées pour suractiver leur système lymphatique, 430 souris femelles vont être utilisées à partir de cinq semaines, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales sous la peau, puis des injections intrapéritonéales tous les deux jours pendant trois semaines, avant d'être transportées vers un second établissement où leur est infligée une perfusion intracardiaque sans réveil. Le porteur résume les atteintes en une phrase, des douleurs modérées et un léger stress liés au développement de la tumeur. La mise à mort sert à récolter les tissus, et le résumé revendique l'expérimentation animale comme "l'unique approche" pour comprendre ces processus.

Objectifs

Le système vasculaire lymphatique a pour but de drainer les graisses, les liquides interstitiels, les macromolécules et les cellules immunitaires afin de maintenir l'homéostasie tissulaire. En condition pathologique, il joue un rôle primordial dans le cancer. En effet, le système lymphatique est le premier site de dissémination métastatique des tumeurs solides, notamment au niveau des ganglions lymphatiques. La lymphangiogenèse, croissance de nouveaux vaisseaux lymphatiques à partir de vaisseaux préexistants, se développe à la fois sur le pourtour des tumeurs et dans le ganglion sentinelle afin de préparer la « niche métastatique ». Bien que ce processus ait été clairement démontré au cours des 20 dernières années, les mécanismes moléculaires restent encore à élucider. Dans ce projet, nous postulons que la croissance du système vasculaire lymphatique péritumoral est stimulée à la fois par la tumeur primaire, mais également par son microenvironement (tissu adipeux). Nous postulons qu’en ciblant le microenvironement tumoral, nous allons pouvoir réduire la lymphangiogenèse et inhibiter la formation de métastases. Afin d’identifier des cibles thérapeutiques anti-lymphangiogéniques, nous allons utiliser trois modèles murins de tumeurs solides ainsi qu’un modèle spontané de carcinome mammaire. D’autre part, des études récentes ont démontré que le système lymphatique participait activement à l’échappement des tumeurs face au système immunitaire en exprimant des récepteurs des points de contrôle immunitaires. Nous allons dans un deuxième temps évaluer les inhibiteurs des points de contrôle dans ces modèles.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre le rôle du système lymphatique dans la progression cancéreuse. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Nous espérons pouvoir identifier quels sont les points de contrôle immunitaires exprimés par le système lymphatique afin de proposer des agents anti-lymphangiogéniques en combinaison avec ces molécules.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, 2 interventions : injection de cellules tumorales en sous-cutané (une seule fois) suivi d'injections intraperitonéales tous les 2 jours pendant 3 semaines. Dans le second établissement utilisateur, 1 intervention : perfusion intracardiaque sans réveil.

Impact sur les animaux

Le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Le système lymphatique joue un rôle primordial dans les communications inter-organes et dans l’homéostasie tissulaire. Les effets pléiotropiques de ce système font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l'expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe est calculé à l'aide d'un logiciel dédié (G power). Le logiciel utilise un modèle mathématique pour déterminer le nombre d'animaux minimum pour avoir des résultats stastitiquement significatifs à l'aide d'un test two way ANOVA afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement. Nous nous tiendrons au nombre d'animaux par groupes indiqués par le logiciel. Ainsi, il est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car la suractivation du système lymphatique par expression du transgène Ap2-VEGFC a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des modèles de carcinomes murins (PyMT, LLC, B16). Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 26 semaines.

Pour savoir si le blocage d'une protéine des vaisseaux réduit l'atteinte cardiaque qui suit une atteinte rénale, 279 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. On leur bouche l'artère rénale puis on rétablit la circulation, une opération de 45 minutes qui doit leur faire perdre environ 10 % de leur poids en deux jours. Suivent six injections intraveineuses, une échographie cardiaque par semaine pendant quatre semaines sous anesthésie, des prélèvements de sang et d'urine à sept dates, des passages en cage métabolique et un transport de douze heures entre deux établissements. Le porteur intègre au calcul d'effectif une mortalité de 3 % imputable à la chirurgie et prévoit de retirer de l'étude et de tuer tout animal dont les complications ne peuvent être traitées.

Objectifs

Nous étudions la survenue et l’évolution d'une atteinte cardiaque aiguë en conséquence d'une atteinte rénale aiguë initiale. Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d’une première protéine nommée P1 dans cette atteinte cardiaque aigüe ; en effet, lorsque P1 est augmentée dans l’organisme, il y a augmentation de l’inflammation et de la fibrose dans le myocarde. Néanmoins, lorsque P1 est génétiquement ou pharmacologiquement diminué, l’inflammation et la fibrose sont également moindres. Nos travaux ont également montré que cette protéine P1 interagissait avec une deuxième protéine (P2) et que cette interaction favorisait la sécrétion de cytokines (protéines inflammatoires). Il semblerait donc que cette protéine P2 ait également un rôle important dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Notre projet a donc pour but d’étudier l’inhibition de cette protéine P2 afin de voir si nous réduisons l’inflammation et la fibrose cardiaque suite à une atteinte rénale aigüe. Cette protéine P2 est retrouvée dans la membrane des cellules des vaisseaux sanguins mais elle peut également se détacher de la membrane et se présenter sous forme soluble pour se retrouver dans la circulation sanguine. Nous essaierons donc, dans une première procédure, de bloquer génétiquement l’expression de P2 grâce à une molécule T qui se fixe directement dans les cellules des vaisseaux sanguins, et dans une seconde procédure de bloquer la forme soluble de P2 grâce à un anticorps. Ensuite nous procéderons à une atteinte rénale aigue sur les souris et nous observerons l’apparition et l’évolution de la dysfonction cardiaque. Si notre hypothèse s’avère exacte, la protéine P2 deviendrait alors une potentielle cible thérapeutique dans cette pathologie cardio rénale. Ces travaux de recherche se dérouleront dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer l'intérêt de la protéine P2 dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Si nos hypothèses s'avèrent exactes, nous pourrions considérer cette molécule comme une cible thérapeutique potentielle pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'injections : - Injections intraveineuses pour l'anticorps (2 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 6 injections au total ; une injection dure 1min), elles seront effectuées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique avant les chirurgies d'ischémie-reperfusion rénale ou contrôles (durée de la chirurgie : environ 45min pour les ischémies et 15 min pour les contrôles), avant chaque échocardiographie prévues toutes les semaines durant 4 semaines (une échocardiographie dure environ 15min par souris) ainsi qu'avant chaque prélèvement sanguin (un prélèvement dure 1min), ces interventions seront menées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales de la molécule de délétion génétique durant 3 jours à raison d'une injection par jour, elles seront effectuées au sein de l'EU2. Les animaux subiront également des prélèvements : -biopsies d'environ 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1, une biopsie dure 30 secondes. Ces prélèvements seront réalisés dans l'EU2. - sanguins à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 72h et 28j postchirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. - urinaires à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 48h, 72h et 28j post-chirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. Pour les prélèvements urinaires, les souris ne resteront pas plus de 2h dans les cages métaboliques. Après chacun des prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera injectée à chacune des souris pour les aider à récuperer. Tous ces prélèvements se dérouleront dans l'EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des biopsies de 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1. La douleur sera légère mais de courte durée. Les animaux subiront une ischémie reperfusion rénale qui pourrait engendrer une douleur. Une perte de poids d’environ 10% est attendue dans les 2 jours suite à cette intervention. De plus, ils subiront différents types d'injections : injections intraveineuses pour l'anticorps, intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique. Bien que ces injections ne soient pas douloureuses, elles pourraient tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de leur répétition. Le transport de l’établissement 1 vers l’établissement 2 pourrait également être une source de stress. Les souris subiront également des prélèvements sanguins et urinaires à différents temps, ce qui pourrait engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions un syndrome qui implique 2 organes différents, à savoir le coeur et le rein, ainsi que les interactions biochimiques et biologiques qu'il existe entre eux. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle cellulaire, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier ce syndrome.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire est calculé au vu des différences obtenues lors de nos précédents travaux afin d'obtenir une différence de 20% entre les groupes contrôle et ischémie, soit 10 souris par groupe sachant que la mortalité imputable à la chirurgie est estimée à 3%. Le calcul a été obtenu en utilisant un logiciel de puissance statistique, prenant en compte les différences observées, la puissance de comparaison et la mortalité imputable au modèle.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux en provenance de l’établissement secondaire. Le transfert sera effectué par un transporteur agréé et durera 12h. Un relevé de température de l’environnement sera fourni pour vérifier les bonnes conditions de transport. Les animaux déjà blessés, stressés ou malades au sein de l’établissement secondaire ne seront pas transférés. Une administration d’analgésique en sous-cutanée, en prémédication (45min avant l'opération) puis une anesthésie en intra-péritonéale seront effectuées pour toutes les opérations chirurgicales. Du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des animaux avant la chirurgie pour éviter l'asséchement de leurs yeux. La prise en charge de la douleur post-opératoire durera tout l'après-midi (les opérations étant effectuées le matin) et une injection d'analgésie en sous-cutanée sera effectuée 6h après la fin de l’intervention. Une surveillance accrue (6h post chirurgie) sera réalisée après la chirurgie pour vérifier la bonne cicatrisation des animaux. Si toutefois des douleurs apparaissaient, une deuxième dose d’analgésique serait administrée avec ajout de nourriture gélifiée dans la cage. Nous utiliserons une anesthésie locale pour les prélèvements sanguins rétro-orbitaires et les injections intraveineuses. En cas de complications impossibles à traiter, l’animal serait retiré de l’étude et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, son potentiel génétique permet d'analyser l'effet d'une absence/surexpression d'un gène cible. Nous disposons de tous les outils permettant une exploration physiopathologique complète. Par ailleurs, les souris utilisées pour nos procédures expérimentales auront un fond génétique très utilisé dans la littérature pour étudier la pathologie qui nous intéresse. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 mois pour caractériser au mieux le syndrome cardio-rénal tel qu'il existe chez l'Homme adulte. De plus, ce stade permet aux animaux une récupération optimale après les chirurgies d'ischémie reperfusion rénale.

Après cinq jours d'injections quotidiennes, 530 souris, en grande majorité des femelles de 5 semaines, sont anesthésiées pour une échographie, une chirurgie de 15 minutes et/ou une injection de cellules tumorales, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le produit injecté pendant ces cinq jours n'est pas nommé, et la chirurgie liée au lymphœdème n'est pas décrite. Pour certaines, la dernière étape se déroule dans un second établissement : sous anesthésie générale, un produit injecté dans le derme de la patte atteinte de lymphœdème et de l'autre patte rend leurs vaisseaux lymphatiques visibles au microscope à fluorescence, puis elles sont tuées sans réveil. Le porteur invoque aussi la gestation, qui "ne peut être observée que sur animal vivant", sans qu'aucune procédure n'en fasse mention. Toutes les souris sont tuées à la fin de chaque procédure pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans le premier établissements utilisateur : dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). Dans le second établissement utilisateur : les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions.

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets pléiotropies des oestrogènes, synthétisées majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car c’est le seul modèle pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de métastases ou l'apparition du lymphoedème secondaire après curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation génique du récepteur aux oestrogènes ERα a été généré seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant à une invalidation du ERα de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Une partie des 530 souris de ce projet est génétiquement modifiée pour ne plus exprimer le récepteur alpha aux œstrogènes dans les cellules qui tapissent leurs vaisseaux lymphatiques. Ces souris, en grande majorité des femelles qui entrent en procédure à 5 semaines, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré : cinq jours d'injections quotidiennes, puis, sous anesthésie, une échographie, une chirurgie de 15 minutes et/ou une injection de cellules tumorales. Certaines sont ensuite transportées dans un second établissement pour une lymphographie sous anesthésie générale, avec une injection dans la patte atteinte de lymphœdème et dans la patte non opérée, avant d'être tuées sans réveil. Les autres sont tuées à la fin de leur procédure pour prélever leurs tissus. Le porteur prévoit des douleurs modérées liées aux chirurgies et aux tumeurs, et écrit dans le même passage que la chirurgie du lymphœdème "ne génère pas d'effet indésirable majeur".

Objectifs

Le système lymphatique permet le maintien de l’homéostasie tissulaire, il assure la balance des fluides, la circulation des cellules immunes et permet le drainage des lipides intestinaux. Lors de la formation d’une tumeur solide, il représente la première voie de dissémination métastatique vers les ganglions. Egalement, une dysfonction de ce système abouti à la formation de lymphoedème, une accumulation massive de de fluide et tissu adipeux dans un membre (éléphantiasis). Les lymphoèdèmes peuvent être primaires (maladie rare) et se développent soit à la naissance (hommes et femmes), soit à la puberté ou pendant la grossesse (femmes uniquement dans ces deux cas) suggérant un effet des hormones féminines sur sa fonction. Les lymphoedèmes peuvent être également secondaires suite à un curage ganglionnaire lors du traitement du cancer (mélanome, sein, cancers gynécologiques). Ce projet vise à caractériser le rôle des hormones féminines dans la physiopathologie du système lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les différences de genre observées dans la physiopathologie du système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre pourquoi le lymphoedème, une maladie incurable qui touche des millions de personnes, affecte majoritairement les femmes.

Procédures

Dans le premier établissement utilisateurs seront réalisées les procédures suivantes : dans un premier temps, une injection quotidienne pendant 5 jours sera effectuée. Ensuite, sous anesthésie générale, une échographie de suivi (20min), ou une intervention chirurgicale (15min) et/ou une injection de cellules tumorales seront réalisées (2min). Dans le second établissement utilisateur, les animaux peuvent être soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure. Au maximum, les souris subiront 2 interventions

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal. La chirurgie du lymphoedème ne génère pas d'effet indésirable majeur chez l'animal. Toutefois, si l'animal présente des signes de souffrance (dos vouté, yeux plissés, absence de toilettage), un traitement avec un analgésique sera mis en place

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Les effets pleiotropies des oestrogenes, synthetisees majoritairement par les ovaires, font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. D’autre part, la gestation ne peut être observée que sur animal vivant. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques du système lymphatique dans la fertilité. De meme, la croissance tumorale et le developpement de lymphoedeme secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale et lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet.

Réduction

Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du cancer du sein et de ses conséquences : le lymphoedème. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement

Raffinement

Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. Cela permettra de réagir rapidement si un animal atteint un des points limites détaillés dans chaque procédure. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffants et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car c’est le seul modele pour lequel on peut avoir un suivi de la gestation, de la croissance tumorale avec formation de metastases ou l'apparition du lymphoedeme secondaire apres curage ganglionnaire. De plus, l'invalidation genique du recepteur aux oestrogenes ERα a ete genere seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet : - des souris conduisant a une invalidation du ERα de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 12 semaines

Une chirurgie de vingt à trente minutes provoque un lymphœdème sur une patte de 256 souris femelles, en reprenant les techniques de chirurgie du cancer du sein. Elles reçoivent ensuite une injection par jour, cinq jours par semaine, pendant deux à huit semaines selon le groupe, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Le porteur écrit que le seul effet indésirable attendu est un gonflement de la patte opérée de 10 à 15 %, qui dure jusqu'à la mise à mort. Après une dernière injection sous la peau des deux pattes et l'observation des vaisseaux au microscope à fluorescence, toutes sont tuées sans réveil pour récolter les tissus.

Objectifs

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce manque est en partie dû à l’absence de modèles expérimentaux permettant d’étudier cette pathologie. La mise au point d’un modèle de lymphoedème secondaire par l’utilisation des techniques de chirurgie du cancer du sein revêt donc un enjeu majeur pour déterminer des cibles afin de lutter contre cette pathologie. Les vaisseaux lymphatiques dépendent de leur environnement, notamment de la matrice qui les entoure. Si cette matrice se modifie, cela peut bloquer leur fonctionnement. Nous étudions comment la fibrose (une accumulation anormale de cette matrice) se développe, quels mécanismes la contrôlent et comment ces changements influencent la santé des vaisseaux lymphatiques. L'objectif est de trouver des solutions pour réparer cette matrice et traiter le lymphoedème. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce protocole a pour but 1/ de reproduire la pathologie humaines ou lymphoedème qui fait intervenir le microenvironement fibreux et adipeux et nécessite donc un modèle intégré, 2/d'identifier les acteurs cellulaires et moléculaires de la fibrose associée au lymphoedème afin de 3/ proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal réalisée dans le premier établissements utilisateur. Une administration de substance sur animal vigil : injection quotidienne 5 jours par semaine pour 4 temps d'étude différents: 2,4,6 et 8 semaines post-opératoire, durée : 1min/animal, réalisée dans le premier établissements utilisateur. Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure réalisée dans le second établissements utilisateur

Impact sur les animaux

Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles. Le modèle murin est le modèle experimental d'induction de lymphoedème le plus étudié et le mieux caractérisé dans la littérature et il a été prouvé que les modèles murins sont relevants par rapport à la pathologie humaine. Cette étude porte sur la mise au point d’un modèle de lymphoedème et l’impact de la fibrose sur la fonction endothéliale lymphatique. Pour ces raisons, nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour générer des modèles de lymphoedème dans la littérature. Nous nous interessons plus particulièrement au lymphoedème secondaire après cancer du sein, c'est pourquoi nous utiliserons des souris femelles.

Placés quatre semaines dans un caisson d'hypoxie intermittente, huit à seize heures par jour pendant leur phase de sommeil, 434 rats subissent des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Ils reçoivent un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire chaque jour, une prise de sang entre le dix-huitième et le vingt-et-unième jour, puis une échographie de l'aorte sous anesthésie gazeuse après un transport entre deux établissements. Presque tous sont tués par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale pour récupérer leurs organes, quinze rats écartés en cours d'étude pouvant être réutilisés ailleurs. Le porteur justifie l'effectif en indiquant que le nombre d'animaux a été fixé à douze, sans dire comment on passe de ce chiffre aux 434 rats déclarés.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.

Bénéfices attendus

Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.

Remplacement

L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.

470 souris femelles vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant douze heures sur une grille en cage à métabolisme individuelle et subissant, lors des tests de tolérance au glucose, une piqûre à la queue toutes les quinze minutes pendant deux heures. La moitié d'entre elles est ovariectomisée au cours d'une chirurgie de trente minutes pour reproduire une ménopause, puis toutes alternent régime gras et régime standard pour provoquer des variations cycliques de poids. S'y ajoutent des gavages, des mesures de pression artérielle sur souris éveillées, un test d'effort sur tapis de course, des IRM sous anesthésie et, juste avant la mise à mort, un cathétérisme du ventricule gauche. Toutes sont tuées pour prélèvement d'organes, afin d'évaluer chez la souris la finérénone, un médicament qui dispose déjà d'une autorisation de mise sur le marché et dont le porteur indique qu'il limite déjà l'insuffisance cardiaque chez les personnes obèses.

Objectifs

L’obésité centrale devient syndrome métabolique si elle est associée à 2 des 4 facteurs de risque suivant : hypertension artérielle, excès de sucre dans le sang, excès de triglycéride dans le sang, diminution de taux sanguin du bon cholestérol. Le syndrome métabolique dont la fréquence augmente de 60% après la ménopause est associé au risque de développer une Insuffisance Cardiaque à Fraction d’Ejection Préservée, forme d’insuffisance cardiaque la plus fréquente chez les femmes, silencieuse au repos mais se révélant lors d’efforts, de fatigue ou de stress. Le pronostic vital est engagé avec un taux de mortalité de 76% dans les cinq années suivant le diagnostic. Surpoids et obésité sont un problème majeur de santé publique et seuls 20% des individus concernés parviennent à une réduction pondérale durable, les autres courant le risque de variations cycliques du poids associées au diabète de type-2, à des fluctuations de pression artérielle, de rythme cardiaque et de filtration rénale, le tout induisant une surmortalité, en particulier chez les femmes. Après une perte de poids, les individus ayant présenté un excès pondéral prolongé sont assujettis à une mémoire métabolique préjudiciable limitant le recouvrement des fonctions cardiovasculaires, tout en exposant à un rebond physiopathologique amplifié en cas de reprise de poids. Dans ce contexte, nous nous intéressons à l’aldostérone, hormone produite par les glandes surrénales, et à son récepteur minéralocorticoïde, notamment impliqués dans la régulation de la réabsorption de sel par les reins, du volume sanguin et donc de la pression artérielle. Il est établi que la finerenone, médicament antagoniste de ce récepteur, limite la progression de l’Insuffisance Cardiaque à Fraction d’Ejection Préservée chez les obèses. Nous voulons dorénavant tester si la finerenone administrée à des individus au cours de phases de perte de poids facilite le recouvrement de leur fonction cardiovasculaire et réduit le risque de rebond d’insuffisance cardiaque en cas de reprise de poids. Nous réaliserons ces traitements chez des souris femelles en condition ou non de ménopause induite par la suppression des ovaires, dans un modèle de 3 cycles successifs de variation de poids : augmentation puis réduction provoquées par un régime riche en graisse (4 semaines par cycle) suivi d’un retour au régime standard (4, 6, 8 semaines pour les cycles successifs).

Bénéfices attendus

La mise en place d’un modèle murin robuste pour mimer des variations cycliques de poids chez les femmes dans des conditions de pré ou de post-ménopause permettra de déterminer comment des variations du métabolisme induisent des dysfonctions systémiques, et comment des mécanismes endocrines pathologiques et/ou associés au vieillissement influencent conjointement la progression de ces dysfonctions systémiques métaboliques, cardiovasculaires, rénales, hépatiques, du tissu adipeux, du pancréas (producteur d’insuline et de glucagon) et des glandes surrénales (productrices d’aldostérone et de glucocorticoïdes). De plus, notre modèle préclinique rend possible l’identification de cibles pharmacologiques pour prévenir le risque de complications cardio-métaboliques chez les femmes sujettes à des variations cycliques de poids. En particulier, nous souhaitons prévenir le risque associé à une mémoire métabolique délétère qui se maintient au cours d’une perte de poids chez les individus ayant présenté un excès pondéral prolongé, mémoire pouvant limiter ou ralentir le recouvrement de leur fonction cardiovasculaire tout en exposant à un rebond physiopathologique amplifié en cas de reprise de poids. Dans cet objectif, notre première hypothèse thérapeutique consiste à prévenir les conséquences de cette mémoire métabolique délétère, grâce un traitement par la finerenone, nouvel antagoniste du récepteur minéralocorticoïde, ayant obtenu une autorisation de mise sur le marché. Nous testerons la possibilité de bénéfices fonctionnels métaboliques, cardiovasculaires, rénales, hépatiques et endocrines après administration de ce médicament au cours des phases de restriction caloriques permettant une perte de poids, ou au cours du troisième cycle complet de variations cycliques de poids. Une approche préclinique faisant usage d’un médicament autorisé chez l’homme renforce notre projet dans sa dimension translationnelle et dans la perspective d’un transfert clinique chez les patientes. Ainsi, les données précliniques issues de ce protocole pourront améliorer l’arsenal thérapeutique proposé aux femmes qui ont des troubles métaboliques et sont à risque de développer une forme d’insuffisance cardiaque majoritaire chez les femmes, l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, dont l’incidence augmente après la ménopause.

Procédures

La moitié des animaux sera soumis à une intervention chirurgicale d’une durée de 30 minutes environ au cours de laquelle les ovaires seront retirés. Les animaux recevront une alimentation standard ou une alternance d’alimentation standard et d’alimentation riche en gras. Le traitement par la finerenone sera administré par gavage. Des mesures de pression artérielle sur souris vigile seront réalisées. Ces mesures durent environ 15 minutes. Des tests de sensibilité au glucose et de tolérance orale au glucose (gavage de glucose ou injection intrapéritonéale d’insuline, suivis du prélèvement d’une goutte de sang à la queue toutes les 15 min pendant 2h) seront réalisés chez des souris vigile. L’analyse de la composition corporelle est effectuée sur souris vigiles. L’étude des artères de résistance et du système périphérique se fera par tomographie en cohérence optique et angiographie rétinienne en microscopie confocale laser. Les souris seront suivies par échocardiographie sous anesthésie au gaz pour mesurer la fraction d’éjection sanguine du ventricule gauche à chaque battement ainsi que le débit cardiaque. La perfusion sanguine du ventricule gauche, via la circulation coronaire et la capacité du cœur à augmenter sa perfusion après injection d’un agent vasodilatateur seront mesurées par IRM sous anesthésie. Des souris vigiles seront soumises à un test d’effort sur tapis de course, pour mesurer si une amélioration fonctionnelle cardiovasculaire se traduit par une meilleure capacité d’exercice. La collecte des urines sera réalisée en cage à métabolisme pour évaluer l’activité rénale. Précédant la mise à mort des souris, le cathétérisme du ventricule gauche sous anesthésie permettra de déterminer la pression intraventriculaire gauche en diastole (relaxation) et systole (contraction) et des paramètres spécifiques de relaxation et de contractilité, uniquement mesurables en hémodynamique invasive. Un prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde. L’injection du mélange anesthésique durera moins de 30 secondes. Le prélèvement de sang dure moins d’une minute.

Impact sur les animaux

Douleur post-opératoire après l’ovariectomie. Inconfort au point d’injection durant le test de sensibilité à l’insuline et l’évaluation de l’intégrité microvasculaire dans la rétine. Stress lié à la contention lors de la mesure de la pression artérielle. Stress et inconfort liés à la mise en cage à métabolisme individuelle pendant une nuit (12h00), les souris étant posées sur une grille permettant de collecter les urines au travers. Inconfort ou douleur lors des phases de réveil après anesthésie générale. Ces anesthésies générales suivies d’une phase de réveil concernent les opérations d’ovariectomie, les examens par IRM et la tomographie en cohérence optique de la rétine.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin de prélever différents organes qui seront analysés par différentes approches.

Remplacement

Les expériences réalisées in vivo ne peuvent être remplacées par des études in vitro en raison de la complexité de la pathologie (l'insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée) nécessitant des analyses fonctionnelles et physiopathologiques complexes, en particulier dans le contexte intégratif de comorbidités telles qu’un diabète de type 2, une dysfonction endothéliale, une dysfonction du tissu adipeux, le risque d’une insuffisance rénale ou hépatique, et en présence de remodelages tissulaires et d’une inflammation chronique. Dès lors, l'utilisation d'animaux ne saurait à ce jour être remplacée par des méthodes alternatives.

Réduction

L'ensemble du protocole a été conçu pour minimiser le nombre d'animaux, en tenant compte de l’exigence et des contraintes des tests statistiques utilisés. Notre habitude des actes expérimentaux envisagés nous permet de connaître le nombre d’animaux requis pour atteindre la puissance statistique nécessaire à mettre en évidence une différence entre les groupes. Le nombre d'animaux demandé pour tout le protocole est de 470 et correspond à une volonté de ne pas soumettre les animaux à une fréquence trop élevée d'actes expérimentaux qui génèrerait un excès de stress expérimental et un risque accru de souffrance.

Raffinement

Pour s'assurer de bonnes conditions de vie des souris, une observation rigoureuse est indispensable. Les souris sont hébergées dans une animalerie conventionnelle à 5 souris/cage, en portoirs ventilés avec accès ad-libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, plus un enrichissement du milieu (plaque de cellulose, tunnel cartonné). Pour le maintien des conditions d'hygiène, le change est réalisé une fois par semaine. Un suivi des animaux est réalisé quotidiennement par les soigneurs et au moins de manière hebdomadaire par le responsable du protocole et/ou ses collaborateurs, pour déceler le moindre signe de souffrance. Le protocole est initié une semaine après l’arrivée des animaux à l’animalerie pour respecter un temps d’adaptation suite au transport. Pour chaque procédure requérant l'usage d'une anesthésie, l'anesthésie est réalisée dans une cage individualisée, avec une humidification régulière des yeux et le maintien de la température corporelle grâce à une lampe chaude, dans un environnement contrôlé et stabilisé Une couverture analgésique sera proposée avant, pendant et après l’induction , avec une évaluation quotidienne la première semaine post-chirurgicale de la douleur, basée sur la "grimace scale de Langford". Couplé à un suivi de poids régulier, cela permettra de statuer sur l’atteinte d’un point limite, notamment en période post-opératoire et vers la fin de l'étude. Pendant la chirurgie, nous injectons une solution préchauffée à 37°C de sérum physiologique stérile pour maintenir l'hydratation des animaux. En post-opératoire, une injection de glucose est réalisée ainsi qu'un ajout dans la cage de nourriture gélifiée qui aide l'animal à mieux se nourrir. Nous nous engageons à suivre le bien-être animal avec des feuilles de suivi individuelles, avec la "grille d'évaluation des signes cliniques" dont la "grimace scale de Langford" afin d’identifier des individus à risque de souffrance avant que les points limites soient atteints pour pouvoir appliquer la mise à mort planifiée. Pour les procédures réalisées avec des souris vigiles des phases d'habituation progressive au dispositif expérimental sans mesure sont réalisées.

Choix des espèces

Le choix de l’espèce animale se justifie par une longue expérience du laboratoire concernant les modèles d’insuffisance cardiaque chez la souris, notamment l’insuffisance cardiaque à fraction d'éjection préservée, après administration d’un régime riche en graisse. Nous nous intéressons à l'impact de la ménopause sur le développement de ce type d'insuffisace cardiaque, pour cela nous utilisons des souris femelles, chez lesquelles la ménopause est induite par ablation des ovaires. Les souris ont 7 semaines à leur arrivée. De plus, nous disposons d’une animalerie moderne avec des portoirs ventilés facilitant l’hébergement et favorisant le confort et la sécurité sanitaire des souris. Enfin, nous disposons d’une excellente expérience des évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques et vasculaires, in vivo et ex vivo, chez la souris.

Les souris utilisées ici sont génétiquement modifiées pour que l'ARN LincPint soit inactivé dans leurs vaisseaux lymphatiques, une lignée qui n'existe que dans cette espèce selon le porteur. 280 femelles de cinq semaines vont ainsi être utilisées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq injections intrapéritonéales sur cinq jours consécutifs, puis une greffe de cellules tumorales, une chirurgie provoquant un lymphœdème ou l'application d'une molécule inflammatoire, avant une lymphographie de moins de cinq minutes. Toutes sont tuées au terme de cette imagerie, pour récolter les tissus.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale et le développement de lymphoedème secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

434 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la quasi-totalité étant tuée par prélèvement complet du sang sous anesthésie. Pendant quatre semaines, ils passent huit à seize heures par jour dans un dispositif d'hypoxie intermittente, pendant leur phase de sommeil, pour reproduire les apnées obstructives, avec un traitement oral quotidien la dernière semaine, parfois une injection supplémentaire, une prise de sang en troisième semaine et une échographie de l'aorte sous anesthésie. Le porteur qualifie de "léger" ou "modéré" chacun des stress attendus, y compris le passage en hypoxie et le transport entre les deux établissements. Quinze rats échappent à la mise à mort et seront réutilisés dans d'autres projets, parmi lesquels ceux qui auront servi à former le personnel aux gestes techniques.

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est l'une des maladies chroniques les plus fréquentes, caractérisée par des baisses et hausses répétées du taux d'oxygène dans le sang. Le SAOS est associé à de nombreuses complications cardiovasculaires et métaboliques (hypertension, diabète, obésité, accident vasculaire cérébral) ainsi qu’à une mortalité précoce. Par conséquent, ces patients ont souvent besoin de combiner plusieurs traitements afin notamment de limiter les risques cardiovasculaires au long terme. Un problème sous-estimé chez les patients SAOS est la réduction de l'efficacité de ces médicaments ou l'augmentation de l'incidence des effets indésirables. À titre d'exemple, l'effet du clopidogrel, un anti agrégant plaquettaire utilisé dans la prévention secondaire des maladies cardiovasculaires, est altéré chez ces patients. Les données sont rares en ce qui concerne les mécanismes sous-jacents et les effets à long terme associés à ces modifications, mais l'inflammation semble jouer un rôle central. Notre hypothèse, appuyée par la littérature sur le sujet, est que l’inflammation présente chez les patients SAOS est un mécanisme majeur impliqué dans les changements pharmacocinétiques et l'altération de la réponse aux médicaments, affectant leur efficacité et leur sécurité. Pour confirmer cette hypothèse, nous souhaitons utiliser un modèle de SAOS in vivo afin de comprendre les modalités d’apparition de l’inflammation lors de l’exposition à l’HI et ses conséquences sur la pharmacocinétique des médicaments, ainsi que sur la fonction vasculaire au sein d’un organisme complexe. Ce projet est réparti sur 2 établissements utilisateurs afin de bénéficier des outils nécessaires à sa réalisation.

Bénéfices attendus

Nous espérons à terme que notre étude fournira des informations cliniquement pertinentes sur les particularités qui influencent la façon dont les patients atteints de SAOS réagissent aux médicaments. Cela permettra de mieux comprendre leur profil de réponse aux traitements et pourrait mener à des soins adaptés et personnalisés.

Procédures

Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 4 semaines (28 jours). Selon leur groupe, les rats recevront un traitement journalier par voie orale lors de la dernière semaine d’exposition (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’administrer). Dans certains cas, en plus du traitement par voie orale, les rats recevront une injection journalière supplémentaire d’un second produit (5 à 10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Un prélèvement sanguin aura lieu en amont des traitements à la fin de la 3ème semaine d’exposition (entre J18 et J21) (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Ces interventions auront lieu au sein de l'EU1. La fonction aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole (entre J23 et J24), par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. Cette intervention aura lieu au sein de l'EU2. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement complet du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure).

Impact sur les animaux

Les animaux recevront à partir de la 3ème semaine d’exposition une administration orale et/ou une injection journalière de médicament ce qui conduira à un léger stress. Le prélèvement de sang opéré lors de la 3ème semaine d’exposition entrainera également un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. La réalisation d'une échographie lors de la 3ème semaine entrainera un stress léger. Enfin le transport des animaux après l'échographie entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.

Devenir

Il est prévu que tous les animaux de la procédure expérimentale soient mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires. Si certains animaux n’ayant subi que des procédures légères sont exclus lors de l’expérimentation, ils pourront être réutilisés pour d’autres projets.

Remplacement

L’étude de la réponse aux médicaments nécessite des manipulations invasives irréalisables chez l’homme. Nous utilisons déjà des modèles de cellules hépatiques afin d’étudier certains mécanismes, mais ces modèles ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier, ni la communication inter-organes (sang, foie, intestin, reins) essentielles dans l'étude du devenir des médicaments. Notre étude nécessite des prélèvements sanguins pour mesurer directement l'effet du traitement, ce qui exige un volume de sang suffisant. Dans ce domaine, le rat est le modèle de référence, car les autres options comme les mouches (drosophile), les vers (C. elegans) ou les poissons (zebrafish) ne conviennent pas pour ce type de recherche. Par ailleurs, les modèles basés sur des cellules ne permettent pas de reproduire l'inflammation généralisée que l'on observe chez l'humain, ni ses conséquences sur l'organisme. Enfin, avant d'effectuer des tests sur les animaux, nous validons d'abord nos recherches à l'aide au sein de modèles cellulaires de foie.

Réduction

Le nombre d'animaux a été fixé à 12, en se basant sur une analyse statistique minimale pour garantir des résultats interprétables. La présence d’une différence entre les sexes après la première série d’expérimentations sera évaluée et si aucune différence n’est constatée, les groupes d’animaux mâles et femelles seront alors rassemblés, ce qui permettra de réduire considérablement leur nombre. De plus, seuls les molécules ayant montrés un intérêt dans les modèles cellulaires seront utilisés chez le rat, participant à la réduction du nombre d'animaux. Une grande partie des organes et tissus de ces mêmes animaux seront collectés, et pourront servir à la réalisation post-mortem de nombreuses analyses ainsi qu'à d'autres études, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés. Enfin, les animaux que nous allons utiliser pour former le personnel aux gestes techniques seront réutilisés d'autres projets.

Raffinement

Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes de diminution de la douleur et de mise à mort. Une surveillance continue sera effectuée pendant l'hébergement et les procédures expérimentales pour évaluer et minimiser les douleurs ou le stress des animaux. Si nécessaire, des analgésiques ou anesthésiques seront administrés immédiatement. Les conditions expérimentales seront optimisées pour leur confort, avec une habituation aux manipulations et des soins spécifiques, comme l'utilisation de gel oculaire pour les anesthésies longues. Des critères d'arrêt précis et un arbre décisionnel seront mis en place, permettant aux équipes d'agir rapidement pour assurer le bien-être des rats. Les expérimentateurs, formés selon la législation, respectent des protocoles rigoureux. Le transport entre les deux unités, au sein du même bâtiment, sera effectué en cages adaptées, avec nourriture, eau et enrichissement. Les rats bénéficieront d'une période d'acclimatation d'au moins 7 jours avant les tests, avec un enrichissement et un suivi régulier pour détecter tout signe de souffrance. Un vétérinaire sera consulté en cas de besoin, et les animaux seront pesés chaque semaine. L'hypoxie durera entre 8 et 16 heures, correspondant à leur période de sommeil, tandis qu'ils auront libre accès à la nourriture pendant la phase d'activité. En hypoxie, un enrichissement moins volumineux sera mis en place afin de ne pas perturber le flux d'air, permettant tout de même aux animaux d'exprimer leur comportement de rongeur. L'HI durera de 8 à 16h, correspondant à leur phase de sommeil. Des soins adaptés seront mis en place devant tout comportement anormal et le vétérinaire responsable des animaux sera contacté en cas de souffrance. Les animaux seront pesés de manière hebdomadaire par l'expérimentateur.

Choix des espèces

Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation et la réponse au médicament. Des modèles alternatifs d’animaux (drosophile, zebrafish, celegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les rats sont le modèle de référence utilisé en recherche pharmacologique et cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser des rats sauvages sans modification génétique. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. La nécessité d'un volume sanguin assez important pour effectuer nos analyses justifie l'utilisation du rat plutôt que de la souris. Les compétences et les outils qui permettront l’analyse des échantillons sanguins et des différents organes prélevés sont déjà maîtrisés par le laboratoire et ses collaborateurs. Nous utiliserons des rats jeunes adultes âgés de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur la métabolisation des médicaments sans biais lié à l’âge.

Mesurer l'effet d'une enzyme sur le drainage des vaisseaux lymphatiques et sur la dissémination des métastases : 360 souris femelles de six semaines vont être utilisées dans ce but, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacune subit une chirurgie de vingt à trente minutes qui lui provoque un lymphœdème, un gavage, une injection de cellules tumorales, puis une lymphographie sous anesthésie au terme de laquelle elle est tuée sans réveil. La patte opérée gonfle de 10 à 15 % à partir d'une semaine après l'intervention, et reste ainsi jusqu'à la mise à mort. Un score évalue l'apparence, le poids, le comportement naturel et le comportement provoqué sur une échelle de 0 à 12, tout animal atteignant 10 étant tué immédiatement.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Dans le premier établissement utilisateur, les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal. Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal). Enfin; dans le second établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines

Cinq jours d'injections intrapéritonéales consécutives, puis au choix une greffe de cellules tumorales, une chirurgie destinée à provoquer un lymphœdème de la patte ou l'application d'une molécule inflammatoire, et pour finir une lymphographie après laquelle l'animal est tué. 280 souris femelles vont être utilisées de cette façon, toutes tuées à l'issue pour récolter les tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le projet vise à établir le rôle d'un ARN non codant, LincPint, dans le fonctionnement des vaisseaux lymphatiques. Pour l'ensemble de ces atteintes, le RNT tient en une phrase sur les effets attendus, les chirurgies et les tumeurs devant engendrer "des douleurs modérées et un léger stress".

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalement implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence qu’un Long Acide Ribo Nucléique (ARN) non traduit en protéine, LincPint, était fortement surexprimé dans vaisseaux lymphatiques au niveau les lésions. De plus, des données de la littérature ont montré que cette molécule jouait une rôle prédominant dans la croissance tumorale. Ce projet aura pour but de déterminer quel est le rôle de LincPint dans la fonction lymphatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre certains aspects de la physiopathologie du système vasculaire lymphatique non étudiés à ce jour. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra de mieux comprendre quels sont les mécanismes de régulation génique qui contrôlent l’apparition et le développement du lymphoedème.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 procédures au total. D'abord, une injection intraperitonéale par jour pendant 5 jours consécutifs est réalisée. Ensuite, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

Les effets des long Acides Ribo Nucléiques (ARN) font intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de ces molécules dans la fonction endothéliale lymphatique. De meme, la croissance tumorale et le developpement de lymphoedeme secondaire font intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale lymphatique, inflammation..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide d'un logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. Cette surveillance permet d'appliquer des points limites précis. Les paramètres contrôlés sont le dos vouté/courbé, yeux plissés/mis-clos, poil herissé et absence de toiletage, diminution des mouvements d'activité, ainsi que la perte de poids. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car il n'existe que dans cette espèce des individus génétiquement modifiés afin d'avoir les caractéristiques nécessaires à notre étude. Cette modification génétique a conduit à l'invalidation de notre molécule d'intérêt dans les vaisseaux lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 12 semaines.