Système cardiaque

12 812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, trente semaines de gavage quotidien et trente semaines d'injections intrapéritonéales bihebdomadaires. S'y ajoutent une chirurgie d'implant d'œstrogène, une injection de cellules tumorales humaines, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue à six jours de vie et des transports entre cinq sites pour les séances d'imagerie. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique et histologique, celles de l'élevage restant en vie pour la reproduction, à l'exception des mâles immunodéficients. Le porteur justifie l'effectif par un calcul de puissance mené "en utilisant un logiciel de statistique", sans autre indication sur la façon dont on parvient à 12 812 individus.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

360 souris femelles subissent une chirurgie de vingt à trente minutes destinée à leur provoquer un lymphœdème de la patte, puis un gavage, une injection de cellules tumorales et une lymphographie sous anesthésie. Toutes vont être tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour récolter les tissus. Un score de douleur et de stress noté de 0 à 12 est relevé, la mise à mort immédiate étant déclenchée à partir de 10. Le porteur qualifie le lymphœdème chez les patientes de pathologie "douloureuse et handicapante", et écrit que la même atteinte, provoquée chirurgicalement chez la souris, n'a "aucun impact sur la mobilité des animaux".

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalementimplique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation dusysteme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence un remodelage pathologique de la matrice extracellulaire promouvant la fibrose induit par une augmentation de l'expression d'une enzyme. Dans cette étude, nous proposons d'étudier l'impact de cette enzyme sur la matrice extracellulaire entourant les vaisseaux lymphatiques et l'impact sur leur fonction de drainage, paramètre critique pour le développement du lymphoedème. Des études ont par ailleurs suggéré que cette enzyme jouait un rôle dans la carcinogenèse, nous étudierons donc également si elle peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Dans le premier établissement utilisateur ,une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal. Une administration de substance sur animal vigil : gavage oral, durée : 1min/animal également dans le premier établissement utilisateur . Les animaux seront égalements soumis à une procédure d'injection de cellules tumorales (10min/animal) dans le premier établissement utilisateur. Enfin, dans le second établissement utilisateur, les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure

Impact sur les animaux

L'induction chirurgicale du lymphoedème ne touche aucun organe vital et n'impacte donc pas la survie des animaux. Cette chirugrie a déjà été utilisée dans de précédentes études validées dans la littérature scientifique et n'a révélé aucun impact sur la mobilité des animaux y compris dans l'utilisation du membre touché par la chirurgie. Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure. Un scoring des signes de douleur et de stress sera effectué suivant la grille de scoring mise en place par le service du bien-être animal de la zootechnie. Cette grille évalue 4 paramètres : apparence, prise de poids/alimentation, comportement naturel, comportement provoqué et permet d’établir un score de douleur/stress sur une échelle de 0 à 12. Tout animal obtenant un score égal ou supérieur à 10 sera immédiatement euthanasié.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux. Le laboratoire est par ailleurs activement engagé dans le développement de microvaisseaux lymphatique in vitro de type "organe sur puce" pour améliorer la relevance physiologique des modèles in vitro et limiter au maximum l'utilisation des animaux

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif. Nous reduirons donc au maximum l'utilisation d'animaux dans ce protocole

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme étudiée a ete generée seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de cette enzyme de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques et dans les fibroblastes. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 6 semaines. Les procedures seront realisees de 6 a 12 semaines

Opérées sous anesthésie gazeuse pour provoquer un lymphœdème du membre par la technique employée en chirurgie du cancer du sein, 256 souris femelles reçoivent ensuite une injection quotidienne cinq jours par semaine, pendant deux, quatre, six ou huit semaines. Ces procédures impliquent un niveau de souffrance modéré. Un transfert entre deux établissements précède la lymphographie finale, injection intradermique dans la patte saine et dans la patte gonflée sous anesthésie générale, à l'issue de laquelle les souris sont tuées sans réveil pour récolter les tissus. Le porteur annonce que le seul effet indésirable attendu est un gonflement de 10 à 15 % de la patte opérée, présent dès la première semaine et jusqu'à la mort de l'animal.

Objectifs

Le lymphoedème secondaire touche environ 15% des femmes ayant eu un cancer du sein, soit près de 1600 nouveaux patients chaque année en France. Malgré la grande prédominance de cette pathologie, aucun traitement n’est actuellement disponible hormis des massages et bandages de contention. Ce manque est en partie dû à l’absence de modèles expérimentaux permettant d’étudier cette pathologie. La mise au point d’un modèle de lymphoedème secondaire par l’utilisation des techniques de chirurgie du cancer du sein revêt donc un enjeu majeur pour déterminer des cibles afin de lutter contre cette pathologie. Les vaisseaux lymphatiques dépendent de leur environnement, notamment de la matrice qui les entoure. Si cette matrice se modifie, cela peut bloquer leur fonctionnement. Nous étudions comment la fibrose (une accumulation anormale de cette matrice) se développe, quels mécanismes la contrôlent et comment ces changements influencent la santé des vaisseaux lymphatiques. L'objectif est de trouver des solutions pour réparer cette matrice et traiter le lymphœdème. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Ce protocole a pour but 1/ de reproduire la pathologie humaines ou lymphoedème qui fait intervenir le microenvironement fibreux et adipeux et nécessite donc un modèle intégré, 2/d'identifier les acteurs cellulaires et moléculaires de la fibrose associée au lymphoedème afin de 3/ proposer de nouvelles cibles thérapeutiques pour cette pathologie. Ce projet permettra d’identifier des cibles thérapeutiques permettant de restaurer la fonction lymphatique défaillante en normalisant le microenvironnement.

Procédures

Les animaux seront soumis à 3 interventions au total. Une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire (réalisée sous anesthésie gazeuse) durée : 20-30 minutes/animal, réalisée dans le premier établissements utilisateur. Une administration de substance sur animal vigil : injection quotidienne 5 jours par semaine pour 4 temps d'étude différents: 2,4,6 et 8 semaines post-opératoire, durée : 1min/animal, réalisé dans le premier établissements utilisateur. Enfin les animaux seront soumis à une procédure de lymphographie : réalisée sous anesthésie générale, une injection sera pratiquée en intradermal dans la patte non opérée et dans la patte lymphoedemateuse, la visualisation des vaisseaux sera ensuite effectuée à l'aide d'un stereomicroscope à fluoresence, durée : 15 minutes/animal. Cette procédure intervenant en fin de protocole les animaux seront mis à mort sans réveil à l'issue de cette procédure réalisée dans le second établissements utilisateur.

Impact sur les animaux

Le seul effet indésirable attendu est un gonflement (10 à 15% d'augmentation par rapport au diamètre moyen de la patte non opérée) de la patte opérée, à partir d'une semaine post-chirurgie et ce jusqu'à la mise à mort des animaux en fin de procédure.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet

Remplacement

Le lymphoedème est une pathologie où le tissu touché est drastiquement modifié et où de nombreux types cellulaires différents interagissent entre eux (cellules endothéliales, fibroblastes, adipocytes...), seul l'utilisation d'un modèle murin peut apporter une relevance physiologique à nos résultats. Néanmoins une fois les acteurs de la fibrose associée au lymphoedème identifiés dans ce modèle, leurs régulations seront etudiées dans différents modèles in vitro disponibles au laboratoire afin de limiter l'usage des animaux.

Réduction

Le nombre d'animaux par groupe sera determiné à l'aide de logiciel dédié afin de déterminer le nombre minimal d'animaux à inclure par groupe pour avoir un effet statistiquement significatif et donc de ne pas utiliser plus d'animaux que necessaire.

Raffinement

Durant l'ensemble du projet les animaux sont hebergés selon la reglémentation européenne et les recommandations du Service Bien-Etre Animal (SBEA) de la zootechnie.5 souris maximum sont hebergées par cage, dans des cages enrichies et aucun animal n'est isolé dans aucune des procédures afin de ne pas induire de stress. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale gazeuse et des analgésiques sont administrés avant et après les opérations. Dès le lendemain de la chirurgie, un suivit post-opératoire est mis en place afin de détecter la douleur mais également une éventuelle absence de : 1/reprise de poids, 2/nidification, 3/toilettage. L'évolution de la plaie et de sa cicatrisation sera également surveillée afin de détecter rapidement une éventuelle infection. Ce suivi sera effectué en conformité avec les grilles de scoring établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). En résumé, ce suivi aura pour but de détecter si l'animal est capable de répondre à ses besoins physiologiques de base, dans le cas contraire tout animal en souffrance sera euthanasié en conformité avec les procédures établies par le service Service Bien-Etre Animal (SBEA). Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

L’expérimentation sera effectuée sur des souris femelles. Le modèle murin est le modèle experimental d'induction de lymphoedème le plus étudié et le mieux caractérisé dans la littérature et il a été prouvé que les modèles murins sont relevants par rapport à la pathologie humaine. Cette étude porte sur la mise au point d’un modèle de lymphoedème et l’impact de la fibrose sur la fonction endothéliale lymphatique. Pour ces raisons, nous utiliserons des souris adultes âgées de 6 à 8 semaines. Cet âge est classiquement utilisé pour générer des modèles de lymphoedème dans la littérature. Nous nous interessons plus particulièrement au lymphoedème secondaire après cancer du sein, c'est pourquoi nous utiliserons des souris femelles.

Porteurs d'un infarctus chronique du myocarde, 48 moutons subissent angiographie, cartographie électrique par cathéter et stimulation intraventriculaire, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Leur fréquence respiratoire et leur volume courant sont modifiés par paliers sous ventilation mécanique, pour observer ce que la respiration fait à l'activité électrique du cœur. Le porteur mentionne des saignements possibles aux points d'introduction des cathéters et des effets indésirables cardiaques lors de la cartographie ou de la stimulation, un défibrillateur restant disponible. Tous sont tués pour prélever le cœur, et le porteur avance que les données recueillies pourraient "réduire considérablement" le nombre d'animaux utilisés à l'avenir.

Objectifs

Les maladies cardiaques sont une cause majeure de décès dans le monde. Les troubles du sommeil comme l'apnée, associés à des problèmes respiratoires pendant le sommeil, augmentent encore le risque de maladie cardiaque. Notre objectif est de mieux comprendre comment les troubles respiratoires affectent le cœur et de développer de nouvelles méthodes de traitement des rythmes cardiaques anormaux. Nous créerons de nouvelles techniques pour étudier l’activité électrique du cœur et testerons des solutions pour améliorer le fonctionnement du système cardio-respiratoire. Nous analyserons les changements dans le comportement cardiaque lors d'une respiration normale et anormale et développerons de nouvelles stratégies pour prévenir les rythmes cardiaques anormaux..

Bénéfices attendus

Dans cette étude, nous caractériserons les mécanismes à l'origine de l'infarctus du myocarde (mort du tissu cardiaque) et son interaction avec la respiration. L’infarctus du myocarde est l’une des pathologies les plus courantes dans le monde et la première cause de mort subite. L’étude de la relation entre les schémas respiratoires et l’activité électrique cardiaque au sein des tissus sains et l’infarctus est essentielle pour comprendre les mécanismes pouvant conduire à la mort des patients. Grâce à ce projet, de nouvelles techniques et technologies peuvent être développées et optimisées dans différents domaines de recherche : imagerie, physiologie, modélisation, traitement du signal et traitement clinique..

Procédures

Les animaux utilisés pourront subir des examens d’imagerie, d'angiographie, de cartographie de contact et de stimulation intraventriculaire. Toutes ces analyses seront effectuées sous anesthésie générale et avec l’administration d’une thérapie antidouleur appropriée. Les techniques d’imagerie utilisées sont de types non invasives (IRM, scanner et/ou échocardiographie, 180 min au total). Le protocole d’angiographie est prévu afin de déterminer la présence ou pas d’irrigation sanguine dans l’infarctus (environ 90 min). Des systèmes de traitement d’image et de cartographie de contact nous permettent de cibler les zones potentiellement favorisantes des rythmes cardiaques anormaux. La cartographie électrique du cœur pourra être effectuée pour évaluer les effets de l’infarctus in vivo (environ 90 min). Une stimulation intraventriculaire pourra être effectuée pour déterminer la fonctionnalité ventriculaire à différentes fréquences de stimulation. Pour tester l'effet de la modification des paramètres pulmonaires sur l'électrophysiologie cardiaque, la fréquence respiratoire et le volume courant varieront par étapes incrémentielles.

Impact sur les animaux

La pose et le retrait des cathéters pour la cartographie peuvent conduire à des saignements aux sites d’introduction. Les anesthésies générales peuvent impacter légèrement le bien-être animal en induisant une légère désorientation ou une apathie transitoire lors du réveil. Lors des procédures d’imagerie non-invasif (IRM) ou mini-invasif (avec des cathéters), le bien-être animal peut être également impacté par la pose de cathéters : au niveau de la patte avant (pour la perfusion de médicaments et d’agents de contraste) et au niveau de la veine fémorale (guide pour la cartographie de contact). Les procédures de cartographie de contact ou de stimulation intraventriculaire peuvent comporter des effets indésirables cardiaques.

Devenir

Afin de prélever le cœur et d’effectuer des études sur sa fonction et sa structure qui nous permettront de mieux comprendre les caractéristiques électrophysiologies de l’infarctus, l'ensemble des animaux seront mis à mort.

Remplacement

Dans le contexte actuel, il n'est pas possible de remplacer l'utilisation des animaux pour ce projet. Les techniques que nous développons nécessitent des études sur des animaux pour comprendre en détail comment les crises cardiaques affectent le cœur et provoquent des arythmies. Les données que nous recueillons grâce à des techniques d’imagerie et de mesures électriques nous aideront à améliorer notre base de données sur le cœur. Cela pourrait, à l'avenir, réduire considérablement le nombre d'animaux utilisés et la nécessité de telles expérimentations.

Réduction

48 animaux sont utilisés dans ce projet. Nous avons calculé statiquement que ce nombre est nécessaires pour obtenir des résultats fiables. Nous avons également rassemblé dans le même projet plusieurs équipes de recherche : imagerie, physiopathologie, traitement des signaux, et modélisation cardiaque. Cette collaboration interdisciplinaire permet de développer et d’utiliser un maximum de techniques compatibles tout en minimisant le nombre d’animaux nécessaires, ce qui optimise notre approche. En plus, l'enregistrement d'une base de données à partir de ces sessions expérimentales permet de créer des modèles informatiques et donc de réduire l'utilisation d'animaux dans des projets connexes futurs.

Raffinement

Pendant les procédures, les animaux reçoivent un protocole antidouleur approprié et sont maintenus sous anesthésie générale avec une ventilation mécanique et surveillés par un ECG et un capteur de pression sanguine, niveau d’oxygène et température corporelle. Cela nous permet d’apporter la nécessaire hydratation ou de fournir des médicaments pour prévenir les rythmes cardiaques anomales. Un défibrillateur est toujours disponible pour éviter tout problème grave pendant les tests. Lorsque les animaux sont hébergés, ils sont placés dans des conditions adaptées à leur espèce, avec des soins appropriés et un environnement social adéquat. Le personnel surveille leur état de santé quotidiennement et peut intervenir rapidement si nécessaire. Si à tout moment leur état de santé se détériore et qu'il n'est pas possible de revenir à la normale, le protocole sera interrompu et l’animal sera euthanasié selon les procédures établies en tenant compte des points limites stricts et spécifiques du projet.

Choix des espèces

Parmi les modèles animaux ayant des caractéristiques anatomiques et fonctionnelles proche de l’homme, les ovins ont été retenus car : •Ces modèles sont une référence pour la communauté scientifique dans l’étude des pathologiques cardiaques •Le personnel impliqué dans ce projet possède une expertise établie de la gestion de ces modèles. Chez l’Homme, la plupart des infarctus se produisent à l’âge adulte. Pour cette raison, des ovins adultes (>12 mois) ont été choisis pour ce projet.

Fournir des anticorps à des équipes de recherche publiques ou privées, à raison d'environ 2 milligrammes par animal : 200 lapins New Zealand White sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit quatre injections d'une information génétique codant l'antigène visé, par voie intradermique, intramusculaire ou sous-cutanée, puis subit trois prélèvements sanguins de 25 à 40 minutes après administration orale d'un tranquillisant. Le porteur signale de la fièvre, un inconfort modéré et l'apparition de petites boules au point d'injection, et compte deux lapins par protocole. Tous sont tués en fin de protocole parce que chaque immunisation est spécifique d'un antigène, ce qui interdit de les réutiliser ailleurs.

Objectifs

L’objectif du projet est de générer par une approche d’immunisation génique des anticorps de lapin contre des antigènes d’intérêt pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L’immunisation correspond à un processus d’éducation et d’activation du système immunitaire contre un antigène spécifique. Parmi les différentes approches d’immunisation existantes, l’immunisation génique sera utilisée. Cette approche émergente vise à faire produire transitoirement un antigène en administrant une information génétique codant in situ pour un antigène spécifique, initiant ainsi une réponse immunitaire. Les anticorps obtenus seront utilisés dans des approches allant de la recherche au diagnostic. Le nombre de lapins prévus par protocole permettra d’obtenir une quantité suffisante d’anticorps (environ 2 milligrammes par lapin) pour une utilisation sur plusieurs années.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voire thérapeutiques. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.

Procédures

4 injections en intradermique, en intramusculaire ou en sous-cutanée de l’information génétique codant pour l’antigène d’intérêt (8 minutes) 3 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).

Impact sur les animaux

Les prélèvements de sang n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur), le volume de sang étant adapté au poids de l’animal en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor. Les prélèvements seront réalisés après administration par voie orale d’un tranquillisant à effet vasodilatateur, permettant de prélever le lapin dans de bonnes conditions pour le lapin et l'expérimentateur. L'injection couplée à un agent de transfection peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-agent de transfection). Les manipulations des lapins étant source de stress, une habituation sera mise en œuvre, afin de mettre en place une relation de confiance entre le lapin et les expérimentateurs.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant notamment dans la caractérisation de molécules thérapeutiques, a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.

Raffinement

Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en œuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en œuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d’une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.

Injectées cinq jours de suite dans l'abdomen pour bloquer l'enzyme Alox15, 440 souris femelles subissent ensuite soit une greffe de cellules tumorales, soit une chirurgie destinée à provoquer un lymphœdème de la patte. Vient une lymphographie sous anesthésie générale, avec injection dans la patte saine et dans la patte gonflée, puis observation des vaisseaux au stéréomicroscope. Les procédures impliquent un niveau de souffrance modéré et se déroulent dans deux établissements, entre lesquels les souris sont transportées. Toutes sont mises à mort à la fin de chaque procédure pour prélever les tissus, le porteur affirmant que l'inflammation chronique et la croissance tumorale ne sont modélisables par aucune approche sans animaux.

Objectifs

Le systeme lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener a la circulation sanguine au niveau de la veine sous-claviere. Il est implique dans le transport des graisses et des macromolecules et joue un role important dans l’immunite en transportant les cellules de l’inflammation. Le reseau lymphatique est egalement implique dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedeme, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoide et dans la dissemination metastasique. Le lymphoedeme est le resultat d’une obstruction ou d’une perturbation du systeme lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedeme est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient apres la chirurgie du cancer, cependant aucune therapie visant la regulation du dysfonctionnement de ce reseau lymphatique n’est proposee. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15- lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le developpement de tumeurs vont engendrer des douleurs moderees et un leger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modelisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours a l’experimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De meme, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endotheliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune strategie de remplacement pour l'etude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune strategie de remplacement du modele animal qui permet de repondre aux questions adressees par ce projet

Réduction

Afin de reduire le nombre d'animaux utilises dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorite uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilises par groupe est reduit a son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calcule de maniere a donner des resultats statistiquement significatifs afin de delimiter l'effet du genotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont places en piece d'acclimatation lors de leur arrivee a la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie competent qui verifie leur etat et place de l'enrichissement (carre de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de differents cartons de transport ne sont jamais melanges lors de la repartition dans les cages d'hebergement. Les animaux seront heberges en cage de 4 ou 5 et seront acclimates pendant une periode de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-etre de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillees quotidiennement selon les directives europeennes relatives a l'hebergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procedure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthesie generale avec analgesique sont realisees pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris a euthanasier seront placees dans une salle isolee du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront realisees dans une troisieme piece.Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espece s’est oriente vers la souris car l'invalidation genique de l’enzyme Alox15 a ete generee seulement dans cette espece. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant a une invalidation de Alox15 de maniere tissu-specifique dans les cellules endotheliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberte, l'ensemble des procedures sera realisee chez des souris femelles a l'age de 5 semaines. Les procedures seront realisees de 5 a 12 semaines.

Transportées entre deux établissements selon une charte de transport, 440 souris femelles vont être utilisées dans ce projet, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent cinq jours d'injections intrapéritonéales à l'état vigile pour éteindre un gène, puis une greffe de cellules tumorales ou une chirurgie provoquant un lymphœdème, avant une lymphographie sous anesthésie au terme de laquelle elles sont tuées sans réveil. L'objet est de comprendre pourquoi les lipides produits par l'enzyme ALOX15 manquent chez les patientes qui développent un lymphœdème après un cancer du sein. Sur le remplacement, le porteur affirme qu'il n'existe "aucune stratégie de remplacement" pour ces processus, la réduction se limitant à n'utiliser que des femelles.

Objectifs

Le système lymphatique a pour but de drainer des fluides tissulaires afin de les ramener à la circulation sanguine au niveau de la veine sous-clavière. Il est impliqué dans le transport des graisses et des macromolécules et joue un rôle important dans l’immunité en transportant les cellules de l’inflammation. Le réseau lymphatique est également impliqué dans de nombreuses pathologies telles que le lymphoedème, le psoriasis, la polyarthrite rhumatoïde et dans la dissémination métastasique. Le lymphoedème est le résultat d’une obstruction ou d’une perturbation du système lymphatique provoquant l’accumulation de fluide dans les tissus interstitiels. Le lymphoedème est une pathologie douloureuse et handicapante, qui survient après la chirurgie du cancer, cependant aucune thérapie visant la régulation du dysfonctionnement de ce réseau lymphatique n’est proposée. Lors d’une étude chez les patientes ayant développé un lymphoedème après cancer du sein, nous avons mis en évidence l’absence de lipides spécialisés dans la résolution de l’inflammation générés par l’enzyme ALOX15. Dans cette étude, nous proposons de traiter les animaux avec ces lipides afin de déterminer lesquels sont responsables de l’inflammation chronique. En parallèle, nous étudierons si l’absence de ces lipides peut influencer la lymphangiogenèse tumorale et avoir des conséquences sur la dissémination métastatique. Le projet se déroule dans deux Établissements Utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra de mieux comprendre les mécanismes de la résolution de l’inflammation associés au système vasculaire lymphatique. Il fournira de nouvelles pistes d’exploration visant à bloquer la diffusion métastatique. Enfin, il permettra d’établir comment réduire l’apparition des lymphoedèmes post-cancer à l’aide des médiateurs de la résolution de l’inflammation.

Procédures

Les animaux seront soumis à jusqu'à 3 interventions au total. Ensuite, l'inhibition de l'expression de la 15-lipoxygenase est effectuée par injection intraperitonéale d'un inducteur en vigil pendant 5 jours consécutifs. Après, ils seront soumis à une injection de cellules tumorales ou à une procédure chirurgicale ayant pour but d'induire le lymphoedème secondaire sous anesthésie générale (durée

Impact sur les animaux

Les chirurgies ainsi que le développement de tumeurs vont engendrer des douleurs modérées et un léger stress sur l'animal.

Devenir

Les animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de récolter les tissus nécessaires aux expériences du projet.

Remplacement

L’inflammation chronique fait intervenir des fonctions, tissus et cellules multiples dans l’organisme non modélisables par des approches in vitro. C’est pourquoi, le recours à l’expérimentation animale est l’unique approche permettant de comprendre les impacts physiologiques de cette molécule dans la fonction endothéliale lymphatique. De même, la croissance tumorale fait intervenir de nombreux partenaires cellulaires et processus pathologiques (cellule endothéliale lymphatique, inflammation, tissu adipeux..), il n'y a aucune stratégie de remplacement pour l'étude de ces processus physio(patho)logiques, ni aucune stratégie de remplacement du modèle animal qui permet de répondre aux questions adressées par ce projet.

Réduction

Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans le cadre de ce projet, nous utiliserons en grande majorité uniquement les femelles car cette partie du projet rentre dans le cadre du traitement du lymphoedème après cancer du sein. De plus, le nombre d'animaux utilisés par groupe est réduit à son minimum sans compromettre les objectifs du projet. Ce nombre est calculé de manière à donner des résultats statistiquement significatifs afin de délimiter l'effet du génotype, du temps et/ou du traitement.

Raffinement

Les animaux sont placés en pièce d'acclimatation lors de leur arrivée à la zootechnie. Ils sont pris en charge par du personnel de la zootechnie compétent qui vérifie leur état et place de l'enrichissement (carré de coton, carton) dans les cages pour amoindrir le stress du transport et permettre aux animaux de faire un nid. Les animaux issus de différents cartons de transport ne sont jamais mélangés lors de la répartition dans les cages d'hébergement. Les animaux seront hébergés en cage de 4 ou 5 et seront acclimatés pendant une période de 5 jours avant de commencer tout protocole. Tout au long du protocole, le bien-être de l’animal est bien pris en compte avec enrichissement du milieu et les souris seront surveillées quotidiennement selon les directives européennes relatives à l'hébergement des animaux de laboratoire. De plus, pour chaque procédure chirurgicale, les souris sont maintenues sur des tapis chauffant et les conditions d’anesthésie générale avec analgésique sont réalisées pour une meilleure prise en compte de la douleur. Enfin, pour un meilleur raffinement, les souris à euthanasier seront placées dans une salle isolée du reste des souris et les manipulations post-euthanasies seront réalisées dans une troisième pièce. Les animaux seront transportés entre les deux établissements suivant une procédure de transport déclarée lors de l’agrément de l’établissement (cheminement et conditions de transport validés par signature d’une charte de transport).

Choix des espèces

Le choix de l’espèce s’est orienté vers la souris car l'invalidation génique de l’enzyme Alox15 a été générée seulement dans cette espèce. Nous utiliserons en particulier dans ce projet des souris conduisant à une invalidation de Alox15 de manière tissu-spécifique dans les cellules endothéliales lymphatiques. Afin de ne pas affecter la croissance et la puberté, l'ensemble des procédures sera réalisée chez des souris femelles à l'âge de 5 semaines. Les procédures seront réalisées de 5 à 12 semaines.

Pour tester si une molécule limite la fuite de plasma hors des vaisseaux pendant un choc septique, 12 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Six reçoivent le traitement, six un placebo, après une injection intrapéritonéale d'un produit pro-inflammatoire qui fait chuter la pression artérielle et peut aller jusqu'à l'insuffisance circulatoire avec troubles de la conscience. Le protocole s'arrête à 24 heures, délai que le porteur présente comme une limitation des effets secondaires, et une IRM d'une heure sous anesthésie clôture l'expérience. Il décrit cet examen comme "parfaitement atraumatique", tout en attendant une possible détresse respiratoire au moment de l'endormissement.

Objectifs

Le choc septique se définit comme une infection généralisée de l’organisme entrainant une défaillance de l’ensemble des organes. Il constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable, d’après l’OMS (Organisation Mondiale de la Santé), d’environ 11 millions de décès chaque année. Lors d’un choc septique il existe notamment un déséquilibre majeur entre les besoins de l’organisme en oxygène et nutriments et les apports fournis par le système cardiovasculaire. Plus spécifiquement, la perméabilité des vaisseaux sanguins augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Cette anomalie vasculaire, qui porte le nom de fuite capillaire, joue un rôle prépondérant dans l’évolution des patients en impactant très négativement leur pronostic vital. Pourtant, bien qu’une mortalité de 60 pourcents, soit associée aux patients présentant une fuite capillaire, son origine reste néanmoins très peu connue et il n’existe à l’heure actuelle aucun traitement disponible. Dans ce contexte, notre projet de recherche vise à trouver des cibles thérapeutiques pour contrôler la fuite capillaire au cours du choc septique chez l’Homme. Dans un travail prospectif de recherche translationnelle entre un service de réanimation médicale et un laboratoire de recherche, une équipe de recherche Française a identifié chez 19 patients plusieurs protéines associées au syndrome de fuite capillaire. Cette étude a permis en particulier d’identifier une cible thérapeutique spécifique, cible d’intérêt particulier du fait de son action sur les vaisseaux sanguins. Notre objectif est ainsi de fournir la preuve de concept in vivo que la modulation de l’activité de cette molécule permet de diminuer la fuite capillaire et ainsi la mortalité au cours du choc septique. Les muscles squelettiques étant des tissus richement vascularisés, la fuite capillaire y est cliniquement importante. L’imagerie médicale étant une technique non-invasive et atraumatique de référence dans l’étude du tissu musculaire, l’objectif de ce projet est donc d’évaluer l’effet protecteur de ce médicament candidate sur le muscle squelettique dans le contexte du sepsis.

Bénéfices attendus

Le contrôle de la fuite capillaire au cours du choc septique est une approche totalement innovante. Elle répond à un besoin médical majeur, la fuite capillaire jouant un rôle majeur dans l’évolution défavorable des patients. L’objectif à long terme de ce projet est la mise au point de nouvelles thérapeutiques pour contrôler la fuite vasculaire chez les patients. La fuite capillaire induite par le choc septique est impliquée dans d’autres formes de syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS) lié à une agression aiguë sévère, comme le choc cardiogénique au sens plus large ou le syndrome de détresse respiratoire aiguë. La positivité de notre étude ouvrirait alors un large champ d’investigations et de thérapeutiques potentielles au cours de ces pathologies.

Procédures

Tous les animaux (12) auront des injections intrapéritonéales (geste rapide de quelques secondes chez une animal vigile) d'une substance pro-inflammatoire et d'un placebo (6) ou du traitement à évaluer (6). Les injections seront réalisées par un personnel formé à cette technique. Après 24 heures, les acquisitions images par résonnance magnétique (IRM) d’une durée d’environ une heure, se feront sous anesthésie légère pour obtenir l'immobilité pendant environ une heure, mais sont parfaitement atraumatiques et n'induisent pas de souffrance par elles-mêmes.

Impact sur les animaux

L’induction d’un syndrome de réponse inflammatoire systémique sera effectuée par injection d’un produit pro-inflammatoire en intra-péritonéal. Il s’agit d’un modèle utilisé de façon extensive dans la littérature pour mimer le syndrome de réponse inflammatoire systémique (SRIS), en particulier chez la souris. L’injection entraine une baisse de pression artérielle, pouvant aller jusqu'à une insuffisance circulatoire avec des troubles de conscience. Le présent protocole limite donc la durée à 24 heures maximum, en rapport avec la question scientifique posée et afin de limiter les effets secondaires induits. Concernant l’IRM, les modalités utilisées dans ce projet seront réalisées sous anesthésie gazeuse afin de garantir l’immobilité. Les principales nuisances qui sont attendues peuvent être une détresse respiratoire au moment de l’anesthésie. De plus le monitorage de la température corporelle est réalisé couplé à un matelas thermostaté afin de maintenir la normothermie de la souris durant l'examen.

Devenir

Euthanasie de tous les animaux, pour récupération post-euthanasie du sang et des tissus afin de pouvoir faire une confrontation anatomo-pathologique avec les images in vivo.

Remplacement

Dans un but de remplacement, des études préliminaires in vitro ont été réalisées au laboratoire. Cependant, ces conditions expérimentales ne sont pas satisfaisantes car elles ne permettent pas de reproduire les nombreuses voies physiologiques mises en jeu au cours du choc septique. La fuite capillaire est en effet d’origine multifactorielle et le peptide d'intérêt régule de nombreuses voies physiologiques, comme l’inflammation, l’angiogenèse ou le métabolisme lipidique. Notre projet nécessite par conséquent le recours à un modèle animal, qui intègre ces différentes composantes physiologiques.

Réduction

L’IRM permet d’acquérir des données multiparamétriques dans un système expérimental complexe, tel l’animal. Il est donc possible à partir d’un même examen, consistant en acquisitions de plusieurs séquences d’imagerie, d’extraire plusieurs paramètres d’évaluation du tissu musculaire. De plus, la nature non-invasive de l’examen par IRM autorise l’observation du tissu musculaire sans induire de modifications durables de ce dernier. Enfin par son caractère atraumatique, l’IRM offre la possibilité de réitérer un examen sur un même animal sans effet nocif pour les individus rendant possible le suivi longitudinal de l’évolution des pathologies et l’étude de l’efficacité dans le cadre d’essais thérapeutiques. Ces 3 spécificités de la RMN permettent dans le cadre de l’expérimentation in vivo de réduire le nombre d’individus nécessaires à une expérience comme le stipule la règle des 3R avec le 2ème R, Réduire. Les hypothèses du calcul du nombre de sujets nécessaires se basent sur les données préalables acquises lors de la mise au point du modèle. L’effet étudié (choc endotoxémique) touche tous les individus exposés et la différence entre individus exposés et contrôles est très nette, ce qui permet de faire un calcul de puissance a priori. Le nombre total d’individu nécessaire pour tirer une conclusion est de 12 individus. Les sous-groupes d’animaux sont ainsi au minimum de 6 individus. Des tests statistiques étayeront l’interprétation fiable des résultats avant de tirer des conclusions.

Raffinement

L’IRM répond enfin au 3ème R de la règle des 3R, Raffinement, grâce au développement constant des outils méthodologiques couplé aux progrès technologiques au niveau électronique qui permettent d’atteindre des résolutions en préclinique environ 3000 fois supérieures à celles obtenues sur les aimants cliniques de pointe. De plus, le raffinement avant expérimentation s’applique aussi à l’hébergement des animaux en groupes dans des cages à usage unique sur des portoirs ventilés et en enrichissant l’environnement à l’aide de papier absorbant et de tubes en carton pour la fabrication de nids. La phase d'induction du sepsis sera couverte systématiquement par une analgésie et la survaillance du comportement et de l'état général des souirs permettr a de définir des points limites qui justifieraient une euthanisie prématurée. De plus, toutes les expérimentations IRM se feront sous anesthésie gazeuse afin de maintenir les animaux immobiles pendant les acquisitions et réduire ainsi tout stress pendant l’examen. La température corporelle de l’animal est maintenue autour de 38 degrés à l’aide d’un tapis chauffant et la fréquence respiratoire est contrôlée en permanence pendant toute la durée de l’examen à l’aide d’un capteur pneumatique amagnétique. Tous les animaux seront surveillés quotidiennement en accord avec la législation en vigueur par du personnel compétent afin de s’assurer du bon état de santé de ces derniers.

Choix des espèces

Le choc septique constitue un enjeu de santé publique majeur et est responsable importante dans le monde. En recherche fondamentale, on peut mimer certains aspects du choc septique, en particulier la perméabilité des vaisseaux sanguins qui augmente drastiquement, provoquant ainsi une fuite majeure du plasma. Les souris miment bien cette réponse, mais la tolèrent mieux que l’homme. La souris d’âge adulte jeune représente ainsi un modèle bien établi pour étudier la réponse inflammatoire induite sans entrainer une surmortalité. Le présent projet a été mis en place chez la souris et a déjà reçu une autorisation par le Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche. L’évaluation par IRM in vivo vient en complétement à des tests faits sur ce même modèle avec une vision d’applicabilité en clinique humaine.

Irradiées pendant trente minutes puis greffées par injection intraveineuse, 120 souris reçoivent ensuite un régime riche en cholestérol pendant seize semaines, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées par ponction intracardiaque sous anesthésie pour prélever les plaques formées dans leurs vaisseaux. L'irradiation détruit les cellules de leur moelle osseuse et provoque une immunodépression compensée par quatre semaines d'antibiotiques dans l'eau de boisson, avec des atteintes intestinales possibles, une perte de poids, de la fatigue et un grisonnement des poils. Le porteur écrit par ailleurs que "l'irradiation est quant à elle indolore".

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires et notamment les complications aigues de l’athérosclérose restent la première cause de mortalité chez l’homme dans le monde. L'athérosclérose est une maladie où des plaques se forment dans les artères, bloquant le flux sanguin et augmentant les risques cardiaques. Dans ces conditions, une réponse inflammatoire s’établit au niveau de la paroi des vaisseaux sanguins entrainant l’activation des cellules immunitaires, qui absorbent alors de grandes quantités de lipides et de cholestérol entrainant alors la formation de la plaque. Les stratégies thérapeutiques existantes ne permettent de réduire que partiellement le risque cardiovasculaire. Il est donc urgent de trouver de nouvelles approches thérapeutiques. Certains types de lipides, notamment les oméga-3 et oméga-6 auraient un rôle important dans la réponse inflammatoire associée à la formation des plaques. Ces lipides en particulier représente alors une piste d’intervention nutritionnelle et thérapeutique prometteuse. Le but du projet est d’étudier l’influence d’une modification de la composition en lipide spécifique au système immunitaire sur développement de l’athérosclérose chez la souris, par un enrichissement plus ou moins important de lipides du type oméga-3, tout en étudiant l’impact du rapport de quantités d’oméga-3/oméga-6. Le développement de l’athérosclérose sera examiné dans un modèle de souris génétiquement modifiées prédisposées à la maladie, dont le système immunitaire sera spécifiquement soit enrichi en lipides de type oméga-3, soit fortement enrichi en lipides oméga-3 au détriment des lipides oméga-6 . Ces souris seront nourries avec un régime riche en cholestérol, nécessaire au déclenchement de la maladie. Ce modèle d’athérosclérose est similaire au développement de la maladie chez l’Homme.

Bénéfices attendus

L'athérosclérose est une maladie vasculaire résultant de l'accumulation de lipides dans les artères, formant alors des plaques dans ces vaisseaux sanguins. Les plaques empêchent la circulation sanguine et provoquent des maladies cardiovasculaires. Chez l’homme, l’athérosclérose est un facteur de risque majeur dans les maladies cardiovasculaires, qui est la première cause de mortalité. Il existe de nombreux types de lipides différents qui composent cette plaque. Certains de ces lipides auraient un rôle protecteur, notamment les lipides dit de type « oméga-3 ». La composition relative des différents types de lipides les uns par rapport aux autres auraient également un impact, notamment le rapport des quantités des lipides oméga-3 sur les lipides oméga-6. La composition en oméga-3, et plus largement une composition relative enrichie en oméga-3 sur les autres types de lipides permettraient de limiter la formation de la plaque. Cet effet serait médié par un impact sur les cellules du système immunitaire présentent dans la plaque, en limitant l’inflammation néfaste associée. Modifier la composition de ces plaques, par exemple par des approches médicamenteuses ou nutritionnelles, semble alors une piste thérapeutique prometteuse. Cependant, avant de pouvoir arriver à ces approches, il est nécessaire de comprendre si une modification de la composition des lipides est capable d’impacter réellement la formation des plaques, en modifiant positivement le comportement des cellules inflammatoires impliquées dans la formation des plaques, limitant ainsi la maladie et le risque cardiovasculaire. La mise en place d'un protocole expérimental impliquant une greffe de moelle osseuse après irradiation permettra de simuler un environnement riche en oméga-3 spécifique aux cellules immunitaires dont font partie les macrophages et d'évaluer les effets protecteurs potentiels des oméga-3 contre cette maladie. En fin de compte, une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques pour traiter ou prévenir les maladies cardiovasculaires associées à l'athérosclérose.

Procédures

- Prise de sang (2 prélèvements ponctuels espacés de 5 semaines) - Transport (1h, 1 aller-retour) - Irradiation (30 min) - Injection intraveineuse caudale unique et ponctuelle (greffe, 1 injection bolus) - Régime riche en cholestérol (16 semaines) - Ponction sanguine intracardiaque terminale sous anesthésie gazeuse

Impact sur les animaux

De faibles douleurs peuvent être occasionnées après les prises de sang et l’injection intra-veineuse, ainsi qu’un inconfort ponctuel pendant la contention des animaux lors de ces manipulations. Un tube de contention sera utilisé pour l’injection intra-veineuse afin d’éviter tout mouvement indésirés de l’animal, minimiser le temps de la procédure et favoriser le bon déroulement de l’injection. Cette contention entraine une gêne provisoire de quelques minutes et peut être stressant pour l’animal. Les animaux seront manipulés de manière hebdomadaire pour effectués les pesées. L’irradiation peut entrainer les effets suivants : - Immunodépression : Destruction des cellules de la moelle osseuse entrainant un risque infectieux augmenté. Cet effet sera compensé une fois la prise de la greffe effectuée. Les souris seront soumises 4 semaines à une antibiothérapie, pouvant entrainer certains effets secondaires propres à l’antibiotique (principalement des réactions allergiques, cependant rares). - Affaiblissement général se traduisant par une perte de poids et de la fatigue. - Atteintes intestinales : L'irradiation peut endommager les cellules épithéliales du tractus gastro-intestinal, pouvant entrainer des troubles digestifs et une absorption réduite des nutriments (contrôlé par une pesée régulière) - Altération de la peau et des poils : Grisonnement localisé des poils possible et ralentissement de la repousse. Le transport est stressant pour les souris, mais tout sera fait pour limiter l’inconfort des souris.

Devenir

La mise à mort des animaux est nécessaire pour la détermination des lésions. Les plaques dans les vaisseaux sanguins seront prélevées pour en déterminer la composition.

Remplacement

L’athérosclérose est une maladie complexe qui ne peut pas être mimée in vitro. Elle implique des interactions entre l’inflammation, les lipides, le cholestérol, le flux sanguin, mais également entre différents tissus comme le foie ou le tissu adipeux. Il est possible in vitro d’étudier ces différents acteurs impliqués dans cette maladie séparément, mais seule l’utilisation de modèles animaux présentant une athérosclérose proche de celle de l’Homme peut permettre de tenir compte de tous ces éléments ensembles, et ainsi permettre une meilleure compréhension globale de cette maladie. Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces.

Réduction

Un modèle mathématique, tenant compte de nos variables d’intérêts ainsi que les différences nécessaires afin de pouvoir conclure à de réelles différences entre nos groupes, nous a permis de réduire le nombre d’animaux à 15 par groupe, ce chiffre correspondant au nombre minimum nécessaire pour avoir des données exploitables par la suite. Les différences attendues sont des différences dans la formation des plaques dans les vaisseaux sanguins ainsi que des paramètres qui lui sont associées. Les expériences seront réalisées chez des souris mâles et femelles afin de tenir compte du dimorphisme sexuel. Enfin les expériences seront répétées une deuxième fois afin de confirmer la reproductibilité des résultats obtenus.

Raffinement

Le transport est stressant pour les souris. Tout sera fait pour limiter l’inconfort et le stress des animaux pendant cette étape (Enrichissement, gel diet, voiture climatisée). L’irradiation est quand-a-elle indolore. Les souris seront transférées dans de nouvelles cages propres à leur retour et un temps de repos de 2h minimum sera respecté pour limiter un stress trop important. Ce délai est nécessairement court puisque la greffe doit être rapidement effectuée. L’irradiation supprime le système immunitaire. 2 à 4 semaines sont nécessaire à la greffe pour fournir de nouveau un système immunitaire entièrement fonctionnel. Ceci sera pallié par 4 semaines d’antibiotiques, dilués dans l’eau de boisson et renouvelés quotidiennement, pour limiter le risque infectieux. Durant cette période, et pendant l’injection de la greffe, tout sera fait pour garder les souris dans un environnement propre et exempt de pathogènes. L’injection et les différentes prises de sang se feront après application d’un anesthésique local. Un tube de contention conçu pour restreindre le temps de confinement et le risque de mouvement indésirable de la souris pendant l’injection sera utilisé afin de réduire le temps de manipulation des souris. Le prélèvement sanguin terminal par ponction intracardiaque se fera sous anesthésie gazeuse, la souris sera maintenue à 37°C via un plateau chauffant le temps de la ponction, de la lidocaïne sera appliquée localement sur le site d’insertion de l’aiguille. L’animal sera ensuite euthanasié pour effectuer les différents prélèvements. Le milieu d’hébergement sera enrichi (objet pour se cacher, nid). Les animaux seront hébergés en groupe de 5 à 10. La mise sous régime riche en cholestérol entrainera la formation de plaque dans les vaisseaux sanguins des souris, celles-ci sont indolores et asymptomatiques.

Choix des espèces

Le modèle de souris prédisposées à l’athérosclérose utilisé dans ce projet est un modèle bien décrit dans la littérature pour l’étude du développement de l’athérosclérose, et est transposable au développement de la maladie telle qu’elle est observée chez l’homme. De plus, le métabolisme des lipides entre l’homme et la souris est bien connu et fortement similaire chez les deux espèces. Des animaux adultes (8 semaines) seront utilisés, l’athérosclérose étant une maladie s’installant sur le temps et touchant la population adulte.