Système cardiaque

Pour vérifier chez l'animal vivant qu'un gène de l'horloge biologique commande les flux d'ions du cœur, 18 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour prélèvement d'organes. Chacune reçoit un capteur implanté sous la peau au cours d'une chirurgie de vingt minutes, capteur qui reste en place onze à douze jours, durée pendant laquelle le porteur reconnaît un inconfort permanent et des bagarres entre animaux le temps de la cicatrisation. Six injections dans l'abdomen complètent le protocole. Les 60 000 morts subites cardiaques annuelles en France servent à situer l'enjeu, la protéine étudiée n'étant présentée comme cible thérapeutique possible qu'à plus long terme.

Objectifs

Les maladies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi elles, l’insuffisance cardiaque a un pronostic grave, avec plus de 75% des hommes et plus de 50% des femmes décédant 5 ans après le diagnostic, la mort subite cardiaque restant la cause majeure des décès. La mort subite est due à des arythmies, c’est-à-dire des anomalies dans le rythme des battements cardiaques. Il est aujourd’hui connu que ces arythmies mortelles sont plus fréquentes à certains moments de la journée, particulièrement le matin au moment du réveil, et à un moindre degré dans la soirée. En revanche, on ne comprend pas complètement pourquoi ce sont ces moments en particulier. Même si l’activité du cerveau et d’autres variations d’hormones sont impliquées dans ces rythmes de la journée, un mécanisme moléculaire au niveau des cellules cardiaques, l’horloge biologique, pourrait également être impliqué. En effet, bon nombre de fonctions biologiques et de maladies, incluant l’activité électrique cardiaque, suivent une horloge biologique journalière interne. Ce système est double : il y a une horloge principale centrale située dans le cerveau, et des horloges présentes dans presque tous les tissus et cellules de l’organisme, dont le cœur. Le fonctionnement de ces horloges repose sur l’expression locale de gènes « horloge » selon un rythme régulier, d’environ 24h. Nous avons prouvé in vitro qu’un des gènes de cette horloge cardiaque serait le dernier maillon qui contrôle les variations des flux d’ions des cellules du cœur. Ces flux d’ions sont essentiels à la fonction cardiaque et leurs perturbations engendrent les arythmies. Nous avons mis en évidence ce nouveau lien entre l’horloge journalière et la fonction cardiaque au niveau cellulaire et le but de ce projet est confirmer cela in vivo.

Bénéfices attendus

De nombreuses fonctions du corps (sommeil, température, fréquence cardiaque...) sont régulées selon un rythme de 24h. Les battements cardiaques sont notamment rythmés par nos phases d’activité et de repos, elles-mêmes commandées par une horloge biologique. Cette horloge repose sur l’expression de gènes « horloge » dans le cerveau et les cellules cardiaques. De même, les maladies cardiovasculaires sont plus fréquentes à certains moments de la journée : les morts subites cardiaques sont dues à des anomalies des battements cardiaques et sont plus nombreuses au moment du réveil. Ces morts subites cardiaques touchent environ 60 000 personnes par an en France et sont encore incomprises. Nous avons mis en évidence dans des études in vitro et ex-vivo un gène qui serait le médiateur final contrôlant les variations journalières des flux d’ions dans les cellules du cœur. La confirmation in vivo de ce rôle offrirait non seulement une meilleure compréhension du contrôle selon le rythme journalier du rythme cardiaque normal et mais aussi des pathologies qui découlent de sa dérégulation, comme les morts subites. A plus long terme, cette protéine pourrait être une nouvelle protéine clé à la fois pour le diagnostic prédictif des morts subites et comme nouvelle cible thérapeutique dans le champ des maladies cardiaques mais pas seulement.

Procédures

Tous les animaux vont être implantés sous la peau avec un capteur qui permet de mesurer et transmettre l’activité électrique cardiaque ; c’est une opération chirurgicale d’environ 20 minutes; le capteur reste en place environ 11 à 12 jours. Des mesures par télémétrie sont ensuite effectuées pendant 24h sans isoler les animaux. Tous les animaux recevront 6 injections intra-péritonéales d’un agent pharmacologique ou de son véhicule; chaque injection dure moins de 5 secondes.

Impact sur les animaux

La chirurgie pour l’implantation de capteurs peut entrainer une douleur dues aux sutures ainsi qu'un inconfort de l'animal. La douleur suite à l’intervention chirurgicale peut durer quelques jours jusqu’à cicatrisation complète. L’inconfort dû au capteur est présent tout le temps d’implantation c’est-à-dire 11 jours (1 semaine de repos après implantation, 3 jours de traitement et 24h d’enregistrement). Pendant la phase de cicatrisation, on observe parfois des comportement d’agressivité entre animaux. Les injections intrapéritonéales avant l'enregistrement du rythme cardiaque peuvent induire un stress léger chez l'animal, dû à la contention, de très courte durée.

Devenir

A la fin de la préocédure, tous les animaux sont euthanasiés car nous avons besoin de prélever les organes pour des analyses de biologie moléculaire.

Remplacement

Cette étude est un complément à une étude in vitro sur cellules très poussée, qui a permis d’identifier un nouvel acteur de l’horloge biologique dans le cœur. Néanmoins, au vu du niveau de complexité et de la spécialisation des cellules cardiaques, aucun système cellulaire (lignées, organoïdes, organes bio-artificiels ou organs-on-a-chip) ne permet de récapituler totalement la fonction et le dysfonctionnement cardiaque. Les modélisations par ordinateur ne sont pas non plus suffisantes pour mimer une telle complexité. Le cœur est un organe complexe, composé anatomiquement de plusieurs compartiments et physiologiquement de plusieurs tissus spécialisés. En complément des études déjà réalisées in vitro, il est indispensable d’étudier le cœur intégré à l’organisme. La souris est un bon modèle car les gènes étudiés sont conservés

Réduction

Une planification à l’aide de logiciels de statistiques nous a permis de déterminer le nombre d’animaux minimum nécessaires pour obtenir des résultats fiables. En fin d’expérimentation, les animaux seront euthanasiés et des expériences de biologie moléculaire seront effectuées afin d’optimiser les ressources à notre disposition.

Raffinement

Les animaux élevés au sein de l’animalerie seront pris en charge et observés de leur naissance à leur euthanasie. Les cages des animaux seront enrichies et les animaux seront suivis par un personnel spécifiquement formé. Les animaux seront hébergés en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles, dans une pièce où les paramètres environnementaux (Température, hygrométrie, lumière) et sanitaires sont contrôlés. Les souris feront l’objet d’une surveillance quotidienne et de pesées régulières en fonction des procédures. Une grille de score a été définie, évaluant les paramètres suivants: apparence, comportement naturel, hydratation, signes cliniques et comportement provoqué. Des points limites, en fonction du score obtenu selon cette grille, ont été décidés, menant à l’administration d’analgésie supplémentaire ou à l’euthanasie. Toutes les procédures impliquant une chirurgie sur l'animal seront pratiquées en utilisant des anesthésiques et analgésiques.

Choix des espèces

La souris constitue un bon modèle cardiovasculaire car c’est un mammifère possédant un cœur à 4 cavités et une physiologie semblable à l’être humain. De plus, les gènes horloge sont hautement conservés entre tous les mammifères. Enfin, cette espèce est la plus couramment utilisée comme modèle d'étude de la fonction cardiovasculaire. Ainsi, ces animaux représentent un bon modèle sur le plan physiologique et génétique. Nous souhaitons étudier des animaux adultes, avec un cœur complètement développé, donc d’environ 8 semaines.

Pour étudier comment une leucémie lymphoblastique B de mauvais pronostic se répartit dans le corps et résiste aux traitements, des cellules de patients rendues lumineuses sont greffées à des souris immunodéprimées. 1310 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin pour des prélèvements. Elles reçoivent deux injections de cellules leucémiques, trois injections de chimiothérapie pour une partie d'entre elles, jusqu'à 12 prises de sang ou deux ponctions de moelle osseuse au genou, et des séances d'imagerie sous anesthésie. Le porteur indique que leur état peut se dégrader rapidement, avec perte de poids et, aux stades avancés, difficultés respiratoires, anémie, parfois masses sous la peau, inactivité et prostration, et que la ponction au genou peut léser le cartilage. Il dit avoir défini des "points limites précoces" sans en donner aucun seuil.

Objectifs

Sur la base de données cliniques obtenues au laboratoire à partir de patients atteints d’un cancer du sang d’un sous-type particulier de mauvais pronostic, les objectifs de notre projet de recherche sont de déterminer l’implication, dans le processus de développement et de la résistance aux traitements de cette leucémie, de deux protéines retrouvées dans les cellules malades de ces patients. Pour cela, nous développerons un modèle de greffe chez la souris de cellules de patients, qui expriment une protéine qui émet de la lumière, et où la présence de ces deux protéines sera éventuellement modifiée. Nous pourrons ainsi suivre la distribution des cellules leucémiques dans la souris greffée grâce à des méthodes d’imagerie du petit animal. Ce modèle, s’il mime cette hémopathie humaine, nous permettra de mieux comprendre les mécanismes responsables de la résistance aux traitements de ce type de leucémie chez l’Homme. Ces connaissances nous ouvriront de nouvelles pistes pour développer des thérapies adaptées à ce sous-type particulier de leucémie lymphoblastique qui échappe aux thérapies conventionnelles.

Bénéfices attendus

Ce projet s’intègre dans un projet de recherche translationnelle, à partir d’observations cliniques, qui ont permis de mettre en évidence l’expression massive de deux protéines pour un sous-groupe particulier de patients atteints de cancer du sang de mauvais pronostic. Une meilleure compréhension des mécanismes de développement de la maladie et de sa résistance aux traitements permettra d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Des modèles murins nous permettront d’une part, de contrôler l’expression des deux protéines et d’étudier les conséquences de leur expression sur la distribution des cellules cancéreuse dans la moelle osseuse. Une meilleure connaissance des processus de dissémination des cellules leucémiques est nécessaire pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. Le projet décrit ici est intégré dans un projet plus vaste qui inclut plusieurs groupes de recherche et, entre autres, le criblage de molécules sur des lignées cellulaires de patients de ce sous-groupe de leucémie pour identifier de nouveaux médicaments qui permettraient de cibler ces cellules leucémiques particulières, et de guérir les patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à une injection sur animal vigile en contention ou injection sur animal anesthésié pour les greffes de cellules leucémiques, deux injections. Pour les animaux traités par chimiothérapie, trois injections de produits chimiques seront réalisées au cours de la procédure. Pour suivre l’évolution de l’hémopathie attendue, 2 à 12 prises de sang, à raison d’une prise par mois ou au maximum deux prélèvements de moelle osseuse (réalisés sur animal anesthésié, avec au minimum 2 mois entre les deux prélèvements), pourront être réalisés sur la souris. Les souris seront anesthésiées pour suivre la distribution des cellules qui émettent de la lumière dans un appareil dédié. La durée des chaque geste ne dépasse pas 10 minutes.

Impact sur les animaux

Suite à l’injection de cellules leucémiques, les souris sont susceptibles de développer une leucémie. La majorité des effets délétères sera dûe à l’émergence de cette maladie : l’état de santé des souris greffées peut se dégrader rapidement, nécessitant un suivi très régulier. Les leucémies entrainent une forte perturbation de la formule sanguine : en conséquence, elles perdent du poids et, dans les stades avancés, présentent des signes de dyspnée, d’anémie, parfois des masses sous la peau, deviennent inactives et prostrées, avec un pelage non entretenu. L’imagerie de bioluminescence nécessite l’injection de luciferine en I.P. et une anesthésie des souris ce qui peut constituer une nuisance temporaire généralement bien supportée. La ponction de moelle osseuse étant réalisée au niveau du genou, la souris peut avoir des lésions au niveau du cartilage qui peuvent provoquer des douleurs et perturber temporairement ses déplacements. Enfin, il existe toujours un risque d’infection ou d’inflammation au niveau des points de ponction ou d’injection.

Devenir

Les animaux seront mis à mort à la fin des procédures pour prélèvements et analyses ultérieures. Ils ne pourront donc pas servir pour d'autres expérimentations.

Remplacement

L’impact des modifications d’expression de CDX2 et/ou UBTF-ATXN7L3 sur la cancérogénèse et la distribution dans le corps de la souris des cellules leucémiques avant et après traitement chimiothérapeutique sera établi in vivo dans les modèles murins de greffes. Ce modèle permet le suivi de cellules leucémiques dans leur environnement médullaire qui est un environnement complexe difficilement modélisable in vitro ou ex vivo, et dans un environnement extra-médullaire. Cette étude de la biodistribution des cellules leucémiques nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Les études mécanistiques associées, non décrites ici, seront réalisées à partir de modèles de cultures ex vivo de cellules de moelle osseuse issues de ces souris et/ou de lignées cellulaires en culture mais ne peuvent pas répondre aux questions abordées par un modèle murin in vivo dans lequel la distribution médullaire et extra-médullaire peut être suivie et où l’interaction avec les cellules de la niche est essentielle. L’utilisation d’un autre modèle animal, par exemple le poisson zèbre, ne permettrait pas non plus de récapituler la complexité du système hématopoïétique des mammifères.

Réduction

Les chiffres indiqués dans le dossier correspondent au nombre estimé maximal d’animaux utilisés pour les expériences envisagées. Le projet repose sur une étude longitudinale avec réalisation de prélèvements répétés sur les mêmes animaux en respectant les délais réglementaires permettant une récupération complète des animaux entre chaque prélèvement. Sur la base de notre expérience et de la littérature, en tenant compte de la variabilité observée dans les études précédentes entre les animaux eux-mêmes, et en estimant que nous aurions au minimum une différence de moyenne entre les groupes de 30%, un nombre d’animaux minimum et suffisant a été déterminé par fonction mathématique à 10 animaux par groupe au minimum pour obtenir des résultats robustes et fiables statistiquement. De plus, la possibilité d’imager les animaux, d’analyser la numération sanguine des animaux par prise de sang et d’immunophénotyper les cellules de moelle osseuse ponctionnées au niveau du genou permet une étude longitudinale et ainsi, de diminuer le nombre des animaux utilisés.

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupes dans des conditions sanitaires contrôlées et permettant un bien-être optimal dans des portoirs ventilés (igloo, tubes de cellulose pour la fabrication des nids, balançoires, litière dépoussiérée). Ils seront acclimatés au moins deux semaines après leur arrivée à l’animalerie et avant le début de toute procédure. Les procédures ont été établies afin de réduire au maximum le stress et la souffrance des animaux soumis aux expérimentations. Une anesthésie sera pratiquée pour certain protocole pour limiter le stress et la douleur. Les animaux seront surveillés quotidiennement durant les procédures. En cas de signes d’infection, la plaie sera traitée avec un antiseptique local. En cas de signes de douleur, les animaux recevront un traitement analgésique. Des points limites précoces ont été définis afin d’interrompre les procédures et limiter la souffrance animale et garantir le bien-être animal.

Choix des espèces

L'espèce utilisée est la souris (Mus musculus) qui représente l’espèce animal la plus propice pour ce type d’étude pour les raisons suivantes : •nombreux protocoles bien établis pour cette espèce •possibilité d'avoir accès à des animaux génétiquement modifiés, notamment permettant les greffes de cellules humaines sans rejet (animaux immunodéprimés) •modèles mimant très bien les cancers hématologiques et qui ont déjà fait l’objet de nombreuses applications dans le domaine. Ce seront des animaux adultes de 8 semaines minimum qui seront utilisés car les potentielles applications thérapeutiques s'adresseront à une population humaine adulte.

Des constricteurs posés autour des carotides pour réduire peu à peu le débit sanguin du cerveau, une pompe implantée sous la peau pour élever la pression artérielle : 894 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les souriceaux sont génotypés à dix jours par tatouage des phalanges, et les adultes passent cinq jours d'apprentissage d'une tâche avant une injection rétro-orbitaire de traceur et un prélèvement de liquide céphalo-rachidien. Le porteur qualifie l'hypertension et la baisse de flux sanguin qu'il provoque de pathologies "asymptomatiques", tout en listant comme complications possibles des accidents cérébro-vasculaires reconnaissables au déplacement en cercle et des infarctus cardiaques laissant l'animal prostré. Toutes sont tuées à la fin des trois procédures pour prélever leurs organes.

Objectifs

La découverte de barrières biologiques, telles que la barrière hémato-encéphalique (BHE), la barrière hémato-encéphalique (BCSFB) a montré comment le cerveau est séparé et protégé du reste du corps. La première barrière, BHE, est une structure spécialisée formée de cellules endothéliales microvasculaires cérébrales, qui tapissent les capillaires cérébraux. Cette barrière est cruciale pour maintenir le microenvironnement cérébral en contrôlant l’entrée et la sortie de diverses substances. Le plexus choroïde est une autre structure critique du système vasculaire du cerveau, responsable de la formation de la barrière hémato-céphalorachidienne (BCSFB). Le plexus choroïde est constitué d'une couche de cellules épithéliales qui tapissent les ventricules du cerveau et produisent le liquide céphalo-rachidien (LCR). Elle se retrouve à l’interface entre le liquide cérébro-spinal et le cerveau. Ces barrières sont des composants essentiels des mécanismes de protection du cerveau, assurant un environnement contrôlé pour la fonction neuronale et protégeant contre les agressions toxiques. Lorsque cette intégrité est altérée, la fonction de barrière est compromise, ce qui peut initier des problèmes de dégénérescence neuronale. On parle alors de démence vasculaire. Ainsi, il est important de comprendre les mécanismes cellulaires régulant les fonctions physiologiques de la barrière hémato-encéphalique. Ce projet utilisera des modèles murins de souris mutées génétiquement pour des cibles régulant la fonction de la barrière hémato-encéphalique. Nous analyserons l’impact de cette délétion sur la formation postnatale de ces plexus, en physiologie et en pathologie (modèle de rétinopathie induite). Chez l’adulte, nous développerons des modèles pathologiques chez la souris créant soit (1) une hypertension modérée par une diffusion continue d'un vasoconstricteur puissant soit (2) une hypoperfusion graduelle du cerveau.

Bénéfices attendus

La prévalence des maladies neurodégenératives présentant des démences vasculaires augmente constamment avec le vieillissement de la population. La combinaison de modèles murins génétiques et de modèles pathologiques permet d’accroître cette connaissance. Ce projet élucidera les mécanismes moléculaires par lesquels le gène Mcc régule les voies de signalisation Wnt dépendante dans les cellules endothéliales et maintient l'intégrité de la barrière sang-cerveaux. Comprendre ces processus est crucial pour développer des thérapies ciblées contre les troubles neurologiques impliquant un dysfonctionnement de la barrière.

Procédures

Nous analyserons le développement des plexus vasculaires chez le souriceaux chez des animaux modifiés génétiquement et nous développerons 2 modèles pathologiques chez la souris adulte afin de créer (1) un stress d’hypertension systémique (2) un stress d’hypo perfusion cérébrale. Nous analyserons les conséquences sur les troubles de comportement (en analysant la mémoire et les fonctions exécutives à l'aide de test de déplacement), et l’apparition des marqueurs de dégénérescences neuronales et vasculaires. Le modèle de développement néonatal : Nombre d’animaux : 384. Modèle d’hypertension artérielle systémique et trouble cognitif : Nombre d’animaux : 240. Les animaux auront une implantation en sous cutanée de pompe diffusant un agent hypertenseur sous anesthésie gaseuse (durée 10 min) puis 3 semaines après lils seront évalués pour chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours (durée 37,5 min répartie sur 5 jours). Puis 1 semaine après une analyse de la permeabilité cérébrale sera faite sous anesthésie avant de traceur moléculaire en retroorbitaire (1 min) et/ou le prélèvement de liquide céphalo rachidien (5 minutes) sous anesthésie gaseuse avec euthanasie des animaux. Modèle d’hypo perfusion cérébrale : Nombre d’animaux : 270. Les souris adultes (2 mois) auront une implantation de constricteurs autour des carotides sous anesthésie gazeuse (durée 10 min) puis 3 semaines après ils seront analysés chaque jour pour l’apprentissage d’une tache pendant 5 jours (durée 37,5 min répartie sur 5 jours). Puis 1 semaine après une analyse de la permeabilité cérébrale sera faite sous anesthésie avant de traceur moléculaire en retro orbitaire (1 min) et/ou le prélèvement de liquide céphalo rachidien (5 minutes) sous anesthésie gazeuse . Tous les animaux inclus ont été génotypés à 10 jours après la naissance par une méthode de tatouage sur les phalanges.

Impact sur les animaux

Le modèle post natal : nos données préliminaires montrent que la délétion précoce du gène Mcc dans le lit vasculaire n’induit pas de retard de croissance. Mais les altérations du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience : immobilité, arrêt de l’allaitement, exclusion du nid par la mère. Chez l'adulte, les pathologies d'hypertension artérielle générée et de baisse de flux sanguin sont des pathologies asymptomatiques. Les complications aigûes pourront être des accidents cérébro vasculaires (l'animal montre des changements de mobilité, souvent déplacement en cercle) ou des infarctus cardiaques (animal reste prostré peu vigile). Les manifestation aigues du comportement pourront apparaître entrainant un arrêt de l’expérience. Le génotypage par tatouage induit une douleur légère de courte durée.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin des 3 procédures dans le but de prélever leurs organes sur lesquels nous ferons des analyses post mortem.

Remplacement

Ce projet sera réalisé en utilisant des modèles murins qui reproduisent des lésions neuropathologiques avec atteintes des barrières vasculaires du cerveau décrites dans les maladies neurovasculaires, ainsi que les signes cliniques associés à ces maladies, comme les déficits d’apprentissage et de mémoire. L'intégrité vasculaire dépend d'interactions multiples entre différents types cellulaires. Il est encore très difficile d'appréhender in vitro les interactions entre le tissu environnant et les réseaux tridimentionnels des vaisseaux et les altérations du phénotype vasculaire sur la fonction d'un organe (notamment le cerveau). L'expérimentation in vivo en association avec l'utilisation de souris transgéniques délétées spécifiquement dans certain tissu (endothélium...) permet de différencier l'action spécifique de chaque type cellulaire dans le tissu et fournit des informations de mécanismes physiopathologiques impossible à obtenir in vitro. Le recours à un être vivant, mammifère, présentant des caractéristiques partagées avec l'homme est donc nécessaire et les rongeurs représentent un modèle de choix pour réaliser des modèles transgéniques de knockout de gènes d'intérêt. Pour réduire le nombre des animaux sacrifiés, aucune expérience déjà publiée n'est reproduite et lorsque cela est possible les études conceptuelles sont réalisées in vitro sur des cellules en culture avant d'être testé in vivo.

Réduction

Le nombre d’animaux a été déterminé à partir des expériences préliminaires qui ont permis d’identifier le nombre minimum d’animaux à utiliser par groupe pour permettre une analyse des résultats statistiquement significative. Pour réduire le nombre d'animaux, les animaux seront inclus dans plusieurs protocoles expérimentaux (tests de comportement, puis analyse de la permeabilite puis euthanasie pour analyse histologique).

Raffinement

Les animaux sont élevés dans des conditions limitant au maximum le stress et la douleur. Ils sont élevés en groupe dans des cages ventilées maintenant une atmosphère saine avec libre accès à l’eau et à la nourriture. Des jouets/ tubes en carton sont mis à disposition des animaux dans leur cage pour enrichir leur environnement, leur permettre de ronger et de se cacher. Les litières sont dépoussiérées et additionnés de cubes de coton leur permettant de construire des nids. Les opérations chirurgicales (implantation de pompe, ajout de constricteurs, injection en retro orbital de traceurs) sont réalisées sous anesthésie gazeuse et en présence d’un antalgique. Les animaux sont surveillés par la visite quotidienne du zootechnicien. En cas de problème de santé des animaux, l'expérimentateur est immédiatement alerté.

Choix des espèces

La souris est un modèle de mammifère à sang chaud dont le système vasculaire est très similaire à celui de l'homme. C'est actuellement la seule espèce de mammifère dont le génome peut être modifié en routine pour créer des modèles de maladies humaines. Des modèles d'hypertension artérielle et de modification du flux sanguin ont été développés et validés chez la souris, montrant leur utilité pour étudier les altérations cognitives et neuronales. Nous prévoyons d'utiliser : Des souriceaux, car la formation des nouveaux vaisseaux se produit dans les organes jusqu'à environ 4 semaines après la naissance. Des souris adultes, âgées de 6 à 8 semaines et pesant entre 24 et 29 grammes, car leur réseau vasculaire est complètement développé, notamment dans le cerveau.

Surveillées chaque jour pendant vingt-huit jours et notées deux fois par semaine sur une grille de douleur, 336 souris portent sur le dos une mini-pompe qui leur délivre de l'angiotensine II. Elles vont toutes être tuées pour prélever leurs tissus vasculaires, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'implantation dure une quinzaine de minutes sous anesthésie, et le porteur indique que la pompe peut limiter certains mouvements et que les points de suture peuvent s'infecter ou sauter. Le bénéfice annoncé se limite à compléter des expériences déjà commencées pour qu'un article sur la fusion mitochondriale puisse être publié.

Objectifs

​​Le maintien de la pression artérielle normale est dépendant de l’équilibre entre le débit cardiaque et la résistance vasculaire. Lors de la pathologie d’hypertension artérielle, le débit cardiaque reste normal. C’est la résistance vasculaire, due à un remodelage des artères, qui augmente et induit ainsi une élévation de la pression artérielle. ​Lors de l’hypertension, il est observé une augmentation du stress oxydatif en grande partie d’origine mitochondrial. Celui-ci a un impact délétère sur toutes les composantes du vaisseau. Ce stress oxydatif contribue au remodelage vasculaire et donc à l’hypertension. ​Les mitochondries sont capables de fusionner entre elles ou de se séparer. L’équilibre entre fusion et fission est essentiel au bon fonctionnement des cellules. Moins de fusion entraîne une diminution de la fonction mitochondriale. Il nous paraît donc essentiel d’étudier l’impact de ce déficit sur la fonction vasculaire lors de l’hypertension artérielle, pathologie dans laquelle les mitochondries jouent un rôle important.​

Bénéfices attendus

Nos premiers résultats montrent l’implication de la fusion mitochondriale dans la fonction vasculaire lors de l’hypertension arterielle. Nous devons compléter plusieurs expériences pour qu’un article décrivant cette implication puisse être publié.

Procédures

- Pose d’une mini-pompe d’angiotensine II en sous-cutanée sous anesthésie générale : ce geste est réalisé une fois par animal, couplée à une analgésie. La durée d’intervention est d’environ 15 minutes. 336 animaux concernés.

Impact sur les animaux

A la suite de la chirurgie et jusqu’à la fin du protocole (28 jours), l’animal a une mini-pompe implantée sur le dos qui peut limiter très légèrement certains mouvements. Une douleur post-chirurgicale n’est pas attendue car l’intervention est peu invasive. Cependant, l’animal est surveillé jusqu’à la fin du protocole (28 jours) pour dépister une éventuelle douleur. Enfin, une petite infection des points de suture pourrait survenir ou que des points sautent, les animaux étant plusieurs par cage.

Devenir

Les animaux sont mis à mort pour récupérer les tissus vasculaires sur lesquels nous allons mener des expériences.

Remplacement

Aucune alternative à l’utilisation d’animaux vivants ne permet d’étudier la fonction vaculaire dans un contexte physiologique et encore moins pathologique. Le modèle prévu est un modèle standard bien documenté dont l’impact sur l’animal est bien maîtrisé.

Réduction

​​Le nombre d’animaux pour les expériences a été précisément défini à l’aide d’un outil informatique pour avoir assez de puissance statistique lors de l’étude. Des tests statistiques adaptés sont utilisés.​

Raffinement

​​​La pose des pompes osmotiques est un acte chirurgical réalisé sous anesthésie générale et analgésie. La réponse nociceptive des animaux sera régulièrement testée en cours d’intervention. Les éventuelles modifications du rythme cardiaque et respiratoire seront observées pour ajuster au mieux l’anesthésie pendant l’intervention chirurgicale. ​Durant les 28 jours de cinétique, les souris seront surveillées quotidiennement afin de détecter une éventuelle réaction cutanée ou une gêne. ​Même si elle n’est pas attendue, la douleur de l’animal sera évaluée 2 fois par semaine selon une grille d’évaluation de la douleur.​​

Choix des espèces

Les souris génétiquement modifiées représentent des outils spécifiques dans la plupart des domaines de la recherche médicale. La souris est un excellent modèle pour la maladie humaine, l'organisation de son ADN et l'expression de ses gènes sont très similaires à celles de l'homme et peuvent être modifier pour se rapprocher au mieux de la pathologie recherchée. L’ensemble des souris utilisées seront des souris adultes âgées entre 3 et 6 mois, âge qui permet de standardiser le poids de l’animal et la taille des vaisseaux.

2 660 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, avec pour certaines une chirurgie de deux heures pour implanter un émetteur de télémétrie et une autre d'une heure quarante-cinq pour poser une fibre optique dans le cerveau. Ces implants peuvent provoquer des douleurs pendant et après l'opération, et les souris opérées sont ensuite isolées. Viennent les tests comportementaux, dont un test aversif par groupe, sur quatre jours et jusqu'à une heure par séance, pour mesurer comment la fréquence cardiaque module la réponse à un signal de danger. L'effectif est justifié par "un logiciel statistique" et par l'expertise des deux équipes, sans qu'aucun chiffre de calcul ne soit donné pour ces 2 660 animaux.

Objectifs

Les parties centrales et périphériques du système nerveux autonome jouent un rôle clé dans la modulation de la fréquence cardiaque, cette dernière fluctuant en fonction de l’état émotionnel. Ainsi, des études cliniques suggèrent qu’une fréquence cardiaque augmentée (tachycardie) est fréquemment associée à des niveaux d’anxiété élevés. Cependant, nous ne disposons que de très peu d’information sur les mécanismes neuronaux sous-tendant la communication cœur-cerveau et la manière dont celle-ci influence les réponses comportementales associées à des signaux prédictifs de situations dangereuses ou « menaçantes ». Cette étude nous permettra de mieux comprendre les mécanismes sous-tendant la communication cœur-cerveau, ce qui constitue une première étape importante pour le développement d’approches alternatives pour le traitement de troubles anxieux généralisés. La réalisation de ce projet nécessite l'utilisation de souris mâles et femelles non génétiquement modifiées ainsi que de différentes lignées de souris transgéniques ayant une fréquence cardiaque augmentée (tachycardie) ou diminuée (bradycardie) afin de déterminer l’impact de la modulation de la fréquence cardiaque dans le contrôle des émotions.

Bénéfices attendus

A ce jour, les études visant à étudier l’impact de l’altération transitoire ou persistante de la fréquence cardiaque sur le traitement de stimuli prédictifs de menaces restent très parcellaires. De plus, la plupart des études ont été réalisées sur les mâles, alors que le dimorphisme sexuel cardiaque n’est plus à démontrer. Il est donc nécessaire de prendre en compte l’existence de ce dimorphisme sexuel cardiaque dans l’étude de l’impact de la fréquence cardiaque sur l’influence des réponses comportementales associées à des signaux prédictifs de situations « dangereuses ». Cette étude va nous permettre à la fois de mieux comprendre certains des mécanismes qui sous-tendent l’apparition de troubles anxieux, mais aussi de proposer de nouvelles approches thérapeutiques se basant sur une régulation de la fréquence cardiaque pour contrôler des réponses émotionnelles associées à des stimuli aversifs.

Procédures

La procédure prévoit : - Des injections intrapéritonéales (une injection par jour de comportement, 30secondes) - Des tests comportementaux dont certains sont aversifs : durée 45min à 1h sur 4jours (1 seul test aversif par groupe de souris) - Des actes chirurgicaux : implantation de transmetteurs pour la télémétrie (2h) ainsi que la mise en place de fibre optique dans des régions précises du cerveau (1h45)

Impact sur les animaux

La procédure prévoit actes chirurgicaux avec pose d’implants pouvant entrainer des douleurs per et post-opératoires (interventions modérées). Il sera aussi effectué des tests comportementaux pouvant entrainer un stress léger chez l’animal (interventions légères) Enfin la manipulation des animaux peut entrainer une gêne chez ces derniers (interventions légères).

Devenir

A la fin de cette procédure tous les animaux seront mis à mort afin de prélever les tissus pour analyses cellulaires et moléculaires de nos différentes lignées

Remplacement

Notre projet repose sur la caractérisation des mécanismes neuronaux et moléculaires associés à la fois aux modifications de la fréquence cardiaque et aux comportements adoptés face à des situations de danger/menace. Nous ne pouvons donc pas valider notre étude sur des modèles in vitro, l'utilisation d'animaux demeure la seule option à ce jour. La souris est l'organisme modèle le plus pertinent pour cela. En effet la bibliographie disponible montre que les souris fournissent un excellent modèle pour étudier à la fois la fréquence cardiaque et les réseaux neuronaux.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à la fois à un logiciel statistique et à l’expertise acquise par les deux équipes. Cela permet d’allier réduction du nombre d’animaux et validité statistique des expériences. Les souris vont suivre consécutivement différents tests afin de diminuer à la fois le nombre d’animaux utilisé et d’obtenir un suivi longitudinal de l’étude

Raffinement

Les animaux seront hébergés en groupe dans des environnements enrichis (paille en carton, igloo ou maison en carton). Les souris seront isolées suites aux différents actes chirurgicaux. Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque procédure expérimentale. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expériences. Une grille de score avec des points limites sera mise en place dès l’apparition de signes cliniques : dos vouté, poils ébouriffés, comportement anormal, stéréotypies. Si l’animal atteint un des points limites il sera euthanasié. Cependant si l’animal montre des signes de « faiblesse » : la fréquence d’observation des animaux sera augmentée et un traitement adapté à la situation sera administré (désinfectant ou analgésique). Si aucune amélioration du bien être de l’animal n’est observé il sera alors ensuite euthanasié

Choix des espèces

Les souris fournissent des excellents modèles pour l'étude des réseaux neuronaux et des changements de fréquence cardiaque à la fois chez les mâles et les femelles. Nous disposons aujourd'hui de nombreux modèles murins transgéniques qui nous permettront d'atteindre les objectifs de notre projet. De plus sa physiologie générale nous permet de nous rapprocher suffisamment de l'homme pour obtenir des données pertinentes d’un point de vue médical. Nos études seront réalisées avec des souris adultes (entre 8 semaines et 24 semaines), ce qui permettra de travailler sur une système cérébral stable, mature, qui n'évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs semaines

Produire des anticorps polyclonaux à la commande, pour le compte d'équipes publiques ou privées : telle est la finalité de ce protocole, où 150 poules vont être utilisées, deux par commande, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque poule reçoit cinq injections intramusculaires d'un antigène mélangé à l'adjuvant complet de Freund, qui peut provoquer des ulcérations au point d'injection, de la fièvre et une baisse de mobilité. Le porteur présente la récupération des anticorps dans le jaune d'œuf comme un raffinement, puisqu'elle évite les prélèvements de sang, et invoque la recommandation du Centre européen pour la validation des méthodes alternatives. Les poules sont malgré tout toutes tuées au 63e jour, un animal immunisé contre un antigène ne pouvant pas, selon lui, servir à une autre commande.

Objectifs

Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tels que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherches publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de poule. La poule est une hôte d’intérêt, pour le développement d’anticorps dirigés contre des protéines hautement conservées chez les mammifères. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Le protocole durera 63 jours.

Bénéfices attendus

Les anticorps polyclonaux sont des auxiliaires et des réactifs employés dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie. Ils permettront notamment d’approfondir les connaissances nécessaires pour l’avancement de la recherche et le développement de test de diagnostic voir de nouvelles pistes d’applications thérapeutiques.

Procédures

5 injections en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (10 minutes)

Impact sur les animaux

Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à l’adjuvant complet de Freund peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les animaux sont surveillés après injection afin de vérifier qu’aucune douleur n’est apparue.

Devenir

Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole à J63.

Remplacement

La méthode usuelle pour produire des anticorps polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budgets et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.

Réduction

Le nombre d’animaux (2 poules par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique, a été adapté au plus juste par rapport au besoin pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole

Raffinement

Les animaux sont injectés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Dans le but de repérer rapidement toute anomalie, les animaux seront suivis quotidiennement. Toute anomalie sera rapportée au vétérinaire qui jugera s’il est nécessaire de réaliser un examen clinique approfondi et interviendra dans le diagnostic, la prescription et mise en place d’un traitement thérapeutique adapté et/ou des soins divers, dans le but de soigner ou soulager l’animal. La recherche sur la douleur aviaire est limitée, mais une grande partie des connaissances provient de la science du bien-être avec un intérêt pour les pratiques agricoles de routine. Dans ce cadre, une attention particulière sera portée à 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du plumage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). La récupération des anticorps à partir des œufs de poule constitue un raffinement, car les prélèvements sanguins ne sont pas nécessaires. Lors de leur hébergement, les animaux auront des conditions d’hébergement adaptées et optimales (logement, environnement, alimentation, apport en eau, soins). Les paramètres d’ambiance, l’aliment, l’abreuvement seront vérifiés quotidiennement. De plus, les poules disposeront d’un environnement enrichi (miroir, perchoir, bloc à picorer, thon, courgette, vers de farine,…)

Choix des espèces

La poule est utile pour la production d’anticorps contre des protéines de mammifères, car elle est éloignée phylogénétiquement de la classe des Mammalia. L’utilisation de poules pondeuses est en totale conformité avec le principe des 3R et cette méthode est fortement recommandée depuis un certain temps par le Centre Européen pour la Validation des Méthodes Alternatives. Il s'agit d'un raffinement du protocole de production d'anticorps, car ces derniers peuvent être extraits du jaune d’œuf sans avoir à prélever du sang sur l’animal. Un autre avantage est que les poules pondeuses sont capables de produire des anticorps en plus grande quantité, ce qui réduit le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir les anticorps. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les poules entreront en protocole dès l’âge de 5 mois. Auparavant elles auront subi une période de quarantaine de 14 jours, et si les animaux ne présentent aucun signe clinique, elles seront aptes à rentrer en protocole.