Système cardiaque
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Impact de l’inhibition de la synthese d’aldosterone dans l’hypertension arterielle chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une minipompe implantée sous la peau en quinze minutes, un régime alimentaire modifié, puis des séjours en cage à métabolisme de huit heures répétés trois fois et un de vingt-quatre heures : 336 rats vont être utilisés dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Cinq jours de suite, un ballonnet gonflable serré sur la queue mesure leur pression artérielle pendant un quart d'heure. Le porteur attend une perte de poids, une augmentation de la diurèse, des douleurs et un risque d'infection après l'opération, et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l'anesthésie. Tous sont tués en fin de protocole pour le prélèvement du sang et des organes, l'objectif étant de comparer un nouvel inhibiteur de l'aldostérone synthase à un traitement existant.
Objectifs
L'hypertension arterielle et ses complications cardiovasculaires et rénales a une très forte prévalence en Europe et augmente avec l'age pour atteindre près de 50 pour cent après 60 ans . L'hypertension arterielle participe au cercle vicieux liant insuffisance rénale chronique (IRC) et pathologies cardiovasculaires. Il est important de comprendre les mécanismes sous-jacents des interactions entre vaisseaux, rein et coeur et d’identifier des thérapeutiques permettant de limiter ces comorbidités. Les données recueillies chez l’Homme et l’animal montrent que l’aldostérone, une hormone produite par les glandes surénales, joue un rôle important et induit inflammation et fibrose tissulaire, ce qui joue un rôle critique dans le remodelage rénal et cardiaque induit par l'hypertension artérielle. L'aldostérone a également un role crucial dans la balance hydrosodée, régulant l'excretion rénale de sodium et potassium. Les objectifs du projet sont d'étudier les conséquences de l'inhibition de la synthèse d'aldostérone par un nouvel inhibiteur spécifique de l'aldostérone synthase sur la balance hydrosodée et la pression artérielle, en comparaison avec celle d'un inhibiteur du récepteur de l'aldostérone.
Bénéfices attendus
L’insuffisance rénale chronique (IRC) dont la prévalence est d’environ 10 pour cent en europe, selon les pays, a des conséquences cardiovasculaires majeures avec une morbidité et mortalité importantes ce qui représente un cout sociétal considérable. Le nombre de décès liés à l’IRC est estimé à 1,5 million dans le monde et est la 5ieme cause de perte d’année de vie. La proportion de sujets en France ayant une qualité de vie altérée variait de 20 à 50 pour cent dans les dimensions à composante physique selon le degré d’IRC. Le but du projet est de tester l'effet d'un nouvel inhibiteur pharmacologique de l'adosterone synthase, ces résultats permettront de proposer des alternatives thérapeutiques aux patients souffrant de l'IRC.
Procédures
Les animaux sous soumis à diverses interventions. Une minipompe délivrant un produit sera implantée sous anesthésie et analgésie (1 fois, 15 min). Certains animaux seront mis sous régimes spéciaux (animal vigile). Pour le recueil des urines (3 fois pendant 8h, une fois pendant 24h) un hébergement individuel temporaire est nécessaire (animal vigile). La mesure de la pression artérielle est réalisée cinq fois sur 5 jours consécutif pendant 15 min (animal vigile). Elle consiste à placer un ballonnet gonflable sur la queue de l’animal puis à mesurer la pression du ballonnet à laquelle le pouls est de nouveau perçu. L’euthanasie est réalisée selon une méthode réglementaire en fin de période expérimentale après prélèvement sanguin sous analgésie et anesthésie (1 fois, quelques minutes).
Impact sur les animaux
Les effets indésirables notoires seront 1) la baisse de la thermorégulation et dans de rares cas une détresse cardiorespiratoire à l’anesthésie (implantation de la minipompe) 2) la douleur et les risques d’infection suite à l’intervention chirurgicale, 3) les conséquences de l'hypertension artérielle (perte de poids, perte d’appétit, diurèse augmentée) 4) le régime alimentaire spécial et les traitements peuvent entrainer une perte de poids et modifier la mobilité et le comportement des animaux, 5) l’hébergement individuel temporaire dans les cages à métabolisme pourra engendrer un stress social mais les animaux seront dans la même pièce que leur congénères 6) le stress lié à la manipulation et la contention durant la prise de pression artérielle 7) le stress et la douleur légère de courte durée au site de prélèvement de sang avec un risque minime d'hémorragie.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés en fin de procédure car des analyses biochimiques sanguines (composition, molécules pro-inflammatoire) ainsi que des analyses sur organes prélevés sont obligatoires pour mener à bien ce projet.
Remplacement
Cette recherche est de type fondamentale. Nous avons besoin de réaliser des expériences in vivo chez le rat afin de pouvoir confirmer nos données obtenues in vitro. Cette étude ne peut être conduite qu'in vivo car il n’y a pas de modèles alternatifs pour l’étude intégrée et multi-organes de l’activation du récepteur minéralocorticoïde par l'aldostérone et de la signalisation sous-jacente dans l'hypertension et le syndrome cardiorénal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu.
Réduction
Le nombre total d’animaux sera de 336 rats. Ce nombre a été calculé pour s'assurer de la faisabilité du projet pour mettre en évidence des différences statistiques entre les résultats de nos différents groupes. Nous chercherons à regrouper les expérimentations dans le but de réduire le nombre d’animaux contrôles. L’étude sera arrêtée si les expériences initiales ne confortent pas l’hypothèse de travail.
Raffinement
Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mis au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress. Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation avec un cycle jour nuit automatique: les animaux sont hébergés avec leurs congénères en portoirs ventilés avec un système d’abreuvement automatique et un accès à volonté à la nourriture et l’eau. Le milieu est enrichi avec un des enrichissements ci-après: carré de lanière kraft et batonnet en bois. Un enrichissement pour se cacher et grimper pourra être ajouté (tunnel, hutte ou équivalent en PVC ou autre). Les conditions de températures et d’hygrométrie sont contrôlées et monitorées. Les animaux sont vérifiés quotidiennement. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive, des soins adaptés. La prise alimentaire sera contrôlée pendant les traitements et les analyses métaboliques. Enfin, certaines analyses cardiovasculaires seront réalisées après habituation, afin de réduire le stress des animaux. Des points limites suffisamment précoces ont été définis. Pour réduire les nuisances, les actions suivantes seront réalisées: Lors de l’anesthésie, la température interne est suivie, les animaux sont placés sur un tapis chauffant pour limiter l’hypothermie, et une attention particulière est portée pour la période de réveil pour s’assurer de la bonne récupération des animaux, une analgésie est réalisée avant-pendant-après la pose de minipompe, le stress sera minimisé par une habituation, de la nourriture molle/hydratée sera ajoutée dans la cage si perte de poids et de mobilité, le comportement des animaux sera surveillé attentivement, en référence à une grille de scoring de l’animalerie
Choix des espèces
L'espèce rat a été choisie car c'est un modèle établi pour le développement de maladies cardiovasculaires et rénales. De plus nous disposons d'un modèle de rats génétiquement modifiés qui permet de remplacer la séquence codante d’un gène de rat par celle de l’homme. Les animaux sont utilisés à l’âge adulte (7 semaines) afin de disposer d’un organisme avec un processus de développement terminé.
Création et évaluation du bien-être animal de deux nouvelles lignées à visée de recherche sur la thématique des rôles physiopathologiques du gène X chez la souris.
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une biopsie d'un millimètre de queue, prélevée au moment du baguage, sert à génotyper chacune des souris de deux nouvelles lignées créées pour ce projet. 210 souris vont être utilisées, toutes tuées à 48 semaines pour un prélèvement terminal, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Sur les 168 animaux issus des croisements, 84 sont susceptibles de présenter un phénotype dommageable, avec un retard de croissance au stade fœtal et une létalité périnatale possibles. Le projet annonce évaluer le bien-être de ces lignées, et le porteur écrit dans le même document que leurs effets ne sont pas connus puisqu'elles n'ont jamais été générées, tout en assurant que ce type de calcifications cérébrales ne provoque pas de phénotype dommageable chez la souris.
Objectifs
L’objectif est de créer et d’évaluer le bien-être animal de deux nouvelles lignées et d’identifier génétiquement celles-ci via une méthode de génotypage invasif. La production de ces animaux est nécessaire pour nos projets de recherche sur les rôles et les mécanismes d’action de la protéine Xpr1 dans les processus de calcifications ectopiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices du projet sont attendus à la fois dans le domaine de la recherche fondamentale et dans le domaine médical. L’utilisation de ces deux lignée de souris permettra de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires d'une mutation identifiée chez les patients humains porteurs de la maladie PFBC (Primary Familial Brain Calcification) et qui est responsable de l’apparition de calcifications vasculaires cérébrales. Elles permettront également d’identifier les mécanismes cellulaires qui sont à l’origine de l’apparition des calcifications cérébrales. Le génotypage, quant à lui, permet la caractérisation génétique des lignées pour optimiser la gestion des élevages et la production des animaux pour les projets scientifiques.
Procédures
1 prélèvement (1mm) à l'extrêmité de la queue - pesée des animaux 1 fois par semaine - évaluation de l’état des animaux (retard de croissance au stade fœtal et létalité péri-natale possible)
Impact sur les animaux
Le stress ressenti par l’animal est limité lors des pesées qui sont rapides et par l’utilisation d’un tunnel pour prendre la souris (1 fois par semaine pendant 14 semaines). Ces deux lignées n'ont jamais été générées, les effets des modifications génétiques ne sont donc pas connus. Néanmoins, nous savons que la présence de ce type de calcifications cérébrales chez la souris n'est pas responsable de phénotype dommageable. La biopsie au niveau de la queue peut entrainer de la douleur et du stress chez l'animal.
Devenir
Les animaux âgés de 48 semaines seront mis à mort pour prélèvement terminal dans le cadre d’un projet dont l’objectif est de comprendre les mécanismes physiopathologiques de la maladie de calcifications cérébrales primaires
Remplacement
Nos projets de recherche visent à comprendre le rôle d’une protéine connue pour transporter du phosphate du milieu intracellulaire vers l’extérieur de la cellule. La régulation des concentrations de phosphate dans le sang et en local est une composante importante pour notre problématique, ce qui nécessite de travailler sur l’organisme entier.
Réduction
Les croisements sont élaborés pour obtenir un nombre suffisant d’animaux permettant d’obtenir des résultats robustes et fiables pour l’évaluation du bien-être animal (au moins 14 animaux par génotype selon les recommandations européennes). Leur nombre est adapté aux besoins de l’évaluation du bien-être chez les deux sexes.
Raffinement
Les schémas d'accouplement de nos lignées permettent de ne pas générer d’animaux dont le phénotype serait très probablement létal pendant la gestation. Pour la mesure de poids hebdomadaire, les expérimentateurs sont entraînés à ne pas tenir les souris par la queue. Ce geste limite le stress des animaux. La biopsie de queue est réalisée lors du baguage sous anesthésie générale. Cette méthode est approuvée, précise, rapide (quelques secondes), standardisée et réalisée par du personnel formé, ce qui limite les effets de stress et douleurs chez les animaux. L’anesthésie permet de favoriser la bonne pose de la bague et le prélèvement de queue dans un environnement plus confortable pour le manipulateur et l’animal.
Choix des espèces
D’autres modèles de souris génétiquement altérées sur d’autres gènes identifiés comme responsables de la maladie PFBC existent dans la littérature. Les deux nouveaux modèles que nous proposons apporteront des réponses clés sur le rôle du gène X dans la pathogenèse de la maladie PFBC. Ils permettront d’observer les effets systémiques d’une mutation fréquemment identifiée sur ce gène chez les patients atteints de PFBC. Ils permettront également d’étudier le rôle spécifique des cellules vasculaires musculaires lisses dans l’apparition ou la progression des calcifications dans le cerveau. Dans ce projet, 14 mâles géniteurs et 28 femelles génitrices seront utilisés pour générer des groupes d’animaux contrôles et mutants suffisamment importants pour apporter des conclusions robustes sur l’évaluation du bien-être animal. Sur les 168 animaux constituant ces groupes, 84 seront susceptibles de présenter un phénotype dommageable, les 84 autres animaux correspondent aux souris contrôles issues des mêmes portées. Exceptées les femelles génitrices C57Bl/6 (n=8), tous les autres animaux seront biopsiés et génotypés. Ce nombre de croisement permettra d’obtenir au moins 14 animaux par groupe, nombre recommandé par le guide européen « Caring for animals ».
Evaluation du risque de saignement de Fabs antiplaquettaires dans des modèles de saignements intracérébraux et de leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de purpura thrombotique thrombocytopénique (EU2/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Les souris utilisées portent la forme humaine du récepteur plaquettaire visé par les deux agents testés, obtenue par mutation. 490 d'entre elles vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 340 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère. Elles subissent une chirurgie de 45 minutes, cinq à dix injections, quatre prélèvements de sang sur un mois et une IRM de vingt minutes, avec des saignements attendus au site d'incision et, au réveil, des signes de douleur et une atteinte du comportement, de la motricité et de l'alimentation. Les cerveaux sont prélevés après mise à mort pour mesurer le saignement cérébral, et le porteur indique que le modèle de purpura impose aussi de tuer les souris pour prélever une grande quantité de sang.
Objectifs
Les plaquettes sanguines ont un rôle primordial dans l’arrêt des saignements. Elles sont aussi impliquées dans la thrombose, c’est-à-dire la formation d’un caillot, qui se développent dans une artère malade. La paroi de l’artère malade induit le recrutement de plaquettes et la formation du caillot, appelé thrombus. Ce phénomène peut aboutir à un accident vasculaire cérébral (AVC). Nous avons généré deux agents antiplaquettaires. Ils ont montré qu’ils empêchaient la formation de caillot dans un modèle in vitro. De plus, des modèles de saignement ont montré qu’ils augmentaient moins le saignement que les antiplaquettaires actuellement utilisés en clinique. Ces agents pourraient être utilisés dans le traitement des AVC. Les traitements antiplaquettaires actuels sont peu utilisés car ils présentent un risque de saignement trop important qui pourrait être fatal pour le patient. Les options thérapeutiques sont donc limitées. Les agents pourraient présenter moins de risque de saignement et donc être utilisés dans cette pathologie. Les agents pourraient également être utilisés dans le traitement du Purpura Thrombotique Thrombocytopénique (PTT). Les patients présentant cette pathologie ont des tout petits caillots dans les vaisseaux sanguins ainsi qu’une diminution des plaquettes due à leur consommation des plaquettes lors de la formation de ces caillots, conduisant à des saignements. Nos agents pourraient réduire les petits caillots sans augmenter les saignements chez les patients PTT. L’objectif de ce projet est donc d’évaluer le risque de saignement des agents dans deux modèles de saignements cérébraux et leur potentiel anti-thrombotique dans un modèle de PTT. Les agents seront comparés à des traitements déjà utilisés en clinique. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus du projet portent sur 2 aspects : - AVC : les agents pourraient présenter un risque de saignement plus faible que les traitements antiplaquettaires classiques et donc représenter un nouveau traitement pour les patients présentant un AVC. - PTT : les agents pourraient réduire la formation de petits caillots chez les patients PTT sans augmenter le saignement, ce qui représenterait un nouveau traitement pour les patients PTT. Ce projet pourrait permettre à long terme de mieux traiter les patients présentant un AVC ou un PTT.
Procédures
Dans les modèles de saignements cérébraux, les animaux seront soumis à une chirurgie (45 min, EU1), à des injections (5 à 10, EU1), à des prélèvements de sang (4 sur 1 mois, EU1) et à un IRM (20 min, EU2). Dans le modèle PTT, les souris seront soumises à des injections (4, EU1) et à des prélèvements de sang (2, EU2).
Impact sur les animaux
Une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur la respiration. Concernant les injections, on peut s’attendre à une douleur localisée. Le transport et les anesthésies pourront causer du stress. Le prélèvement de sang peut entrainer un saignement localisé de courte durée. On pourra observer des saignements au site d’incision lors de la chirurgie et, au réveil, on s'attend à un impact sur le comportement, l'apparence physique, la nutrition et la motricité ainsi qu’à des signes de douleur notamment au site chirurgical. Dans le modèle antigène – anticorps, on s’attend à des saignements en cas de blessure, à un impact sur le comportement et sur l’apparence physique.
Devenir
A l’issue de la procédure de saignement cérébraux et d’AVC, les animaux anesthésiés sont mis à mort afin de prélever les cerveaux pour quantifier le saignement cérébral. Dans la procédure de PTT, une grande quantité de sang est prélevée pour évaluer l’impact de nos agents sur le PTT, ce qui nécessite la mise à mort de l’animal.
Remplacement
L’objectif de ce projet est d’évaluer l’effet d’agents dans des modèles de saignements cérébraux et de PTT. Dans les deux cas, le processus étudié est complexe et relève du fonctionnement de l’organisme complet (vaisseaux, pression artérielle, circulation du sang…). Il n’est donc pas possible de remplacer le modèle animal par de l’in vitro du fait de la nécessité du métabolisme de la souris pour évaluer le processus. Cependant, l’effet anti-thrombotique de nos agents a déjà été confirmé in vitro dans un modèle de perfusion de sang utilisant du sang humain de donneur sain.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés lors de cette étude est réduit au minimum, ce nombre étant fixé à 20 à 45 souris/groupe pour la mise au point des modèles et à 12 souris/groupe pour l’obtention de résultats lors des expérimentations.
Raffinement
Les animaux disposent de 14 jours d’acclimatation entre leur arrivée à l’animalerie et leur utilisation en procédure. Une habituation à la contention d’une durée de 5 jours est prévue. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum : • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Le changement d’hébergement en fonction des groupes n’est réalisé que si nécessaire. Aucun regroupement n’est réalisé afin d’éviter le risque de conflits, nous séparerons seulement les souris qui ne subiront pas l’expérimentation des souris qui la subiront. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie et analgésie de l’animal avant et pendant chaque opération. • Par utilisation de gel ophtalmique pour protéger les yeux de l’animal endormi • Par l’application d’une goutte d’anesthésique local sur l’œil après les injections au niveau de l’oeil • Par injection de sérum physiologique avant les procédures chirurgicales afin d’assurer l’hydratation de l’animal. • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée afin lutter contre l’hypothermie pendant les procédures. • Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont maitrisés et caractérisés. Les techniques de mutation ont permis de générer des souris exprimant la forme humaine du récepteur plaquettaire ciblé, permettant d’étudier l’effet des agents sur les saignements cérébraux et dans le traitement du PTT. Les souris seront utilisées au stade adulte entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris adultes et ne présentant pas encore de vieillissement.
Développement et Validation de Biomarqueurs pour évaluer le remodelage vasculaire pulmonaire par Imagerie TEP.
- Recherche appliquée
- Diagnostic des maladies
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Injectés d'une molécule qui provoque une hypertension artérielle pulmonaire ou une maladie veino-occlusive, 372 rats développent tous la maladie, avec gêne respiratoire, toux, œdème pulmonaire, perte d'appétit et baisse de mobilité. 288 d'entre eux sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, les 84 autres dans des procédures de souffrance modérée, et tous sont tués pour que leurs organes soient analysés. Chacun passe jusqu'à trois séances d'imagerie de deux heures sous anesthésie gazeuse, avec pose d'un cathéter fémoral et trente prélèvements artériels, pour mettre au point un traceur capable de distinguer les deux maladies à l'imagerie. Le porteur annonce des points limites destinés à arrêter la souffrance, sans indiquer lesquels.
Objectifs
Le projet vise à améliorer le diagnostic et le traitement de deux maladies pulmonaires rares et graves : l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et la maladie veino-occlusive pulmonaire (MVOP). L'HTAP est une condition où la pression dans les artères des poumons augmente, jusqu’à causer éventuellement une insuffisance cardiaque. La MVOP est souvent confondue avec l'HTAP mais implique des changements dans les veines pulmonaires et une augmentation du nombre de petits vaisseaux sanguins, ce qui réduit l'oxygène dans le sang. Ces maladies sont difficiles à diagnostiquer correctement et à traiter efficacement. Notamment, l’établissement du bon diagnostic est d’autant plus crucial que l’état de santé d’une personne atteinte de MVOP peut s’aggraver si elle reçoit un traitement contre l’HTAP. Cela représente un défi médical majeur. Le projet se concentre sur deux objectifs principaux. Premièrement, il vise à développer un traceur pour l'imagerie médicale qui permettra de visualiser spécifiquement les changements dans les artères pulmonaires, et de différencier entre les deux maladies. Deuxièmement, le projet vise à comprendre comment ces maladies se développent. Pour atteindre ces objectifs, nous avons besoin de recourir à des modèles animaux. Deux modèles spécifiques seront utilisés chez les rats : l’injection de monocrotaline (MCT), une molécule qui induit une HTAP, et l’injection de mitomycine-C (MMC), un composé qui provoque une HTAP similaire à la MVOP. Ce projet pourrait améliorer la façon dont ces maladies rares sont détectées et traitées, offrant de nouvelles perspectives pour les patients.
Bénéfices attendus
Ce projet apportera des bénéfices significatifs à court et à long termes, améliorant à la fois les connaissances scientifiques et la prise en charge des patients atteints d'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) et de maladie veino-occlusive pulmonaire (MVOP). Bénéfices à court terme : Le projet identifiera des signatures moléculaires spécifiques des différents types de modifications vasculaires observés dans l’HTAP et la MVOP. Cela aidera à mieux comprendre les mécanismes sous-jacents de ces maladies. Bénéfices à long terme : Les résultats du projet permettront d'identifier les patients susceptibles de bénéficier des thérapies visant à limiter les modifications vasculaires dès les stades précoces de la maladie. Cela est crucial pour offrir des traitements personnalisés et améliorer les résultats thérapeutiques. De plus, le radiotraceur développé pourrait aider à distinguer la MVOP de l’HTAP classique, une distinction essentielle puisque les patients atteints de MVOP, qui ont un pronostic plus sévère, ne peuvent pas bénéficier des thérapies vasodilatatrices standard en raison du risque élevé d’œdème pulmonaire. Un diagnostic précis pourrait donc améliorer significativement la gestion de ces patients, souvent en attente urgente de transplantation pulmonaire. Ces nouvelles connaissances pourraient ouvrir la voie à de nouvelles stratégies thérapeutiques et à des innovations dans le traitement de l’HTAP et de la MVOP.
Procédures
Les interventions prévues sur les animaux sont listées ci-dessous : • Administration d’un composé (10 secondes ; 1 fois par semaine pendant maximum 2 semaines) induisant une hypertension artérielle pulmonaire ou la maladie veino-occlusive pulmonaire selon le groupe . • Réalisation de 3 sessions d’imagerie sous anesthésie gazeuse (durée 120 minutes au maximum et espacé de 7 jours) • Injection d’un radiotraceur (1 minute) • Pose d’un cathéter veineux (30 secondes) et fémoral (5 minutes) • Réalisation de prélèvements artériels sous anesthésie (30 prélèvements qui durent 2-3 secondes espacés sur 120 minutes au maximum)
Impact sur les animaux
L'exposition des animaux à la monocrotaline (MCT) ou à la mitomycine-C (MMC) entraînera le développement d'une hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) chez tous les sujets, qui entrainera plusieurs effets indésirables, notamment : • Gêne respiratoire (dyspnée), toux, œdème pulmonaire • Diminution de l’activité globale et fatigue • Perte de poids due à une perte d’appétit • Modifications comportementales, telles que l’inactivité excessive ou une réduction de la mobilité • Risques de dysfonctionnement rénal (particulièrement avec la MMC) Les rats anesthésiés pour les sessions d'imagerie peuvent se sentir désorientés et anxieux à leur réveil. Pour minimiser ce stress, ils seront réveillés dans leur cage habituelle.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure afin d’extraire les organes et réaliser des manipulations ex vivo permettant de corréler les mécanismes biologiques, la distribution des biomarqueurs d’intérêt avec les données en imagerie.
Remplacement
Pour comprendre pleinement les mécanismes de l'HTAP et les réponses aux traitements potentiels, il est essentiel de pouvoir observer les effets des interventions dans un organisme entier, incluant la distribution, le métabolisme, et l'élimination des composés, ainsi que les interactions avec divers systèmes biologiques. Cela est particulièrement crucial pour les études sur la fonction cardiovasculaire et le remodelage vasculaire, où les interactions entre les différents organes et systèmes doivent être évaluées dans leur totalité. Bien que des progrès significatifs aient été réalisés dans le développement de modèles non animaux, à l’heure actuelle, seul le recours à des modèles animaux permet d’y parvenir en obtenant des données complètes et fiables. Ces modèles sont pour l’instant les seuls à reproduire les conditions pathologiques et les réponses physiologiques de manière holistique, ce qui est indispensable pour atteindre les objectifs de ce projet. Il n’existe pas de modèle in vitro ou in silico susceptible de constituer une alternative pour modéliser la complexité des tissus et des interactions biologiques dans un contexte physiologique et pathologique complet.
Réduction
Pour ce projet, nous avons déterminé le nombre d'animaux à utiliser par une approche intégrée visant à utiliser le moins d’animaux possible tout en garantissant des résultats fiables et reproductibles. Voici les techniques que nous mettons en œuvre pour réduire le nombre d'animaux nécessaires : - Imagerie non invasive répétée : Nous utiliserons une technique appelée tomographie par émission de positons (TEP) pour étudier les changements dans le système cardiovasculaire. Cette méthode, qui ne nécessite pas d'intervention chirurgicale, permet de suivre les mêmes animaux à plusieurs étapes de l’étude. Cela signifie que nous avons besoin de moins d’animaux, car nous pouvons observer les évolutions chez chaque individu au fil du temps. - Analyse statistique : Nous utilisons des méthodes statistiques qui nous permettent d’optimiser les comparaisons entre les groupes d’animaux. En réduisant les variations internes à chaque groupe, nous pouvons détecter des différences importantes avec un plus petit nombre d’animaux. - Nous avons également utilisé des logiciels spécialisés pour optimiser la taille des échantillons.
Raffinement
Deux semaines d’acclimatation sont prévues avant l’entrée des animaux en protocole. Une surveillance quotidienne des rongeurs sera pratiquée par les zootechniciens et les expérimentateurs. De l'enrichissement sera ajouté dans les cages des animaux. Tous les examens d’imagerie sont réalisés sous anesthésie générale par voie gazeuse afin de minimiser le stress de l’animal. Un suivi de l’état des animaux est pratiqué de façon hebdomadaire : poids, qualité de la fourrure des animaux et posture de l’animal dans sa cage. Des points limites sont établis afin de minimiser et d’arrêter, la souffrance chez les animaux.
Choix des espèces
L'utilisation du rat comme modèle animal pour ce projet de recherche sur l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est justifiée pour plusieurs raisons : - Les modèles induits chez le rat sont couramment utilisés pour modéliser l'HTAP, car ils reproduisent fidèlement les caractéristiques pathophysiologiques de la maladie humaine, notamment le remodelage vasculaire et les réponses inflammatoires, ce qui n’est pas le cas pour les souris. - De plus, cette espèce, de par sa taille, présente l’avantage d’être particulièrement adaptée aux études d’imagerie par TEP (tomographie par émission de positons). Les rats utilisés seront aux stades adultes afin d’avoir des systèmes cardiovasculaires et immunitaires pleinement développés, ce qui permet une étude plus précise et stable des mécanismes de l'HTAP, une maladie qui survient principalement chez l’adulte.
Etude du rôle fonctionnel des canaux ioniques dans la génération et la régulation de la fréquence cardiaque
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
2 060 souris issues de quatorze lignées génétiquement modifiées vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 940 sans jamais se réveiller et 1 120 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Celles qui reçoivent un capteur de télémétrie implanté restent hébergées seules jusqu'à huit semaines, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress. S'y ajoutent des injections intrapéritonéales hebdomadaires, la pose de micro-pompes osmotiques et trois échographies cardiaques. Le porteur justifie la souris par la puissance de la génétique chez cette espèce, tout en reconnaissant que sa fréquence cardiaque est bien plus élevée que celle de l'humain, alors que l'objet du projet est précisément la régulation de cette fréquence.
Objectifs
La fréquence et le rythme cardiaque sont des facteurs très importants pour la qualité de la vie et la santé humaine. Définies comme des dysfonctions du rythme cardiaque, les arythmies sont des maladies très répandues avec des degrés de sévérité et gravité très variables, pouvant aller jusqu’à la mort subite. La bradycardie fait partie des arythmies les plus fréquentes. Elle se caractérise par une fréquence cardiaque trop basse (avec risque de syncope) pour répondre à la nécessité physiologique de l'organisme notamment face à l’effort. Elle est plus répandue chez la population âgée, mais peut aussi affecter de jeunes individus. La fréquence cardiaque est générée au niveau de l’oreillette droite du cœur dans la zone hyperspécialisée du nœud sinusal. Notre projet vise à mieux comprendre le rôle physiologique de protéines spécifiques, appelées canaux ioniques, impliquées au niveau du nœud sinusal dans la genèse et la régulation de la fréquence cardiaque. Ces canaux ioniques pourraient constituer de nouvelles cibles thérapeutiques dans la prise en charge de la bradycardie. En utilisant des modèles de souris génétiquement modifiées pour différentes combinaisons de canaux ioniques (14 lignées différentes), nous allons étudier la génération et la régulation de la fréquence cardiaque. Cette étude se fera par la combinaison d’approches in vivo (électrocardiogrammes et échographies cardiaques) et d’approches ex vivo et in vitro sur le cœur. Dans ces différentes approches, nous effectuerons divers traitements pharmacologiques connus pour réguler la fréquence cardiaque. Notre programme de recherche a trois objectifs : (i) Identifier le rôle de ces canaux ioniques dans la régulation de la fréquence cardiaque (ii) Comprendre comment l’interaction entre le système nerveux autonome et ces canaux de la cellule du nœud sinusal génère les symptômes de la bradycardie (iii) Comprendre le mécanisme de restauration de la fonction cardiaque par blocage (pharmacologique et/ou génétique) du canal potassique activé par l'acétylcholine (IKAch).
Bénéfices attendus
Comprendre les mécanismes à la base de la génération et de la régulation cardiaque et proposer de nouvelles stratégies thérapeuthiques pour la prise en charge de la dysfonstion sinusale.
Procédures
injections intrapéritonéales (injection hebdomadaire, durée de l'injection, environ 30 s) implantation de capteurs de télémétrie (implantation unique, durée totale de l'intervention : 30 minutes), implantation de micro-pompes osmotiques (une fois, durée totale de l'intervention : 15 minutes)- Echographies cardiaques réalisées (3 échographies de 15 minutes environ / souris). Ces échographies sont réalisées à différents stades du protocole. Comme les échographies sont réalisées sur les animaux implantés avec le capteur de télémétrie (procédure n°1), l'hébergement individuel est maintenu pour une durée maximale de 8 semaines.
Impact sur les animaux
L'injection intrapéritonéale va induire une légère douleur liée à la piqure de l'aiguille. L'hébergement individuel des animaux suite à l'implantation des capteurs de télémétrie va causer du stress pour l'animal.
Devenir
Des échographies cardiaques sont réalisées pour toutes les souris dont la fréquence cardiaque a été enregistrée par télémétrie. A l'issue de ces procédures in vivo, les souris sont euthanasiées afin d’effectuer des procédures ex vivo et in vitro sur le cœur entier ou le nœud sinusal isolé et de récupérer leurs tissus cardiaques (3R).
Remplacement
La génération et la régulation de la fréquence cardiaque sont des phénomènes complexes encore mal élucidés. L’activité du système nerveux autonome et la tension artérielle font partie des multiples facteurs pouvant moduler le rythme cardiaque. Par conséquent, pour étudier le rôle des canaux ioniques impliqués dans la détermination de la fréquence cardiaque, nous sommes obligés de recourir à un système in vivo. La souris est l'organisme modèle permettant ce genre d'étude. L'utilisation d'animaux demeure donc, à ce jour, la seule option pour évaluer avec précision et pertinence les mécanismes associés aux modifications de la fréquence cardiaque.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire a été déterminé grâce à un logiciel statistique, à notre expertise et aux données bibliographiques. Cela permet d’allier réduction du nombre d’animaux et validité statistique des expériences. Les souris vont suivre consécutivement différentes procédures in vivo, ex vivo et in vitro afin de diminuer à la fois le nombre d’animaux utilisé et d’obtenir un suivi longitudinal des animaux inclus dans les protocoles.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des environnements enrichis (paille en carton, igloo ou maison en carton). Aucune des lignées de souris que nous utiliserons ne présente de phénotype dommageable. Un suivi régulier sera appliqué dès le début de nos expériences par du personnel qualifié. Afin de diminuer le stress, les souris seront manipulées quotidiennement par les expérimentateurs avant chaque procédure expérimentale. La douleur induite par l'implantation des transmetteurs pour la télémétrie est prise en charge par un analgésique pendant et après l'anesthésie. Afin de garantir le bien-être des animaux, des points limites seront appliqués.
Choix des espèces
Le projet utilise la souris car c’est le modèle mammifère de référence pour la technique de modification génique et de transgénèse. Le projet scientifique vise à utiliser la puissance de la génétique chez la souris pour étudier le rôle des gènes codants pour des canaux ioniques dans la régulation de la fréquence cardiaque et dans les mécanismes pathologiques de la bradycardie. Bien que la fréquence cardiaque de la souris soit significativement plus élevée de celle chez l’humain, il a été montré que l’ablation spécifique des gènes codant pour les canaux ioniques reproduit fidèlement certaines maladies congénitales de l’automatisme cardiaque et du rythme. Le choix de l’espèce est donc approprié pour conduire le projet. Nos études seront réalisées avec des souris adultes (entre 8 semaines et 104 semaines). Bien que les bradycardies d’origine congénitales ou acquise affectent aussi les enfants et les jeunes adultes, nos approches sont optimales uniquement sur des souris adultes (à partir de 2 mois). De plus, limiter l’étude au stade adulte permet l’observation de la fréquence cardiaque après la pleine maturation des mécanismes de régulation du rythme.
Impact d’un cocktail de polluants persistants sur le développement du syndrome cardiorenal
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système urogénital
Toute souris dont le score d'évaluation devient trop élevé est mise à mort immédiatement, et 15 % des opérées meurent dans les trois jours qui suivent la chirurgie. 840 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, toutes dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Chacune subit un infarctus provoqué par ligature coronaire ou une ischémie rénale avec ablation de l'autre rein, un cathétérisme du ventricule gauche, jusqu'à trois mesures de filtration rénale de deux heures, un prélèvement de sang à la veine cave et jusqu'à sept gavages hebdomadaires de dioxine et de benzopyrène. Le bénéfice annoncé est une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels ces polluants aggravent l'insuffisance cardiaque et rénale, le porteur ajoutant que passé les 72 premières heures il est rare d'observer des signes de souffrance.
Objectifs
Les polluants organiques persistants (POPs) sont relargués dans l'atmosphère de façon naturelle (feu de forêt, éruption volcanique) ou industrielle (combustion incomplète des matières organiques). Une fois émis dans l'atmosphère, les POPs retombent et polluent les eaux et les sols et contaminent les végétaux et les animaux où ils s’accumulent du fait de leur persistance. Malgré les mesures visant à réduire leur émission, l'homme continue à être exposé chroniquement aux POPs par l’ingestion d’aliments contaminés. Les POPs sont connus pour endommager le bon fonctionnement de différents organes. Ils exercent leurs effets toxiques en se fixant sur un récepteur aux hydrocarbures aromatiques nommé AHR. Des études récentes démontrent que AHR joue un rôle important dans les atteintes cardiaques et rénales liées à l’exposition aux polluants. En particulier chez l’homme, l’activation de AHR est associée à un risque accru de développer une hypertension artérielle et une atteinte rénale et ainsi de surmortalité cardiovasculaire. Il a également été montré chez les rongeurs que l’activation de AHR par les polluants favorise le développement d’une hypertrophie cardiaque et induit une toxicité rénale. Le cœur et les reins sont deux organes fortement interconnectés et la dysfonction de l’un peut affecter la fonction de l’autre conduisant ainsi à une maladie appelée syndrome cardio-rénal. Le récepteur AHR est fortement exprimé dans ces deux organes qui répondent à l’exposition aux POPs en activant les gènes cibles de la voie AHR. Le rôle des POPs et de l’activation de la voie AHR dans le développement du syndrome cardio-rénal n’est pas connu. Les objectifs de ce travail sont : 1. D’étudier l’effet d’une exposition chronique d'un cocktail de deux POPs (la dioxine et le benzopyrène) sur le développement du syndrome cardio-rénal chez des souris présentant une atteinte cardiaque ou rénale primaire. 2. De déterminer si le potentiel effet du cocktail de POPs sur le syndrome cardio-rénal est médié par l’activation de la voie AHR.
Bénéfices attendus
Ce travail offrira une meilleure compréhension des mécanismes par lesquels les polluants organiques persistants accélèrent la progression de l'insuffisance cardiaque et rénale primaire et l'apparition du syndrome cardio-rénal de type 1 ou 3 dans les populations vulnérables.
Procédures
Chaque animal subira les interventions suivantes : A. Procédures chirurgicales ou prélèvement invasif sur animal anesthésié au nombre de quatre : 1. Modèle d'insuffisance cardiaque post-ischémique (1 fois, durée : 20 min) ou modèle d'insuffisance rénale par ischémie rénale unilatérale et néphrectomie controlatérale (1 fois, durée : 30 min) 2. Analyse de l'hémodynamique cardiaque par cathétérisme consistant à introduire une sonde (cathéter) dans le ventricule gauche afin de mesurer les pressions et les volumes cardiaques (1 fois, durée : 20 min) 3. Mesure du débit de filtration glomérulaire (DFG) (3 fois max, durée : 2h) 4. Prélèvement de sang par la veine cave (1 fois, durée : 2 min). B. Procédures non ou peu invasives sur animal anesthésié ou vigile sont au nombre de trois : 1. Échographie cardiaque ou rénale sur animal anesthésié (3 fois max, durée : 20 minutes) 2. Gavage au polluant ou au solvant sur animal vigile (7 fois max à raison d’1 fois par semaine, durée : 20 secondes) 3. Récolte d'urine après miction spontanée (4 fois max, durée : 2 minutes)
Impact sur les animaux
Les nuisances attendues sont principalement du stress lié à la contention et aux manipulations sur animal vigile (prélèvement d’urine, gavage). Les effets indésirables sont principalement ceux liés à la chirurgie (modèle d’insuffisance cardiaque ou rénale post-ischémique) ; pouvant dans les trois premiers jours suivant l’opération conduire à une atteinte cardiaque ou rénale aigue avec une mortalité accrue pour les animaux les plus atteints (15% dans les deux modèles). Les effets indésirables seront la perte de poids (10%), une altération de leur apparence physique (manque de toilettage, poil ébouriffé, paupière fermée, posture anormale) ou un comportement anormal (mobilité réduite, agressivité). Dans notre expérience, passées les premières 72h, il est rare d’observer des signes de souffrance chez l’animal ayant subi une thoracotomie/ischémie cardiaque ou une ischémie rénale/néphrectomie, suggérant que la période critique douloureuse est limitée à ce temps court après la chirurgie.
Devenir
A la fin de chaque procédure, tous les animaux seront mis à mort. Leurs organes seront prélevés afin de réaliser des analyses histologiques et/ou moléculaires nécessaires pour atteindre les objectifs de notre étude.
Remplacement
Afin de tester les mécanismes moléculaires impliqués, des expériences de culture cellulaire en présence de polluants seront menées indépendamment. Pour répondre à cette question, le remplacement total des animaux par de la culture cellulaire n'est pas réaliste car les modèles in vitro ne rendent pas compte de l'immense complexité des interactions physiopathologiques qui existent entre deux organes à l’échelle d’un organisme entier. L'utilisation de modèles animaux pour étudier la toxicité cardio-rénale médiée par les polluants reste nécessaire pour atteindre les objectifs de notre projet de recherche. Dans ce contexte, la souris est le modèle de choix en raison des similitudes physiopathologiques avec les maladies cardio-rénales humaines. Par ailleurs, les souris génétiquement modifiées peuvent fournir des notions importantes sur le rôle de la voie de signalisation du récepteur aux hydrocarbures aromatiques appelé AHR dans la toxicité des polluants, avec une grande pertinence pour la santé humaine.
Réduction
Nous allons réduire le nombre d'animaux par l'utilisation des méthodes non invasives (échocardiographie, échographie rénale, mesure du débit de filtration glomérulaire, prélèvements d'urine) permettant de répéter les analyses sur le même animal au cours de la maladie, mais aussi grâce à l'utilisation de tests statistiques appropriés. Nos expériences dans le laboratoire ont démontré que : - des groupes de n=15 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les analyses histologiques et moléculaires compte tenu de la mortalité post-opératoire dans nos deux modèles chirurgicaux (infarctus du myocarde et ischémie rénale/néphrectomie) et de la variabilité biologique de la réponse aux polluants. - des groupes de n=20 animaux par groupe expérimental sont nécessaires pour les évaluations fonctionnelles compte tenu de la variabilité inter-individuelle et de la mortalité accrue post-opératoire.
Raffinement
Pour raffiner, les animaux importés de fournisseurs agréés pour les besoins expérimentaux sont laissés en acclimatation une semaine avant toute manipulation. La souffrance des souris sera réduite en utilisant des sédatifs et analgésiques. Pour les échographies et les modèles chirurgicaux, les souris seront anesthésiées, placée sur plaque chauffante à 37°C pour éviter toute hypothermie et des injections d’antidouleurs seront faites en pré- et post-opératoire afin de limiter la douleur. Dans la semaine suivant la chirurgie, la surveillance des animaux sera renforcée avec un examen bi-quotidien par du personnel compétant afin de vérifier leur état général de santé. Tout au long de l’étude, nous suivrons la grille d’évaluation proposée tenant compte des changements du poids, de perturbation de l'apparence physique et du comportement. Tout animal auquel aura été attribué un score élevé à cette évaluation recevra des analgésiques. Tout animal auquel aura été attribué un score trop élevé sera immédiatement mis à mort. La qualité de l'élevage est améliorée en enrichissant les cages expérimentales avec des bâtons à ronger, des éléments permettant la nidification (papiers, maison en carton) ainsi qu’un accès illimité à la nourriture et à l’eau de boisson.
Choix des espèces
La souris a l’avantage indéniable de permettre l’utilisation des souris génétiquement modifiées afin d'identifier les mécanismes cellulaires et moléculaires responsables des effets toxiques des polluants. Dans ce projet, nous allons notamment utiliser des souris mutantes où le récepteur des polluants est spécifiquement supprimé dans les cellules endothéliales vasculaires. La souris offre également l'avantage d'être de petite taille et de limiter ainsi les quantités de polluants au cours de l'étude. Le modèle d’infarctus du myocarde induit par ligature coronaire permanente chez la souris conduit à une insuffisance cardiaque progressive dès les premiers jours après l’intervention chirurgicale. Il en est de même pour le modèle d'ischémie rénale/néphrectomie unilatérale conduisant à une insuffisance rénale aigue. Nous maitrisons les outils permettant les évaluations fonctionnelles et structurelles cardiaques et rénales in vivo ainsi que ex vivo dans ces modèles chez la souris. Nous utiliserons des animaux adultes mâles de 8 semaines pour notre étude. A ce stade, le cœur et le rein sont parfaitement formés et nous possédons déjà tous les paramètres fonctionnels et structurels de ces deux organes pour l'ensemble des génotypes à tester.
Etude d’une voie de signalisation dans les cellules endothéliales de la barrière hémato-encéphalique chez le rat
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Tués sous anesthésie profonde pour qu'on leur prélève le cerveau, 450 rats Wistar-Han vont être utilisés, 250 pour mettre en culture les cellules de leurs vaisseaux cérébraux et 200 pour en isoler les cellules par tri magnétique. Les procédures sont classées sans réveil pour les 250 premiers et en souffrance légère pour les 200 autres, qui reçoivent en plus une injection intrapéritonéale unique trois à vingt-quatre heures avant la mise à mort. L'objet est d'élucider le mécanisme d'activation d'une protéine repérée dans les vaisseaux sanguins du cerveau. Le porteur présente la culture cellulaire comme une réduction du nombre d'animaux utilisés, les rats fournissant le matériel de départ de ces cultures.
Objectifs
L'activité de la protéine d'intérêt a été récemment identifiée dans les vaisseaux sanguins cérébraux chez le rat. L'objectif du présent projet est d'élucider le mécanisme exact d'activation de cette protéine et de comprendre son rôle physiologique. Son mécanisme d'activation sera étudié dans des cellules obtenues à-partir de vaisseaux sanguins de cerveau de rat et cultivées en laboratoire. Son rôle physiologique sera étudié en injectant un inhibiteur spécifique de cette protéine chez les rats puis en analysant les gènes dont l'expression est modifiée dans les vaisseaux sanguins cérébraux.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de caractériser une nouvelle voie de régulation physiologique de la barrière hémato-encéphalique. Il pourrait aboutir à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques dans des pathologies associées à une dysfonction de cette barrière telles que l'ischémie cérébrale et les pathologies neurodégénératives.
Procédures
Tous les rats seront mis à mort sous anesthésie générale profonde à l'issue des procédures. Une partie des rats subira, 3 à 24 heures avant la mise à mort, une injection intra-péritonéale unique (durée 30 secondes).
Impact sur les animaux
L’injection intra-péritonéale n'engendre qu'un stress léger et de courte durée chez l'animal.
Devenir
Les animaux du Lot 1 (250 rats) sont mis à mort afin de prélever leur cerveau et de réaliser des cultures de cellules à-partir des vaisseaux sanguins cérébraux. Les animaux du Lot 2 (200 rats) sont mis à mort afin de prélever leur cerveau, d'isoler les cellules des vaisseaux sanguins par tri magnétique et d'analyser l'expression des gènes dans ces cellules.
Remplacement
L'étude des mécanismes d'activation de la voie de signalisation étudiée au niveau des vaisseaux sanguins cérébraux nécessite d'étudier l'effet de nombreux agonistes et inhibiteurs permettant de moduler cette voie à différents niveaux. La réalisation de cette étude sur des cellules, et non sur des animaux, permet de diminuer fortement le nombre d'animaux utilisés puisque les expériences in vitro permettent de tester un grand nombre de composés en parallèle. Seul un petit nombre d'anbimlaux est utilisé pour obtenir les cellules qui sont ensuite mises en culture.
Réduction
Le nombre d'animaux inclus dans le projet (450 rats) a été calculé au plus juste afin d'obtenir des résultats statistiquement significatifs compte-tenu des tests utilisés. Des tests statistiques spécifiques sont utilisés pour déterminer les lots et pour analyser de façon optimale les résultats.
Raffinement
Tous les animaux seront hébergés en groupes sociaux dans des cages avec enrichissement. L'ensemble des procédures chirurgicales et de mise à mort sont effectuées sous analgésie et anesthésie (chimique). Les animaux sont surveillés sur la base de point limite et si un animal présente des signes de souffrance importants, il sera mis à mort sous anesthésie générale.
Choix des espèces
Les rongeurs possèdent une barrière hémato-encéphalique très similaire à celle de l’Homme. Le métabolisme et les processus physiologiques régulant l’homéostasie sont également très proches chez l’Homme et chez les rongeurs. Ceux-ci peuvent donc valablement servir de modèles dans l'étude et le rat Wistar-Han est une espèce particulièrement recommandée pour les études sur le métabolisme. Rats jeunes adultes de 13 semaines pour que la barrière hémato-encéphalique soit mature
Rôle de Jam A dans la production des plaquettes sanguines
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Trois heures d'anesthésie et une chirurgie du crâne sans réveil pour 100 d'entre elles : 466 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. 318 subissent des cycles répétés d'anesthésie gazeuse, des injections et des contrôles de numération à la queue avant un prélèvement terminal de sang à l'aorte, et 18 un temps de saignement mesuré à la queue pendant quinze à trente minutes. L'objet est de comprendre comment se forme le réseau de membranes internes qui donne naissance aux plaquettes sanguines, le porteur indiquant que ce réseau reste sous-développé en culture cellulaire, ce qui l'amène au modèle animal. Sur les 466 souris, 448 sont tuées parce que les expériences sont terminales et 18 sont réutilisées pour un prélèvement d'organes.
Objectifs
Les plaquettes sanguines sont produites par les mégacaryocytes (MKs) dans la moelle osseuse et sont vitales pour l'arrêt des saignements. Les MKs possèdent la caractéristique unique de contenir un réseau complexe de membranes internes (DMS). Ce réseau joue un rôle essentiel dans la production journalière de plaquette puisqu’il forme les futures plaquettes. Ainsi, la production par chaque MK d’environ 2000 plaquettes nécessite une production abondante et régulée de ce réseau membranaire. Un développement anormal est associé à une diminution du nombre de plaquettes circulantes dans certaines maladies héréditaires hémorragiques. A ce jour, les mécanismes moléculaires impliqués dans le développement des membranes internes sont encore largement méconnus. De façon remarquable, nous avons récemment observé la présence de jonctions serrées au niveau de ces membranes internes. Nous avons précédemment montré la présence d'une protéine particulière à ce niveau. Notre hypothèse est que cette protéine est un acteur clé du développement normal de ces membranes, en relation avec les protéines présentes autour des MKs dans la moelle elle jouerait un rôle clé dans la libération des plaquettes vers la circulation sanguine. Nous savons que ce réseau de membranes est sous-développé dans les MK en culture. C'est la raison pour laquelle le modèle animal est choisi dans le but de reproduire, le plus fidèlement possible, l'environnement de la moelle osseuse. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées n’exprimant plus cette protéine d'intérêt spécifiquement dans la lignée MK, qui sont disponibles au laboratoire, et ne présentent pas de phénotype dommageable.
Bénéfices attendus
Les retombées de ce projet sont cognitives et cliniques. Sur le plan fondamental, il vise à comprendre la biogénèse du réseau de membranes internes du MK (DMS), une étape clé et indispensable de la formation des futures plaquettes sanguines. Sur le plan clinique, une meilleure compréhension de la formation des plaquettes permettra de mieux comprendre la régulation du nombre de plaquettes produites par MK, et à plus long terme, de contribuer à faire avancer les traitements chez les patients thrombopéniques.
Procédures
Les animaux seront soumis à 4 différents types d'interventions : 1- Anesthésie générale par voie injectable et prélèvement terminal à l'aorte : 30 souris. 2- Anesthésie gazeuse de 5 minutes au masque pour injection des traitements pharmaceutiques et suivi de la numération à la queue, puis anesthésie générale par voie injectable pour le prélèvement terminal de sang à l'aorte : 318 souris. 3- Anesthésie générale longue de 3h au maximum, par voie injectable, et chirurgie du crane pour 100 souris, la chirurgie est sans réveil. 4-Anesthésie gazeuse de 15 à 30 minutes pour la réalisation d'un temps de saignement à la queue : 18 souris. Total : 466 souris
Impact sur les animaux
Les injections et prélèvements de sang répétés présentent un risque modéré de douleurs à la queue et de saignements légers : nuisances légère. Les protocoles liés aux traitements pharmaceutiques ont déjà bien été établis au laboratoire et les souris ne présentent pas de signes manifestes de gêne, de détresse ou de perte de poids : nuisance légère . En raison de la répétition des cycles d'anesthésie gazeuse et de réveil, nous anticipons un stress supplémentaire des animaux : nuisance modérée. En ce qui concerne les expériences par microscopie intravitale, nous anticipons un risque d'hypothermie, un dessèchement oculaire et un risque de douleur liée à la durée de l'anesthésie de longue durée : nuisance modérée.
Devenir
Lors de ce projet, sur les 466 animaux : 448 seront mis à mort puisque les expériences auquelles ils sont soumis sont terminales, et 18 animaux seront réutilisés (prélèvement d'organes).
Remplacement
Les expériences nécessitent un animal adulte vivant, car elles posent la question du fonctionnement du système hématopoïétique in vivo dans sa totalité, à l’état homéostatique, en faisant appel à une multitude de cellules qui interagissent dans toute la compléxité du vivant et en particulier la circulation sanguine. Nous avons par ailleurs remarqué que la morphologie, en particulier notre sujet d'étude, le DMS, diffèrent fortement dans des MKs en culture par rapport à ceux observés in vivo
Réduction
A la fin des expériences les animaux seront mis à mort et les moelles osseuses récupérées, fixées et stockées pour des observations ultrastructurales ultérieures, limitant ainsi le nombre de souris. Le nombre de souris est réduit au minimum mais déterminé afin d’obtenir des résultats statistiques solides dans les différents génotypes et traitements. Enfin, le maximum de prélèvements seront réalisés sur une même souris (sang, fémurs, tibia).
Raffinement
Les expériences seront raffinées afin de limiter l’angoisse, l’inconfort, le stress et la douleur associés aux procédures expérimentales. : - Pendant l’hébergement, les animaux sont élevés en groupe dans un environnement calme, enrichi et non stressant et privilégié avec un minimum de manipulation. Les expériences intravitales et les prélèvements à l'aorte ont toujours lieu sur des souris profondément anesthésiées. - Les prélèvements de sang à la queue seront réalisés sous anesthésie gazeuse, nous appliquerons un tampon hémostatique pour arrêter le saignement avant de replacer l'animal dans sa cage. A la fin de l’expérimentation, les animaux sont mis à mort avant leur réveil. Une fiche de suivi avec les points limites définis sera mise en place afin de pouvoir contrôler l’état des animaux tout au long du protocole expérimental. Une attention particulière est apportée à l’animal et une décision est prise : augmentation de l’enrichissement, soins, euthanasie. Concrètement, lors de la surveillance quotidienne des animaux, nous observerons attentivement l’aspect des souris pour s’assurer de l’absence de signes extérieurs d’infection tels que des lésions cutanées ou des écoulements nasaux ou oculaires. Une attention particulière sera apportée au niveau des sites d’injection des substances pour s’assurer qu’il n’y a pas d’infections.
Choix des espèces
La souris est largement utilisée pour étudier et modéliser la biologie et la physiologie humaine en particulier pour la production de plaquettes. La connaissance de la souris et notre expertise d’imagerie adaptés à cette problématique conduisent à choisir cet animal pour l’étude. Les souris seront utilisées sans distinction à un stade de développement adulte de 8 à 35 semaines.
Développement d’une membrane innovante d’épuration sanguine pour allonger la durée de préservation d’organe en transplantation cardiaque
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
62 cochons de 45 à 60 kilos vont être utilisés, opérés sous anesthésie générale et tués avant tout réveil. Trente-six subissent un prélèvement du cœur, six une exsanguination par voie percutanée destinée à recueillir 1 500 mL de sang, douze une transplantation cardiaque suivie de trois heures de maintien en vie pour évaluer la fonction du greffon, la procédure complète durant six heures. L'objet est de mettre au point une membrane de filtration du sang pour allonger au-delà de quatre heures la conservation des cœurs destinés à la greffe, avec des débouchés annoncés jusqu'en néphrologie et en toxicologie. Le porteur écrit que, les procédures étant menées sous anesthésie générale sans réveil, aucun effet indésirable ni aucune nuisance ne sont attendus pour l'animal.
Objectifs
La transplantation cardiaque est le traitement de référence de l'insuffisance cardiaque avancée mais la pénurie de greffons est un obstacle majeur dans la prise en charge de ces patients. Environ 400 transplantations cardiaques sont réalisées chaque année en France pour des patients souffrant d’insuffisance cardiaque avancée. La problématique majeure actuelle en transplantation cardiaque est le manque de donneur avec un ratio actuel d’un seul greffon disponible pour deux candidats en attente. En conséquence la durée d’attente pour une transplantation cardiaque augmente et 55 à 70 patients inscrits sur liste d’attente (sur 500 nouveaux inscrits chaque année) meurent chaque année faute d’avoir pu être transplantés. De plus, la durée préservation du greffon, en préservation froide statique conventionnelle, est limitée à 4 heures, restreignant ainsi la distance géographique entre le donneur et le receveur. La perfusion cardiaque ex vivo normothermique au sang (EVHP) est une technologie utilisée en transplantation cardiaque pour allonger la durée de préservation d’organe. Le cœur prélevé sur le donneur d’organe est immédiatement reperfusé au sang et oxygéné ce qui le met dans des conditions optimales jusqu’à la transplantation grâce à une machine de perfusion transportable. Contrairement à la préservation froide conventionnelle dans la glace, la perfusion cardiaque ex vivo au sang réduit les risques de souffrance de l’organe pendant son transport jusqu’à la transplantation. L’objectif est de développer un dispositif médical d’épuration du sang dédié pour la préservation prolongée sur machine du cœur en attente de transplantation.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d’améliorer l’accessibilité aux greffons cardiaques en prolongeant la durée de préservation des greffons, supprimant ainsi les restrictions géographiques. La proximité de l’anatomie et de la physiologie cardiovasculaire entre l’homme et le porc rendent les résultats expérimentaux de notre protocole rapidement transposables à la pratique clinique en transplantation cardiaque chez l’homme. Un greffon marginal est un cœur à risque d’échec précoce de transplantation, principalement en raison des antécédents du donneur (âge >55 ans, facteurs de risque cardiovasculaire, arrêt cardiaque prolongé). Des interventions pharmacologiques pourront également être appliquées pour réhabiliter les greffons marginaux avant la transplantation. De plus, la coronarographie ex-vivo permettra un meilleur dépistage des donneurs à haut risque. La coronarographie ex vivo étant un examen d’imagerie des artères du cœur réalisé au cours de la perfusion isolée du cœur sur machine. Cet examen renseigne sur la présence de lésions sur les artères coronaires qui peuvent être présentes sur les greffons marginaux. Ce projet ouvre la voie à une nouvelle génération de solutions de filtration sanguine miniaturisées, permettant la filtration sélective des toxines, des médicaments et des médiateurs inflammatoires. La membrane HaemoVIPER sera un atout majeur, non seulement dans le domaine de la transplantation, mais aussi dans les maladies rénales chroniques, les maladies dysimmunitaires et les intoxications médicamenteuses.
Procédures
Avant l'anesthésie générale, l'ensemble des animaux auront une injection intra musculaire afin d’obtenir une sédation vigile et une anxiolyse.36 animaux seront soumis à un prélèvement cardiaque sous anesthésie générale. La durée moyenne de la procédure chirurgicale de prélèvement cardiaque est de 2 heures. 6 animaux seront soumis à une exsanguination par voie percutanée, la durée moyenne de la procédure chirurgicale d’exsanguination est de 2 heures. 12 porcs auront une transplantation cardiaque. La durée moyenne de la procédure de la procédure chirurgicale de transplantation cardiaque est de 3 heures. La totalité des animaux transplantés seront maintenus en vie 3 heures après la réalisation de la transplantation afin d’évaluer la fonction cardiaque. La durée totale de la procédure est de 6 heures.
Impact sur les animaux
S'agissant de procédures expérimentales réalisées sous anesthésie générale balancée sans réveil, aucun effet indésirable ni nuisances ne sont attendus pour l'animal qui sera euthanasié en fin de procédure ou en cas d'échec de l'anesthésie.
Devenir
Les animaux seront tous euthanasiés en cours d’expérimentation, sous anesthésie générale, en raison soit de l’explantation du cœur soit de l'exsanguination nécessaire à la procédure. L’analyse des tissus myocardiques après la transplantation sera primordiale dans la compréhension de nos résultats.
Remplacement
Il n’existe à ce jour aucun modèle alternatif au modèle animal pour étudier la production et la filtration de molécules produite par le coeur perfusé sur une machine (EVHP). De même, l’impact de la perfusion prolongée et de la filtration sur la qualité de préservation ex vivo du cœur ne peuvent être étudiés que sur un modèle animal. En effet, la perfusion d’organe ex vivo repose sur l’utilisation d’un organe et non d’un tissu ou d’une culture cellulaire (pas d’alternative in silico ou in vitro). Il est donc nécessaire dans notre approche d’utiliser un cœur prélevé sur un système vivant. Par ailleurs seul un modèle sur le gros animal permet l'instrumentation nécessaire pour placer le cœur sur un module de perfusion d’organe isolé tel qu’utilisé en pratique clinique. Enfin ce modèle permet d’extrapoler facilement les résultats à l’homme, dont le système cardiovasculaire est proche sur le plan anatomique, physiologique et métabolique. Le développement de la membrane de filtration comprendra des expérimentations in silico et des simulations numériques pour remplacer une partie des animaux.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux nécessaires à l’étude, le nombre d’animaux par groupe sera suffisant afin de pouvoir réaliser des tests de comparaison statistique entre les groupes. Nous avons prévu l’inclusion de 2 animauxpréliminaire afin de réaliser une procédure test de faisabilité de transplantation cardiaque chez le porc avant d’inclure les animaux dans les groupes expérimentaux. Le modèle de perfusion de cœur de porc ex-vivo sur machine est appliqué dans notre laboratoire depuis 2020 avec plus de 100 procédures réalisées. Les causes d’échec rencontrées (10 %) sont inhérentes à la qualité de l’organe (malformation cardiaque, cardiopathie hypertrophique, insuffisance valvulaire aortique). Dans chaque groupe, dès que le nombre d'animaux nécesaire pour les analyse sera atteint, aucune autre inclusion ne sera effectuée.
Raffinement
Respect d’une période d’acclimatation d’une semaine minimum entre l’arrivée à l’animalerie du laboratoire et l’inclusion dans le protocole de recherche - Hébergement en groupe de deux pour favoriser le contact régulier entre congénères - Environnement adapté à chaque phase de l’expérimentation pour réduire l’angoisse des animaux (accompagnement et anxiolyse durant le transfert depuis l’animalerie jusqu’en salle d’intervention) - Privilégier les ponctions vasculaires percutanées échoguidées artérielles et veineuses, pour mise en place des cathéters de surveillance hémodynamique continue : moins de souffrance, moins de saignement et risque infectieux réduit. L’atteinte d’un point limite sera déterminée par l’observation de signes comportementaux, d’apparence générale permettant de quantifier la souffrance de l’animal selon un score spécifique à l’espèce porcine. L'évaluation du bien-être animal sera réalisée de manière quotidienne pour chaque animal, pendant la période d'acclimatation et durant l’opération jusqu'à son euthanasie. Ces différents éléments seront évalués à l'aide d'une grille d'évaluation émanant de la cellule du bien-être animal. Durant les procédures expérimentales, l’anesthésie générale sera maintenue en combinant hypnotiques et analgésiques. En cas d’échec d’anesthésie ou d’analgésie au cours de l’expérimentation, l’animal sera euthanasié par injection intraveineuse. Le décès des animaux sera déclaré après 5 minutes d’inefficacité circulatoire (arrêt d’activité cardiaque électrique à l’ECG, absence de pulsatilité artérielle et pression artérielle moyenne inférieure à 30 mmHg).
Choix des espèces
Le modèle animal choisi est le porc. Le porc présente une physiologie circulatoire proche de celle de l’homme (Fréquence cardiaque proche de 100/min, débit cardiaque entre 3,5 et 4 L/min pour un poids de 50 kg). Par ailleurs son anatomie cardiovasculaire facilite la réalisation des canulations artérielle et veineuse nécessaires pour sa perfusion isolée ex vivo. La modélisation chirurgicale est facilitée par l’usage du gros animal Cette convergence permet une adaptation optimale de l’espèce aux expérimentations et limitera au minimum le nombre d’animaux tests (échecs techniques). Enfin notre protocole prévoit des prélèvements sanguins et des biopsies cardiaques répétées sur le cœur perfusé ex vivo avec respectivement un volume et un poids de prélèvement minimum afin de pouvoir réaliser les analyses plasmatiques et tissulaires. Là encore, l’expérimentation sur le porc est adaptée pour ces prélèvements répétés, contrairement à un modèle rongeur qui permettrait un recueil plasmatique et tissulaire de plus faible quantité. Les animaux utilisés dans le protocole expérimental sont des porcs de 45 à 60 kg. A ce stade de développement les porcs ont un système circulatoire très proche de l’homme et leur gabarit permet une modélisation chirurgicale optimale, notamment pour la canulation de l’aorte et de l’artère pulmonaire pour l’implantation du cœur sur le module de perfusion ex vivo. Par ailleurs, le volume sanguin nécessaire à la perfusion du cœur ex vivo sera recueilli sur l’animal, juste avant l’explantation du cœur et la mise à mort de l’animal. Ce volume sanguin doit être de 1500 mL, ce qui justifie d’inclure des animaux ayant une masse sanguine d’au moins 2,5 à 3 litres, soit un poids supérieur à 50 kg afin de ne pas avoir de difficultés pour recueillir 1500 mL au moment de l’exsanguination. Enfin, des prélèvements biologiques seront répétés durant la procédure de perfusion cardiaque ex vivo, à la fois des échantillons plasmatiques et des biopsies myocardiques. En conséquence, seul un modèle expérimental sur le gros animal peut permettre de satisfaire à ces contraintes répétées de volume et de poids des prélèvements biologiques destinées à l’analyse du métabolisme.
Evaluation d’un ciblage de PCSK9 dans le cadre d’un traitement des conséquences cardiovasculaires du syndrome d’apnées obstructives du sommeil chez des souris 2/2
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Cent huit souris seront réutilisées dans d'autres procédures et les animaux d'élevage maintenus en vie pour la reproduction, les autres étant tués pour prélever leurs organes. 446 souris vont être utilisées au total, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré. Elles passent quatorze ou cinquante-six jours dans un dispositif qui les prive d'oxygène par intermittence pour reproduire les apnées du sommeil, avec des injections, deux à quatre prélèvements de sang, des mesures de pression artérielle à la queue trois fois par jour pendant trois jours, une échographie cardiaque sous anesthésie et un transport routier entre deux établissements. Le porteur écarte la drosophile, le poisson zèbre et le nématode comme animaux de "classes phylogénétiques inférieures" non pertinents, et affirme que les modèles cellulaires ne représentent pas la complexité d'un "organisme entier".
Objectifs
Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) est une pathologie touchant 5-20% de la population générale, caractérisée par des apnées répétitives pendant le sommeil conduisant à un manque d’oxygène dans le sang, qu’on appelle hypoxie intermittente (HI). Les complications cardiovasculaires qui en découlent posent un réel problème de santé publique, avec en particulier une incidence accrue d’athérosclérose chez les patients SAOS conduisant à une augmentation de la mortalité par infarctus du myocarde et accident vasculaire cérébral. Le traitement de référence du SAOS, la pression positive continue (PPC), permet d’améliorer les symptômes et la qualité de vie des patients, mais son effet sur le risque cardiovasculaire reste controversé. Ainsi, un axe futur de la prise en charge des patients apnéiques est d’associer la PPC à un traitement permettant de réduire le risque cardiovasculaire, mais il est nécessaire de bien connaitre les mécanismes associés au SAOS pour cibler les thérapeutiques les plus pertinentes. Parmi les mécanismes impliqués dans les premières phases de la formation des plaques d’athérome on peut citer une inflammation et des problèmes de paroi des vaisseaux, entraînant une augmentation de la migration des globules blancs et conduisant à un remodelage des vaisseaux avec un épaississement de la paroi et l’apparition de lésions d’athérosclérose. Ces phénomènes vont ainsi être activés chez les patients SAOS. Une protéase d’intérêt à commencer à se détacher ces dernières années dans la recherche sur l’athérosclérose. Notre hypothèse est donc que cette protéase serait un acteur majeur des troubles aux niveaux des parois des vaisseaux induits par l'HI. Afin de confirmer cette hypothèse nous voulons évaluer l’impact d’un blocage de cette protéase sur le remodelage vasculaire provoqués par une hypoxie intermittente, dans nos modèles expérimentaux de souris. Nous espérons ainsi déterminer si cette protéase pourrait servir de cible thérapeutique pour les conséquences cardiovasculaires du SAOS. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs différents.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si notre protéase d’intérêt pourrait être une cible thérapeutique possible pour lutter contre les conséquences cardiovasculaires du SAOS. Celles-ci n’ayant pas de traitement suffisamment efficace actuellement, et les anticorps contre celle-ci étant déjà approuvés chez l’homme pour d’autres indications, les résultats de cette étude pourraient conduire à proposer un nouveau traitement à moyen terme pour ces malades.
Procédures
Les animaux seront placés en hypoxie ou en normoxie pendant 14 ou 56 jours selon leur groupe. Le traitement étudié sera injecté aux animaux le premier jour pour les animaux exposés 14 jours et les jours 28 et 42 pour ceux exposés 8 semaines (10 minutes pour prendre en main l’animal et l’injecter). Deux prélèvements sanguins auront lieu pour les animaux exposés 2 semaines, et quatre prélèvements pour les animaux exposés 8 semaines (10 minutes pour réaliser la contention de l’animal et prélever le sang). Tous les animaux seront soumis à des mesures de pression artérielle vigile (3 fois par jour pendant 3 jours, à raison de 15 minutes par session), non-invasives à la queue. La fonction cardiaque et aortique sera mesurée une fois, en fin de protocole, par échographie sous anesthésie gazeuse d'une durée moyenne de 30 minutes. A la fin de cette exposition, les animaux seront mis à mort par prélèvement du sang sous anesthésie générale (10 minutes de procédure). L'imagerie sera réalisée dans un des établissements utilisateurs et toutes les autres interventions se dérouleront dans l'autre établissement utilisateur.
Impact sur les animaux
Les animaux recevront une injection de médicament ce qui conduira à un léger stress. Les animaux se verront aussi prélever de sang toutes les semaines ou toutes les deux semaines ce qui entrainera un léger stress. La mesure sur animal éveillé de la pression artérielle peut induire un léger stress. Enfin les animaux seront placés dans le dispositif à hypoxie intermittente, ce qui entraîne un stress modéré et une perte légère de poids sur les 3 premiers jours, le temps qu’ils s’adaptent. Enfin le transport des animaux après les échographies entre les deux sites pourrait induire un stress d’un niveau léger en gravité.
Devenir
Les animaux de la procédure d’élevage seront tous maintenus en vie pour effectuer les reproductions. Tous les animaux de la procédure expérimentale seront mis à mort afin de pouvoir prélever leurs organes et effectuer des analyses supplémentaires.
Remplacement
L’étude du remodelage des vaisseaux nécessite des manipulations invasives ce qui exclut une étude in vivo chez l’homme. Nous utilisons des modèles cellulaires pour les premières étapes de nos travaux, mais ils ne sont pas en mesure de représenter la complexité d’un organisme entier. Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur l’intégrité et le remodelage des vaisseaux. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature.
Réduction
Le nombre d’animaux par lot a été défini à minima, soit 12 par groupe, afin que les résultats puissent être statistiquement interprétables. Cette valeur a été obtenue par une approche statistique. Nous évaluerons la présence d’un effet sexe sur nos résultats après la première série d’expérimentations. S’il n’y a pas de différences entre les sexes alors nous rassembleront nos groupes d’animaux et réduirons leur nombre de moitié. Après la réalisation des procédures in vivo et l'euthanasie des animaux, nous allons collecter les organes et tissus de ces mêmes animaux pour les utiliser au cours des études ex vivo post-mortem, rationnalisant encore ainsi le nombre des animaux utilisés.
Raffinement
Une attention générale sera portée à la qualité des méthodes d'anesthésie et d'analgésie des animaux. De plus, une surveillance attentive sera réalisée pendant l'hébergement et lors de la réalisation des procédures expérimentales afin d'évaluer en permanence les nuisances subies (douleur, stress, ...), de façon à pouvoir appliquer immédiatement un renforcement analgésique et/ou anesthésique si nécessaire et faire en sorte que ces nuisances soient absentes ou réduites à leur niveau minimum. Les conditions d'expérimentation seront aussi optimisées pour le confort des animaux, avec habituation à la contention (pour les mesures de pression artérielle) et gel oculaire appliqué lors d'anesthésies longues (échographie). Des points limites prédictifs et précoces, gradés précis et adaptés, ainsi que des critères d'arrêt, sont définis, et un arbre décisionnel mis en place, permettant aux personnels de décider des actions à réaliser pour le bien-être des souris et l'application des points limites et critères d'arrêt définis. Les expérimentateurs et soigneurs seront formés pour appliquer ces procédures et règles de protection du bien-être animal, conformément à la règlementation. Le transport des animaux entre les 2 EU est fait par un expérimentateur compétent, en cage d'hébergement standard, temporairement occultée, avec eau, croquettes et enrichissement. Une fois réceptionnées, les souris seront transférées dans des cages propres pour une période d’acclimatation d’au moins 7 jours avant le début des expérimentations dans la salle où se trouve le dispositif à hypoxie intermittente. Le personnel responsable du bien-être animal veillera à leurs conditions d’hébergement, à leur adaptation à leur environnement et à la mise à disposition ad libitum en nourriture et eau. De plus, un enrichissement de leur milieu de vie adapté sera mis en place pendant la période d’acclimatation et d’expérimentation. Les conditions d’hébergement respecteront les normes relatives au bien-être animal en vigueur. Afin de limiter leur angoisse, ils seront acclimatés à l’expérimentateur pendant ces 7 jours. Tout comportement anormal sera signalé afin de mettre en place des soins adaptés. Le vétérinaire responsable des animaux sera contacté si un animal présente une souffrance inhabituelle. Les animaux seront examinés quotidiennement et pesés de manière hebdomadaire par les zootechniciens ou l’expérimentateur.
Choix des espèces
Nos travaux sont centrés sur les effets de l’hypoxie intermittente sur les parois des vaisseaux et le remodelage des vaisseaux. Des modèles alternatifs d’animaux de classes phylogénétiques inférieures (drosophile, zebrafish, c-elegans) utilisés parfois en recherche fondamentale ne sont pas pertinents pour les questions scientifiques abordées dans ce projet. Les souris sont le modèle de référence utilisé en recherche cardiovasculaire fondamentale ce qui permettra une comparaison de nos résultats avec ceux de la littérature. Dans ce travail, il est prévu d’utiliser les souris sauvages et génétiquement modifiées, déjà existantes au laboratoire. Ces modèles sont parmi les plus reconnus comme souche référente dans la communauté scientifique. De plus, l’anatomie des vaisseaux de la souris est parfaitement connue et les outils qui permettront l’analyse sont déjà maîtrisés au laboratoire. Nous utiliserons des souris jeunes adultes âgées de 12 semaines au début de l’exposition, ce qui permet une meilleure connaissance de l’impact de l’hypoxie intermittente sur le système vasculaire sans être biaisé par l’effet de l’âge.
Étude des effets d’une modification protéique, l’O-GlcNAcylation, sur l’adaptation à la vie extra utérin chez le rat Wistar.
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système cardiaque
Placés en manque d'oxygène de un à vingt-et-un jours et injectés chaque jour sous la peau, 756 rats vont être utilisés dans ce projet, mères gestantes et nouveau-nés compris. Les procédures sont déclarées d'un niveau de souffrance léger. Le porteur indique que l'hypoxie peut provoquer des troubles respiratoires, cardiovasculaires et métaboliques, et affirme dans le même temps que les effets "devraient être amoindris" chez ses animaux. Les mises à mort à la naissance, à sept jours et à vingt-et-un jours sont faites par dislocation et par décapitation, une couverture anesthésique n'étant prévue que pour les mères, afin de prélever cœur, aorte, poumons, reins, foie et sang.
Objectifs
L'oxygène est essentiel à la survie, les humains ayant besoin d'au moins 94 % d’oxygène dans leur sang pour un fonctionnement cellulaire approprié. Les malformations cardiaques peuvent perturber la circulation sanguine et l'oxygénation en raison de modifications anatomiques. La malformation la plus courante, touche 1 naissance sur 2 000. Cette condition entraîne des altérations morphologiques du coeur, provoquant une décoloration bleutée de la peau due à un manque d'oxygène dans le sang, communément appelée "bébés bleus", par opposition aux "bébés roses" ayant une concentration normale. Dans d'autres malformations cardiaques congénitales, la saturation peut même descendre en dessous de 30 %. De manière remarquable, ces nourrissons peuvent survivre pendant des semaines, voire des années, avant de nécessiter une intervention chirurgicale, malgré des niveaux d’oxygène dans le sang généralement considéré comme incompatibles avec la vie. Le taux de survie de ces patients est étonnamment élevé. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire expliquant ce phénomène n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge des patients. La stimulation d’une une modification protéique a démontré être bénéfique lors d’un manque d’oxygénation du cœur et dans le choc hémorragique. Son importance lors du développement cardiaque a été souligné dans de nombreuses études ainsi que son rôle dans la réponse à l’hypoxie. De plus notre équipe a mis en évidence un switch des niveaux de cette modification au niveau cardiaque entre le jour avant la naissance et le jour de la naissance. L’hypothèse de ce projet est que l’augmentation des niveaux de cette modification pourrait être bénéfique dans le cadre d’un manque d’oxygénation à la naissance. Les objectifs de ce projet sont : (1) Définir l’implication de cette modification dans la transition vie intra utérine et vie extra utérine. (2) Identifier les mécanismes moléculaires impliqués dans l’adaptation à l’hypoxie.
Bénéfices attendus
Pour vivre l’humains a besoin d'une concentration en oxygène dans le sang d'au moins 94 %. Les nourrissons atteints de malformation cardiaque peuvent avoir une concentration artérielle en oxygène proche de la normale (au-dessus de 90 %) ou considérablement réduite, avec des niveaux tombant jusqu'à 30 % dans les cas graves. De manière remarquable, ces nourrissons peuvent survivre pendant des semaines, avant de nécessiter une intervention chirurgicale, malgré des niveaux d’oxygène dans le sang généralement considéré comme incompatibles avec la vie. Le taux de survie de ces patients est étonnamment élevé. A ce jour, aucun mécanisme moléculaire expliquant leur capacité d’adaptation n’a été validé. L’identification et la compréhension de ces mécanismes sont des enjeux scientifiques et cliniques afin d’améliorer la prise en charge de ces patients. Les bénéfices associés à ce projet sont 1) une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans l’adaptation au manque d’oxygène natale et 2) identifier des cibles thérapeutiques.
Procédures
Les animaux subissent 1 unique procédure qui correspond à une hypoxie de 1 à 21 jours. 1 jour avant l’accouplement et jusqu’au sacrifice ou la mise bas les animaux recevront une fois par jour, une injection sous cutanée de NButGT afin d’augmenter les niveaux de O-GlcNAcylation. L’injection est réalisée sur une période de 5 secondes afin de limiter tout stress chez l’animal. L’étude de l’impact structurel et fonctionnel de l’hypoxie +/- O-GlcNAcylation sera réalisée via une échocardiographie d’environs 5min sur les animaux à la naissance et 7 jours de vies. A la fin de cette période, les animaux sont euthanasiés afin de prélever les différents organes (cœur, aorte, rein, poumons, foie, sang).
Impact sur les animaux
L’injection sous cutanée peut être à l’origine d’une inflammation localisée. Afin de limiter ce risque les sites d’injections seront modifiées chaque jour. De plus tout animal ayant une apparition d’une réaction cutanée, des difficultés respiratoires ou d’une modification de son comportement (léchage, grattage intensif) fera l’objet d’un arrêt du protocole. L’impact de l’hypoxie sur les animaux est très bien décrit dans la littérature. L’hypoxie peut provoquer des problèmes respiratoires, cardiovasculaire, et métabolique. Les animaux étant soumis à une hypoxie pendant 24h à 21 jours les effets observés ici devraient être amoindrit. Chaque signe de détresse de l’animal mettra fin au protocole.
Devenir
A la fin de la procédure, l’ensemble des animaux seront euthanasiés. Après euthanasie, le cœur, l’aorte, les poumons, les reins, le foie et le sang seront prélevés pour des analyses.
Remplacement
Le développement cardiaque est un processus complexe et intégré faisant intervenir une multitude d’acteurs. Mimer le développement cardiaque par des approches cellulaire n’est pas envisageable ; rendant l’usage d’animaux indispensable pour mieux comprendre le lien entre l’adaptation à la vie extra utérine, le manque d’oxygène et notre modification post-traductionnelle.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés est réduit au minimum tout en ayant des données statistiques assez puissantes (dans la mesure du possible les tests seront réalisés en aveugle, afin d’augmenter la puissance de l’étude). Enfin, lorsque cela est possible, plusieurs investigations seront réalisées sur les mêmes animaux, afin de limiter la multiplication de groupes expérimentaux et d’animaux nécessaires. Au total, le nombre d’animaux maximal utilisé dans ce projet est de 756 animaux.
Raffinement
Après leur arrivée, les animaux seront placés par 3 dans des cages avec enrichissements (tunnel et bâton en bois) sur portoirs ventilés et avec accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. Lors de la procédure d’accouplement et après cette dernière, les animaux seront placés individuellement dans des grandes cages avec enrichissements (tunnel, frisotis et bâton en bois) et accès à l’eau et à la nourriture ad libitum. L’alimentation et l’eau de boisson seront assurées par un membre de l’équipe, assurant une surveillance quotidienne des animaux. Lors de la mise a morts des animaux, et lorsque cela est possible (mise à mort des mères), une couverture anesthésique sera mise en place. La mise à mort des animaux à 7, 21 jours et à la naissance (J0) ne peut être réalisé respectivement que par dislocation et décapitation. Ces gestes sont connus de l’équipe qui y a régulièrement recourt et qui les maitrise.
Choix des espèces
Ce modèle est l’un des modèles les plus utilisés en recherche. De plus, notre équipe possède une expertise sur ce modèle animal, son comportement et sur l’ensemble des procédures associées. La taille des animaux permet de réaliser plusieurs analyses sur un même animal et donc de réduire le nombre d’animaux utilisés. L’objectif du projet est d’étudier le lien le lien entre l’adaptation à la vie extra utérine, le manque d’oxygène et notre modification post-traductionnelle. Afin d’étudier l’impact sur le développement cardiaque, différents stades de développement sont nécessaires dans ce projet. L’utilisation d’animaux à la naissance (J0), à 7 jours post naissance (J7) et à 21 jours post naissance, permet d’obtenir une information complète sur l’impact de l’O-GlcNAcylation lors du développement cardiaque post-natal
Etude du rôle des plaquettes dans l’insuffisance cardiaque (1/2)
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
Une mortalité de l'ordre de 20 % est attendue pendant la chirurgie qui resserre l'artère en sortie du cœur, puis de 5 % pendant le développement de l'insuffisance cardiaque qui s'ensuit. 1 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour que leur cœur et leur sang soient analysés. L'opération dure une trentaine de minutes, l'artère est exposée puis rétrécie, et l'évolution de la maladie est suivie chaque semaine par échographie sous anesthésie, dans un second établissement rejoint à pied. L'effectif de 1 260 souris est rapporté à la littérature du domaine et à l'expérience de l'équipe, sans que le calcul soit détaillé.
Objectifs
Cette demande d'autorisation concerne deux laboratoires (EU1 et EU2). L'insuffisance cardiaque est une pathologie évolutive au cours de laquelle le cœur perd progressivement sa capacité à pomper correctement le sang, avec un essoufflement qui apparaît chez les sujets atteints d'abord à l'effort puis au repos. Cette maladie s’installe progressivement le plus souvent suite à la survenue d'un infarctus du myocarde, ou bien en raison de l'hypertension artérielle ou d'un rétrécissement aortique. Elle est due à un changement de morphologie du cœur qui doit s'adapter à de nouvelles contraintes, et qui finit par s'épuiser. Notre étude porte sur l'étude du rôle des plaquettes sanguines dans l'évoluton de cette maladie. Pour ce faire, nous allons utiliser un modèle d'insuffisance cardiaque qui est bien décrit chez la souris, et qui permet d'induire la maladie en quelques semaines. Nous appliquerons dans une 1ère partie ce modèle à des souris modifiées génétiquement chez lesquelles différents déterminants de surface des plaquettes ont été modifiés. En comparant ces souris à des souris non modifiées génétiquement, nous pourrons déterminer si un ou plusieurs de ces déterminants est important dans l'évolution de la maladie du cœur. Dans une 2ème partie, en fonction des données obtenues dans la 1ère, nous testerons différents traitements pharmacologiques susceptibles de freiner le développement de la maladie chez les souris. L'objectif de ce projet est de trouver de nouvelles approches thérapeutiques qui permettrait de traiter l'insuffisance cardiaque.
Bénéfices attendus
Il n'existe actuellement pas de traitement curatif contre l'insuffisance cardiaque. Nous souhaitons par ce projet mieux comprendre l'évolution de cette maladie afin de trouver une nouvelle cible thérapeutique qui permettrait de la combattre. Si un ou plusieurs des déterminants de surface plaquettaire s'avère(nt) être une (des) cible(s) potentielle(s) (Partie 1), nous testerons alors des traitements pharmacologiques dont nous disposons et qui sont capables de les bloquer (Partie 2). Nos résultats pourraient par conséquent s'avérer être bénéfiques à la santé humaine.
Procédures
Tous les gestes techniques sont réalisés sur des animaux analgésiés et anesthésiés à l'aide d'une anesthésie gazeuse. La veille de l'intervention chirurgicale, un prélèvement sanguin (1 min) est prévu ainsi qu'une session d'épilation de la zone opérée. Un prélèvement sanguin final est prévu également au moment de l'euthanasie des animaux. La chirurgie dure environ 30 minutes. Elle consiste en l'exposition de l'artère en sortie du cœur et en son rétrécissement (20 min). L'animal est ensuite recousu (10 min). L'évolution de la pathologie cardiaque est suivie chaque semaine par imagerie en échographie sur les animaux anesthésiés (5 min). Les interventions ont lieu au sein du premier laboratoire (EU1), à l'exception du suivi échographique qui est quant à lui effectué dans les locaux du deuxième (EU2).
Impact sur les animaux
Une certaine mortalité est attendue lors de la chirurgie induisant l'insuffisance cardiaque, estimée de l'ordre de 20%, puis au cours du développement de la maladie (5%). Les autres effets indésirables prévus sur les animaux sont : - une douleur post- opératoire à J0 et pendant 24h - une perte de poids post-opératoire (modérée) - un stress occasionné par les séances d'imagerie
Devenir
Les animaux arrivant à la fin de la procédure sont euthaniasiés afin de pouvoir analyser leur cœur. Nous étudions également leur sang pour analyser des marqueurs de la maladie cardiaque qui peuvent s'y trouver en circulation.
Remplacement
La maladie que nous étudions est complexe et fait intervenir un grand nombre de paramètres différents (inflammation, modification de la paroi cardiaque, dialogue avec d'autres organes comme les poumons et les reins). Il n'est aujourd'hui pas possible de mimer ces phénomènes autrement qu'en utilisant des animaux vivants dont la physiologie est proche de celle de l'être humain.
Réduction
Le nombre d'animaux nécessaire à notre étude a été déterminé grâce aux données disponibles dans la littérature du domaine et à notre expérience des modèles animaux. Des tests statistiques permettant de connaître le nombre de souris minimal nécessaire ont aussi été réalisés.
Raffinement
Une grille de score a été mise en place, nous permettant d'agir en cas de souffrance des animaux. Les animaux qui dépassent les points limites que nous avons définis sont euthanasiés. La douleur post-opératoire ou potentiellement occasionnée par les prélèvements sanguins est évaluée et traitée préventivement par l'administration d'un anti- douleur. De la nourriture humide est placée au sol dans leur cage afin de faciliter la prise de nourriture et l'hydratation après la chirurgie. Chaque jour, les animaux sont pesés et leur apparence générale est contrôlée. Du coton est placé dans leur cage pour leur permettre de faire des nids. Le transport des souris entre les deux établissements dure 5 minutes à pied et se fait dans leur cage qui est placée dans un sac de transport.
Choix des espèces
La souris est un mammifère dont le système cardiovasculaire a un fonctionnement et une organisation très proches de ceux de l'être humain. Ce système est mature lorsque la souris est adulte (à environ 8-10 semaines), raison pour laquelle nous utiliserons des animaux de cet âge, la maladie touchant des êtres humains d'âge adulte. Le patrimoine génétique de la souris est par ailleurs connu depuis de nombreuses années et nous avons à notre disposition des souris modifiées génétiquement qui ne produisent pas un certain nombre de molécules d'intérêt, ce qui permet d'étudier leur rôle (partie 1 du projet), comparativement aux souris qui la produisent normalement. D'autre part, des souris qui ne sont pas modifiées génétiquement seront utilisées dans le cadre du test de nouvelles approches thérapeutiques (partie 2 du projet).