Système cardiaque

12812 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune pouvant subir huit prélèvements sanguins à la queue, des gavages quotidiens pendant 30 semaines et des injections intrapéritonéales deux fois par semaine sur la même durée. S'y ajoutent une chirurgie de pose d'implant d'œstrogène, une injection sous-cutanée de cellules tumorales humaines dans les deux flancs, une ligature vasculaire, une biopsie de la queue au sixième jour de vie et des transports entre cinq établissements. Le porteur signale un risque de perforation de l'œsophage et de passage de la solution dans les poumons lors des gavages, des douleurs dès que la tumeur atteint un certain volume, des démangeaisons et des difficultés à s'alimenter et à s'abreuver. Les souris des procédures expérimentales sont tuées pour exploration anatomique, celles de l'élevage restant en vie pour l'accouplement sauf les mâles immunodéficients, et le bénéfice annoncé tient en une phrase, une meilleure compréhension des syndromes d'hypercroissance et l'identification potentielle de nouveaux traitements.

Objectifs

Les syndromes d’hypercroissance sont causés par des mutations génétiques affectant uniquement certains tissus. Notre objectif est de développer des modèles précliniques porteurs de mutations de ces genes dans différents tissus afin de comprendre la physiopathologie des anomalies et d’identifier de nouveaux traitements permettant de prévenir l’apparition des symptômes ou de freiner la pathologie. Le projet se déroule sur 5 sites différents.

Bénéfices attendus

Ce projet nous conduira à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires conduisant aux syndromes hypertrophiques et à l'identification potentielle de nouveaux traitements

Procédures

Les interventions subies par les animaux seront : 1) Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour l’insertion des implants d’œstrogène (EU1 et EU2) 2) Une injection en sous cutané de cellules tumorales humaines sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2). 3) Des prélèvements sanguins (n= 8 par souris) à la queue sous anesthésie gazeuse (EU1 et EU2) 4) Des inductions par gavages au tamoxifène (moins d’une minute) sur 5 jours pour induire les phénotypes d’hypercroissance (EU1 et EU2) 5) Des observations des tumeurs et des imageries in vivo sous anesthésie gazeuse durant maximum 30 min (EU3, EU4, EU5) 6) Des traitements en injections bihebdomadaires intra péritonéal (moins d’une minute) de traitements (30 semaines) (EU1 et EU2) 7) Des gavages quotidiens de traitements (moins d’une minute) pour une durée maximale de 30 semaines (EU1 et EU2) 8)Une chirurgie de 10 min sous anesthésie gazeuse pour ligature vasculaire (EU1 et EU2) 9) Biopsie de la queue à jour 6 de vie pour génotypage (3 secondes) (EU1 et EU2)

Impact sur les animaux

Les souris recevront par voie sous cutanée (flancs gauche et droit) deux injections mais toutes n’auront pas de développement de tumeurs. S’il y a prise de greffe, et formation de tumeurs sous cutanées, les effets de la tumeur peuvent être indésirables et générer certaines contraintes : douleurs à partir d’un certain volume, difficultés à s’alimenter et à s’abreuver, tension au niveau de la peau, démangeaisons et irritations. L’insertion de l’implant et la mise en place d’un point de suture peut également provoquer une gêne avec des démangeaisons et une légère tension au niveau de la plaie suite à la cicatrisation. Une hypothermie, une déshydratation et un asséchement des yeux peut également survenir suite à l’anesthésie. Les séances d’imageries et les prélèvements sanguins répétés sont un stress. L’administration par gavage comporte un risque de perforation de l’œsophage ainsi qu’un risque d’arrivée de la solution dans les poumons, entrainant des signes de détresse respiratoire. Les injections péritonéales répétées peuvent induire une irritation et/ou une douleur au niveau de la zone d’injection. Les ligatures vasculaires peuvent engendrer des infections localisées, des saignements et des douleurs. Le transport d'un centre à un autre pour les imageries in vivo peut induire un stress pour les animaux. Au cours des biopsies à jour 6 pour génotypage, une douleur localisée de très courte durée peut survenir.

Devenir

Les animaux de la procédure d’élevage seront maintenus en vie pour accouplement et maintien des lignées sauf pour les males immunodéficients. Les animaux des procédures d’expérimentation seront mis à mort pour exploration anatomique et histologique.

Remplacement

Il n'existe pas de modèle in vitro qui permette d'étudier les caractéristiques des syndromes de surcroissance. Au cours de ces syndromes, les cellules nécessitent un environnement complexe avec de multiples interactions et facteurs de croissances qu’il est actuellement impossible de récréer in vitro. La souris est le seul mammifère pour lequel la protéine impliquée ici a été mutée.

Réduction

Nous utiliserons un nombre d'animaux nécessaire pour avoir la puissance statistique. Celle-ci été défini en utilisant un logiciel de statistique. Le nombre de souris par groupe a ensuite été calculé afin de pouvoir mettre en évidence un effet statistique significatif. Tout au long du projet pour minimiser le nombre d'animaux utilisés et conformément aux objectifs scientifiques, nous réutiliserons les différents tissus.

Raffinement

Nous éviterons toute souffrance inutile des animaux en les surveillant régulièrement. Le gavage sera effectué par un technicien expérimenté. Le volume des injections sera réduit au minimum possible. La chirurgie sera réalisée sous anesthésie et analgésie adaptées, avec une surveillance accrue post-opératoire. L’ensemble des prélèvements et des imageries sera réalisé sous anesthésie gazeuse. Enfin, des points- limites précis ont été établis (poids, comportement, aspect du poil), entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.Le transport entre sites est assuré par un prestataire agréé. Les animaux ont accès à l’eau et l’alimentation pendant toute la durée du trajet. Les cages sont ventilées et enrichies avec du coton.

Choix des espèces

La souris est préférée comme espèce car elle présente l’avantage de facilité d’élevage et de reproduction. Elle permet l’étude d’animaux génétiquement modifiés particulièrement informatifs pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques. Par ailleurs, de nombreux outils d’analyses ont été développés et bien caractérisés dans cette espèce animale (notamment les anticorps pour la mise en évidence de protéines par western blot, par immunohistochimie, et pour des dosages immunoenzymatiques...). Souris âgées de 6 semaines pour l'induction au tamoxifène car il est nécessaire que l'organogénèse soit terminée. Ces souris seront ensuite suivies à l'âge adulte.

279 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ischémie-reperfusion rénale d'environ 45 minutes sous anesthésie, six injections intraveineuses d'anticorps sur trois semaines, une biopsie de 2 mm pour génotypage, des échocardiographies hebdomadaires pendant quatre semaines, des prélèvements sanguins et urinaires à cinq dates, des passages en cage métabolique et un transport de douze heures entre deux établissements. Le porteur affirme qu'aucune alternative à l'animal n'existe dans la littérature pour étudier ce syndrome qui touche à la fois le cœur et le rein, et que la protéine visée deviendrait une cible thérapeutique si son hypothèse se vérifie. L'effectif se déduit d'un calcul de puissance fixant dix souris par groupe, auquel s'ajoutent 3 % de mortalité chirurgicale attendue, et une perte de poids d'environ 10 % est prévue dans les deux jours suivant l'ischémie.

Objectifs

Nous étudions la survenue et l’évolution d'une atteinte cardiaque aiguë en conséquence d'une atteinte rénale aiguë initiale. Nos récents travaux ont permis d’identifier le rôle important d’une première protéine nommée P1 dans cette atteinte cardiaque aigüe ; en effet, lorsque P1 est augmentée dans l’organisme, il y a augmentation de l’inflammation et de la fibrose dans le myocarde. Néanmoins, lorsque P1 est génétiquement ou pharmacologiquement diminué, l’inflammation et la fibrose sont également moindres. Nos travaux ont également montré que cette protéine P1 interagissait avec une deuxième protéine (P2) et que cette interaction favorisait la sécrétion de cytokines (protéines inflammatoires). Il semblerait donc que cette protéine P2 ait également un rôle important dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Notre projet a donc pour but d’étudier l’inhibition de cette protéine P2 afin de voir si nous réduisons l’inflammation et la fibrose cardiaque suite à une atteinte rénale aigüe. Cette protéine P2 est retrouvée dans la membrane des cellules des vaisseaux sanguins mais elle peut également se détacher de la membrane et se présenter sous forme soluble pour se retrouver dans la circulation sanguine. Nous essaierons donc, dans une première procédure, de bloquer génétiquement l’expression de P2 grâce à une molécule T qui se fixe directement dans les cellules des vaisseaux sanguins, et dans une seconde procédure de bloquer la forme soluble de P2 grâce à un anticorps. Ensuite nous procéderons à une atteinte rénale aigue sur les souris et nous observerons l’apparition et l’évolution de la dysfonction cardiaque. Si notre hypothèse s’avère exacte, la protéine P2 deviendrait alors une potentielle cible thérapeutique dans cette pathologie cardio rénale. Ces travaux de recherche se dérouleront dans 2 établissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Cette étude nous permettra de déterminer l'intérêt de la protéine P2 dans l’atteinte cardiaque aigüe suite à une atteinte rénale aigüe. Si nos hypothèses s'avèrent exactes, nous pourrions considérer cette molécule comme une cible thérapeutique potentielle pour cette pathologie.

Procédures

Les animaux subiront différents types d'injections : - Injections intraveineuses pour l'anticorps (2 fois par semaine pendant 3 semaines, soit 6 injections au total ; une injection dure 1min), elles seront effectuées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique avant les chirurgies d'ischémie-reperfusion rénale ou contrôles (durée de la chirurgie : environ 45min pour les ischémies et 15 min pour les contrôles), avant chaque échocardiographie prévues toutes les semaines durant 4 semaines (une échocardiographie dure environ 15min par souris) ainsi qu'avant chaque prélèvement sanguin (un prélèvement dure 1min), ces interventions seront menées dans l'EU1 - Injections intrapéritonéales de la molécule de délétion génétique durant 3 jours à raison d'une injection par jour, elles seront effectuées au sein de l'EU2. Les animaux subiront également des prélèvements : -biopsies d'environ 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1, une biopsie dure 30 secondes. Ces prélèvements seront réalisés dans l'EU2. - sanguins à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 72h et 28j post-chirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. - urinaires à J-14 avant la chirurgie ainsi qu'à 24h, 48h, 72h et 28j post-chirurgie pour la procédure 1. A J14 avant chirurgie, puis à J10, J17, J24, J28 post chirurgie pour la procédure 2. Pour les prélèvements urinaires, les souris ne resteront pas plus de 2h dans les cages métaboliques. Après chacun des prélèvements sanguins, du sérum physiologique sera injectée à chacune des souris pour les aider à récuperer. Tous ces prélèvements se dérouleront dans l'EU1.

Impact sur les animaux

Les animaux subiront des biopsies de 2mm afin d'identifier les animaux d'intérêt pour la procédure 1. La douleur sera légère mais de courte durée. Les animaux subiront une ischémie reperfusion rénale qui pourrait engendrer une douleur. Une perte de poids d’environ 10% est attendue dans les 2 jours suite à cette intervention. De plus, ils subiront différents types d'injections : injections intraveineuses pour l'anticorps, intrapéritonéales pour l'anesthésie chimique. Bien que ces injections ne soient pas douloureuses, elles pourraient tout de même causer une gêne à l'animal ou un stress du fait de leur répétition. Le transport de l’établissement 1 vers l’établissement 2 pourrait également être une source de stress. Les souris subiront également des prélèvements sanguins et urinaires à différents temps, ce qui pourrait engendrer un stress.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés pour pouvoir évaluer les conséquences physiopathologiques par de l'histologie, l’étude de l'expression protéique et génétique des marqueurs de dommages tissulaires et inflammation à partir des organes et des tissus d'intérêt.

Remplacement

Nous étudions un syndrome qui implique 2 organes différents, à savoir le cœur et le rein, ainsi que les interactions biochimiques et biologiques qu'il existe entre eux. Malheureusement, il est impossible de reproduire un système aussi complexe dans un modèle cellulaire, le recours à l'animal est donc nécessaire. A ce jour, dans la littérature, il n’existe aucune alternative à l’animal pour étudier ce syndrome.

Réduction

Le nombre de souris nécessaire est calculé au vu des différences obtenues lors de nos précédents travaux afin d'obtenir une différence de 20% entre les groupes contrôle et ischémie, soit 10 souris par groupe sachant que la mortalité imputable à la chirurgie est estimée à 3%. Le calcul a été obtenu en utilisant un logiciel de puissance statistique, prenant en compte les différences observées, la puissance de comparaison et la mortalité imputable au modèle.

Raffinement

Une période d’acclimatation de 10 jours sera observée après l’arrivée des animaux en provenance de l’établissement secondaire. Le transfert sera effectué par un transporteur agréé et durera 12h. Un relevé de température de l’environnement sera fourni pour vérifier les bonnes conditions de transport. Les animaux déjà blessés, stressés ou malades au sein de l’établissement secondaire ne seront pas transférés. Une administration d’analgésique en sous-cutanée, en prémédication (45min avant l'opération) puis une anesthésie en intra-péritonéale seront effectuées pour toutes les opérations chirurgicales. Du gel ophtalmique sera appliqué sur les yeux des animaux avant la chirurgie pour éviter l'asséchement de leurs yeux. La prise en charge de la douleur post-opératoire durera tout l'après-midi (les opérations étant effectuées le matin) et une injection d'analgésie en sous-cutanée sera effectuée 6h après la fin de l’intervention. Une surveillance accrue (6h post chirurgie) sera réalisée après la chirurgie pour vérifier la bonne cicatrisation des animaux. Si toutefois des douleurs apparaissaient, une deuxième dose d’analgésique serait administrée avec ajout de nourriture gélifiée dans la cage. Nous utiliserons une anesthésie locale pour les prélèvements sanguins rétro-orbitaires et les injections intraveineuses. En cas de complications impossibles à traiter, l’animal serait retiré de l’étude et euthanasié.

Choix des espèces

Le modèle de souris présente de nombreux avantages pour notre protocole expérimental. Outre sa petite taille et son coût avantageux, la souris permet de générer un grand nombre de descendants très rapidement. Par ailleurs, son potentiel génétique permet d'analyser l'effet d'une absence/surexpression d'un gène cible. Nous disposons de tous les outils permettant une exploration physiopathologique complète. Par ailleurs, les souris utilisées pour nos procédures expérimentales auront un fond génétique très utilisé dans la littérature pour étudier la pathologie qui nous intéresse. Les souris utilisées auront entre 2 et 4 mois pour caractériser au mieux le syndrome cardio-rénal tel qu'il existe chez l'Homme adulte. De plus, ce stade permet aux animaux une récupération optimale après les chirurgies d'ischémie reperfusion rénale.

Trois injections quotidiennes pour déclencher la modification génétique, puis deux séances d'imagerie sous anesthésie avec injection d'un agent de contraste dans la veine de la queue: 40 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à la fin de chaque procédure pour prélever les organes. Chaque séance dure environ une heure et intervient au premier puis au sixième jour après la première injection. Le projet porte sur les malformations vasculaires cérébrales d'une maladie génétique héréditaire dont ces souris reproduisent les mutations, avec l'espoir déclaré d'améliorer le diagnostic des atteintes cérébrales chez les patients. Ni la maladie étudiée ni la substance injectée ne sont nommées, et le porteur affirme que les souris ne présentent aucun signe visible de stress ou de souffrance, sans perte de poids ni modification de comportement.

Objectifs

Nous étudions une maladie génétique héréditaire qui fragilise les vaisseaux sanguins et qui se manifeste, entre-autre, par des hémorragies, par l’élargissement des vaisseaux sanguins ainsi que des malformations entre les artères et les veines. Cette maladie peut conduire à des complications sévères touchant différents organes : atteinte du foie pouvant nécessiter une greffe, des poumons mais aussi du cerveau. Il s’agit d’une maladie génétique dont la prise en charge et le contrôle des symptômes est difficile. Il est donc nécessaire de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la maladie pour développer de nouvelles approches thérapeutiques. Très peu d’études sont réalisées sur le cerveau et pourtant dans cet organe, des mauvaises connexions entre les artères et les veines peuvent apparaître chez les patients mais les problèmes du système vasculaire du cerveau, et les répercussions que cela peut avoir sur les cellules nerveuses ne sont pas bien décrits. Différents acteurs sont impliqués dans le développement de cette maladie qui contrôlent, ensemble, à différents niveaux, la bonne organisation du réseau vasculaire sanguin. Pour comprendre le rôle de chacun de ces acteurs, on utilise des modèles de souris ne produisant plus certains de ces acteurs et on étudie les conséquences de cette perte sur les vaisseaux sanguins. Nous allons dans ce projet étudier les effets de la perte de ces acteurs sur les vaisseaux sanguins cérébraux par imagerie médicale. Cette technique nous permet de connaître de nombreux paramètres vasculaires et de voir les désorganisations des vaisseaux sanguins dans les souris malades. Cette étude pourra apporter un bénéfice certain dans le diagnostic des problèmes cérébraux des patients atteints de cette maladie.

Bénéfices attendus

Notre étude vise à identifier les conséquences de la perte de facteurs connus pour contrôler l’organisation des vaisseaux sanguins dans un organe encore très peu étudié, le cerveau avec une technique d’imagerie qui n’a encore jamais été utilisée sur ce type de souris. Ces facteurs sont à l’origine d’une maladie vasculaire génétique et les patients atteints de cette maladie ont parfois des problèmes de malformations vasculaires cérébrales. L’imagerie médicale apportera de nouvelles données d’imagerie qui auront un intérêt direct dans le diagnostic des atteintes cérébrales des patients.

Procédures

Des injections sont prévues pour induire la modification génétique mimant celle des patients (1 injection par jour pendant 3 jours). Deux imageries médicales maximum sont ensuite réalisées sur chaque animal au premier et au 6ème jour après cette première injection. Pour procéder à l’imagerie médicale, les animaux sont anesthésiés et un agent de contraste est injecté dans la veine de la queue. Chaque imagerie dure environ 1h.

Impact sur les animaux

Les injections induisent une douleur de quelques secondes lors de la piqûre. L'imagerie medicale nécessite une anesthésie générale le temps de l’examen. Les souris ne présentent pas de signes visibles de stress ou de souffrance, notamment aucune perte de poids ou modification de comportement n’ont été observées à l'âge où les expériences sont réalisées.

Devenir

Les protocoles nécessitent qu’à la fin de chaque procédure, tous les animaux soient euthanasiés, afin de récupérer les organes.

Remplacement

Le développement de cette pathologie fait intervenir plusieurs types cellulaires. Il n’est actuellement pas possible de recréer les interactions cellulaires entre tous ces acteurs in vitro. De plus, les cellules composant les vaisseaux sanguins ont un phénotype différent d’un tissu à l’autre. Cette différence est fondamentale mais non maintenue en culture. Afin de comprendre les mécanismes moléculaires qui conduisent aux malformations vasculaires cérébrales, nous devons avoir recours à l’expérimentation animale, les modèles in vitro n’étant pas adéquats.

Réduction

Nous avons utilisé un logiciel statistique, ainsi que les données de la littérature pour déterminer la taille des groupes nécessaires permettant de faire les tests statistiques nécessaires à la validation des données par la communauté scientifique. Dix souris par groupe seront nécessaires.

Raffinement

Les changements de litière, de biberon et l’apport d’alimentation sont pris en charge par les zootechniciens de façon quotidienne, y compris les week-end. Les cages contiennent des petites maisons et du matériel de nidification changé régulièrement comme dispositif d’enrichissement. Chez les souris adultes, une mise en place de point limite permettra de s’assurer du bien-être des animaux. L’imagerie médicale est réalisée sous anesthésie générale, avec un enregistrement des paramètres vitaux des souris (respiration rythme cardiaque). Pendant toute l’expérience, une échelle de cotation de douleur basées sur des signes indicatifs de gêne sera utilisée afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir des points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible des mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. En cas de signe de douleur, des analgésiques seront administrés.

Choix des espèces

Les souris utilisées dans ce projet portent des modifications génétiques semblables aux mutations portées par les patients atteints de cette maladie. Elles constituent donc le meilleur modèle de la pathologie pour mieux comprendre les mécanismes de développement de cette pathologie et mieux développer des traitements. Les symptômes de cette maladie apparaissent à l’adolescence, nous allons étudier les phénotypes vasculaires à l’âge jeune adulte uniquement.

L'extrémité de la queue coupée et le saignement observé jusqu'à trente minutes, puis la carotide mise à nu et ponctionnée, le saignement observé vingt minutes encore : 32 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mêmes animaux subissent les deux épreuves, ce que le porteur présente comme une mesure de réduction. Le projet cherche à mesurer le rôle d'une enzyme, la PKC theta, dans l'arrêt du saignement, avec l'espoir lointain de traitements antiplaquettaires plus sûrs pour les patients. Toutes les souris sont tuées, la ponction de la carotide et la perte de sang qu'elle entraîne étant, selon le porteur, incompatibles avec un réveil.

Objectifs

L’hémostase est le processus biologique assurant l’arrêt des saignements. Elle implique notamment les plaquettes sanguines, qui, suite à une lésion vasculaire, adhèrent, s’activent et agrègent pour former un caillot qui bouche la lésion vasculaire. Ce processus implique différents récepteurs des plaquettes. Des études récentes suggèrent un rôle de la protéine kinase C (PKC) theta dans les voies de signalisation des certains de ces récepteurs. Le but de ce projet est d’évaluer le rôle de la PKC theta dans l’hémostase en évaluant l’impact de son absence ou de la présence d’une PKC theta humaine dans des modèles d’hémostase chez la souris.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont de mieux comprendre le rôle de la PKC theta dans l’arrêt du saignement. Les récepteurs comprenant la PKC theta dans leur voie de signalisation sont impliqués dans l’arrêt du saignement mais également en thrombose artérielle. Un bénéfice à long terme de ce projet pourrait être le développement de nouveaux traitements antiplaquettaires impactant peu l’arrêt du saignement, et donc plus sûr pour le patient que les traitements actuellement disponibles.

Procédures

Les animaux anesthésiés sont soumis à un temps de saignement à la queue (coupure de l’extrémité de la queue et observation du saignement jusqu’à son arrêt, maximum 30 min) et à une exposition de la carotide avec un temps de saignement à la carotide (ponction de la carotide et observation du saignement pendant 20 min).

Impact sur les animaux

Pour toutes les procédures, une des nuisances attendues est un impact de l’anesthésie sur le rythme respiratoire (irrégulier ou apnée) ainsi que le risque de saignement au site d’incision.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure car une ponction de la carotide, et la perte de sang importante qui en découle, n’est pas compatible avec un réveil de l’animal.

Remplacement

L’objectif de ce projet est d’étudier le rôle de la PKC theta dans l’arrêt du saignement. Ce processus étant particulièrement complexe et faisant intervenir plusieurs types cellulaires (plaquettes, globules rouges, globules blancs) ainsi que les conditions d’écoulement du sang (vaisseau, pression artérielle, flux sanguin), les modèles in vitro ne sont pas assez sophistiqués pour en reproduire toute la complexité. De plus, il n’existe pas à l’heure actuelle de modèle d’arrêt du saignement in vitro.

Réduction

Le projet se fera par étapes. Les mêmes animaux seront utilisés pour les 2 modèles de temps de saignement afin de réduire le nombre d’animaux nécessaire. Ce nombre est fixé à 8 souris/groupe pour l’obtention de résultats statistiquement significatifs. Les effectifs sont calculés selon notre expérience sur les modèles d’hémostase, le critère recherché étant la comparaison de moyennes (temps d’arrêt du saignement, volume de sang perdu).

Raffinement

Une période d’acclimatation de 2 semaines entre l’arrivée des souris à l’animalerie et leur utilisation sera respectée. Les animaux seront habitués à la contention pour faciliter l’injection IP d’anesthésiant. Le stress et la douleur de tous les animaux utilisés dans ce projet seront diminués au minimum: • Par l’hébergement dans des cages en fonction des groupes expérimentaux 3 jours avant l’expérimentation. Ces cages seront munies de particules de bois et enrichies avec des carrés de cellulose, bâtonnets de coton, frisure de papier, ce qui leur permet d’organiser leur environnement selon leurs besoins. Les animaux sont entre 2 et 5 par cage afin d’éviter le stress causé par l’isolement. • Par une anesthésie de l’animal avant et pendant la durée de l’expérimentation • Par l’installation de l’animal sur une plaque chauffée à 38°C afin lutter contre l’hypothermie pendant l’expérimentation ainsi que son réveil en boite à 37°C • Par l’injection d’analgésique avant chaque procédure. • Par application de gel sur les yeux lors de l’anesthésie afin de les protéger. Pendant toutes les expérimentations, les animaux sont surveillés par du personnel entrainé pour vérifier l’absence de signe de douleur grâce à des points limites spécifiques établis pour chaque procédure. Ces points limites permettront de soustraire l’animal aux procédures expérimentales et ainsi limiter sa souffrance et son inconfort.

Choix des espèces

La souris est un animal pour lequel les modèles d’études in vivo sont largement maitrisés et caractérisés, notamment les modèles d’arrêt du saignement. De plus, les techniques de mutation génétique ont permis de générer des souris déficientes pour le la PKC theta ou exprimant la PKC theta humaine, nous permettant ainsi d’évaluer leur rôle respectif dans l’arrêt du saignement. Les souris seront utilisées au stade adule entre 2 et 6 mois. Cet âge correspond à la période utilisant des souris adultes et ne présentant pas encore de vieillissement.

Trois heures de chirurgie du thorax, puis deux actes chirurgicaux supplémentaires à deux mois et trois jours d'intervalle, le dernier se terminant par la mise à mort : 80 cochons vont être utilisés sur cinq ans dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des sondes de mesure et un câble de pacemaker sont implantés dans leur cœur, puis une insuffisance cardiaque leur est provoquée par stimulation cardiaque et pression artérielle élevées, pour tester des traitements de protection du muscle cardiaque. Le porteur juge probable qu'une partie des animaux supporte mal ce traitement, avec baisse d'activité, perte d'appétit et amaigrissement en fin de protocole. Tous sont tués pour l'étude du cœur au microscope, alors que le projet annonce des bénéfices valant "autant pour la santé humaine que pour la santé animale".

Objectifs

L’insuffisance cardiaque est une maladie grave qui se définit par l’incapacité du coeur à pomper suffisamment de sang pour répondre aux besoins de l’organisme. Elle survient généralement chez des individus majoritairement âgés dont la santé est fragilisée depuis plusieurs années par des troubles cardiaques ou respiratoires ou par de l’hypertension. Elle se présente par un essoufflement et une fatigue disproportionnés par rapport à l’effort produit, d’abord uniquement à l’effort, puis aussi au repos. Dans les cas les plus avancés apparaissent dyspnée, toux nocturne, oedème (des poumons, des membres inférieurs), ascite, cardiomégalie. Le nombre de cas d’insuffisance cardiaque a augmenté au cours des 30 dernières années, en raison de l’amélioration des traitements des troubles cardiaques et avec le prolongement de l’espérance de vie des personnes atteintes. L’insuffisance cardiaque est une cause importante de mortalité, et le taux de survie 5 ans après le diagnostic est d’environ 50%, avec au moins 165000 hospitalisations et plus de 70000 décès annuels en France. C’est pourquoi nous étudions l’insuffisance cardiaque avec un modèle de porc avec ou sans troubles métaboliques (insulino-résistance et dyslipidémie) à pression artérielle et stimulation cardiaque élevées, car nous avons grand besoin de comprendre sa physiopathologie et de trouver de nouvelles stratégies visant à prévenir ou à réduire la progression du dysfonctionnement du coeur. Notre projet prévoit d’utiliser au maximum 80 porcs sur 5 ans. La fréquence cardiaque, la taille du cœur, l’anatomie coronaire, l’innervation, la circulation collatérale native du porc sont très proches de celle de l’Homme. Le plan général du projet est de pratiquer une chirurgie afin d’implanter des sondes de mesure de l’activité cardiaque (pression aortique et ventriculaire gauche, débit aortique et coronaire) et un câble de stimulation de pacemaker, et après une période de repos, d’induire une insuffisance cardiaque afin d’évaluer l’effet d’un traitement thérapeutique grâce aux sondes implantées, mais aussi grâce à des mesures échocardiographiques et à l’analyse de sang et de tissus cardiaques prélevés. Le premier traitement prévu est une thérapie cellulaire basée sur les cellules dérivées des cardiosphères, cellules pluripotentes obtenues par mise en culture de fragments cardiaques et permettant une régénération du tissu de l’organe. D’autres traitements pourront être testés par la suite, tel un basé sur l’ANGPTL4.

Bénéfices attendus

Le projet permet d’évaluer de manière très prédictive des stratégies de protection cardiaque, dont les résultats bénéfiques à long terme valent autant pour la santé humaine que pour la santé animale, et jouent sur l’amélioration globale de la qualité de vie, grâce à une amélioration de la fonction cardiaque.

Procédures

Chaque animal sera soumis 1 seule fois à une chirurgie thoracique réalisée sous anesthésie générale d’environ 3 heures, puis environ 2 mois plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale d’environ une demie-heure, puis 3 jours plus tard à un acte chirugical percutané sous anesthésie générale se terminant par la mise à mort. Tous les autres actes sont indolores et consistent en des soins, ou à des échocardiographies ou à des enregistrements de paramètres hémodynamiques effectués sous sédation légère afin que l’animal soit bien calme.

Impact sur les animaux

L’insuffisance cardiaque se caractérisant essentiellement par une fatigue chronique, il est probable qu’un certain nombre d’animaux supportent moins bien ce traitement, ce qui entrainera une baisse d’activité et une perte d’appétit avec une stabilisation, voire une légère baisse de leur poids en toute fin de protocole.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort pour récupérer le coeur afin d'en faire l'étude histologique.

Remplacement

Aucune méthode alternative ne permet actuellement de tester totalement une stratégie de protection cardiaque sans passer finalement par l’expérimentation animale. Les traitements envisagés ont déjà été testés in vitro ou sur des animaux de petite taille (rongeurs) aux caractéristiques cardiaques trop dissemblables de l’Homme. Seuls des essais effectués sur un modèle d’étude cardiaque proche de l’Homme sont scientifiquement acceptables pour envisager une extrapolation vers la pratique clinique humaine.

Réduction

Il est prévu d’utiliser le minimum d’animaux pour chaque stratégie testée, et le nombre par lot est fixé à 8. De plus, à chaque fois que c’est possible, les animaux des lots témoins sont mutualisés pour chaque stratégie.

Raffinement

Des antalgiques, des anesthésiques et des tranquillisants sont utilisées à des doses adaptées (voir détails plus bas). Nous ne pensons pas observer de différences comportementales entre avant et après les actes chirurgicaux. Des signes indicatifs de gêne inhérents au modèle expérimental seront probablement observés en fin de protocole, et cette période sera particulièrement surveillée afin qu’elle soit le plus courte possible pour l’animal. Ils sont suivis quotidiennement et bénéficient de sciure pour satisfaire leurs réflexes de fouissage, et d’objets « manipulables » pour améliorer leur qualité de vie. Ils sont logés à plusieurs avant leur chirurgie.

Choix des espèces

L’animal choisi est le modèle le plus adapté pour ce projet, et validé depuis plusieurs années dans notre laboratoire. Le porc, par sa fréquence cardiaque, la taille de son myocarde, son anatomie coronaire, son innervation et l’absence de circulation collatérale native, est un modèle proche de l’Homme. Il permet de réaliser des études précliniques très prédictives sur le plan cardiovasculaire. Porc fermier à 2 mois ½ (25kg), âge minimal souhaité et poids maximal souhaité pour commencer les expérimentations. Mini-porc Yucatan à 9 mois (40kg), avec un poids devant rester stable le temps de l’expérimentation, la différence d’âge se justifiant par la longue mise en place des troubles métaboliques.