Système nerveux

Une canule de fibre optique dépassant de deux millimètres au-dessus du crâne, et le toilettage excessif qui en découle : 9 200 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. 5 040 d'entre elles subissent deux chirurgies sous anesthésie de 30 à 90 minutes puis six séances d'enregistrement de l'activité de leurs neurones, 4 160 une chirurgie puis cinq jours d'observation de leurs comportements sociaux, et 4 800 des injections intrapéritonéales ou intrathécales. L'objet du projet est le toucher affectif, la caresse légère, et les structures cérébrales qui l'intègrent. Le porteur décrit ces chirurgies comme "extrêmement bien tolérées par les animaux", et justifie la mise à mort de toutes les souris par leur modification génétique et leur infection par des virus, qui interdisent de les replacer.

Objectifs

L’objectif de ce projet est de mettre en évidence les structures responsables de l’intégration du toucher affectif et de définir leurs rôles dans les comportements pro-sociaux.

Bénéfices attendus

Ce projet permet de disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires du toucher léger chez la souris. Il aura des répercussions dans deux domaines. En effet, le toucher léger est altéré dans des pathologies humaines (autisme, défaillances cardiovasculaires, etc), et nos données permettront l'identification de cibles pharmacologiques pour corriger ces déficits dans l'espoir de réduire les déficits de comportement social associés. D'autre part, "la stimulation tactile affective" est une approche thérapeutique utilisée dans de nombreux domaines (gestion de la douleur, de l'anxiété, du stress chronique, soins palliatifs, contact parents-enfants, troubles du sommeil, etc..) et notre travail devra permettre de raffiner ces protocoles, et/ou de proposer des approches pharmacologiques pour alléger les symptomes de ces pathologies.

Procédures

Pour les procédures 1 à 6 : Chaque animal sera soumis à deux chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (30 à 90 minutes) puis à plusieurs sessions d’enregistrement de l'activité neuronale sur animal vigile (5 fois 10 minutes puis 1 fois 20 minutes) (5040 animaux) Pour les procédures 7 à 9 : Chaque animal sera soumis à une chirurgie sous anesthésie générale gazeuse (30 à 60 minutes), puis à l’observation automatique de leurs comportements sociaux en groupe (5 jours). (4160 animaux) Supplément pour les procédures 2, 5 et 8 : injection de produits par voie intrapéritonéale (2 minutes par animaux) (2400 animaux) Supplément pour les procédures 3, 6 et 9 : injection de produits par voie intrathécale (2 minutes par animaux) (2400 animaux)

Impact sur les animaux

Les actes chirurgicaux nécessaires à ce projet sont des actes chirurgicaux similaire à ceux utilisés par de nombreuses équipes de recherche à travers le monde et extrêmement bien tolérées par les animaux. Nous prévoyons cependant que des effets indésirables liés à ces chirurgies peuvent créer un stress dut à l’opération chirurgicale, des douleurs post-opératoires (qui sont prise en charge pharmacologiquement) ainsi qu’une gêne dut à la présence d’une canule de fibre optique dépassant de 2mm au-dessus du crane. Le stress et les douleurs peuvent entrainer une légère perte de poids qui sera monitorée. La gêne occasionnée par la présence de la fibre optique peut entrainer un toilettage excessif qui sera lui aussi évalué. Nous considérons que ces effets indésirables peuvent durer 1 semaine au maximum apres la chirurgie.

Devenir

Tous les animaux utilisés étants génétiquement modifiés et/ou infectés par des virus génétiquement modifiés eux aussi, il nous est impossible de replacer ou de faire adopter ces animaux. Ils seront donc mis à mort à la fin de chaque procédure. Des prélèvements histologiques seront effectués sur chaque animaux pour confirmer les résultats

Remplacement

La perception du toucher est un phénomène appréhendé par l’organisme conscient, et lui seul, en particulier sa dimension émotionnelle. Il n’existe pas de modèles in-vitro ou de modèles mathématiques permettant de modéliser la représentation du toucher pouvant mimer une émotion, en dehors des animaux de laboratoire. De plus, la variété des techniques de modifications génétiques chez la souris permet d'identifier et de cibler spécifiquement des mécanismes moléculaires ou cellulaires à un niveau où l’expérimentation humaine n’atteint pas ce niveau de résolution. Nous considérons donc le recours à la souris comme guidé par des considérations scientifiques, techniques et éthiques

Réduction

Chez l’homme, la dimension émotionnelle du toucher est un paramètre confondant, qui rend difficile la constitution de petites cohortes homogènes. À l’inverse, les modèles animaux sont homogènes et fournissent des résultats reproductibles. Ceci permet d'établir avec précision le nombre d'animaux nécessaire à la validation des hypothèses de travail par des tests de puissance statistique. Nous exploitons au mieux nos enlevages, puisque nous étudions mâles et femelles, et que nous étudions la majorité des génotypes produits. Ce projet propose d’utiliser plusieurs approches afin d’atteindre le même objectif, mais dès les premiers résultats prémilitaires obtenus, il sera possible de juger laquelle de ces approches est la plus efficace et donc de réduire le nombre de procédures qu’au modèle le plus efficace (viral contre génétique par exemple). De meme, ce projet propose d’aller investiguer dans plusieurs régions du cerveau et il est fort possible que certaines d’entre elles ne répondent pas nos attentes et seront donc éliminées dès les premiers résultats obtenus, réduisant encore le nombre d’animaux utilisé. Les nombres d'animaux nécessaires aux différentes procédures ont été déterminés en utilisant un logiciel libre de calcul de puissance statistique en le nourrissant des données issues d'une analyse rétrospective des résultats obtenus en utilisant les mêmes techniques par notre groupe et pas d'autre groupes à travers le monde.

Raffinement

Nos procédures requièrent que tous nos animaux soient suivis dès leur naissance. Ceci permettra de s’assurer du bien-être des animaux tout au long de leur vie en suivant certains paramètres définis par une fiche et grille de suivi clinique au minimum trois fois par semaine (en annexe). Cette fiche de suivi permet de déceler rapidement des signes précoces d’éventuelle douleur et ou détresse (points limites). Pour aider à la prise de décision, cette fiche contient plusieurs critères d’évaluation permettant de déterminer un score qui permet à l’expérimentateur de prendre la décision adaptée pour mettre en place rapidement des mesures visant à éviter ou réduire cette souffrance, et si nécessaire, l’arrêt des souffrances par mise à mort. Ce suivi tout au long de la vie par les expérimentateurs permettra aussi de réduire le stress des animaux qui y seront habitué. Cela augmentera aussi la qualité et la reproductibilité des résultats, et donc in fine diminuera le nombre d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats significatifs. Les tests comportementaux présents dans cette saisine n’utilisent pas d’environnements considérés comme stressant ou anxiogènes et laissent une liberté d’action maximale à l’animal en le laissant choisir de lui-même d’interagir ou non avec des textures ou un congénère, tout en limitant ce temps d’expérimentation à 20 minutes par individus. Toutes les manipulations, pharmacologiques ou génétiques, ont pour but d’améliorer les relations sociales des individus et donc d’améliorer les conditions de vie des animaux, et cela, très tôt après leurs naissances. Les cages d’hébergement sont toutes enrichies avec des boules des cotons et des maisons en plexiglass rouge. Toutes les douleurs opératoires et postopératoires seront prises en compte avec une prise en charge pharmacologique adaptée.

Choix des espèces

Le projet utilise la souris, car c’est le modèle mammifère de référence pour la technique de modification génique. Le projet scientifique vise à utiliser la puissance de la génétique chez la souris pour étudier le rôle des gènes essentielles dans la perception et l’intégration sensorielle normale et pathologique Notre projet vise à moduler différentes voies neuronales durant les étapes tardive du développement neuronal qui ont lieu apres la naissance et durant l'adolescence pour en observer les conséquences à l'état adulte. Par conséquent, nous manipulerons les animaux dès la naissance et jusqu'à l'âge adulte.

3 780 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal reçoit une injection sous la peau du crâne par semaine pendant quatre semaines, passe des tests cognitifs, puis subit une ponction du liquide céphalo-rachidien avant d'être tué par exsanguination. Une partie du protocole porte sur des souriceaux de sept jours, que la manipulation expose au rejet par leur mère, à la mort par hypothermie ou au cannibalisme, effets que le porteur qualifie de rares et sporadiques. Sur le remplacement, il affirme qu'aucun modèle in vitro ne capture la complexité d'un "organisme entier" et écarte la drosophile, C. elegans et le poisson zèbre, dont la barrière cérébrale diffère trop de celle des mammifères.

Objectifs

Récemment, certaines zones barrières du cerveau, ont été identifiées comme des interfaces de communication active entre la périphérie et le cerveau, plutôt que comme des tissus barrières. De plus, des découvertes récentes ont identifié des canaux ouverts dans l'os du crâne, les cellules immunitaires présentes dans la moelle osseuse peuvent accéder au cerveau en cas de maladie ou d'infection, tandis qu'en bonne santé elles atteignent le cerveau et de là libèrent des facteurs solubles qui peuvent façonner le cerveau à distance. Les troubles du spectre autistique et la schizophrénie sont considérés comme neurodéveloppementaux. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative mortelle associée au vieillissement, qui touche 30 à 50 % des personnes de plus de 85 ans. Pour les maladies neurodéveloppementales et neurodégénératives, certains traitements existent, mais leur efficacité est limitée et de nouvelles approches thérapeutiques sont nécessaires de toute urgence. Des recherches récentes suggèrent unanimement que la dérégulation du système immunitaire est au centre de la pathologie. Les signaux inflammatoires dans le cerveau atteint de la maladie d’Alzheimer devraient donc influencer l’activité de la moelle osseuse. En effet, des travaux antérieurs et préliminaires ont montré que le processus de production de cellules immunitaires et d’autres propriétés du tissu de la moelle osseuse sont altérés dans la maladie d’Alzheimer, mais il n’est pas certain que cela soit vrai pour la moelle osseuse crânienne. De plus, nous savons que les signaux immunitaires dérivés de la moelle osseuse via le cerveau peuvent influencer l’activité cérébrale chez les adultes, mais on comprend moins bien si ces signaux contribuent au développement du cerveau. Notre objectif est d’étudier comment la moelle osseuse crânienne est altérée dans la maladie d’Alzheimer et au cours du développement, et si des changements dans dans la moelle osseuse pourraient modifier le développement cérébral ou la progression de la trajectoire de la maladie d’Alzheimer.

Bénéfices attendus

Cette analyse permettra d’identifier des facteurs produits par la moelle osseuse du crâne et potentiellement impliqués dans la modulation du développement et du fonctionnement du cerveau dans les cerveaux sains et atteints de la Maladie d’Alzheimer (MA). À court terme, cette étude fournira des connaissances fondamentales sur un nouveau canal de communication cerveau-immunité. Explorer les frontières cérébrales dans cette direction est très important car l’accès des médicaments courants au cerveau est souvent altéré, car de nombreux médicaments ne traversent pas la barrière hémato-encéphalique. Ces dernières années, nous avons observé d’énormes progrès dans le développement de médicaments pour les maladies cardiovasculaires, les maladies immunologiques et le cancer, mais peu de progrès ont été réalisés en neurologie, en partie à cause de cet obstacle. Par conséquent, la compréhension des voies alternatives vers le cerveau est un défi majeur en neurologie. Plus précisément, à long terme, ces recherches pourraient conduire au développement de nouvelles approches pharmacologiques qui réguleraient cette voie de communication cerveau-immunité pour lutter contre la Maladie d’Alzheimer (MA) ou prévenir le risque d’autisme.

Procédures

Dans la procédure 1, les souris seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse, une fois par semaine pendant 4 semaines. Ensuite, les souris seront testées pour leur capacité cognitive (sans stress ni douleur) pendant une semaine. Enfin, les souris recevront une injection intrapéritonéale 16h plus tard, une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien et seront mises à mort par exsanguination (élimination du sang). Dans la procédure 2, des souris âgées de 7 jours seront soumises à une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne sous anesthésie gazeuse. Suite à l’injection, les souris âgées de 15 ou 21 jours recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien. Les souris adultes après une injection sous-cutanée sur le dessus du crâne seront testées pour leur comportement (pas de stress ni de douleur) dans un délai de deux semaines. Apres, les souris recevront une injection d'anesthésie et d'un analgésique. Sous analgésie profonde et anesthésie totale, les souris seront soumises à une injection intrapéritonéale, à un prélèvement de liquide céphalorachidien.

Impact sur les animaux

Les injections et l'anesthésie peuvent provoquer une légère douleur et un stress temporaire. Nous ne prévoyons pas d'effets négatifs supplémentaires résultant de ces manipulations ou de la nature des substances injectées. Dans de rares cas, les souriceaux après manipulation sont rejetés par la mère et ils peuvent mourir d'hypothermie. Dans des cas sporadiques, une séparation temporaire peut provoquer un stress chez la mère entraînant un cannibalisme chez les souriceaux. De plus, la manipulation des animaux pendant les tests comportementaux peut provoquer un léger stress et un inconfort.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour la dissection des tissus afin de répondre aux questions scientifiques posées dans cette proposition.

Remplacement

Notre objectif est d'étudier comment les cellules situées dans la moelle crânienne agissent sur le cerveau, dans le développement et dans un modèle de maladie d’alzheimer (MA). La niche de la moelle crânienne est un organe complexe composé de vaisseaux sanguins, de nerfs et de tissu stromal englobant différents types de fibroblastes, d'adipocytes et de cellules immunitaires de l'ensemble de l'arbre hématopoïétique. Notre question est de savoir comment ces cellules et leurs produits atteignent le cerveau et modulent sa fonction. Il n'existe pas de modèle in vitro ou ex vivo qui capture la complexité d'un organisme ou d'un tissu avec ses composants endothéliaux, stromaux, immunitaires et neuronaux. Des animaux plus simples tels que la drosophile, C. elegans ou le poisson zèbre ne peuvent pas non plus être utilisés car la physiologie de la barrière cérébrale de ces animaux est très différente de celle des mammifères. De plus, l'indicateur le plus fiable de la gravité de la maladie dans les modèles de MA (et les patients) est la mesure de leur capacité cognitive, et pour les modèles de troubles du spectre autistique (TSA) - comportement social, les paramètres ne peuvent pas être testés dans des modèles non animaux.

Réduction

Nous souhaitons étudier les interactions entre le crâne, la moelle osseuse et le cerveau dans les maladies neurodégénératives et le développement. Les quantités d'animaux utilisées pour réaliser notre projet sont établies en tenant compte de notre expérience antérieure et de tests statistiques. Seuls 10 microlitres du liquide à analyser ( liquide cephalo rachidien (LCR)) peuvent être collectés dans le cerveau d'une souris, ce qui ne permet qu'un seul type d'analyse. Un seul échantillon de crâne et des méninges uniques ne peuvent être utilisés que pour une seule analyse à la fois, mais le cerveau peut être conservé (de plusieurs façons) et utilisé pour plusieurs tests. Nous prévoyons pour chaque groupe, 14 animaux à analyser ; le sexe des animaux peut influencer les phénotypes observés, des mâles et des femelles seront inclus (7 mâles et 7 femelles). Des expériences seront réalisées en triples pour obtenir des résultats solides. Selon le nombre de groupes comparés, avec une puissance de 80% et un risque alpha de 5% : - 4 groupes comparés (sains vs. alzheimer et traités vs. contrôle) : les effectifs proposés (7 individus par groupe) devraient nous permettre d'obtenir des résultats significatifs pour des tailles d'effet supérieures à 1.

Raffinement

Les procédures décrites sont conçues pour minimiser l'inconfort des animaux. Le suivi des animaux, selon une liste de signes cliniques et des points limites spécifiques et précoces. Dès l’apparition d’un signe clinique, nous multiplierons l’enrichissement (plus de coton, un igloo) et, le cas échéant, nous chaufferons les cages avec des chaufferettes si l’animal montre des signes d’hypothermie. Des aides alimentaires (type gel hydrique) et une réhydratation sous-cutanée avec de la solution saline seront mises en place au besoin. Si un animal atteint le score limite, il sera mis à mort. Des injections sous-cutanées (sous la peau) sur le dessus du crâne seront effectuées sous anesthésie générale et sur un tapis chauffant sur lequel les animaux seront maintenus pendant la procédure et jusqu'à leur réveil pour minimiser l'inconfort.

Choix des espèces

La souris est l'espèce la plus utilisée en laboratoire pour l’étude des fonctions cognitives. De nombreux anticorps dirigés contre des épitopes murins et permettant l’analyse par imagerie et/ou la déplétion de certains types cellulaires sont également disponibles. L’ensemble de ces avantages permet, en utilisant ce modèle, de répondre rapidement aux questions scientifiques posées. Ce modèle permet de travailler avec la meilleure efficacité́ possible tout en offrant une représentation certes imparfaite mais néanmoins proche de la physiologie humaine. Nous utiliserons des souris adultes âgées de 2 à 9 mois. Au cours du développement typique de la maladie de type Alzheimer chez les souris, les premiers signes de pathologie sont la formation de plaques bêta-amyloïdes dans le cerveau, clairement visibles au microscope, qui se développent à 3 mois, ainsi que des différences comportementales dans les capacités d'apprentissage et de mémoire, que nous mesurons dans des tests comportementaux. Cet âge peut varier légèrement en fonction de l'animal et du sexe (les femelles développent généralement la maladie plus lentement que les mâles dans ce modèle). Pour capturer ces fenêtres de progression de la pathologie, des injections sous-cutanées pour manipuler le crâne seront administrées aux animaux à l'âge de 3 à 6 ou de 6 à 9 mois et des échantillons seront prélevés à 4, 6 ou 9 mois. Nous injecterons aussi des souris le 7e jour postnatal (P.7) pour pouvoir capturer la fenêtre de développement de la croissance et du recâblage intenses du cerveau, qui se produit vers entre le 10eme et le 20eme jour postnatal. Nous analyserons les cerveaux aux âges entre le 15eme et le 21eme jour postnatal pour capturer tous les changements que la manipulation aurait pu imposer au cerveau et analyserons le comportement des souris adultes après la manipulation pour voir si cela a eu des effets à long terme.

400 souris vont être utilisées dans le second volet d'un même projet, chacune passant par une ou deux neurochirurgies de deux heures à deux heures trente, puis par vingt jours de contrôle alimentaire et soixante essais comportementaux quotidiens. Le niveau de souffrance déclaré est modéré, et toutes sont tuées à l'issue pour l'examen de leur cerveau. Le premier volet mobilise 400 autres souris dans les mêmes conditions, ce qui porte l'ensemble à 800 animaux pour une même question. Les retombées cliniques évoquées, l'éclairage de troubles moteurs et perceptifs, restent au conditionnel, quand les lésions cérébrales et la restriction alimentaire, elles, sont programmées.

Objectifs

La prise de décision perceptuelle est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration sensori-motrice fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à un contrôle alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Les animaux sont hébergés et manipulés dans le cycle jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Pour respecter leur rythme de vie et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit hébérgés avec de la lumière. Les tests comportementaux sont ainsi réalisés lors des phases actives des souris et elles ne sont pas dérangées lors de leurs phases inactives. Les résultats avec des souris en cycle jour/nuit inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables si elles sont menées pendant la phase nocturne, alors que les souris sont normalement éveillées et actives. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent effectivement dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture antalgique qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. Des points limites spécifiques suffisamment précoces seront définis.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

Deux heures trente de neurochirurgie sous anesthésie, puis vingt jours de restriction alimentaire ramenant le poids à 85 % de sa valeur initiale : 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Cent d'entre elles subissent deux opérations, une lésion cérébrale puis l'implantation de sondes, espacées de dix jours, avant d'être hébergées seules pour éviter que les implants ne s'arrachent. L'objectif tient à comprendre comment deux zones du cerveau dialoguent quand une souris décide d'agir après avoir exploré son environnement avec ses moustaches. Le porteur justifie le choix de la souris par une organisation du système nerveux "assez similaire" à celle de l'humain et par une taille de cerveau homogène qui garantit la reproductibilité des sites d'injection.

Objectifs

La prise de décision perceptuelle est le processus par lequel les informations sensorielles entrantes sont intégrées par le cerveau afin de guider le comportement de l’individu en produisant une réponse motrice appropriée. Chez les rongeurs, il apparaît de plus en plus clairement que cette intégration sensori-motrice fait intervenir deux zones cérébrales clés. La première zone est la partie du cerveau qui reçoit les informations sensorielles provenant des moustaches. La deuxième zone est la partie qui va planifier et organiser les mouvements. Elle est impliquée dans la sélection et l’exécution des commandes motrices. La première zone quant à elle constitue un système sensoriel important pour les rongeurs permettant de collecter les informations sensorielles de l’environnement. Les rongeurs ont en effet développé un système sensoriel complexe et utilisent de préférence leurs moustaches pour explorer leur environnement tactile immédiat. Pourtant, on ne sait toujours pas à ce jour comment ces deux zones cérébrales interagissent pour assurer une prise de décision adaptée en réponse à la perception de l’environnement. Par ailleurs, la plupart de nos connaissances proviennent d'études utilisant des tâches comportementales peu naturelles (avec immobilisation de la tête de l’animal par exemple). De plus le rôle de ces zones cibles et de leur interaction dans des conditions qui reproduisent ce qui se passe dans la nature de façon éthologiques reste à ce jour inconnu.

Bénéfices attendus

Ce projet est avant tout un projet de science fondamentale. Il vise à comprendre au niveau cellulaire les principes de l’intégration des informations sensorielle et motrice qui permettent l’adaptation de la prise de décision en réponse à la perception de l’environnement. Tout cela dans un contexte environnemental le plus éthologique possible. Au-delà de cet aspect fondamental, le projet vise à explorer des problématiques que l’on retrouve en clinique. En effet, l'accent mis sur la prise de décision au cours d’une tâche ayant une vraie valeur éthologique dans un environnement naturel est central dans les neurosciences cognitives modernes, en particulier pour la recherche sur les primates humains et non humains. En outre, l'incapacité à résoudre la tâche comportementale proposée est une caractéristique frappante de plusieurs troubles moteurs et perceptifs. Le projet est donc particulièrement bien placé pour dessiner les bases d'études plus appliquées, en reliant notamment les techniques de neurosciences les plus récentes aux processus cognitifs essentiels. Enfin, le projet est à la pointe de nombreuses techniques expérimentales, allant de modèles comportementaux innovants à la neuroanatomie avancée et l’étude des signaux électriques générés par l'activité des neurones pendant la prise de décision. Ce projet se déroulera dans deux établissements utilisateurs différents.

Procédures

Les animaux seront d’abord acclimatés à leur hébergement dans le premier établissement utilisateurs pendant 2 jours. Puis les animaux seront soumis à une neurochirurgie lésionnelle et/ou implantatoire de sondes. Ces chirurgies se feront sous anesthésie et dureront chacune entre 2h et 2h30. 75 animaux auront une chirurgie lésionnelle, 150 animaux auront une chirurgie implantatoire, et 100 animaux auront ces deux chirurgies (lésionnelle et implantatoire). 75 animaux auront une injection de solution saline pour servir de contrôle. Un intervalle de 10 jours sera respecté entre chaque chirurgie lorsqu'il est nécessaire de faire une chirurgie lésionnelle puis de faire une chirurgie implantatoire. Après 10 jours de récupération et de surveillance post-opératoire, les animaux seront déplacés dans le deuxième établissement utilisateurs puis acclimatés à leur nouvelle animalerie pendant 10 jours. Ensuite, les animaux seront soumis à un contrôle alimentaire qui durera une vingtaine de jours. Pendant ces 20 jours les animaux auront l’étape de comportement avec 3 phases : l’habituation (5 jours), l’apprentissage (5 jours) et le contrôle (5 jours). Pour la phase d’habituation les animaux auront des essais durant 30 minutes. Pendant la phase d’habituation et de contrôle, les animaux auront 60 essais par jour ce qui représentera environ 2 heures par jour. Les animaux seront hébergés de façon individuel après la chirurgie pour éviter tout arrachement des sondes.

Impact sur les animaux

Le projet peut induire des effets indésirables sur les animaux, listés ci-dessus. : ● Le risque de douleur durant la chirurgie. ● Le risque de douleur aiguë lié à la récupération post-opératoire. ● Le risque d’infection des implants. ● Le risque de stress lié à l’hébergement individuel après la chirurgie. ● Le contrôle des apports caloriques en régulant la quantité de nourriture disponible, nécessaire à l’exécution de la tâche comportementale, sera limitée pour atteindre une réduction maximale à 85% de leur poids initial.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort à l'issu des procédures. La mise à mort des animaux sera nécessaire pour réaliser des contrôles d’immunohistochimie sur les cerveaux.

Remplacement

Par définition, les mécanismes neuronaux de la prise de décision perceptuelle ne peuvent être étudiés que chez des animaux vigiles confrontés à une situation de choix. Cela est d’autant plus vrai dans le cadre d’expérimentation avec une forte valeur éthologique ajoutée. Dès lors, aucun des modèles in vitro ne peut être utilisé ici.

Réduction

Les techniques expérimentales utilisées ici permettent de façon intrinsèque de réduire dramatiquement le nombre d'animaux utilisés, avec une qualité de mise en pratique assurant la reproductibilité des expérimentations entre les laboratoires. Par ailleurs, afin de limiter le nombre d’expériences et donc d’animaux, la taille de nos groupes expérimentaux est définie par l’utilisation de tests statistiques.

Raffinement

Une grille de notation sur le comportement de construction du nid chez la souris sera réalisée comme un indicateur du bien-être. En effet, lors de stress, de douleur ou de mal être chez la souris la construction des nids est affectée. Cette évaluation quotidienne permettra d’alerter ou d’identifier un mal-être ou une douleur éventuelle lorsque la qualité du nid est altérée. Elle permettra également de témoigner d’un bien-être lorsque le nid est de bonne qualité. Pour respecter le rythme de vie des animaux et les manipuler lorsqu’ils sont réveillés, les animaux seront hébergés avec un cycle de lumière jour/nuit inversé correspondant à leur phase d’éveil/sommeil. En effet, les souris sont des animaux nocturnes. Grâce à un système de programmation de l’éclairage, le jour ils seront donc dans l’obscurité avec lumière rouge (non visible pour eux) et la nuit ils seront hébergés avec de la lumière. Les tests comportementaux seront ainsi réalisés lors de l’éveil des souris et elles ne seront pas dérangées lors de leurs phases de sommeil. Les résultats avec ce cycle de lumière inversé seront plus pertinents sur le plan éthologique et fourniront des données plus fiables et robustes. Les tests comportementaux ont également été raffinés pour étudier des comportements de prise de décision éthologique (qui existent dans la nature) dans des conditions quasi-naturelles au sein même du laboratoire. Le projet comprend des chirurgies qui se feront sous anesthésie générale avec une couverture médicamenteuse qui agira dès le réveil de l’animal et qui sera maintenue si l’animal montre des signes de souffrance. La procédure d’anesthésie a été raffinée et permet d'être rapidement inversée par l’injection d’une solution de réveil, permettant ainsi d’éviter au maximum les problèmes et inconforts liés à une anesthésie pharmacologique. Les procédures de chirurgie ont été raffinées grâce à la cartographie du cerveau permettant des injections précises ciblant seulement les structures d’intérêt, permettant ainsi de réduire considérablement les effets secondaires liés à des injections peu spécifiques. Les animaux, bien que hébergés de façon individuelle, auront un contact olfactif et visuel avec leurs congénères. Ils auront un enrichissement important (nid, maison, tunnel, bâtonnets à ronger) et seront manipulés/habitués quotidiennement par le même expérimentateur. L’ensemble des animaux est surveillé quotidiennement.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Le projet sera réalisé sur des animaux de 8 semaines ce qui correspond chez cette espèce à l’âge jeune adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stables le temps de nos protocoles, et la taille du cerveau est homogène, garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection.

6 176 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent une greffe de cellules tumorales, jusqu'à deux injections dans le sinus rétro-orbitaire, quatre injections intrapéritonéales, trois gavages hormonaux, deux prélèvements sanguins et une irradiation de six minutes et cinquante-quatre secondes. Le porteur décrit des tumeurs pouvant entraîner des difficultés respiratoires, des ulcérations, des nécroses, des automutilations et l'isolement des animaux, celles dont le système immunitaire est absent y étant plus exposées. Les retombées annoncées, mieux choisir les traitements et repérer les patients qui répondent aux immunothérapies, sont renvoyées au long terme, tandis que le porteur affirme qu'aucun modèle in vitro ne reproduit l'évolution d'un "organisme entier" au cours du développement des cancers.

Objectifs

Les points de contrôle immunitaires sont des protéines qui interagissent avec les cellules du système immunitaire, appelées lymphocytes T, pour réguler leur activité une fois qu'une infection est éliminée. Cependant, dans le cas d’un cancer, les cellules tumorales utilisent ces protéines pour bloquer l’action des lymphocytes T, ce qui leur permet d’échapper au système immunitaire. Pour contrer cela, des médicaments appelés « inhibiteurs de points de contrôle immunitaires » ont été développés. Ils réactivent les lymphocytes T pour qu'ils attaquent les cellules cancéreuses. Ces traitements ont révolutionné le traitement de certains cancers, comme le mélanome avancé. Cependant, beaucoup de patients ne répondent pas à ces traitements ou rechutent dans les cinq ans. Il est donc crucial de mieux comprendre comment les voies cellulaires et moléculaires sont mises en place lors de traitements et de trouver des moyens de prédire qui va y répondre. La protéine Eomes, présente dans les lymphocytes T, joue un rôle important dans la lutte contre les tumeurs, mais on ne sait pas encore clairement comment elle influence la réponse à ces traitements. Les premières recherches montrent que plus il y a d'Eomes, meilleure est la réponse contre le cancer. Ce projet vise à comprendre comment Eomes agit sur l'efficacité des traitements contre le cancer, en utilisant des modèles de cancer chez la souris. Cela permettra de savoir si les lymphocytes T possédant Eomes sont les cibles principales des inhibiteurs des points de contrôle immunitaires.

Bénéfices attendus

La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires mis en place lors du traitement par les inhibiteurs des points de contrôle immunitaires permettra d’améliorer la compréhension des réponses immunitaires impliquées dans la réponse antitumorale et ainsi de comprendre pourquoi certains patients sont réfractaires aux thérapies actuellement utilisées. À terme, cette étude aura donc pour but de mieux sélectionner les traitements, d’augmenter l’efficacité des traitements déjà existants, et potentiellement d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Tous les gestes invasifs seront réalisés sous inhalation d'isoflurane (2% + mélange air/oxygène). Une attention particulière sera portée au suivi par des personnes formées et compétentes. Les injections en sous cutanée ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau de la veine caudale durent 5 minutes et sont réalisées une seule fois. Les injections en intraveineuse au niveau du sinus retro-orbital durent 1 minute et sont réalisées 2 fois avec un jour d’intervalle entre les deux injections. Les prélèvements de sang en sous-mandibulaire durent 1 minute par souris et sont réalisées 2 fois avec 3 semaines d’intervalle entre les deux prélèvements. Les injections intrapéritonéales ont une durée de 1 minute par souris et sont réalisées 4 fois avec 2 jours d’intervalle entre chaque injection. L’administration par gavage d’un traitement hormonal a une durée de 2 minutes par souris et sera réalisée 3 fois par souris. L’irradiation a une durée de 6 minutes et 54 secondes et est réalisé une seule fois.

Impact sur les animaux

Les modèles tumoraux murins induits dans ce projet vont engendrer le développement de tumeurs pouvant entraîner des difficultés de déplacements. Un défaut d’alimentation et/ou de boisson et une perte de poids de l’animal peuvent apparaître. De plus, les tumeurs pourraient éventuellement induire des troubles fonctionnels chez l'animal comme des difficultés respiratoires ou une augmentation du rythme respiratoire ainsi qu’une altération de la température corporelle. Des troubles comportementaux pourraient survenir tels que des auto-mutilations,des défauts de toilettage et de nidification ainsi que l’isolement. L’état général des souris pourrait être altéré. Les tumeurs peuvent également présenter des ulcérations ou des infections. Lors de la régression tumorale favorisée par l’action des combinaisons d’immunothérapies, des nécroses peuvent être visibles sans saignements ni rougeurs. L’absence de système immunitaire chez certaines souris du projet les rendent plus sensibles au développement et à la progression tumorale ainsi qu’aux ulcérations, infections et invaginations de la tumeur.

Devenir

Les animaux qui ont développé des tumeurs seront mis à mort afin de réaliser des analyses sur les cellules purifiées à partir des organes prélevés (moelle osseuse ou tumeurs, ganglions drainants la tumeur et rate). Ceci nous permettra d’évaluer l’efficacité des immunothérapies sur la réponse immunitaire anti-tumorale.

Remplacement

Le recours à l'expérimentation animale dans le cadre de cette étude se fait après de nombreuses études in vitro dans des modèles cellulaires. Le principe de remplacement n'est pas applicable à ce projet car les études in vitro ne sont pas capables de prendre en compte la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers. Ces études in vitro ne reproduisent pas l'ensemble des voies impliquées dans des modèles physiologiques intégrés et par conséquent ne permettent pas l'obtention de résultats scientifiques exploitables et pertinents de la pathologie humaine. Cependant, il n’existe à l’heure actuelle aucun modèle in vitro capable de prendre en compte toute la complexité des mécanismes cellulaires sollicités et de considérer en même temps, l’évolution adaptative constante de l’organisme entier au cours du développement de cancers.

Réduction

L’ensemble des expériences sont organisées de manière à réduire au maximum le nombre d'animaux grâce à des études préliminaires qui nous ont permis de maîtriser ces modèles murins. Les résultats actuels ont permis de valider que des lots de 10 souris par génotype selon les paramètres à évaluer permettent d'acquérir des données fiables. La stratégie d’expérimentation sera une étude longitudinale. Cette approche expérimentale permet d’appliquer un modèle statistique pour un plan en mesures répétées et permet d’avoir une puissance de test importante car chaque animal est observé à différents temps et devient son propre contrôle. Un test statistique sera utilisé pour les expériences du projet. Dans ce projet, nous utilisons un modèle de mélanome murin dans lequel les cellules cancéreuses émettent de la lumière. Par imagerie, nous sommes capables de visualiser la progression tumorale et les métastases au cours du temps et ce de manière non invasive en ré-utilisant les mêmes animaux. Par ailleurs, dans ce projet, nous injecterons simultanément des cellules immunitaires (Lymphocytes T) compétentes et déficientes pour une protéine d’intérêt dans une seule et même souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, réduisant ainsi le nombre d’animaux utilisé.

Raffinement

Le bien-être de l’animal est un facteur de variabilité expérimentale que nous prenons en considération grâce au suivi quotidien des animaux dès l’initiation des modèles de cancers. Ainsi, l’expérimentateur impliqué dans le projet observera le comportement et mesurera le poids des animaux tous les deux jours à compter de l'initiation des modèles de cancers jusqu'à la fin de l'expérimentation. Toutes modifications de la prise de nourriture/boisson, de la posture, des déplacements, de la sociabilité et de la nidification seront observées. En cas de déshydratation et de perte de poids inférieur au seuil défini dans les points limites, de la nourriture et de l’eau sous forme de gel seront ajoutés. Les comportements d’agressivité seront également surveillés et du coton sera ajouté. Suite à l’induction des modèles tumoraux, des nécroses inflammatoires avec apparition d'une invagination au centre de la tumeur, de petits saignements et de rougeurs sur le pourtour de la tumeur peuvent se développer et seront nettoyées avec de la Vétédine. Pour diminuer la souffrance et la douleur liée aux procédures expérimentales et au développement de cancers, un traitement analgésique en locale (lidocaïne) sera administré aux souris au niveau de ces nécroses inflammatoires. Par ailleurs, des grilles d’expressions faciales des souris mises à disposition dans l’animalerie sont consultées pour détecter la douleur, la détresse ou la souffrance des animaux. De manière concomitante, des points limites ont été définis en concertation avec les zootechniciens pour détecter une dégradation trop importante de la santé et du bien-être des animaux et arrêter l’expérimentation. Pour éviter la mort à cause d’une éventuelle infection des souris dont le système immunitaire est non fonctionnel, ces souris seront hébergées en portoir ventilé, manipulées sous hotte avec port de gants, masque, combinaison, surchaussures et charlotte. Certains actes seront réalisés sous anesthésie générale et/ou sous anesthésie locale suivies d’un réveil des animaux sur tapis chauffant. Par ailleurs, les animaux sont hébergés en groupes sociaux harmonieux dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification, bâtonnets à ronger). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum" et de la musique est diffusée en salle d’hébergement pour diminuer le stress et atténuer les bruits environnementaux.

Choix des espèces

Les modèles de l’espèce animale Mus musculus sont à la base de la compréhension des mécanismes de reconnaissance par le système immunitaire et ont permis ces dernières années d’importantes avancées thérapeutiques dans ce domaine. En effet, ces modèles sont très utilisés dans le criblage de nouvelles molécules, car, du fait de la présence de nombreux gènes équivalents chez l’homme et chez la souris, ils intègrent les caractéristiques de la pathologie humaine et aident à la compréhension de la résistance des cellules tumorales aux traitements. Par exemple, notre projet de recherche est basé sur l’utilisation d’animaux génétiquement modifiés pour les molécules d’intérêt Eomes (délétion dans les lymphocytes T). Aucune autre espèce animale avec ces caractéristiques génotypiques pour ces protéines n’est disponible. Par ailleurs, cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Il est également important de souligner que nous disposons chez la souris d’outils précieux (anticorps monoclonaux, plasmides, etc...) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. L’ensemble des expériences du projet sera réalisé sur des jeunes adultes soit des animaux âgés d’environ 6 à 8 semaines car les transplantations de cellules cancéreuses sont plus efficaces chez les jeunes adultes et permettent donc une meilleure prise tumorale.

640 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, chacune passant une semaine avec une roue d'activité, jusqu'à 45 minutes sur un tapis roulant menant à l'épuisement musculaire, et vingt à trente minutes sous anesthésie pour la mesure de la force de ses muscles. Les procédures, d'un niveau de souffrance modéré, comprennent aussi des tests de marche, de coordination et d'agrippement sur animal vigile, et l'enregistrement de l'activité électrique du nerf vers le muscle par piqûre d'aiguilles de stimulation, avec un risque de détresse respiratoire, d'hypothermie et de douleurs au réveil. Les muscles et les autres tissus sont prélevés après la mise à mort, sur des souris alors âgées de trois à neuf mois. Le porteur annonce de nouvelles cibles thérapeutiques "utilisables chez l'homme" contre la fonte musculaire, quand l'objet immédiat du projet est d'identifier des mécanismes chez la souris.

Objectifs

Le système neuromusculaire joue un rôle essentiel dans les fonctions motrices de l'organisme, incluant la respiration, la locomotion, la mastication et d'autres activités quotidiennes. Cependant, diverses situations telles que le vieillissement, les périodes d'hospitalisation prolongée, les pathologies chroniques (les maladies cardiovasculaires, le diabète, etc…), le cancer, ainsi que les maladies neuromusculaires génétiques comme par exemple la dystrophie musculaire de Duchenne, peuvent entraîner une perte de masse musculaire. Les cellules souches musculaires, nichées dans le tissu, jouent un rôle crucial dans le processus de régénération pour réparer les fibres musculaires endommagées, en réponse à l'exercice intense ou au cours de maladies neuromusculaires. La compréhension des mécanismes sous-jacents à la formation des muscles et de leurs cellules souches associées, ainsi que des processus d'appariement des nerfs (motoneurones) sur les fibres musculaires en croissance, est essentielle pour envisager des interventions thérapeutiques ciblées sur l'axe neuromusculaire. Il existe une diversité de types de fibres musculaires, chacune dotée de propriétés de contraction et d'endurance distinctes, et présentant une vulnérabilité variable dans différentes conditions pathologiques ou lors du vieillissement. La complexité de ces interactions rend difficile leur étude in vitro ou ex vivo. Cependant, l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés offre une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des propriétés des différentes fibres musculaires et des motoneurones, ainsi que de l'interaction entre les différents types cellulaires dans l’équilibre du système neuromusculaire. L'objectif de cette étude est d'identifier de nouveaux mécanismes impliqués dans le maintien de cet équilibre à la fois dans les éléments contractiles musculaires et dans les motoneurones, et pouvant potentiellement être perturbés dans diverses conditions pathologiques. Ce travail de recherche pourrait ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques visant à préserver la fonction neuromusculaire et à traiter des pathologies associées.

Bénéfices attendus

Le système neuromusculaire nous permet de nous mouvoir mais est aussi associé à des fonctions vitales comme la respiration et la déglutition. Les muscles squelettiques et les motoneurones associés s’atrophient au cours du vieillissement, lors d’hospitalisation prolongée, au cours du cancer, et dans de nombreuses myopathies d’origine génétique. La compréhension de la physiologie et de la physiopathologie neuromusculaire liée à de nouveaux acteurs, comme les protéines spécifiques étudiées dans ce projet, pourrait aboutir à la mise en évidence de nouvelles voies ou cibles thérapeutiques utilisables chez l’homme.

Procédures

Pour une première partie des animaux : L’évaluation des paramètres de la marche, de la respiration, de la coordination et de la force d’agrippement se réalisent sur animaux vigiles, elles seront faîtes 1 seule fois par animal et dure de 5 à 25 minutes. L’évaluation de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs et l’enregistrement de l’activité électrique vers le muscle en passant par le système nerveux se réalisent sous anesthésie et analgésie adéquat, 1 fois par animal et elles durent de 10 à 20 minutes. Pour la seconde partie des animaux : Le test de l’activité volontaire s’effectue par les animaux de manière volontaire, la roue est maintenue pendant 1 semaine. Le test de tolérance à l’effort avec le tapis roulant est réalisé par les animaux eux-mêmes, 1 seule fois par animal et dure environ 45 minutes au maximum. Les mesure de force musculaire (sans réveil) s’effectuent sur animaux anesthésiés et sous analgésie adéquat, 1 fois par animal et durent 20 à 30 minutes.

Impact sur les animaux

Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles (cages à roue, tapis de course, test d'équilibre, test d'agrippement) sont le stress lié à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à l’isolement de courte durée des souris dans les appareillages de mesure. Une fatigue musculaire peut survenir pour le tapis de course. Pour certains tests, seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir comme pour le test d’activité volontaire et l’évaluation des paramètres respiratoires. Les effets indésirables pouvant survenir pour les actes sous anesthésie sont la détresse respiratoire et l’hypothermie puis des douleurs post opératoires lors du réveil dues aux stimulations et à la contraction musculaire involontaire. . Les principales nuisances attendues pour les tests fonctionnels sur animaux vigiles (mesure de l’activité volontaire, test d’effort sur un tapis roulant, test d'équilibre, test d'agrippement) sont la peur liée à la manipulation momentanée de l’animal par l’expérimentateur, au changement d’environnement et à l’isolement des souris dans les appareillages de mesure qui peuvent générer un léger stress. Un épuisement musculaire peut survenir pour le tapis de course. L’évaluation de la marche et l'évaluation des paramètres respiratoires ne nécessitent aucune contention, les souris se déplacent librement dans les équipements. Seul un léger stress dû aux changements d’environnement est à prévoir. Les effets indésirables pouvant survenir pour l'évaluation non invasive de la fonction musculaire des muscles fléchisseurs et de l’activité électrique du système nerveux périphérique sont le réveil spontané, l’hypothermie, la détresse respiratoire, les douleurs post opératoires lors du réveil dues aux piqûres des aiguilles de stimulation et à la contraction involontaire, et du stress au réveil de l’anesthésie. Pour les mesures de force, les risques sont le réveil spontané, l’hypothermie et la détresse respiratoire.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés à la fin des procédures en suivant la réglementation en vigueur. Tous les tissus et échantillons musculaires seront prélevés pour des analyses histologiques et moléculaires réalisés ultérieurement en laboratoire de recherche.

Remplacement

Il existe une diversité de type de fibre musculaire, chacune dotée de propriétés de contraction et d'endurance distinctes, et présentant une vulnérabilité variable dans différentes conditions pathologiques ou lors du vieillissement. Malheureusement, la complexité de ces interactions rend difficile leur étude in vitro ou ex vivo. Cependant, l'utilisation de modèles murins génétiquement modifiés offre une opportunité précieuse pour approfondir notre compréhension des propriétés des différentes fibres musculaires et des motoneurones, ainsi que de l'interaction entre les différents types cellulaires dans le maintien de l'homéostasie neuromusculaire. Il est donc indispensable d’utiliser un modèle animal. Néanmoins, nous utilisons en parallèle des approches in vitro, notamment des cultures cellulaires de myoblastes et de myotubes contrôles et mutants pour étudier l’impact de la délétion des protéines d'intérêt dans la différenciation, le typage et le métabolisme des cellules musculaires, ainsi que pour l’étude les mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents.

Réduction

640 animaux seront utilisés dans ce projet, la taille des effectifs a été établie grâce à un calcul de puissance et des tests statistiques seront utilisés pour une interprétation fiable des résultats. Pour limiter le nombre d’animaux, les animaux seront analysés de manière longitudinale (un même animal pour plusieurs tests et donc plusieurs résultats).

Raffinement

Lors du transport entre les deux animaleries, les animaux pourront subir du stress dû aux mouvements des cages de transport, dû au transfert dans les nouvelles cages ou encore dû au changement d’environnement et d’alimentation, une période d’acclimatation d’une semaine minimum sera réalisée. Les conditions d’hébergement et l’enrichissement du milieu sont gérées par les techniciens de l’animalerie. Elles consistent à un contrôle quotidien des cages, de la température et de l’hygrométrie. Ces pièces sont équipées de cycle jour/nuit permettant un cycle de réveil et de sommeil constant et sain pour l’animal. Le changement des cages se fait sous hotte aspirante et les cages possèdent des filtres. Les cages sont placées sur un portoir ventilé. Les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum (abreuvement automatique). Pour que les animaux puissent faire leur nid, des lanières de papier kraft seront utilisées comme enrichissement ainsi que des bâtons à ronger ou des maisonnettes pour se cacher (ou équivalent) afin d’éviter le stress. Le nombre d’animaux par cage est réduit à 2 minimum et à 5 maximum. Si nécessaire, la nourriture pourra être placée sur le plancher de la cage. Afin de permettre une interprétation fiable des résultats avec le respect du bien-être animal, une surveillance quotidienne sera réalisée pour détecter tout signe d'inconfort. Des points limites suffisamment précoces et prédictifs ont été définis. En vue de réduire au maximum le stress des animaux, un exercice d’habituation sera réalisé 2 jours avant les tests. A l’exception de l’évaluation des paramètres respiratoires dont le stress doit être réduit au maximum, une session par jour pendant 5 jours sera nécessaire. Pour les actes le nécessitant les souris recevront l’anesthésie et l’analgésie adéquat afin d’éviter toute douleur et stress.

Choix des espèces

L’espèce souris Mus musculus a été choisie car elle représente un excellent modèle pour étudier la physiologie des mammifères dans une population homogène d’animaux (même fond génétique). De plus, la souris est un modèle de choix pour l'étude des dysfonctionnements musculaires car de nombreuses voies de régulation dans le système neuro-musculaire sont conservées entre souris et homme, permettant une extrapolation des résultats obtenus. De plus, l'utilisation de modèle de souris transgéniques permet une étude approfondie de de protéines d’intérêts dans la fonction neuromusculaire. Enfin, la disponibilité de données bibliographiques importantes sur la physiologie et la physiopathologie de la souris est un atout important dans l'analyse et l'interprétation de nos travaux de recherche sur ce modèle animal. Les expériences seront réalisées sur des souris adultes à partir âgées de 2 à 8 mois chez lesquelles le système neuromusculaire est complètement développé. A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et seront âgés de 3 à 9 mois environ.