Système nerveux
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Impact du neurodéveloppement dans l’évolution des ataxies spinocérébelleuses de type 3 sur un modèle murin
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 867 souris pour treize animaux par génotype, par sexe et par stade de développement, en deux répétitions : c'est le compte annoncé sur cinq ans pour comparer le développement du cerveau de souris porteuses du gène humain de l'ataxie spinocérébelleuse de type 3. Les procédures déclarées se limitent à un prélèvement au bout de la queue et relèvent d'un niveau de souffrance léger, l'atteinte venant de la mutation elle-même, qui provoque des troubles moteurs à partir de 90 semaines. Les souris mutées sont tuées après douze mois pour que ces effets n'apparaissent pas, les reproductrices dès que leur fécondité baisse, et les petits sans intérêt génotypique sont proposés à d'autres équipes ou tués dès réception du génotype. Pour une maladie qui touche 1 à 9 personnes sur 100 000, les cibles thérapeutiques annoncées restent une perspective à long terme.
Objectifs
L’ataxie spino-cérébelleuse de type 3 (SCA3) est une maladie neurodégénérative héréditaire faisant partie du groupe des ataxies spino-cérébelleuses. Elle a de lourdes conséquences sur la qualité de vie des patients, car elle provoque notamment des contractions musculaires involontaires et des troubles cognitifs. Cette maladie est causée par une anomalie génétique. Même si cette maladie se manifeste à l’âge adulte, la protéine mutée est exprimée dès le stade embryonnaire, ce qui pose la question de l’aspect neurodéveloppementale dans cette maladie. Peu d’études se sont intéressées aux phases de développement dans cette maladie cependant certaines études ont montré des modifications pertinentes dans le modèle murin de celle-ci. De plus la protéine en question a de nombreux rôles importants, elle est notamment impliquée dans la réparation de l’ADN. Ainsi, comprendre son rôle dans le développement du cerveau est crucial pour comprendre cette pathologie, ce qui aiderait à développer des nouvelles stratégies thérapeutiques. L’objectif du projet sera de suivre le développement du cerveau chez les animaux portant le gène humain normal et le gène humain anormal afin de les comparer. Pour cela, nous allons élever nos animaux modèle de la pathologie et nous réaliserons des analyses histologiques et de biologie moléculaire à différents stades de développement. Nous utiliserons des souris génétiquement modifiées pour reproduire la maladie.
Bénéfices attendus
La prévalence de l’ataxie spinocérébelleuse est de 1 à 9 personnes sur 100000. Elle a de lourdes conséquences sur la qualité de vie des patients, car elle provoque notamment une dystonie et des troubles cognitifs. Cette étude permettra de mieux comprendre l’effet de cette mutation sur le développement du cerveau et les potentiels mécanismes compensatoires. Cela permettra de mettre en évidence des marqueurs spécifiques, permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades précoces. De plus, elle vise à long terme à identifier des cibles thérapeutiques afin de corriger les symptômes associés à la maladie.
Procédures
Un prélèvement de l’extrémité de la queue sera réalisé sur animaux vigiles pour déterminer la présence de la mutation (moins d’une minute par animal, réalisé 1 fois). Tous les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire
Impact sur les animaux
Le prélèvement pour connaitre le patrimoine génétique des animaux peut générer une légère douleur chez l’animal. Les manipulations et contention des animaux peuvent être source de stress. La modification génétique apportée par les animaux provoquera des troubles moteurs significatifs à partir de l'âge de 90 semaines et commencera par une présence non significative de symptômes vers l'âge de 12 mois (45 semaines).
Devenir
Les animaux seront euthanasiés à différents âges afin de récupérer des tissus post-mortem pour analyses histologiques et biochimiques. Les animaux reproducteurs seront euthanasiés pour conserver des capacités de reproduction optimales. Les petits ne présentant pas d’intérêt génotypique seront soit proposés à d’autres équipes de recherche si cela est possible ou seront euthanasiés à la réception du génotype.
Remplacement
L’étude du développement du cerveau nécessite le recours au modèle murin car il permet de préserver l’environnement du développement du cortex qui implique l’interaction de différents types cellulaires entre eux, ce qui ne peut pas être reproduit en culture cellulaire. L’étude de l’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles murins. Il n’existe pas d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas d’animaux et permettant d'étudier le développement et la complexité du cortex. Ces analyses nécessitent l'utilisation d’animaux pour trois raisons majeures : le comportement des neurones corticaux diffère selon leur environnement puisqu'ils adoptent un comportement migratoire dans le cerveau et un comportement de croissance une fois mis en culture ; la mise en place des couches du cortex, ainsi que les connexions neuronales qui y sont formées, ne peuvent être reproduits en culture cellulaire. Ainsi les modèles de culture cellulaire ne permettent pas d’étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux dans le cortex.
Réduction
Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en réduisant au plus petit nombre le nombre d’animaux tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisés. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés. La variabilité interindividuelle peut être élevée, nous avons donc défini qu’il sera nécessaire de tester 13 souris par génotype et par sexe (en deux réplicas) pour chaque stade de développement du cerveau. Ainsi, pour l’ensemble de l’analyse neurodéveloppementale nous estimons que nous utiliserons 1867 souris maximum au cours des 5 années du projet.
Raffinement
Les cages sont maintenues en portoirs ventilés avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau (biberon). La nourriture est adaptée au stade physiologique. Les conditions de luminosité, température et d’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères (5 par cage maximum et couple en trio). Afin de récupérer des embryons à des stades précis nous réaliserons des accouplements contrôlés d’une nuit, ce qui pourra nécessiter de laisser un mâle hébergé seul pendant cette nuit. Toutes les cages sont enrichies d’un nid et de stick en bois. Les cages d’accouplements bénéficient également d’une maison et/ou de papier kraft et d’une alimentation adaptée. Dans le cadre du maintien courant de la lignée les souris seront observées quotidiennement par le personnel qualifié des animaleries. Conformément au bien-être des animaux, une femelle n'aura pas plus de 6 portées. Les mâles mutants ne seront pas accouplés au-delà de l'âge de 8 mois, afin de maintenir une capacité de reproduction optimale basée sur l'expérience de l'équipe. Dans le cadre de la maintenance de la lignée, les accouplements sont effectués avec des femelles sans mutation provenant d'un fournisseur, afin d'éviter toute dérive génétique susceptible d'aggraver le phénotype nuisible. Les animaux mutés seront euthanasiés après l'âge de 12 mois pour s'assurer que les effets néfastes de la mutation ne sont pas atteints. Les animaux seront également particulièrement surveillés à l'approche de l'âge de 12 mois, afin de détecter d'éventuels signes précoces de souffrance dus à la mutation. Une attention particulière sera accordée aux difficultés locomotrices et à la prostration, qui sont deux signes caractéristiques de la souffrance liée à la mutation. Des points limites ont été établis et seront respectés pour éviter toute souffrance aux animaux. Un protocole d'analgésie sera utilisé pour assurer une euthanasie sans douleur de certaines souris.
Choix des espèces
L’étude du développement du cerveau nécessite le recours au modèle murin car il permet de préserver l’environnement du développement du cortex qui implique l’interaction de différents types cellulaires entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles murins. Notre choix se porte sur la souris car les techniques de transgénèses sont bien maitrisées chez cette espèce, ce qui permet de créer une lignée d’intérêt qui permet de reproduire les caractéristiques de la pathologie humaine. Le but de ce projet est de suivre le développement du cerveau aux âges suivants : · Stade embryonnaire, donc femelle gestante : pour suivre la mise en place des couches du cortex · Jour post-natal 0, 4, 7 et 15 : Il s’agit de stade critiques pour la maturation du cerveau. · Jour post natal 21,30 : à ce stade on estime que le cortex et le cervelet sont matures. Enfin nous utiliserons des souris adultes à 3 mois pour considérer des effets de la maladie sur un cerveau adulte.
Programme d’immunisation de lapins pour la génération d’anticorps polyclonaux
- Production de routine
- Recherche appliquée
- Autres troubles humains
- Cancers
- Diagnostic des maladies
- Maladies animales
- Maladies des plantes
- Maladies infectieuses
- Troubles cardiaques
- Troubles immunitaires
- Troubles nerveux
- Troubles urogénitaux
- Recherche fondamentale
- Autre recherche fondamentale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système immunitaire
- Système nerveux
- Système respiratoire
- Système urogénital
- Tests réglementaires
Mis en quarantaine vingt et un jours puis engagés dans le protocole dès l'âge de trois mois, des lapins New Zealand White sont immunisés par paires, deux par commande d'anticorps. 3 615 lapins vont être utilisés au total, tous tués à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré. Chacun reçoit dix injections d'antigène mêlé à un adjuvant, qui peuvent ulcérer les points d'injection et provoquer fièvre et baisse de mobilité, puis subit cinq prélèvements de sang de vingt-cinq à quarante minutes, jusqu'à un dixième de son volume sanguin. Le porteur affirme qu'il n'existe pas de méthode substitutive aussi efficace, les banques d'anticorps produites hors animal ne donnant pas, selon lui, une gamme comparable en temps, en budget et en matériel.
Objectifs
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Ces anticorps constituent des ressources largement utilisées dans des applications diagnostiques et thérapeutiques. Les anticorps polyclonaux sont notamment utilisés pour l’évaluation, la détection et la purification de protéines d’intérêts. Ces anticorps polyclonaux trouvent des applications en biologie et en biochimie, tel que des tests de grossesses ou plus récemment pour détecter la présence du virus SARS-CoV-2. Notre société assure la production d’anticorps polyclonaux pour le compte de différentes équipes de recherche publiques ou privées. L'objectif de la présente demande est d'obtenir des anticorps polyclonaux de lapin. Il a été observé que les anticorps produits par les lapins présentent généralement de hautes affinités pour l’antigène cible, grâce notamment à la mise en place de mécanismes propres à l’espèce. Les anticorps seront produits par injection à un animal de l'immunogène (antigène) cible, combiné à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire.
Bénéfices attendus
Les anticorps polyclonaux seront des auxiliaires et des réactifs employés non seulement dans des procédés relatifs à la biochimie, à la biologie moléculaire et à l’immunohistochimie, mais aussi à des fins diagnostiques voir thérapeutiques. En effet, les anticorps polyclonaux de lapins développés interviendront notamment dans la caractérisation d’une substance médicamenteuse. Les anticorps développés dans le cadre de projets de recherche, permettront de localiser, d’identifier ou de purifier des protéines synthétisées au sein des cellules, d’un tissu ou d’un organe.
Procédures
10 injections en intradermique, en sous-cutanée ou en intramusculaire de l’antigène associé à un adjuvant (8 minutes) 5 prélèvements (durée 25 à 40 minutes par prélèvement).
Impact sur les animaux
Les immunisations peuvent notamment conduire à l'apparition d'ulcérations aux points d'injection. L'injection en intramusculaire couplée à un adjuvant (hors adjuvant complet de Freund) peut provoquer l’apparition de fièvre et d’inconfort modéré, pouvant se traduire par une légère diminution de la mobilité pendant les premières heures suivant l’injection (apparition de petites boules correspondant au dépôt de l’émulsion antigène-adjuvant). Les prélèvements de sang et les injections avec de l’adjuvant incomplet de Freund, n’entrainent pas de gêne particulière (inconfort mineur). Le volume de sang étant en effet adapté au poids de l’animal et correspondra au maximum à 10% du volume en accord avec les recommandations relatives aux volumes sanguins maximaux prélevés du guide Gircor.
Devenir
Tous les animaux sont concernés par l'euthanasie. Les projets étant spécifiques d’un antigène, nous ne pouvons pas réutiliser les animaux pour d’autres protocoles, les animaux sont donc tous euthanasiés en fin de protocole.
Remplacement
La méthode usuelle pour produire des Anticorps Polyclonaux (AcP) reste l’immunisation de l’animal avec des préparations antigéniques pures ou partiellement purifiées, souvent combinées à un adjuvant qui accroît la réponse immunitaire. Les AcP sont produits chez les animaux vivants, puisqu’il n’existe pas de méthode substitutive aussi efficace pour cette production. L’immunité humorale correspond à un processus complexe impliquant différents acteurs du système immunitaire in vivo. Ce processus se traduit par la production d’un répertoire diversifié d’immunoglobulines répondant à un grand nombre d’antigènes. In vivo, l’adaptation accrue du système immunitaire vis à vis de l’antigène au fur et à mesure des immunisations est indispensable pour obtenir des anticorps notablement plus spécifiques et pertinents que ceux obtenus avec des systèmes de développement in vitro. En effet, les techniques partant de banque naïve ne permettent généralement pas une obtention aisée (en termes de temps, budget et matériels) d’une large gamme d’anticorps de hautes affinités ciblant différents épitopes.
Réduction
Le nombre d’animaux (2 lapins par protocole) pour l’obtention de réactifs intervenant dans la caractérisation d’une molécule thérapeutique. Ce nombre a été adapté au plus juste par rapport au besoin de sérum pour les investigations et les recherches au regard de notre recul sur ce protocole. La quantité d’anticorps générés sera suffisante pour des investigations poussées sans avoir à réimmuniser des animaux.
Raffinement
Les animaux sont prélevés et euthanasiés en dehors de la pièce de stabulation pour éviter toute transmission de stress. La pièce de stabulation est à l'abri de toute nuisance sonore. L'observation quotidienne des animaux par le personnel compétent permet une détection précoce de tout risque d'atteinte d'un point limite et ainsi une intervention adaptée au plus tôt. Des tableaux de points limites ont été mis en place avec notre vétérinaire. L’établissement des points limites mis en oeuvre se base sur 3 critères principaux : comportementaux (éveil, posture, comportement exploratoire, locomotion, agressivité, vocalisation…), signes cliniques (apparence générale, aspect du pelage, ouverture des paupières, éventuelles lésions…) et zootechniques (abreuvement, poids, …). L’observation de l’un de ces paramètres, permet de définir un score clinique, avec différents niveaux : normal, observer attentivement avec mise en oeuvre potentielle d’antalgies, souffrance sévère : arrêt immédiat du protocole et remise en cause de la procédure expérimentale. Ces mesures en accord avec le principe d’amélioration (raffinement), constitue un outil permettant d’atteindre les objectifs scientifiques tout en minimisant autant que possible la souffrance animale. Les points limites mis en place au sein de notre structure pour ce protocole permettent d’atteindre l’objectif de l’étude avant même l’installation d’une souffrance. Les prélèvements seront réalisés après injection d'une molécule, qui possède un effet tranquillisant, permettant une réalisation du prélèvement moins stressante pour l'animal.
Choix des espèces
L'espèce utilisée est choisie avec soin. Nous prenons en compte les facteurs suivants : 1) la quantité nécessaire d'anticorps ou d'antisérum (choix d’animaux de plus grandes tailles lorsqu'on a besoin de grandes quantités d'anticorps); 2) la relation phylogénétique entre l'espèce d'où provient l'antigène protéique et l'espèce utilisée pour produire l'anticorps; 3) la fonction effectrice des AcP provenant de l'espèce productrice d'anticorps; 4) l'utilisation prévue des anticorps. Dans le cadre de cette procédure expérimentale, les lapins New Zealand White ont été retenus, car ils permettront de fournir une quantité suffisante d'anticorps, via la mise en protocole d'un nombre restreint d'individus, avec un risque d'échec du projet très faible. De plus, ces lapins sont communément utilisés pour la production d'AcP, ils sont faciles à manipuler et produisent des antisérums à titre élevé et à forte affinité. La meilleure production d’anticorps est obtenue chez les jeunes adultes. Les lapins entreront en protocole dès l’âge de 3 mois. Auparavant ils auront subi une période de quarantaine de 21 jours, en absence d’incident durant ce temps, ils seront alors aptes à rentrer en protocole.
Mise en place d’un modèle murin de sclérose en plaques (encéphalomyélite autoimmune expérimentale) et validation d’efficacité de molécules de références.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une paralysie des membres postérieurs, qui empêche les souris de se nourrir, est provoquée par l'injection d'adjuvant de Freund et d'une protéine de la myéline. 384 souris vont être utilisées, 360 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, avec des administrations quotidiennes de J-7 à J+35 et un score neurologique relevé chaque jour. Le porteur écrit que les animaux parvenus à ce stade restent capables de se déplacer librement dans leur environnement, tout en indiquant que la prise de nourriture leur devient impossible et que des croquettes sont déposées au sol de la cage. À J+35, une ouverture du thorax et de l'abdomen permet une ponction cardiaque puis le prélèvement du cerveau, l'objectif déclaré étant de valider ce modèle dans l'établissement pour y tester ensuite, pour le compte d'industriels financeurs, l'efficacité de traitements de la sclérose en plaques.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune démyélinisante du système nerveux central. Actuellement, les traitements disponibles sont peu nombreux. Malgré une prise en charge médicamenteuse et paramédicale qui permet un ralentissement de l’évolution de la pathologie chez certains patients et l’amélioration de leur qualité de vie, il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir la SEP. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes visant à traiter efficacement cette pathologie. L’objectif de ce projet et de mettre en place et valider un modèle murin d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE-MOG). Ce modèle est décrit comme reproduisant au mieux la physiopathologie de la forme progressive de la SEP, permettant ainsi une transposabilité des résultats obtenus vers la clinique. Une fois ce modèle validé au sein de notre structure, nous l’éprouverons en validant l’efficacité des traitements actuellement disponibles.
Bénéfices attendus
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie auto-immune démyélinisa nte du système nerveux central. Actuellement, les traitements disponibles sont peu nombreux. Malgré une prise en charge médicamenteuse et paramédicale qui permet un ralentissement de l’évolution de la pathologie chez certains patients et l’amélioration de leur qualité de vie, il n’existe à ce jour aucun traitement permettant de guérir la SEP. Ainsi, il parait indispensable de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques innovantes visant à traiter efficacement cette pathologie. Les bénéfices attendus de ce projet et de mettre en place au sein de notre structure un modèle animal de SEP, permettant une transposabilité des resultats obtenus vers la clinique. A plus long terme, nous pourrons tester l’efficacité de nouveaux traitements et les comparer aux traitements de référence actuellement disponibles.
Procédures
Dans cette étude, 384 animaux seront soumis à une injection sous-cutannée de la solution permettant l’induction de l’EAE. Cette administration se fera sur des animaux anesthésiés par voie gazeuse, avec une couverture analgésique. Cette manipulation durera moins de 5 minutes. L’ensemble de ces animaux auront également une administration par voie intra-péritonéale à J0 et J2. Cette injection dure quelques secondes, sur un animal vigile contentionné. Certains animaux (288 animaux) pourront être soumis à une administration par voie intra-péritonéale ou sous-cutannée pour l’administration des traitements. Ces administrations seront réalisées sur des animaux vigiles contentionnés, et durera moins d’une minute par animal. Ces administrations seront réalisées au maximum une fois par jour, de J-7 à J+35. L’ensemble des animaux de cette étude (384 animaux) seront évalués par un score neurologique basé sur l’évaluation de la démbulation spontannée de l’animal dans sa cage. Cette évaluation ainsi que leur pesée seront faites quotidiennement à partir du lendemain de l’induction du modèle, jusqu’au jour de mise à mort. Enfin, à J+35, les animaux seront soumis à une laparo-thoracotomie pour accéder au cœur et faciliter le prélèvement sanguin par ponction cardiaque. Viendra ensuite soit une perfusion transcardiaque permettant la fixation du cerveau avant son prélèvement soit un prélèvement du cerveau frais. La durée de cette intervention sera comprise entre 10 et 15 minutes pour la perfusion puis 10 minutes pour les différents prélèvements.
Impact sur les animaux
Le modèle, par définition, reproduit les effets de la SEP à savoir : démyélinisation et dégérescence axonale entrainant des déficits moteurs. Pour induire ce modèle, une administration sous-cutannée d’adjuvent de Freund est réalisée. Ce composé peut induire des irritations cutannées temporaires. L’évolution du modèle peut aller jusqu’à une paralysie des membres postérieurs de l’animal pendant plusieurs jours (moins de 5 jours) avec une récupération partielle dans les jours suivants. Les animaux ayant atteint ce stade d’évolution de la pathologie sont toujours capables de se déplacer librement dans leur environnement. Cependant la prise de nourriture est impossible dans ces conditions, d’où l’ajout de croquettes directement au sol de la cage des animaux. De plus une attention particulière est portée sur l’évolution de leur poids et l’hydratation des animaux.
Devenir
A la fin du projet, tous les animaux seront mis à mort permettant le prélèvement du cerveau et de la moelle épinière post fixation pour analyse.
Remplacement
Ce projet correspond aux étapes des tests d’innocuité et d’efficacité de thérapeutiques in vivo faisant suite aux nombreuses expérimentations et validations réalisées in vitro par les industriels financeurs. Actuellement il n’existe aucune méthode alternative à l’expérimentation animale nous permettant d’obtenir le même niveau d’information obtenue avec l’expérimentation animale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons dans la littérature et au sein de notre laboratoire font de la souris le modèle préférentiel pour mener à bien ce projet. En effet, mus musculus est l’une des espèces animales la plus étudiée dans le domaine de l’AVC hémorragique, permettant une analyse comparative et critique des résultats obtenus.
Réduction
Les données extraites de la littérature scientifique préclinique, combinées à une étude de détermination de la puissance statistique régulièrement mise à jour avec nos données (α=0.05 ; β=0.8) permettent de définir un nombre minimal d’animaux de 20 par groupes dans nos conditions protocolaires. Cette approche nous offre la capacité de visualiser des différences réelles de manière statistiquement significative entre les groupes étudiés. Afin d’anticiper les exclusions d’animaux dues à de la mortalité ou l’atteinte des points limites, l’augmentation de l’effectif de 24 par groupes expérimentaux est obligatoire pour atteindre un effectif final satisfaisant de 20 animaux par groupe. Ainsi, nous parvenons à concilier l'efficacité de notre projet avec sa valeur scientifique, conformément aux principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche Maintenir cette marge de sécurité contribue à assurer la validité scientifique de notre projet tout en respectant les normes éthiques et les principes de réduction du nombre d'animaux utilisés en recherche.
Raffinement
Les animaux sont hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE) et isolés de tous bruits extérieurs. Les souris seront en groupes sociaux avec plusieurs enrichissements (coton et demi-sphère de cellulose), auront de la nourriture et de l’eau ad libitum pendant toute la durée du projet. Leur bien-être sera suivi bi-quotidiennement par du personnel qualifié 5j/7 et quotidiennement pendant les week-ends et jours fériés. Durant toute la durée de l’étude, les animaux seront également pesés quotidiennement à partir du jour d’induction du modèle. Pendant l’induction du modèle, chaque animal sera sous anesthésie qui sera maintenue jusqu’au réveil de l’animal. Les animaux bénéficieront d’une couverture analgésique. Lors de la phase de réveil, les animaux sont replacés dans leur cage. Un arbre décisionnel basé sur une grille de score et l’utilisation de points limites adaptés permettra l’amélioration du bien-être animal par la réhydratation des animaux ou l’utilisation d’analgésiques. La mise en place de critères d’arrêts de la souffrance permettra de décider de la mise à mort d’un animal. Pour cela, une surveillance stricte des souris sera réalisée quotidiennement jusqu’à l’euthanasie de l’animal.
Choix des espèces
Le nombre total d’animaux nécessaire sera de 384 souris. Conformément à la règle des 3Rs, nous avons réduit au maximum le nombre d’animaux nécessaire au projet. Ce nombre maximal d’animaux nous permettra de déceler des différences significatives entre nos groupes expérimentaux sur les différents paramètres étudiés. Ainsi, nous concilions le nombre d'animaux utilisés pour notre projet et sa valeur scientifique. Le nombre d’animaux pour cette étude a donc été défini à partir d’une analyse de puissance et des données existantes dans la littérature (voir 3.3.6.2. Réduction).
Effets de la stimulation transcrânienne sur l’activation du système nerveux central selon le sexe et le cycle hormonal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Huit heures d'enregistrement sous anesthésie profonde, après une trachéotomie, la canulation de la carotide et de la jugulaire et l'ouverture du crâne, sans réveil prévu. 144 rats vont être utilisés, 128 dans des procédures menées sous anesthésie et tués avant tout réveil, 16 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère dont une ovariectomie de dix minutes. L'objet est de comparer, selon le sexe et le stade du cycle hormonal, l'effet d'une stimulation électrique du crâne sur les neurones qui transmettent la douleur de la face et des méninges, le cycle des femelles étant vérifié par frottis sous anesthésie. Le porteur retient le rat Sprague Dawley parce que le laboratoire l'utilise depuis des années et parce que d'autres études sur le sujet ont employé la même souche.
Objectifs
La migraine, caractérisée par des céphalées récurrentes, touche environ 15 % de la population et principalement les femmes. Les approches de neurostimulation telle que la stimulation transcrânienne à courant continu du cortex moteur représente une stratégie thérapeutique prometteuse, mais peu de chose sont connu sur l'effet bénéfique de cette stimulation sur la migraine et sur les mécanismes sous-jacents à cet effet. Nous avons précédemment montré dans notre modèle animal de migraine (induite par une inflammation des méninges) que les mâles et les femelles à différent cycle hormonal i) avaient une douleur migraineuse d'intensité différente et ii) activaient différemment les neurones du complexe sensitif du trijumeau. Certains de ces neurones reçoivent les informations sensorielles issues de la face et des méninges et sont impliqués dans les voies de la douleur. L’objectif général du projet sera d’étudier l’hypothèse selon laquelle l’efficacité thérapeutique de la stimulation transcrânienne est différente selon le sexe et le cycle hormonal des femelles et de déterminer les mécanismes cellulaires associés. Ce projet comportera 3 objectifs. Tout d’abord, les études sur l’efficacité de la stimulation sont très peu comparables entre elles à cause des différents protocoles utilisés. Le premier objectif consistera donc à déterminer in vivo chez le rat mâle anesthésié les paramètres de stimulation les plus efficaces pour inhiber l'activité des neurones du complexe sensitif du trijumeau. Pour ce faire, des enregistrements des neurones chez les rats anesthésiés seront réalisés. Le second objectif sera d’étudier l’efficacité de la stimulation chez les femelles à différent cycle hormonal et comparer avec les femelles ovariectomisées. Enfin, les mécanismes cellulaires liés à l’effet de la stimulation transcrânienne au niveau des neurones du complexe sensitif du trijumeau étant peu connus, le dernier objectif sera d’étudier ces mécanismes en réalisant des expériences ex vivo.
Bénéfices attendus
En plus de la mise au point d’un protocole de stimulation transcrânienne efficace, ce projet nous permettra de savoir si la stimulation a un effet différent selon le sexe et le cycle hormonal des femelles (à différentes phases du cycle hormonal et chez les femelles ovariectomisées) en condition physiologique. Cette étude nous permettra plus tard d'utiliser le protocole de stimulation dans différents modèles de douleur trigéminale et migraineuse et d’étudier leur efficacité en condition pathologique.
Procédures
Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales. Un groupe d'animaux subiront une ovariectomie. L'opération durera 10 minutes sous anesthésie générale. Les expérimentations d’électrophysiologie in vivo sont prévues sur une durée maximale de 8 heures sous anethésie générale profonde sans réveil. La chirurgie inclut une trachéotomie, une canulation de la carotide, une canulation de la jugulaire, une craniotomie, et l’exposition de la région d'enregistrement.
Impact sur les animaux
Certains animaux vont subir une ovariectomie sous anesthésie gazeuse. Nous nous attendons au développement d’une douleur suite à la chirurgie. Les animaux auront des injections d’antidouleur. Ces injections pourront induire un stress.
Devenir
La procédure d'électrophysiologie ne permet pas de réutiliser les animaux. En effet, les animaux seront mis à mort à la fin de la procédure.
Remplacement
Aucune méthode alternative ne permet de remplacer ce protocole. En effet il est fondamental de réaliser des études in vivo, car l’intégration de la douleur implique de nombreuses régions du système nerveux central et périphérique simultanément. L’étude sur l’animal permet également de conserver son état hormonal physiologique. Il n'existe pas dans la littérature de méthode alternative pouvant répondre à l'efficacité d'une stratégie à potentiel thérapeutique anti douloureux. Un animal entier avec un système nerveux intégré, même sous anesthésie, est un préalable à une étude pertinente dans le domaine de la douleur. Des études électrophysiologiques chez l’animal vivant sous anesthésie est un moyen de réduire la souffrance et de définir de façon reproductible, l'efficacité des différents protocoles de stimulation sur l’activité des neurones.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au maximum. Le nombre d'animaux a été déterminé par une approche statistique. Huit animaux par groupe est le nombre d'animaux nécessaire pour permettre de mettre en évidence une différence statistique entre eux. Pour les expériences in vivo, chaque animal sera son propre contrôle. Une analyse de variance à une voie suivie d'un test post-hoc seront réalisés. Dans le cas d'une distribution normale, un test paramétrique sera effectué et dans le cas d'une distribution non gaussienne un test non paramétrique de type Mann Whitney sera réalisé.
Raffinement
Les rats bénéficieront d’un enrichissement environnemental avec des rouleaux qui seront positionnés dans les cages. Des visites seront réalisées au moins 2 fois par jour et toute observation de signes (points limites) tels que manque de toilettage, piloérection, altération de la posture normale (difficulté à se déplacer, se relever ou se nourrir), déshydratation, température corporelle anormale, agressivité (impossibilité pour la manipulation), vocalisations spontanées, perte de plus de 15% de son poids dans la semaine qui suit l’ovariectomie, s'il a de grosses difficultés à se déplacer, à relever pour se nourrir, si l'animal présente des tumeurs et/ou de lésions sur la peau (sur la face, les yeux et/ou la queue), nous mettrons fin à l’expérimentation pour ces animaux par une mise à mort. Dans le cas des femelles, les cycles hormonaux seront vérifiés avant la procédure électrophysiologique par la réalisation de frottis chez l'animal anesthésié. Lors de l'enregistrement électrophysiologique in vivo chez l’animal anesthésié, tous les paramètres dits limitants seront évalués (température, pression artérielle, rythme respiratoire). Si une altération durable et irréversible de ces paramètres apparait, les expériences seront interrompues par une mise à mort.
Choix des espèces
Le rat, en particulier la souche Sprague Dawley, est couramment utilisée au sein du laboratoire depuis de nombreuses années et dans les études précédentes sur le sujet dans d’autres laboratoires. C’est par ailleurs un des modèles les plus utilisés pour les études comportementales et électrophysiologiques dans le domaine de la douleur. Nous utiliserons des animaux entre 8-12 semaines. Des animaux adultes sexuellement matures sont requis pour étudier l'influence du cycle hormonal.
Etude de la composition lipidique membranaire et de son impact sur la diffusion et l’accumulation de la production de protéines amyloïdes
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une canule est enfoncée dans le cerveau pour y injecter des fibrilles de protéines, au cours d'une intervention de trente minutes sous anesthésie, suivie d'injections répétées pendant soixante-douze heures. 1 152 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées pour des analyses histologiques et biochimiques. Le porteur en attend le rôle des lipides membranaires dans l'accumulation des protéines amyloïdes des maladies d'Alzheimer et de Parkinson, et décrit une activité locomotrice modifiée et un état d'anxiété altéré dont il affirme qu'ils n'ont aucun impact sur la santé des souris. Sept tests comportementaux sont annoncés, de trois à six minutes chacun, sans qu'aucun soit nommé.
Objectifs
Les maladies d'Alzheimer et de Parkinson se caractérisent par l'accumulation d'agrégats protéiques dans le cerveau. Dans des conditions normales, les protéines qui composent les agrégats sont fortement associées à la membrane cellulaire pour remplir leurs fonctions. Nous visons ici à comprendre le rôle des lipides – principaux composants membranaires – dans le traitement, la propagation et l’accumulation des protéines amyloïdes dans le cerveau. Nous émettons l'hypothèse qu'une composition altérée de la membrane lipidique pourrait favoriser ou arrêter la génération et la propagation des protéines amyloïdes.
Bénéfices attendus
La recherche dans le domaine neurodégénératif s'est concentrée sur la biologie des protéines au cours des 30 dernières années, et pourtant de nombreuses informations manquent. Récemment, les lipides et les enzymes impliqués dans le métabolisme lipidique ont été mis à l'honneur dans la recherche sur la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Ainsi, avec ce projet, nous créerons de nouvelles connaissances dans ce domaine encore peu étudié, améliorant ainsi notre compréhension de la pathogenèse de la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les animaux ne subiront qu'une seule intervention chirurgicale. L'intervention chirurgicale unique dure au maximum 30 minutes sous anesthésie et analgésie précédée et suivie d'injections intrapéritonéales et sous-cutanées répétées sur 72 heures. Durant l'intervention chirurgicale l'injection intracérébrale durera 5 minutes (3 minutes d'injection et 2 minutes en laissant la canule en place pour permettre la pénétration de la solution injectée). Sept tests comportementaux seront réalisés (durée de 3-6 minutes pour chaque test).
Impact sur les animaux
Au cours de nos expériences les animaux pourront subir quelques effets indésirables suite à la chirurgie sous anesthésie générale et analgésie. Les chirurgies pourraient générer un stress, une douleur modérée et de l’inconfort. Cependant, tous les moyens seront mis en place pour éviter toute douleur à la suite des chirurgies. Les animaux peuvent présenter également des changements subtils dans leur comportement, tels qu'une activité locomotrice différente et un état d'anxiété modifié. Ces changements n’ont aucun impact sur leur santé.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques et biochimiques.
Remplacement
Pour étudier les maladies neurodégénératives nous avons encore besoin d’utiliser un modèle vivant assez proche de l’être humain et utilisable facilement en laboratoire. Les meilleurs modèles de maladies neurodégénératives qui ont été caractérisés restent des lignées transgéniques de souris. Pour étudier le métabolisme des lipides, les modèles génétiques ont également été établis chez la souris. La combinaison de ces 2 conditions représente le modèle idéal pour étudier ces maladies neurodégénératives.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques. En effet, une recherche antérieure sur la maladie de Parkinson utilisant certaines souris nous a permis d'effectuer une analyse et d'estimer la taille minimale des cohortes à analyser. La même recherche nous a permis de détecter un taux d'échec maximum de 10 % suite à des interventions chirurgicales. Pour les collectes de tissus, sur la base d'une comparaison de 2 groupes indépendants, et en prenant en compte cette perte potentielle de 10% ainsi que des effets techniques pouvant représenter jusqu'à 10% de la variabilité, nous avons déterminé qu'un effet différentiel pourra être détecté avec un effectif de 16 animaux par groupe (8 mâles et 8 femelles). Après les tests comportementaux, les individus seront considérés pour la collecte de tissus, pour détecter aussi un effet.
Raffinement
Tous les efforts seront mis en place pour réduire le plus possible toute douleur, souffrance et angoisse de l’animal. Pour cela, des points limites précoces et spécifiques seront bien définis et mis en place. Selon les signes cliniques présentés par les animaux, nous pourrons notamment avoir recours à : un complément alimentaire hautement calorique, chauffage des cages, réhydratation sous cutanée renforcement d’enrichissement des cages. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Si le point limites sont atteint les animaux sont mis a mort. Durant la chirurgie, des anesthésiques et antalgiques seront utilisés, ainsi que des antalgiques de nouveau en post-chirurgie. Tout ceci est indispensable pour le bien-être de l’animal ainsi que pour la validité des résultats.
Choix des espèces
Nos questions biologiques nécessitent d’induire des modifications génétiques. De nombreux outils de manipulation génétique sont disponibles chez la souris, ce qui en fait un modèle animal de choix pour notre projet. De plus, l’organisation du cerveau de souris présente des similarités avec le cerveau humain, ce qui en fait un bon modèle pour étudier les maladies neurodégénératives. Des travaux ont notamment démontré que la souris est un modèle d’étude valide pour étudier les maladies neurodégénératives. Dans ce projet, nous utiliserons des souris non modifiées et des souris transgéniques permettant de vérifier le rôle des lipides dans la biogenèse, l’accumulation et la propagation des protéines à l’origine de maladies neurodégénératives. Étant donné que les maladies neurodégénératives affectent le cerveau adulte, nous utiliserons des souris adultes tout au long de l’étude. Le groupe expérimental de souris sera donc composé de compagnons de portée âgés de 8 à 12 semaines. Cet âge permettra le double objectif d'analyser le cerveau adulte, mais permettra en même temps l'analyse des stades avancés de la pathologie (3 mois post-opératoires) sans aucun effet secondaire lié à l'âge, qui pourrait perturber les résultats obtenus. En effet, même si certains groupes seront évalués des mois après l'administration des fibrilles, les analyses seront réalisées à un stade où les souris ne sont pas encore trop âgées. Celui-ci vise à prévenir les décès naturels liés au vieillissement avant la conclusion de leur suivi expérimental.
Production de souris bigéniques SOD1*VGLUT1-Venus
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Croiser deux lignées pour faire naître des souris qui développent une sclérose latérale amyotrophique et dont certains neurones sont fluorescents conduit à utiliser 1 052 souris, dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées. 1 004 d'entre elles atteignent un stade précoce de la maladie et 48 un stade avancé, avec un déficit moteur des pattes arrière puis des pattes avant. Les mises à mort sont fixées à 50, 75 et 110 jours d'âge, selon l'étape de la maladie visée pour le prélèvement de tissus. Aucune analgésie n'est prévue, le porteur affirmant que la dégénérescence des motoneurones ne provoque pas de douleur mais une paralysie, alors que sa propre grille déclenche l'apport de nourriture humidifiée dès les tremblements des pattes postérieures.
Objectifs
Dans le cadre d’un projet de collaboration entre laboratoire, trois équipes collaborent afin d’explorer les caractéristiques de certaines altérations présentent à des stades précoces de trois maladies neurodégénératives (Alzheimer - AD, Parkinson - PD, sclérose latérale amyotrophique - SLA), afin de découvrir de nouveaux biomarqueurs communs. Pour la maladie SLA, il existe un modèle murin dont les symptômes sont similaires à ceux des humains : la souris SOD. Nous prévoyons donc de croiser ces souris avec d’autres ayant la capacité de marquer certains types de neurones du cerveau. Grâce à ce croisement, nous serons à même de pouvoir faire des prélèvements de tissu des structure cible et ainsi espérer identifier ces biomarqueurs.
Bénéfices attendus
Le projet permettra d'obtenir afin de découvrir de nouveaux biomarqueurs précoces communs aux maladies neurodégénératives sclérose latérale amyotrophique (SLA), Alzheimer (AD) et Parkinson (PD).
Procédures
205 animaux (P1) et 799 animaux (P2) développeront un stade précoce de la maladie SLA (sclérose latérale amyotrophique), soit 1004 animaux. 48 développeront des symptômes plus avancés de la maladie : déficit moteur des pattes arrière puis avant de l'animal.
Impact sur les animaux
La moitié des animaux produit porteront le trangène SOD. Cette mutation portée par les animaux est similaire à celle décrite chez certains patients atteints de la maladie SLA. Ces animaux vont présenter des altérations motrices à partir d'environ 4 mois d'âge.
Devenir
La maladie est incurable tant pour les humains que pour les animaux. Il n'est donc pas possible de les maintenir en vie. Les animaux seront donc euthanasiés.
Remplacement
Il n’existe actuellement pas de méthode alternative permettant de remplacer l’utilisation de souris car ce projet repose sur l’évolution de la sclérose latérale amyotrophique. Les mécanismes de cette maladie ne sont pas encore suffissamment connus pour permettre une modelisation in silico.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés à chaque temps a été déterminé selon des travaux antérieurs déjà publié. Ce nombre a été réduit au minimum afin de pouvoir produire suffissamment de tissus ex vivo pour la suite de l'expérimentation.
Raffinement
La lignée murine élevée dans ce projet est bien connue et dispose d’une feuille de scoring adaptée afin d’éviter toute souffrance aux animaux. Dès le score 1 (Tremblement des pattes postérieures lors de la suspension. Faiblesse dans l’extension des pattes arrière), de la nourriture humidifiée et des tétines longues seront proposées pour pallier au déficit moteur que peuvent rencontrer les animaux. La grosse majorité des animaux sera utilisée avant tous développement de la maladie. Aucune analgésie n’est utilisée lors du développement de la maladie car celle-ci n'engendre pas de douleur mais une paralysie liée à la dégénérescence des motoneurones, et car aucun acte invasif ne sera réalisé sur ces animaux. Pour un meilleur bien-être des animaux, les cages seront enrichies de matériel de nidification et de dispositif leur permettant de se cacher de leurs congénères.
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. Cette connaissance a conduit à la création de nombre de modèle murin obtenu à l'aide d'outil génétique. Le choix de l'espèce est lié au fait que le modèle murin de la Sclérose Latérale Amyotrophique n'existe que chez la souris, tout comme le modèle de souris aux neurones glutamate fluorescents. Enfin, le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Les âges d'euthanasies des animaux sont fixés selon les étapes de developpement de la maladie ALS : 50 jours d'âge, 75 jours et 110 jours.
Evaluation d’agonistes inverses du GPER dans la douleur cancéreuse
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
152 souris vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère, 104 d'entre elles passant sur la table d'opération pour qu'on leur implante des cellules cancéreuses, puis sous anesthésie deux fois par semaine pendant trois semaines pour mesurer la bioluminescence de leurs tumeurs. Une neuropathie douloureuse leur est provoquée par injection d'un anticancéreux, puis évaluée en appliquant des filaments sur la patte de l'animal vigile. Le porteur écrit que la neuropathie et les métastases osseuses constituent des atteintes irréversibles, mais "indispensable" à la conduite de l'étude, et toutes les souris sont mises à mort pour cette raison. Il annonce un antalgique et antitumoral à breveter, sur un marché qu'il désigne comme principalement celui des cancers du sein triple négatif.
Objectifs
Le cancer du sein triple négatif présente un taux de survie à 5 ans de 77% qui chute à 11% si métastases. Les douleurs associées à ce type de cancer sont de deux types : les douleurs neuropathiques périphériques induites par la chimiothérapie et les douleurs métastatiques. Nous avons montré que le récepteur GPER (pour G protein-coupled estrogen receptor), était impliqué dans le cancer et la douleur. Sur la base de ces résultats, nous émettons l’hypothèse que des molécules modulant le récepteur GPER pourraient améliorer le cancer triple négatif et les douleurs associées. Pour ceci, de telles molécules seront synthétisées. Après plusieurs étapes de screening in vitro, les meilleurs ligands (10 molécules maximum) seront alors évalués par nos soins (objet de cette procédure APAFIS) sur la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies grâce à l’utilisation d’un modèle murin. Le ligand présentant la meilleure efficacité sera alors évalué sur : (1) le développement de la tumeur, (2) la douleur neuropathique induite par les chimiothérapies et (3) la douleur métastasique grâce à l’utilisation de modèles murins. Le projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Le produit attendu est un nouvel antalgique et antitumoral permettant de lutter contre la progression tumorale ainsi que les symptômes neuropathiques, tels que les douleurs induites par certaines chimiothérapies, mais aussi prévenant (lorsqu’il sera co-administré avec les chimiothérapies) l’apparition de neuropathies pour lesquelles il n’existe aucun traitement efficace. L’utilisation d’animaux est indispensable dans ce contexte d’interaction entre système nerveux, tumeur, dissémination sanguine et système immunitaire. Ces travaux compileront les bases nécessaires au dépôt de brevet de molécule dans le but de passer ensuite à des études chez l’Homme. Le marché visé est principalement celui des cancers du sein triple négatif, permettant d’améliorer non seulement le pronostic vital de nombreuses patientes, mais aussi leur qualité de vie.
Procédures
*L’ensemble des animaux subiront des injections pour administrer l’anticancéreux responsable de la mise en place du modèle et des composés à tester. La piqure d'aiguille pour l’injection est réalisée en quelque secondes sur animal vigil. *L’application de filaments au niveau de la patte de l’animal vigile pendant quelques secondes sera réalisée afin d’évaluer la douleur. *104 animaux subiront une chirurgie sous anesthésie générale pour l'implantation des cellules cancéreuses qui durera environ 5 minutes par animal. *La mesure de la bioluminescence (durée : 5 min par animal) sera réalisée 2 fois par semaines pendant 3 semaines sous anesthésie générale. *Toutes les interventions sont réalisées à l’établissement utilisateur EU1 à l’exception de la mesure de la bioluminescence qui sera effectuée à l’EU2.
Impact sur les animaux
L’induction de la neuropathie chimio-induite (CIPN) ainsi que de tumeur chez l’animal seront des nuisances à part entière et irréversibles, mais indispensable à la conduite de l’étude. La CIPN ainsi que les métastases osseuses seront associées à des désordres douloureux qui seront évalués dans le cadre du projet. Elle sera aussi responsable d’une diminution du gain de poids des animaux. Le poids des animaux sera suivi régulièrement. Une application de quelques secondes de filament au cours du test de von Frey est susceptible d’induire chez l’animal une douleur légère.
Devenir
L'ensemble des animaux sera mis à mort puisque la souffrance de l’animal est irréversible.
Remplacement
Plusieurs étapes de screening réalisées en amont des expériences demandés dans cette procédure seront effectués afin de réduire le nombre de molécules à évaluer et donc le nombre d’animaux. En effet, l’ensemble des molécules designées ou synthétisées subiront : - un screening in silico des dérivés (seules les molécules se fixant sur le GPER seront retenues) - un screening in vitro des dérivés (seules les molécules présentant une action agoniste inverse sur le GPER et une action antiproliférative sur cellules TNBC seront retenues). S'agissant d'étude sur la douleur, l'animal vivant est nécessaire pour explorer et évaluer les troubles nociceptifs par le biais de tests comportementaux. Ce type d'étude sur modèle animal de CIPN et de métastases osseuses n'est pour le moment pas encore remplaçable par des modèles in vitro. S'agissant d'étude sur la croissance tumorale, un screening des composés et une étude de l’interaction de ces composés avec le paclitaxel in vitro sera réalisé préalablement au passage chez l’animal. Ces approches alternatives ne permettent pas de prendre en compte l’organisme vivant dans sa totalité et ne peuvent, à l’heure actuelle, se substituer à l’utilisation de modèles animaux. En effet, les modèles animaux vivant sont, dans les derniers stades d’études, nécessaire pour explorer et évaluer l’effet antitumoral, que ce soit la dissémination de métastases dans la circulation sanguine, mais aussi l’impact du système immunitaire, par le biais d’imagerie. Ce type d'étude sur modèle animal de métastases osseuses est donc pour le moment nécessaire avant le passage en phase clinique chez l’Homme.
Réduction
*Ces travaux seront précédés par des études in vitro permettant de sélectionner les molécules les plus prometteuses à des doses adaptées. *Une forte expertise du laboratoire s’étendant sur plusieurs années d’expériences concernant les tests comportementaux et modèles animaux permet d’affiner le nombre d’animaux. *De plus le nombre d’animaux de ce projet a été défini de façon à utiliser le minimum d’animaux tout en obtenant des données statistiquement suffisantes. *La PROCEDURE 1 est une étape de GoNoGo, c’est-à-dire que si les résultats de celle-ci sont négatifs (pas d’effet antalgique de chaque composés) alors l’étude s’arrête et les procédures suivantes ne seront pas réalisées. *Toutes les procédures seront réalisées sur des groupes randomisés avec un groupe témoins négatif (recevant du véhicule ou une chirurgie factice), et menées en aveugle. *L’ensemble des résultats, y compris négatifs, feront l’objet d’une publication afin d’éviter la reproduction d’expérience.
Raffinement
Des méthodes de raffinements sont utilisées afin d'augmenter au maximum le bien-être des animaux inclus dans ce projet, pour cela les conditions d'hébergement seront optimales (température, hygrométrie, luminosité). Le nombre d’animaux est adapté à la taille de la cage et en adéquation avec la règlementation . De plus, le milieu est enrichi par du matériel de nidification (coton), un abri (dôme carton) et des matériaux à ronger (bois tendre). L’hébergement en groupe est maintenu pour le bien-être animal. Une surveillance des conflits sera réalisée. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée par le personnel de l’animalerie qui est sensibilisé aux différents modèles. Les expérimentateurs sont tous titulaires du niveau « concepteur et réalisateur de projet » ainsi que de la formation de chirurgie sur rongeurs. Après leur arrivée à l’animalerie, une période de repos d’une semaine est observée afin d’acclimater les animaux à leur nouvel environnement. Pour limiter l’anxiété des animaux, ils sont habitués à la contention dès leur arrivée à l’animalerie et à l’appareillage des tests comportementaux pendant 3 jours avant le test. De plus, le personnel de l’animalerie et les expérimentateurs utilisent dès que possible la technique du cupping pour limiter l’anxiété des souris lors du transfert des animaux. Des points limites ont été définis pour cette étude et seront mis en place. Ils sont suffisamment prédictifs et précoces pour limiter la douleur à son minimum. Le transport des animaux entre l’animalerie (EU1) et le centre d’imagerie (EU2), s’effectuera en voiture. Les animaux seront hébergés dans des boites opaques avec couvercle filtrant. Un document de transport (avis/accord du vétérinaire) accompagnera les animaux. Le transport sera conditionné à l’état des animaux et les conditions climatiques.
Choix des espèces
La souris est habituellement utilisée pour ces travaux portant sur les CIPN et la croissance tumorale. D’autres travails antérieurs de l’équipe sur cette thématique ont eu recours à la même espèce et souche, ce qui permet de bénéficier d’une expertise et de données antérieures ainsi que du modèle de neuropathie chimio-induite (choix des doses et du temps de traitement). Enfin, la souris possède une activité et un comportement spontanée tout à fait adaptés à l’étude de la douleur au travers de tests comportementaux permettant de confirmer l’induction de la neuropathie et le développement tumoral. Les animaux auront 8 semaines à la réception à l'animalerie, et ils auront 1 semaine d'acclimatation, pour avoir un âge d’environ 9 semaines au début des expérimentations. L’âge de 9 semaines est communément choisi pour ce type de projet.
Etude du rôle de d’une protéine d’intérêt dans un modèle de souris de la maladie d’Alzheimer (2/2)
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Quatre tests comportementaux d'une semaine chacun, séparés par une semaine de repos, attendent les souris adultes de ce projet. 804 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures d'un niveau de souffrance léger à modéré, les nouveau-nés subissant d'abord une contention d'une minute pour une biopsie de la queue. L'objet déclaré est de mesurer le rôle d'une protéine dans le développement de la maladie d'Alzheimer, les tests étant censés évaluer les capacités mémorielles, sans que le porteur précise lesquels sont employés. Le choix de la souris tient à la disponibilité commerciale de lignées transgéniques d'Alzheimer, aux outils déjà validés chez cette espèce et à une durée de vie que le porteur juge adaptée au projet.
Objectifs
L'objectif principal de ce projet est d'étudier le rôle d'une protéine d'intérêt dans le développement et la progression de la maladie d'alzheimer. Le projet se deroulera dans deux établissements utilisateurs notés EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Ce projet pourrait conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventives pour ralentir et/ou limiter le développement de la maladie d'Alzheimer.
Procédures
Les nouveau-nés subiront une contention d'une minute pendant laquelle une biopsie de queue sera prélevée. Les animaux adultes seront soumis à quatres tests comportementaux qui durent chacun environ 1 semaines. Les animaux seront mis au repos pendant une semaine entre chaque test. Ces tests permettent de mesurer les capacités mémorielles des animaux et seront réalisés dans l'EU2. Les élevages se dérouleront dans l'EU1.
Impact sur les animaux
Les animaux pourront développer une légère douleur lors des biopsies pour le génotypage et des effets indésirables au cours des contraintes liées aux test comportementaux. Ces effets indésirables seront de l'ordre de l'angoisse et du stress de courte durée lorsque les animaux seront placés dans des environnements différents et multiples pour les tests comportementaux. Des effets indésirables liés aux troubles cognitifs se développant à partir de 4 mois peuvent aussi apparaitre.
Devenir
Les animaux sans génotypes d’intérêt pour le projet sont mis à mort. Les animaux ayant les bons génotypes seront mis à mort après les tests comportementaux, à l'age de 8 mois au plus tard, pour éviter les souffrances liées à leur phénotype dommageable exprimé à partir de 12 mois.
Remplacement
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence le rôle d'une protéine inhibitrice de protéase dans un modèle expérimental de la maladie d'Alzheimer. Le projet met en jeu des explorations comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Pour respecter le principe de réduction, le nombre de souris utilisées sera réduit à son minimum (analyses de paramètre multiples pour chaque souris et utilisation de tests statistiques adaptés). L’étude sera arrêtée si les expérimentations initiales invalident l’hypothèse de travail. Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Un nombre minimal et homogène d’animaux par étude est utilisé afin d’exploiter de façon rigoureuse et efficace les résultats des expériences et afin d’avoir un nombre d’animaux suffisant pour réaliser une analyse statistique. Des tests statistiques précis permettront de s'assurer de la significativité des résultats et un calcul de puissance a permis de dimensionner les groupes expérimentaux.
Raffinement
Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cage groupées dans un milieu enrichi. L’enrichissement social des souris sera garanti en évitant tout isolement prolongé durant les biopsies pour génotypage et les phases d'expérimentation. Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Durant le transfert des animaux entre les deux EU, les animaux seront transportés dans des boites de transports du type safebox contenant litière et enrichissement, elles-mêmes placées dans des sacs opaques à la lumière pour limiter le stress des animaux.
Choix des espèces
Les tests de comportement étant la méthode de choix pour tester l'efficacité d'une voie thérapeutique dans la maladie d'Alzheimer, nous avons besoin d'utiliser un organisme vertébré pour nos expériences in vivo. Le modèle souris est un bon modèle pour les raisons suivantes : - Plusieurs lignées transgéniques murines modélisant la maladie d'Alzheimer existent et sont disponibles commercialement. - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris (sondes pour hybridation in situ, immunohistologie, tests comportementaux). - La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet. Les souris adultes agées de 6 mois seront utilisées. A cet âge, les souris ont des défauts cognitifs détectables par des tests comportementaux et qui seront eventuellement modulés par l'absence ou la surexpression de notre protéine d'intérêt.
Utiliser la pharmacothérapie pour prévenir et traiter les Neurofibromes cutanés dans le modèle murin de neurofibromatose de type 1
- Recherche appliquée
- Cancers
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
Gavées ou injectées deux fois par jour, cinq jours par semaine pendant un mois, puis rasées et épilées à la cire sous anesthésie, 148 souris porteuses de neurofibromes cutanés vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont isolées pendant toute la durée du traitement, ce que le porteur reconnaît comme une source de stress à gérer. Il écrit par ailleurs qu'aucune des procédures n'est douloureuse et que les tumeurs de son modèle sont plates, petites et indolores, tout en décrivant des irritations cutanées après l'épilation et des douleurs ponctuelles aux sites d'injection. Quatre des cinq composés testés l'ont déjà été sur le même modèle lors d'une étude précédente, et la peau du dos de chaque souris est prélevée après la mise à mort.
Objectifs
La neurofibromatose de type I est une maladie génétique qui touche environ 1 million des personnes dans le monde. Elle se caractérise par l'apparition de tumeurs bénignes appelées neurofibromes cutanés et dont le nombre peux atteindre des milliers. Ces tumeurs, en plus d’être esthétiquement dommageables, peuvent causer des démangeaisons et des douleurs impactant sévèrement sur la qualité de vie du patient. Nous avons conçu le modèle murin de NF1 (Nf1-KO) qui recapitule le développement des NFc. Ce modèle est utilisé pour décoder les mécanismes qui gouvernent le développement des NFc et pour l’élaboration des pharmacothérapies pour leur traitement. L'objectif de ce projet est de tester l'efficacité de 5 composés à prévenir ou faire régresser les NFc dans ce modèle. 4 d’entre elles ont déjà été testé lors de l’étude précédente au moyen du même modèle. Les nouveaux essais avec des molécules utilisées précédemment visent à renforcer les résultats précédents, décoder leurs mécanismes d’action sur les cellules tumorales et le microenvironnement tumoral et d’évaluer leur efficacité pour prévenir le développement des NFc. L’efficacité du nouveau composé sera testée en utilisant le protocole curatif pour faire régresser les NFc déjà présents et matures. Les 4 procédures respectent des règles éthiques strictes pour garantir le bien-être des animaux, et l'étude a été validée par des comités scientifique de pilotage de ces projets.
Bénéfices attendus
Aujourd'hui, il n'existe aucun traitement efficace pour prévenir ou faire régresser ces tumeurs chez les patients NF1. La seule option consiste en leur exérèse chirurgicale, procédure utilisée quand le nombre des NFc est réduit. Ce projet vise à (i) évaluer l’efficacité de nouveaux composés, puis de comparer les résultats avec ceux obtenus avec d’autres molécules, (ii) décoder leur mécanismes d’action sur des cellules tumorales et leur environnement, (iii) identifier des éventuels effets indésirables et (iv) explorer les synergies entre les composées dans des cas d’utilisation des combinaisons des composés.
Procédures
Nous allons administrer des molécules en intrapéritonéales ou par gavage deux fois par jour sur 5 jours, pendant un mois. Cette procédure ne nécessite pas l'anesthésie des animaux. Il faut environ 1 min de contention par animal pour réaliser les administrations. Le rasage, épilation et la prise de photo de la peau du dos des souris se feront sous anesthésie générale pour une durée inférieur à 5 min par souris. Cette étape sera réalisée deux fois (avant et après le traitement), afin de pouvoir évaluer l’efficacité des molécules.
Impact sur les animaux
Les NFc présents dans notre modèle murin sont indolores, plates et de petite taille. Les travaux récents révèlent que chez les patients NF1, les NFc sont moins sensibles aux stimuli thermiques et mécaniques que la région adjacente dépourvu des tumeurs. Nous n’avons observé aucun phénotype dommageable chez des souris mutantes avant l’âge de 1 an. Malgré, l’aspect asymptomatique nous sommes à l’écoute du bien-être animal. Toutefois, des nuisances liées au stress des manipulations, aux contentions répétées des souris, à l’anesthésie générale sont également à prendre en compte. De plus certains des animaux seront traités par injection pendant 28 jours qui peut induire une douleur légère ponctuelle et locale au site d'injection. L’épilation à la cire avant et après le traitement (28 jours d'intervalles) peut également induire une légère irritation de la peau pendant quelques minutes et enfin, lorsque les souris seront gardées isolées durant la durée du traitement la gestion du stress est à prévoir.
Devenir
Pour l’ensemble des procédures décrites dans le projet, tous les animaux seront mis à mort à la fin des traitements, afin d’évaluer l’efficacité des molécules à faire régresser la croissance des tumeurs cutanées. Pour cela la peau du dos de chaque souris sera prélevée en vue de faire une analyse cellulaire et moléculaire et seront comparées au groupe contrôle qui n’a pas reçu les molécules.
Remplacement
A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, récapitulant le développement des NFc. Tous les précédents essais pharmacologiques ont été réalisé avec le même modèle animal et en utilisant la même procédure expérimentale nous permettant de comparer l’efficacité des composés entre eux.
Réduction
L’expertise acquise lors de précédents études nous ont permis d’optimiser et standardiser la procédure de traitement, de suivi et d’analyse post mortem des animaux réduisant ainsi considérablement le nombre d'animaux.
Raffinement
Aucune des procédures utilisées pour l’administration des molécules et suivi des animaux n’est douloureuse et ne nécessite l’utilisation des traitements anti-douleurs. Lors des épilations à la cire, les souris seront anesthésiées, rasées, épilées à l'aide de petites bandes de cire froide, puis de la vaseline sera appliquée sur la zone épilée pour réduire les irritations et rougeurs. Contrairement aux patients NF1, les souris Nf1- KO développent des NFc dont l’aspect est plat et la taille est réduite sans phénotype dommageable. Lors de l’anesthésie générale, pour éviter l’hypothermie, les souris seront maintenues sur un tapis chauffant. Leurs yeux seront également enduits d’une crème ophtalmique afin de prévenir un dessèchement de la cornée. Le personnel de l’animalerie a mis en place des conditions d'hébergement optimales et des stratégies de raffinement rigoureuses pour améliorer le bien-être des souris. Nous fournissons également des enrichissements environnementaux, pour favoriser les comportements naturels et réduire le stress. Lors des précédentes études nous n’avons observé aucun effet indésirable sur la perte du poids et le comportement des animaux. Néanmoins, les souris sont surveillées en se basant sur une grille d’évaluation du bien-être animal, avec l’utilisation de point limite, nous permettant en cas de signe persistant de plus de 24h de décider de l’arrêt du traitement avec la mise à mort des animaux. Enfin le personnel de l’animalerie nous informe quotidiennement et lors de leur visite les weekends de l’état de santé des souris.
Choix des espèces
Nous avons conçu un modèle murin de la Neurofibromatose de type 1 qui recapitule le développement des NFc. A notre connaissance, il n’existe aucun autre modèle animal, ni système in vitro, permettant d’étudier ces tumeurs et de réaliser des tests pharmacologiques. Pour ce projet nous utiliserons deux stades de développement des NFc en utilisant d'une part des males âgés d’un mois et demi (P45) pour les traitements préventifs correspondant à la phase de croissance et d'autre part en utilisant des mâles âgés 6 mois pour les traitements curatifs correspondant à la phase de stabilisation des NFc.
Traitement pharmacologique dans l’enfance du Syndrome du X Fragile chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Une injection quotidienne du cinquième au vingt et unième jour de vie, puis une injection de facteur inflammatoire dans une patte arrière: c'est le sort de chacune des 3 200 souris expérimentales de ce projet sur le syndrome de l'X fragile, auxquelles s'ajoutent 350 reproductrices amputées du bout de la queue pour génotypage. Toutes sont tuées à l'issue, 3 200 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et 350 un niveau léger. S'y ajoutent des tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique provoquant une douleur qui peut durer jusqu'à une heure, et 72 heures d'isolement visuel et olfactif pour mesurer l'activité jour-nuit. Le porteur prévoit de tuer sur le champ tout animal montrant paralysie, vocalisations ou convulsions, et explique qu'analgésiques et anesthésiques restent exclus d'un protocole dont la douleur est l'objet d'étude.
Objectifs
Le syndrome X fragile (FXS) est une maladie neurodéveloppementale, cause la plus fréquente (1/4 000 hommes et 1/7 000 femmes) de l'autisme avec retard mental héréditaire. Il est dû à une mutation sur le chromosome X qui entraîne l’absence de la protéine FMRP qui contrôle de nombreuses fonctions dont la quantité et la localisation de nombreuses protéines cellulaires dans les neurones. En clinique humaine, comme dans la souris génétiquement modifiée modèle de la pathologie, le FXS est associé à des troubles des comportements socio-cognitifs et sensori-moteurs, et à des défauts cellulaires de morphologie et de plasticité synaptique des neurones. Selon le génotype, on pourra distinguer des individus atteints (hommes et les femmes), mais aussi des femmes porteuses faiblement ou non symptomatiques. In vivo, l'inhibition pharmacologique d'enzymes particulières produit un phénomène de "sauvetage" des défauts sociaux-cognitifs des souris transgénique modèles de la pathologie humaine. Dans une perspective thérapeutique chez l'humain, ce projet a pour objectif de tester l'efficacité d'un traitement chronique précoce par des inhibiteurs pharmacologiques de ces enzymes dans l'enfance des souris modèle du FXS, sur les troubles sensori-moteurs caractéristiques de la pathologie et associés aux troubles socio-cognitifs. Quatre inhibiteurs seront testés, dont certains développés en collaboration, présentant des propriétés pharmacologiques différentes et ouvrant de nouvelles perspectives thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Sur le plan de la recherche fondamentale, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les mécanismes neuronaux moléculaires et les voies de transduction dans les fonctions sensorielles et sensori-motrices. Sur le plan de la recherche appliquée et clinique, les résultats attendus permettront de mieux comprendre les symptômes associés au syndrome X Fragile et de proposer une nouvelle cibles thérapeutiques. Avant de proposer de tester de nouveaux composés chez l'homme, il faut en valider les effets sur un modèle de souris génétiquement modifié qui reproduit fidèlement les symptômes comportementaux et neuro-anatomiques des individus atteints de FXS.
Procédures
Les souris reproductrices (350 souris) subiront une ablation du bout de queue pour génotypage. Toutes les souris expérimentales (3200 souris) subiront un traitement chronique P5-P21 (de 5 à 21 jours après la naissance) par injection quotidienne (30 sec /souris/jour pendant 15 jours), ainsi qu'un prélèvement sanguin par veine caudale sous contention (5 min), une injection intraplantaire (30") dans une patte arrière et pour la moitié une anesthésie chimique (5 min), un prélèvement sanguin sous anesthésie (1 min) avant euthanasie (5 min), alors que l'autre moitié subira une anesthésie gazeuse avant euthanasie (5 min).
Impact sur les animaux
Bien que rares, des inflammations ou infections pourront se développer aux points de prélèvements (queue) et d’injections. Le traitement chronique sur les souriceaux (P5-P21) peut entrainer une dégradation de l'état général qui constituera un point limite. Les gestes de contention et les tests d'interaction sociale, les tests sensori-moteurs et les tests de sensibilité cutanée mécanique et thermique non invasifs peuvent induire du stress, qui sera néanmoins réduit (nuisance modérée) par l’habituation préalable. Un isolement visuel et olfactif relatif de 72h sera nécessaire pour mesurer les variations d’activité durant le cycle jour-nuit. Pendant les tests comportementaux de sensibilité cutanée, une douleur cutanée transitoire ou prolongée (max 1h) sera ressentie sur la queue ou une patte arrière.
Devenir
Les souris sont génétiquement modifiées et ne peuvent être disséminées dans la nature pour adoption. De plus, elles ont subi un traitement pharmacologique, ainsi que des tests comportementaux invasifs avec injections de facteurs inflammatoires. Elles ne peuvent donc pas être conservés pour une réutilisation. Elles seront donc mises à mort en fin de protocole et permettront des prélèvements sanguins et tissulaires nécessaires aux résultats expérimentaux.
Remplacement
Les expériences de comportement et de pharmacologie chez la souris sont nécessaires pour avoir accès à la complexité physiopathologique de l'intégration du message douloureux et des processus sensori-moteurs. Elles permettent aussi d'utiliser des souris génétiquement modifiées, transposition directe de la pathologie humaine chez l'animal. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques.
Réduction
L‘objectif de Réduction a été pris en compte car le nombre total de souris (3200) correspond au nombre maximal nécessaire à l'obtention de résultats significatifs (15 souris/condition + une sécurité optionnelle de 5 souris/lot pour compenser l’exclusion de certains animaux en cours d’étude selon les points limites prévus). Toute expérience rendue inutile par des résultats obtenus par nous ou d’autres groupes (veille bibliographique mondiale permanente) ne sera pas conduite. En fonction de leur génotype, de leur sexe et de leur traitement pharmacologique les lots de souris seront comparés grâce à des tests statistiques adaptés à la distribution statistique des données et au type de comparaison choisies (comparaison sur le même animal ou sur des animaux différents). Le design des méthodes de reproduction a été optimisé pour pouvoir produire sur les 5 ans de la durée du projet les souriceaux les deux génotypes mâles et des trois génotypes femelles (dont des animaux normaux) qui devront être comparés (la pathologie X-Fragile est causé par une mutation sur le chromosome X). Le projet s’étalant sur 5 ans, le nombre réel des reproductions et des animaux reproducteurs pourra être réduit en fonction des portées (nombre des bébés, sexes et génotypes) déjà produits et étudiées auparavant. Les animaux reproducteurs pourront être aussi utilisés pour produire des souris dans le cadre d’autres projets du laboratoire, ou pour renouveler les lots de reproducteurs, et seront mis à mort à la fin de leur période de reproduction pour permettre des prélèvements de tissus post-mortem.
Raffinement
Pendant les expériences, un suivi quotidien sera réalisé par contrôle visuel de l'état de l'animal et de ses sites d'injection ou de prélèvement, ainsi qu’un contrôle expérimental (comportement mesuré par le test). Le poids de chaque souriceau sera relevé et, en cas de stagnation ou de décroissance de la prise de poids sur deux jours, le souriceau sera euthanasié. Les risques de rejet et de cannibalisme liés à la manipulation des souriceaux sera limité en mettant les souriceaux en contact avec l’urine de la mère avant d’être remis dans le nid. Dans le cadre de la prise en compte de leur souffrance, les animaux adultes seront habitués aux tests préalablement afin de réduire leur stress. Chaque test/intervention sera séparé au minimum d’une semaine du suivant. Si un animal est blessé ou présente des signes d’infection au site d’injection ou de prélèvement, nous l'isolerons et le soignerons jusqu'à guérison (si après une semaine l'animal est encore blessé, il sera mis à mort). Tout animal qui présenterait des signes de paralysie, de douleur excessive permanente (vocalisations, convulsions), de comportement anormal (prostration, apathie…) ou d‘une pathologie quelconque serait euthanasié sur le champ, car nous ne pouvons pas envisager l’emploi d’analgésique ou d’anesthésique dans les protocoles qui ont pour objet d’étude la douleur.
Choix des espèces
Travailler avec des souris permet de comparer le comportement « normal » ("sauvage") avec le modèle transgénique du FXS (souris Fmr1-KO), et d'étudier les défauts de comportements sociaux, cognitifs, anxieux ou sensori-moteurs que l'on peut retrouver chez les patients. D'autre part, de nombreux modèles comportementaux de douleur et de motricité font actuellement référence chez la souris dans le type d’étude que nous souhaitons mener. Aucune méthode alternative ne permet de satisfaire l‘objectif de Remplacement à notre connaissance, et les études précliniques chez l’animal restent nécessaires à la poursuite d’études cliniques. Le traitement pharmacologique chronique sera réalisé de P5 à P21 (de 5 à 21 jours après la naissance), correspondant à l'enfance chez la souris, où le processus neurodéveloppemental est crucial. Les tests sensori-moteurs et sociaux seront conduits à 1 mois à l’adolescence, une période clé du développement de l’autisme, puis de 8 à 20 semaines afin d'évaluer le bénéfice du traitement pharmacologique précoce à l’âge adulte.
Conséquences cardio-respiratoires de la mutation d’un gène spécifique dans la forme congénitale d’une maladie génétique rare (maladie de Steinert)
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
- Système respiratoire
Tous les souriceaux sont tués au plus tard deux jours après leur naissance, leurs tissus étant prélevés pour analyse. 744 souris vont être utilisées dans ce projet sur la forme congénitale de la maladie de Steinert, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Les mesures portent sur la ventilation des nouveau-nés éveillés pendant une heure, le jour de la naissance puis le lendemain, ce qui suppose de les séparer de leur mère aussi longtemps, et le porteur reconnaît que la mutation dans sa forme sévère peut conduire à une détresse respiratoire. Vingt-quatre femelles échappent à la mise à mort, gardées pour produire de nouvelles portées.
Objectifs
La dystrophie myotonique de Steinert est une maladie génétique qui touche environ 1 personne sur 8000 en France. Elle se manifeste par une faiblesse musculaire, des problèmes cardiorespiratoires, des cataractes précoces, et des troubles de l'apprentissage. La manifestation à la naissance (congénitale), la forme la plus sévère, peut se détecter dès la période prénatale par une réduction des mouvements fœtaux et un excès de liquide amniotique. À la naissance, les bébés présentent une faible tonicité musculaire, des difficultés à sucer et à avaler, et souvent des problèmes respiratoires. La maladie est due à une anomalie d’un gène spécifique caractérisée par une répétition excessive d'un motif particulier dans le gène. Plus cette répétition est longue, plus la maladie est sévère, pouvant atteindre jusqu’à 1000 répétitions chez certains patients. Le projet a pour but de mieux comprendre les mécanismes de cette maladie, particulièrement dans sa forme sévère, afin de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Actuellement, aucun traitement efficace n’existe. Pour étudier cette maladie, nous disposons de souris génétiquement modifiées portant le gène muté. Ces souris reproduisent certaines caractéristiques de la maladie humaine. Il s’agit alors d’identifier les mécanismes spécifiques liés à la mutation du gène et comprendre comment ces mécanismes contribuent aux symptômes sévères observés dans la forme congénitale de la maladie.
Bénéfices attendus
La maladie de Steinert est caractérisée par la répétition exagérée d'un motif spécifique. La compréhension de la conséquence de cette répétition est capitale pour mieux gérer la maladie, la progression des symptômes et leur variabilité, pour identifier d'autres gènes impliqués et pour tester de nouvelles approches thérapeutiques.
Procédures
Pour les femelles gestantes : Isolement de la femelle gestante 4 jours avant la mise bas. Pour les souriceaux : Mesure de la ventilation , de la fréquence respiratoire, du volume inhalé à chaque cycle respiratoire, de la durée et du nombre d'apnées chez les souriceaux éveillés pendant 1 heure le jour de la naissance et à J+1.
Impact sur les animaux
1/Séparation maternelle le temps de réaliser l'enregistrement des paramètres ventilatoires d'une heure. 2/ La mutation dans sa forme sévère peut conduire à une détresse respiratoire. 3/ Les femelles gestantes sont isolées 4 jours avant la mise bas pour permettre la nidation et réduire le stress lors de la prise en charge à la naissance.
Devenir
Tous les souriceaux sont euthanasiés au plus tard 2 jours après leur naissance. Prélèvement tissulaire postmortem pour des analyses à l'échelle des molécules. Les femelles sont ré-utilisées pour obtenir de nouvelles portées.
Remplacement
Les études sur des cultures cellulaires sont importantes dans la compréhension de la maladie. Toutefois, ces modèles sont limités car non représentatifs de la pathologie dans sa complexité d’expression et de prise en charge. Étant dans l’optique de recherche de traitement pharmacologique notamment pédiatrique, l’Agence européenne du médicament recommande l’utilisation de l’animal en développement. L’expérimentation animale ne peut alors être évitée. Dans la maladie de Steinert, il n’y a actuellement pas de traitement pharmacologique satisfaisant.
Réduction
Nous utilisons l'effectif qui permet d'avoir une puissance statistique suffisante pour tester nos hypothèses. Compte tenu de la variabilité inter-individuelle sur les variables observées comme la ventilation, nous avons déterminé un effectif de 30 animaux pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Cet effectif peut être réduit si au cours des analyses intermédiaires, un effectif plus faible permet de tester les hypothèses.
Raffinement
Pendant les mesures, la surveillance est constante. Des points limites adaptés à l’âge des souriceaux (deux premiers jours de vie) comportent le score d’adaptation à la vie extra-utérine pour le souriceau (coloration du souriceau, mouvement spontané, respiration spontanée, réaction à la douleur, présence de lait dans le ventre) et le comportement de la mère envers sa portée (constitution du nid, présence de lait dans le ventre). Pour les mesures, nous utilisons des techniques non invasives et contrôlées (durée de la mesure, température dans les chambres de mesure) pour minimiser l'angoisse des animaux. La durée maximale de séparation maternelle le temps d’une mesure est d’une heure. Les cages des femelles gestantes isolées puis les mères avec les portées sont enrichies en cellulose douce pour le nid. Par ailleurs, le personnel technique de l'animalerie effectue une vérification journalière obligatoire des espaces d'hebergement des souris et toutes les cages sont vérifiées.
Choix des espèces
L’approche sur un animal entier permet de voir les effets de la mutation dans un contexte physiologique. La souris constitue un modèle de neuro-développement humain et la souris avec modification génétique est largement utilisée dans l'analyse ou l'étude du développement d'une maladie génétique. Dans le cas de la maladie de Steinert, les modèles animaux existants sont murins. Ces modèles murins permettent alors de préciser les processus conduisant à la maladie et de tester ultérieurement les stratégies thérapeutiques. Notre investigation est au stade postnatal précoce, les deux premiers jours de vie (à la naissance (P0) et à P1).
Effet anti-obesité d’agonistes de CD36: Rôle de CD36 lingual
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
Quinze prélèvements de sang par incision du bout de la queue, chacun sur une souris maintenue une minute: 160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent dix-huit semaines de régime hypergras jusqu'à l'obésité et le diabète, avec gavages au glucose, mesures de glycémie tous les quinze jours et 72 heures d'hébergement individuel réparties en quatre tests de dix-huit heures. L'objet réel est de vérifier si des "faux lipides" conçus par l'équipe agissent sur un récepteur lingual du goût du gras et coupent l'appétit. Le porteur retient la souris parce que sa lignée génétiquement modifiée n'existe que dans cette espèce, et cite aussi la disponibilité des réactifs et des "coûts limités de maintenance".
Objectifs
Des études récentes effectuées chez l’homme comme chez la souris indiquent que l'obésité est associée à une altération du goût avec une préférence élevée pour les corps gras. Les bourgeons du goût localisés dans les papilles gustatives linguales représentent le siège de la perception gustative. C’est plus précisément grâce aux récepteurs gustatifs (taste receptors, TR), présents sur ces cellules que les saveurs sont détectées. Le récepteur CD36 est le récepteur du gras qui est impliqué dans la détection des lipides (acides gras) alimentaires et par conséquent la préférence pour les aliments gras. Dans le but de réduire la prise alimentaire des aliments gras. Nous avons développé des faux lipides qui sont soit des analogues d’acides gras ou un extrait d’origine végétale. Ces molécules sont capables d’interagir avec le lipido-récepteur CD36 et de mimer le goût du gras comme des acides gras naturels. Cela, ouvre des perspectives de l’utilisation de ces « faux lipides » comme modulateurs du gout du gras et du comportement alimentaire Le but de cette étude est de 1-Vérifier si nos molécules agonistes de CD36 « faux lipides » sont capables d’induire la satiété et de réduire l’incidence de l’obésité. Le test de comportement « test double choix » la mesure de prise alimentaire, du poids corporel ainsi que la glycémie à jeun fourniront des éléments de réponses à ce sujet. 2-Démontrer par l’utilisation de souris qui n’expriment pas le récepteur du gras uniquement dans les papilles linguales, l’implication, in vivo, de ce récepteur lingual dans l’action des faux lipides
Bénéfices attendus
Il a été rapporté que le goût du gras représente une sixième modalité gustative aux côtés du sucré, du salé, de l'amer, de l'acide et de l'umami. Le récepteur du gras CD36 est responsable non seulement de la perception lipidique mais également du renforcement de la préférence alimentaire pour les repas riches en gras. L’altération du gout du gras conduit à une attirance excessive pour les aliments gras, favorisant ainsi l’installation de l’obésité et les maladies métaboliques associées tels que l’insulinorésistance et le diabète de type 2. Les études réalisées chez les souris n’exprimant pas récepteur du gras CD36 ont démontré qu’elles perdent la perception du goût du gras. A court terme, ce projet permettra la description et l’utilisation ultérieure d’une nouvelle lignée génétiquement modifiée, qui n’exprime pas le récepteur du gras uniquement dans les papilles linguales,qui pourra servir de modèle animal pour les études ou les interrogations relatives au rôle de CD36 dans le gout du gras. A long terme ce projet nous permettra de développer de nouvelles molécules anti-obésité ciblant le récepteur du gras « CD36 »
Procédures
L’ensemble des souris sera nourri avec un régime standard ou hypergras et sera pesé de façon hebdomadaire. Des mesures de la glycémie tous les 15 jours pendant 18 semaines au niveau de la queue ainsi qu’un test tolérance au glucose en fin de protocole nécessitent une mise à jeun de 6h, un gavage au glucose (moins d’une minute) et une incision de l’extrémité de la queue, ces mesures de glycémie seront réalisées par bandelette glucomètre Ainsi pour la mesure de la glycémie, chaque souris subira un total de total 15 prélèvements d’une goutte de sang après incision de queue. Le prélèvement sera réalisé réalisés sous anesthésie locale (technique de mesure non invasive nécessitant une simple contention pendant 1 minute). Les souris seront hébergées individuellement en tout pendant 72 h (4 tests de 18h) pour réaliser un test comportemental. Un prélèvement sanguin terminal intracardiaque (sous anesthésie générale) sera réalisé avant la mise à mort (toujours anesthésiées). Après euthanasie, les organes d’intérêt seront prélevés.
Impact sur les animaux
- Inconfort lié à l’obésité induite par le régime alimentaire hyper-gras : l’obésité ou le surpoids peut réduire la mobilité des souris qui développent également un diabète de type 2. Nous avons limité la durée du régime alimentaire à 18 semaines. Durée optimale pour observer les effets des molécules anti-obésité limitant ainsi les inconforts liés à l’obésité. - Douleur lors des prélèvements sanguins au niveau de la queue. Les prélèvements sanguins (une goutte sur une bandelette de glycomètre) nécessitent une section de 0.5 à 1mm de l’extrémité de la queue qui peut induire une douleur et une infection locale. Les souris subiront en tout 15 prélèvements sanguins (10 prélèvements tous toutes les deux semaines pour suivre l’installation du diabète type 2 et 5 prélèvements lors du test un test de tolérance au glucose). Pour pallier à cette nuisance, nous effectuons une anesthésie locale (crème emla 5%) avant incision et nous désinfectons (solution antiseptique) la queue avant et après l’incision de même que les instruments (ciseaux) à l’alcool. - Irritation de la gorge lors des gavages : le test de tolérance au glucose (OGTT) nécessitant un gavage avec une solution de glucose, afin de minimiser cette irritation malgré la qualification de l’expérimentateur nous utilisons des sondes en plastique souple adéquates pour souris (38 mm longueur et 1,2 mm de diamètre de la pointe). -Stress lors des manipulations : les gavages nécessitent également une contention. Pour pallier à ce stress, nous limitions la durée de contention à quelques secondes. - Stress lors d’hébergement individuel des souris : les souris seront en hébergement individuel en tout pendant 72 h pour réaliser des tests de doubles choix (4 tests de 18h). Nous avons limité cette durée d’hébergement individuel à 18h qui représente la durée minimale pour réaliser ce test comportemental
Devenir
A l’issue de la procédure, toutes les souris seront mises à mort..
Remplacement
L’obésité est une maladie multifactorielle impliquant l’altération du métabolisme des lipides et glucides, les dérégulations hormonales (hormones du tissu adipeux), l’activation du système immunitaire, l’inflammation. Ainsi malgré les résultats obtenus, in-vitro, le recours à l’animal est indispensable. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
L’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous a permis de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques. Le nombre d’animaux nécessaire à cette étude correspondra au nombre minimum permettant une étude statistique valable avec un test non paramétrique adapté aux petits échantillons. Ainsi, après une estimation statistique, la taille minimale des groupes est de 10 animaux.
Raffinement
Les animaux seront hébergés en groupes dans les conditions habituelles de l’animalerie, le calme sera maintenu tant que possible dans la salle d’hébergement et une visite quotidienne sera réalisée. Pour le bien-être des souris, du matériel d’enrichissement permettant la construction de nid sera fourni en permanence avec un accès libre à la nourriture et la boisson. Lorsque les souris seront hébergées individuellement, un enrichissement supplémentaire sera apporté (igloo et matériau de nidification en cellulose). Les souris seront habituées à la contention pour diminuer le stress, lors des pesées et des prélèvements. Un anesthésiant local sera appliqué sur la queue lors des prélèvements sanguins et une anesthésie générale sera réalisée avant la mise à mort.
Choix des espèces
Du point de vue scientifique, la souris reste le modèle de choix pour des études sur l’obésité et le comportement alimentaire. Bien que techniquement plus difficile que l’utilisation du rat, notre modèle animal génétiquement modifié est réalisé seulement chez la souris, c’est pourquoi ce modèle est indispensable. D’un point de vue technique, la disponibilité des outils (anticorps, kits de dosage etc…) et les coûts limités de maintenance contribuent au choix de modèle souris. De plus, l’élevage et l’induction de la modification génétique étant plus facile sur les souris, cette espèce est un modèle de choix pour notre étude. De même, la durée d’induction de l’obésité à partir de 8 semaines chez la souris est relativement courte, ce qui permet la création des groupes expérimentaux dans des délais raisonnables. Des souris mâles de 4 à 5 semaines seront mises sous régime obésogène pour maitriser l’induction de l’obésité. Il y’a pas de référence pour déterminer l’obésité chez la souris tels que l’indice de masse corporelle chez l’humain. Cependant les souris ayant un poids corporel au-delà de 45 g sont considérées comme obèses et développent une hyperglycémie à jeun. A la fin de l’étude, les animaux auront alors entre 22-23 semaines et seront donc adultes. Cet âge est privilégié dans le but d’étudier des pathologies d’ordre métabolique (induites par des régimes obésogènes) telles que le diabète de type 2 normalement diagnostiqué chez l’Homme à l’âge adulte.