Système nerveux
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Consommation d’alcool à l’adolescence et mémoire
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Alcoolisés par injections intrapéritonéales répétées pendant leur adolescence, 240 rats sont ensuite soumis à des tests de mémoire dans un labyrinthe en Y, dix minutes d'exploration libre puis cinq minutes de test. Les procédures impliquent un niveau de souffrance léger pour la moitié d'entre eux et modéré pour l'autre, et aucun rat ne sort vivant du protocole. Le porteur écrit qu'aucune nuisance n'est attendue en dehors de la douleur locale de la piqûre, tout en prévoyant une grille de perte de poids graduée jusqu'à 40 % et l'arrêt du traitement au premier signe de douleur avérée. Les cerveaux sont prélevés après les tests d'apprentissage, pour des analyses neurochimiques.
Objectifs
Mettre en évidence chez le rat adolescent les conséquences d'une exposition à l'alcool à des fréquences différentes sur la plasticité synaptique bidirectionnelle, mécanismes cellulaires des apprentissages et de la mémoire, dans l'hippocampe. Déterminer la durée des perturbations pour savoir si les effets de l'alcool sont irréversibles et s'ils dépendent de la fréquence d'exposition. Identifier les cibles moléculaires responsables des effets de l'alcool afin de savoir si la fréquence d'exposition engage des cibles différentes pour des effets potentiellement différents. Faire le lien entre les perturbations électrophysiologiques et les capacités d'apprentissages des animaux exposés à l'alcool. Ce dossier est déposé afin de terminer le projet de l'autorisation précédente car il nous reste les protocoles d'apprentissages à effectuer. Nous avons à ce jour utiliser 1100 animaux sur les 3800 prévus parce que nous avons affiné nos protocoles d'injection d'éthanol aux animaux (voir ci-dessous) et que nous avons rencontrés de nombreux problèmes techniques ralentissant l'obtention des résultats prévus initialement.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de déterminer si la fréquence d'exposition à l'alcool à des effets specifiques sur les mécanismes de la mémoire et sur les capacités d'apprentissages chez le rat adolescent. Ce projet repondra egalement à la question de la réversibilité des effets d' alcoolisations répétées à différentes fréquences à un âge adolescent, pendant la periode finale de maturation cérébrale, et donc permettra de préciser les messages de prévention à destination des jeunes consommateurs.
Procédures
Les interventions que subiront les animaux après les procédures d'injection d'alcool consistent en trois tests comportementaux, tous basés sur la curiosité spontanée des rongeurs à explorer leur environnement. Les injecitons d'alcool en i.p. durent de 1 à 2 sec car les volumes restent faibles. Ces injections sont toujours suivis d'un massage au lieu d'injeciton et d'une observation de l'animal pendant quelques minutes (jusqu'à l'endormissement). Les tests comportementaux durent, par animal, 10 min pour la phase de déambulation libre dans le labyrinthe en "Y" puis de 5 min pour la phase de test (quel bras vat-il choisir?). Entre les deux, l'animal est remis en cage.
Impact sur les animaux
Aucune nuisance n'est attendue sur l'animal en dehors d'une douleur locale lors de l'éxécution du geste de piquer l'animal
Devenir
A l'issue des procédures indiquées, les animaux seront testés dans des tâches d'apprentissages afin de mesurer leur capactité mnésique et leur flexibilité cognitive. A la suite de ces tests, les animaux seront euthanasiés. Le cerveau sera prélevé pour analyses neurochimques
Remplacement
Pour ces denriers tests comportementaux, nous sommes dans l'obligation d'utiliser l'animal car il s'agit de compléter des études neuropharmacologiques et electrophysiolgoiques précédemment effectuées ex vivo sur une tranche cérébral d'hippocampe. Ces expérinces ici réalisées in vivo chez l'animal intact et libre de ses mouvemetns permettent donc de vérifier nos résultats obtenus sur une partie seulement du cerveau. AInsi, il pourra être établis qu'un mécanisme neuronal observé de manière précise ex vivo a une réalité physiologique en modulant le comportement de l'animal. Il n’existe pas à ce jour de méthode de substitution si l’on veut étudier les mécanismes neuronaux de la mémoire. En effet, les signaux que nous étudions ne sont générés que si les neurones sont organisés en réseau fonctionnel qui inclus donc l’ensemble des types cellulaires du système nerveux central (neurones + glie), ainsi que les voies d’entrées et de sortie des informations mnésiques. Il faut donc au minimum une partie de l’Hippocampe à notre disposition dans un modèle semi-intégré. D’autre part, il nous faut avoir accès au fonctionnement du neurone dans son environnement biophysique et physiologique afin de déterminer les acteurs cellulaires des effets de l’alcool et notamment les cibles membranaires sur les neurones, ce qui ne peut être obtenus sur une culture de cellules. LEs études proposées ne peuvent se faire que sur un mammifère qui possède un hippocampe comparable à celui de l'Homme. Le rongeur étant l'espèce utilisée dans les travaux précédents du laboratoire et des autres équipes mondiales avec lesquelles les résutlats de ces travaux seront partagés et discutés, et qui utilisent également le rat, il n'est donc pas possible de remplacer l'espèce utilisée dans le contexte des études proposées.
Réduction
Le nombre d'animaux déterminée pour cette demande d'autorisation de projet scientifique a été calculé en se basant sur l'expérience du laboratoire en terme d'études comportementales sur animaux vigiles. Ce nombre bénéficie églament de notre expérience récente sur ce projet qui a démontré des résultats avec moins d'animaux que ce qui était prévu au départ puisque nous avons à ce jour utilisé 1100 animaux sur les 3850 prévus parce que nous avons affiné nos protocoles d'injection d'éthanol aux animaux notamment.
Raffinement
Le raffinement pour diminuer les angoisses sera assuré par un hébergement enrichi (stimulations sensorielles),en groupe (activités sociales) et en présence de musique dans la pièce de stabulation. Toutes les mesures seront mises en oeuvre afin de limiter souffrance et douleurs éventuelles. Les cages sont pourvues de litière en quantité suffisante, de rouleaux de carton (jeux, cache), de litiére foisonnante (nidification) et d'une cache surélevée en plastique pouvant servir de refuge ou autre. Nous pouvons ajouter que le déroulement de ce projet nous a permis d'observer des résultats significatifs après un nombre d'injections d'alcool inférieur à ce que nous avions prévu au départ, participant de fait au mieux-être des animaux. Les points limites sont les suivants: en cas de douleur avéré lors de la répétition des injections, le traitement s'arrêtera aussitôt et l'animal recevra immédiatement et pendant 3 jours consécutifs, du paracétamol (200 mg/kg) dans l'eau de boisson (vol de 30 ml consommé par jour par individu). L'animal sera réintégré au protocole s'il va mieux sinon il sera écarté définitivement. Score 0 1 2 3 pour Perte de poids de 0-10% 10-20% 20-30% 30-40%, respectivement. Un score de 3 observé une fois est irrémédiable et conduit à écarter l'animal de l'étude. Un score de 2 pendant 2 jours consécutifs et malgré notre intervention (arrêt du traitement) sera églament rédhibitoire. Un score de 1 aménera à suspendre le traitement et à observer la récupération de l'animal sans plus d'intervention; une aggravation de sa situaiton (score 2) aménera à l'écarter définitivement du protocole expérimental.
Choix des espèces
L’utilisation de rongeurs se justifie de par 1) leurs similitudes morphofonctionnelles au niveau cérébral par rapport aux humains. Ces animaux sont capables d'apprentissage et ressentent les effets de l'alcool au même titre qu'un humain et les mécanismes de la mémoire décryptés chez ces rongeurs sont considérés être les mêmes chez l'Homme, 2) les études au niveau international déjà effectuées par d’autres équipes et 3) notre propre expérience puisque nous avons déjà publié avec des rongeurs dans le cadre de projets équivalents. Ce présent projet est une continuation et une extension de ces études publiées car nous n'avons pas répondu à toutes nos interrogations. Il est reconnu que dans la population humaine, les jeunes femmes consomment de l’alcool au moins autant que les hommes mais scientifiquement, il existe beaucoup moins de connaissances fondamentales sur les mécanismes mnésiques perturbées chez les animaux femelles même si de nombreux articles indiquent une plus grande sensibilité des femelles aux effets de l’alcool. C’est ce que nous déterminerons entre autres ici dans le cadre d’une consommation excessive et de courte durée. La maturation sexuelle ayant lieu au cours de la puberté il est important de pouvoir déterminer le rôle de cette période sur la sensibilité à l’alcool.
Rôle de la relaxine-3 dans la douleur neuropathique chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 160 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant des niveaux de souffrance léger pour 520 d'entre elles et modéré pour 640, toutes tuées à l'issue pour analyses immuno-histologiques. Une chirurgie sous anesthésie de quarante-cinq minutes au maximum installe une douleur neuropathique chronique, suivie de deux tests de douleur, de quatre tests d'anxiété et de dépression, d'une biopsie de la queue pour génotypage, d'un jeûne unique de vingt-quatre heures et d'infusions de composés directement dans le cerveau sur animal en mouvement libre. Le projet cherche à savoir si des neuropeptides de la famille de la relaxine-3 soulagent à la fois la douleur et les symptômes anxio-dépressifs qui l'accompagnent. Le porteur détaille les mesures de raffinement, hébergement social, manipulation quotidienne, analgésie chirurgicale, et écrit dans le même résumé que la douleur des souris "est inévitable et ne peut pas être soulagée car c'est l'objet de l'étude".
Objectifs
La douleur neuropathique est fortement associée aux troubles émotionnels avec une prévalence équivalent à 30%. Elle représente un fardeau économique majeur sur la société, estimé à plus de 800 millions d’euros en Europe. Il est donc nécessaire de comprendre les mécanismes qui sous-tendent cette comorbidité et mettre en place de stratégies thérapeutiques pour soulager et prévenir la chronicisation de la douleur neuropathique et le développement des troubles émotionnels. Nous proposons dans cette étude d’évaluer l’effet thérapeutique d’une sous-famille de neuropeptides dans un modèle chronique chez la souris neuropathique et génétiquement modifiée.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra potentiellement de développer des composés pharmacologiques ciblant les récepteurs RXFP3 (Relaxine-3) si leur effet thérapeutique se confirme au cours de cette étude dans le but de soulager la douleur neuropathique et les symptômes anxio-dépressifs.
Procédures
- Les animaux sont soumis à une douleur chronique - Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale pour une durée maximale de 45 minutes - Les animaux subissent 2 tests évaluant la douleur (15 minutes en moyenne - stimulation courte de maximum 20 secondes) et 4 tests évaluant l'anxio-dépression (durée de 5 minutes par test) - Une biopsie caudale sur animal éveillé ou anesthésié pour le génotypage d'une durée inférieure à 1 minute - Les animaux subissent un jeûne unique de 24h pour un test comportemental. - A la fin de l'étude, une chirurgie pour prélèvement sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
- La présence de la douleur chez le modèle animal est inévitable et ne peut pas être soulagée car c'est l'objet de l'étude. - La douleur post-chirurgicale est aigue, transitoire et inflammatoire. - Suite à la chirurgie, une légère difficulté dans les déplacements des animaux est attendue mais qui disparaît rapidement dans les 24 à 48 h. - Infusion intracérébrale de composés pharmacologiques sur animal en mouvement libre. - Un stress lié à un jeûne unique de 24h. - Un inconfort et une légère douleur aigue de courte durée (1 minute) sont à prévoir lors du tatouage des animaux et de la caudectomie pour génotypage.
Devenir
A la fin des procédures, les animaux sont mis à mort pour des analyses post-mortem en immuno-histologie.
Remplacement
Au vu de notre thématique d’étude, il nous est malheureusement impossible de remplacer notre modèle in vivo par un modèle in vitro ou in sillico. En effet, l’étude de la douleur et de la comorbidité anxio-dépressive nécessite une observation comportementale, uniquement possible chez un animal vivant et vigile.
Réduction
Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire autant que possible le nombre d’animaux par condition expérimentale, mais toujours dans l’optique d’obtenir le maximum d’information scientifique par test. Le nombre d'animaux a été déterminé pour obtenir des résultats statistiquement valides tout en se basant sur des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique interindividuelle.
Raffinement
Les animaux sont hébergés en groupe sociaux de 2 à 5 individus pour respecter leurs besoins sociaux. Des carrés de coton seront placés dans la cage pour favoriser la nidation, et des barreaux de bois à ronger pour limiter les comportements d’agressivité. Avant le début des procédures et sur une période d’une semaine, les animaux sont manipulés quotidiennement par l’expérimentateur et acclimatés à l'environnement où les tests se dérouleront afin de réduire l'état de stress et d'angoisse chez l'animal. Les animaux seront observés tous les jours et leur comportement sera suivi afin de déceler tout signe d’inconfort ou de stress. Durant les chirurgies, des méthodes d’anesthésie et d’analgésie sont systématiquement utilisées. Un suivi post-chirurgical rapproché sera réalisé. Des points limites sont mis en place pour l’ensemble des procédures expérimentales. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, une concertation avec la structure chargée du bien-être des animaux àl'institut (SBEA) pourra être réalisée afin d’intégrer ces nouvelles pratiques dans nos procédures.
Choix des espèces
Ce projet sera réalisé sur le modèle animal - Souris adulte (à partir de l'âge de 8 semaines post-naissance). Il nous est indispensable de travailler sur un modèle animal, social, entier avec un système neurobiologique mature afin d’être dans les conditions les plus proches de la complexité humaine. Le modèle murin adulte présente une forte homologie structurale du cerveau avec l’Homme le rendant incontournable dans la recherche en neurosciences.
Etude pilote : Marquage des neurones du sinus carotidien de souris par injection de molécules fluorescentes
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
Anesthésiées, épilées et désinfectées au cou, 70 souris reçoivent une injection de marqueurs dans la paroi de leurs carotides au cours d'une chirurgie de trente à quarante minutes, sont réveillées, puis réanesthésiées quatre jours plus tard pour dix minutes d'imagerie. Une à trois semaines après l'opération, elles sont tuées pour prélever les neurones et les mettre en culture, dix d'entre elles étant manipulées sous anesthésie sans réveil. Cette étude pilote doit établir si des marqueurs déjà décrits dans la littérature fonctionnent mieux que la seule référence existante, avec pour perspective lointaine des cibles thérapeutiques contre l'hypertension. Le porteur écrit qu'aucun effet indésirable n'est lié aux molécules injectées, tout en listant hémorragie, infection, détresse respiratoire et perte de poids au titre de la chirurgie et de l'anesthésie.
Objectifs
L'hypertension artérielle est la principale cause des maladies cardiovasculaires et des décès prématurés dans le monde. Malgré les diverses options thérapeutiques disponibles, de nombreux patients hypertendus gardent une tension artérielle non contrôlée. Il a été montré que, dans ces cas d’hypertensions résistantes et/ou réfractaires aux traitements médicamenteux, les mécanismes de régulation de la pression artérielle sont affectés. Ces mécanismes réflexes modulent le diamètre des veines et des artères, ainsi que le rythme et la contractilité cardiaque, afin de contrôler la pression sanguine. La détection de la pression artérielle est initié par des neurones dont les terminaisons, sensibles à l’étirement des vaisseaux sanguins, se situent dans des structures particulières des grosses artères : les carotides (au niveau du cou) et la crosse aortique (à la sortie du cœur). Cette sensibilité à l’étirement leur est conférée par l’expression de protéines similaires à celles qui sont impliquées dans le toucher et dont notre équipe est spécialiste. Notre projet vise donc à caractériser quelles protéines sont spécifiquement exprimées par les différents types de neurones détectant la pression sanguine chez la souris en conditions physiologiques, et, par la suite, leurs modifications dans des modèles d’hypertension. Nous nous intéresserons aux neurones situés au niveau des carotides. Afin de pouvoir les identifier, nous injecterons aux environs de la carotide des molécules permettant de marquer les neurones appelées marqueurs neuronaux. Ce projet est une étude pilote visant à évaluer l'efficacité de différents types de marqueurs neuronaux.
Bénéfices attendus
Notre étude pourrait être à l'origine de l'identification de nouvelles cibles thérapeutiques pour le traitement de l'hypertension.
Procédures
1) Injection de marqueurs dans la paroi des carotides. Les souris seront anesthésiées. Pour éviter toute douleur, nous administrerons par voie sous-cutanée 30 min avant la chirurgie un analgésique morphinique. La zone d’injection sera épilée puis désinfectée. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante et leur température sera contrôlée. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la procédure qui durera 30 à 40 minutes. En fin de procédure l’animal sera réveillé, placé dans une pièce de surveillance post-examen, chauffé, avec eau et nourriture. 2) Visualisation du marquage des carotides. 4 jours après la chirurgie, les souris seront anesthésiées pour vérifier la présence d’un marquage grâce à un appareil d'imagerie in vivo. La manipulation durera 10 min maximum. 3) 1 à 3 semaines après la chirurgie, les souris seront mises à mort pour prélever les organes et procéder à des cultures de neurones.
Impact sur les animaux
Les risques sont liés à 1) l’anesthésie : stress de la manipulation, déshydratation, détresse respiratoire et perte de poids; 2) à la chirurgie : hémorragie, infection. Il n'y a aucun effet indésirable lié aux molécules injectées.
Devenir
Les animaux seront mis à mort dans le but de vérifier la présence effective du marquage dans les neurones.
Remplacement
Le marquage des neurones des carotides ne peut se faire que sur des animaux vivants. Les marqueurs neuronaux fonctionnent chez la souris. Les alternatives non animales n'existent pas.
Réduction
Ce projet est une étude pilote visant à évaluer l'efficacité de marqueurs neuronaux suite à leur injection dans la paroi des sinus carotidiens de souris. Cette technique dispose d'une seule référence utilisant un marqueur qui présente une efficacité très limitée. Nous nous proposons donc de mettre en place cette technique avec des marqueurs déjà décrits dans la littérature et dont l'efficacité pourrait s'avérer supérieure. Etape 1/ Mise au point de l'injection dans les sinus carotidiens. Pour cela, nous injecterons un marqueur visible à l'oeil nu qui nous permettra de nous former sur l'acte chirurgical (isolation de la carotide et suture) et de valider la localisation de l'injection. Nous utiliserons au maximum 10 souris. Etape 2/ Test des différents marqueurs neuronaux fluorescents. Nous injecterons trois marqueurs différents. Pour chaque marqueur, nous effectuerons 10 sessions comprenant 2 souris. Soit 20 souris par marqueur et 60 souris au total pour le test des 3 marqueurs neuronaux. Pour l'ensemble de l’étude pilote, nous utiliserons donc au maximum 70 animaux. Pour chaque procédure, si nous estimons avoir la maîtrise nécessaire du geste chirurgical (procédure 1) ou les résultats suffisants pour conclure sur l'efficacité des marqueurs (procédure 2), nous arrêterons l'expérimentation avant d'avoir utiliser le nombre maximal d'animaux prévus.
Raffinement
A réception, les souris passeront une période d’acclimatation de 5 jours minimum. Les chirurgies se feront sous anesthésie. Pour éviter toute douleur pendant et après la chirurgie, nous administrerons par voie sous-cutanée un analgésique morphinique. Les souris seront placées sur une plateforme chauffante et leur température sera contrôlée. L'animal fera l'objet d'une surveillance visuelle pendant toute la durée de la chirurgie qui durera 30 à 40 min. En fin de chirurgie, l’animal sera réveillé, placé dans une pièce post-examen, chauffé, avec eau et nourriture à volonté. Suite à la chirurgie, les animaux seront 2 par cage. Leur environnement sera enrichi avec des dômes et des nids à base de coton. Si une infection de la cicatrice est détectée, une pommade antibiotique à large spectre sera appliquée. Nous utiliserons une grille de score afin d’évaluer le bien-être des animaux tous les jours pendant 4 jours puis 3 fois par semaine. L'évaluation prendra en compte 1) le poids corporel ; 2) l'apparence physique ; 3) le rythme respiratoire ; 4) le comportement non provoqué, 5) les réponses comportementales aux stimuli (réaction à un bruit ou comportement exploratoire suite aux changements de litière) et 6) l'aspect du site de chirurgie. Chaque modification sera cotée et le score total sera comparé aux points limites établis, ce qui nous permettra de mettre en place une action si nécessaire (analgésie ou mise à mort).
Choix des espèces
Nous utilisons le modèle souris car si l'étude de faisabilité se révèle satisfaisante, nous aurons ainsi accès aux modèles de souris transgéniques. De plus, le marquage des neurones des sinus carotidiens est une méthode qui a fait ses preuves sur la souris. Les souris qui seront utilisées dans ce projet seront âgées de 6 à 10 semaines ce qui correspond à un stade jeune adulte. Les souris ne présentent pas encore d'accumulation de tissus graisseux et/ou fibreux qui pourraient nuire aux prélèvements d'organes post-mortem.
Noyau Parasousthalamique, reconnaissance de saveurs, conditionnement et addiction au sucre
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Cartographier les connexions d'un noyau de l'hypothalamus postérieur, récemment identifié par l'équipe, sert de préalable annoncé à des recherches sur la boulimie et l'anorexie. 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées ensuite pour prélèvement du cerveau. Chaque animal subit une chirurgie intracérébrale unique de trente à quarante minutes pour l'injection de traceurs, puis, trois semaines plus tard au minimum, deux tests comportementaux de quinze minutes portant sur la récompense alimentaire et l'anxiété, précédés parfois d'une injection intrapéritonéale. Sur le remplacement, le porteur écrit en une phrase qu'il n'existe pas d'alternative, sans indiquer ce qui a été examiné.
Objectifs
Depuis plusieurs années nos recherches sont orientées vers l’étude d’un noyau de l’hypothalamus postérieur (noyau parasousthalamique – PSTN) potentiellement associé à diverses fonctions notamment en lien avec la prise alimentaire. Nous continuons d’accroitre nos connaissances tant au niveau de l’organisation du réseau que des fonctions de cette structure récemment identifiée. Ce projet concerne l’étude descriptive et des connexions neuronales de cette région dans des circuits et fonctions en lien avec certains processus cognitifs (perception hédonique) et émotionels (anxiété). Ces travaux sont préliminaires à des recherches dans les domaines de la boulimie et de l’anorexie.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre l’organisation de la région que nous avons identifiée chez le Rongeur et chez l’Homme et son impliquation dans des pathologies psychiatriques (anoréxie, boulimie). Il est adossé à d’autres projets, notamment transversaux, qui vont aider à identifier les causes de certains effets indésirables chez des patients stimulés par DBS (deep brain stimulation) (ex : Parkinson) et chez lesquels une prise de poids importante est observée. Il va aussi donner des informations originales quant à la différenciation de phénotypes neuronaux, et peuvent encore déboucher à une meilleure compréhension des pathologies telles que boulimie et anorexie.
Procédures
Tous les animaux utilisés dans cette étude recevront des injections de molécules nous permettant de déterminer l'endroit où les neurones ciblés envoient leurs axones. Cette technique nécessite une intervention chirurgicale unique par animal, sous anesthésie générale et avec injection d'analgésiques. La durée de l’intervention est de 30 à 40 mn, essentiellement due au temps de l’injection sur plusieurs minutes. Puis, nous allons étudier dans quelle mesure cette région est modulée par la manipulation du système de la récompense impliqué dans l’ingestion d’aliments palatables, ou encore vérifier si l’inhibition sélective de ces neurones dans l’hypothalamus postérieur peut moduler des comportements anxieux en lien avec l’alimentation (‘Binge-eating’ ou réaction de manque à une habituation au sucre). Ainsi donc les chirurgies seront suivies (trois semaines après minimum), de deux expériences comportementales de 15 min chacune. Des injections uniques intrapéritonéales seront aussi réalisées afin d’administrer des médicaments ou agents pharmacologiques. Ces injections sont suivies des mêmes expériences comportementales.
Impact sur les animaux
Une douleur modérée est attendue suite à l’injection intracérébrale. Ainsi, ces injections seront effectuées sous anesthésie générale avec adjonction d’analgésiques qui seront aussi administrés après l’injection proprement dite. Certains états de malaise léger ou d’anxiété légère seront aussi induits par nos conditions expérimentales, mais ils seront de courte durée et améliorés par du raffinement.
Devenir
La mort des animaux à l’issue de toutes les procédures est indispensable pour le prélèvement du cerveau.
Remplacement
Il n’existe pas d’alternative à l’utilisation du modèle souris à ce projet qui est ciblé pour cette espèce en tant que modèle pour comprendre les comportements animaux et humains, et nécéssite des interventions sur le cerveau.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux utilisé, les coordonnées des sites d’injections intracérébrales seront déterminées initialement sur animaux morts. Pour calculer le nombre d’animaux, nous nous sommes basés sur un outil en ligne gratuit du NC3Rs, conçu pour guider les chercheurs dans la conception de leurs expériences : l’EDA. Certains des animaux avec des injections inadéquates pourront être considérés comme contrôle supplémentaire, dépendamment du nombre.
Raffinement
Les principales mesures de raffinement concerneront les soins pré-, per- et post-chirurgicaux apportés aux animaux (par l’administration d’analgésiques et la surveillance quotidienne) et les conditions d’hébergement (enrichissement du milieu). Les animaux sont régulièrement manipulés par les expérimentateurs afin de diminuer le stress lors des procédures, notamment comportementales, et ils seront habitués aux conditions expérimentales afin de diminuer tout stress potentiel. Pendant les expériences, les animaux seront quotidiennement surveillés afin de vérifier leur condition. Toute souffrance potentielle sera évaluée grâce à des critères qui, s’ils sont constatés, déclencheront l’intervention de la structure du bien-être animale et si les points limites sont atteints, provoqueront l’intervention du vétérinaire attaché à notre animalerie. Les décisions de soin ou d’arrêt des souffrances seront alors prises.
Choix des espèces
Le choix de l’espèce est dicté par les modèles existants permettant d’obtenir des résultats qui seront exploitables à la fois pour l’Homme et l’animal dans la compréhension des mécanismes cérébraux gouvernant l’expression de comportements adaptés ou pathologiques en lien avec la prise alimentaire. Tous les animaux utilisés dans ce projet seront adultes.
Validation préclinique chez le modèle porcin d’un dispositif électronique ingestible permettant de moduler l’activité vagale et cérébrale de manière non invasive
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Système gastrointestinal
- Système nerveux
22 porcs juvéniles de 30 à 40 kg vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, chacun subissant des anesthésies générales plafonnées à six heures. Un dispositif filaire de stimulation est inséré dans le duodénum, par chirurgie ou par canule, puis les animaux passent un scanner et un électrocardiogramme, parfois deux scintigraphies gastriques à une semaine d'intervalle ou une imagerie cérébrale de deux heures trente. Tous sont tués à l'issue, le porteur indiquant qu'il n'est pas possible de les remettre dans le circuit d'élevage pour la consommation humaine. Le bénéfice décrit reste une étape intermédiaire : valider un prototype filaire, pour envisager plus tard un dispositif ingestible autonome, lui-même préalable à un éventuel usage chez l'humain.
Objectifs
De nombreuses pathologies d’origine nutritionnelle ou digestive font état d’anomalies de communication au niveau de l’axe intestin-cerveau, comme en contexte d’obésité, de gastroparésie ou de maladies inflammatoires chroniques de l’intestin. Le nerf vague joue un rôle majeur dans cette communication entre organes et différentes approches thérapeutiques invasives ont déjà été envisagées pour stimuler le nerf vague, comme la stimulation électrique avec implantation d’électrodes et de stimulateur par voie chirurgicale. L’objectif de cette étude préclinique est de tester un dispositif électronique ingestible qui serait capable de parvenir au niveau de l’intestin et de s’y déployer pour stimuler les neurites (terminaisons nerveuses) des villosités intestinales, modulant ainsi l’activité du nerf vague, par voie de conséquence la vitesse de vidange gastrique (la stimulation du nerf vague permettant de détendre le sphincter pylorique et d’accélérer la vidange gastrique) et in fine les réponses cérébrales, notamment à une stimulation alimentaire gustative sucrée. Dans la présente étude pilote, un prototype filaire du dispositif sera testé chez le modèle porcin afin de valider les effets de la stimulation opérée par ce dispositif au niveau de l’activité du nerf vague, de ses effets au niveau gastrique et cérébral.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra de valider l’efficacité d’un premier prototype filaire capable de moduler l’activité vagale, la vidange gastrique et les réponses cérébrales par stimulation des neurites au niveau de l’intestin. Une fois cette preuve de concept obtenue, permettant de disposer de paramètres de stimulation efficaces, un futur projet pourra être envisagé cette fois avec un dispositif ingestible capable de se déployer de manière autonome dans l’intestin grêle, donc sans nécessité d’implantation chirurgicale. Cette solution représenterait une alternative non invasive en comparaison des autres techniques de stimulation vagale existantes, facilement implémentable et modulable en fonction des patients. En fin de vie ou d’action, le dispositif ingestible final sera excrété par voie naturelle via les fèces.
Procédures
Quatre animaux permettront de déterminer la meilleure stratégie pour implanter le dispositif de stimulation filaire : 1) la stratégie la moins invasive, privilégiée, correspond à l’insertion préalable du dispositif filaire sous anesthésie générale ; 2) la stratégie alternative, choisie si le dispositif ne peut pas rester longtemps en place, nécessite l’implantation d’une canule duodénale permettant l’insertion du dispositif le jour des mesures. Une fois le mode d’insertion choisi, 4 à 6 nouveaux animaux seront implantés avant d’être soumis à une imagerie anatomique CT-Scan (rayons X) et un enregistrement électrocardiographique (ECG) sous anesthésie générale pour repérer le dispositif dans le duodénum et évaluer l’effet de la stimulation sur l’activité vagale (intervention unique de 1h30 à 2h). Si aucun effet n’est observé durant l’ECG, les animaux seront soumis à 2 scintigraphies gastriques à une semaine d’intervalle, afin d’évaluer indirectement l’effet de la stimulation sur l’activité vagale en évaluant le temps de vidange gastrique après un repas test radiomarqué (interventions de 2h à 2h30). Sur 9 à 12 animaux différents, une imagerie par résonance magnétique fonctionnelle cérébrale sera réalisée sous anesthésie générale une semaine après l’intervention chirurgicale, afin d’évaluer l’effet de la stimulation sur l’activité cérébrale et les réponses cérébrales à une stimulation gustative sucrée (intervention de 2h à 2h30).
Impact sur les animaux
Douleur, lésion physique ou gêne après intervention chirurgicale. Stress psychosocial léger du fait de l’hébergement en cages individuelles, même si les animaux ont toujours des contacts visuels et auditifs avec des congénères. Stress psychosocial léger au début de l’habituation au hamac de contention, si l’option de réaliser des scintigraphies gastriques est retenue.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chacune des étapes du projet. Il n'est en effet pas possible de conserver ces animaux ni de les remettre dans le circuit d'élevage pour une consommation humaine ultérieure. Par ailleurs, des prélèvements intestinaux sont susceptibles d'être réalisés après la mise à mort afin de vérifier l'absence d'inflammation au niveau du site de fixation du dispositif de stimulation.
Remplacement
Les objectifs de ce projet sont de valider les effets d’un prototype de dispositif médical capable de stimuler le nerf vague via les terminaisons nerveuses intestinales et de moduler l’activité cérébrale, notamment en réponse à des stimuli alimentaires comme une stimulation sucrée. Ce dispositif doit impérativement être testé sur un modèle in vivo pertinent avant de l’optimiser et de l’appliquer à une étude clinique chez l’humain. Le porc est un animal de référence pour l’expérimentation médicale en chirurgie, gastroentérologie, nutrition et neurosciences. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain. De plus, de très nombreuses études ont été publiées sur ce modèle dans le domaine de l’imagerie cérébrale, notamment par notre équipe qui est un des leaders sur le sujet.
Réduction
Quatre animaux sont un strict minimum nécessaire pour tester les deux stratégies d'insertion du dispositif de stimulation, chaque animal représentant son propre contrôle lors des mesures ECG et de vidange gastrique. Comme précédemment validé et publié, un effectif d’environ 8-9 animaux représente le minimum nécessaire pour observer des différences significatives entre groupes ou traitements expérimentaux dans le domaine de l’imagerie cérébrale par IRMf, mais nous avons décidé d’inclure 12 animaux afin de garantir une puissance statistique satisfaisante tout en palliant d’éventuels imprévus.
Raffinement
Les techniques d’anesthésie et de chirurgie employées utilisent des appareillages de pointe et seront réalisées par un chirurgien spécialiste de la chirurgie gastrointestinale chez l’humain et de la chirurgie expérimentale sur modèle porcin, avec l’aide de personnels compétents en anesthésie et analgésie porcine. Le suivi et l’analgésie post-opératoires des animaux seront effectués par des personnels compétents de manière à réduire la douleur et la souffrance des animaux. Toutes les interventions chirurgicales seront réalisées sous anesthésie générale et respecteront la charte nationale d’éthique sur l’expérimentation animale. Les scintigraphies gastriques ne seront réalisées qu’en l’absence d’effet au niveau de la variabilité du rythme cardiaque enregistrée via ECG. Cette mesure est non invasive, réalisée sur animaux vigiles préalablement habitués au hamac de contention avec des récompenses alimentaires. Des points limites et critères d’arrêt des souffrances et de l’expérimentation ont été précisément définis, prenant en compte des indicateurs de bien-être général et d’éventuelle souffrance physique post-opératoire non résolue par l’usage d’analgésique, notamment grâce à l’utilisation quotidienne d’une grille de notation dédiée à l’espèce porcine.
Choix des espèces
Le porc est le modèle gros animal de référence pour l’expérimentation médicale. Son système digestif, son anatomie et sa physiologie générales sont proches de ceux de l’humain. Par ailleurs, son cerveau est gyrencéphale, c’est-à-dire qu’il est doté de circonvolutions comme chez les primates, et est d’une taille relativement importante, ce qui permet la réalisation d’imagerie cérébrale fonctionnelle avec les mêmes machines (e.g. IRMf) que chez l’humain. Enfin, le porc est omnivore et présente une préférence spontanée pour la saveur sucrée, qui sera notamment étudiée en imagerie cérébrale dans le cadre de ce protocole de recherche. Porcs juvéniles de 30 à 40 kg, de race Large White x (Piétrain x Landrace) pour les tests sur l'implantation du dispositif (N=4). Miniporc Yucatan jeunes adultes (12 mois) pour les étapes 1 et 2 d'exploration des effets de la stimulation sur l'activité vagale et cérébrale (N=18).
Injection cérébrale postnatale d’AAV chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une injection dans le cerveau sous anesthésie, puis une chirurgie terminale sans réveil pour prélever l'encéphale : 480 souris nouveau-nées porteuses d'une mutation provoquant des calcifications cérébrales sont utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur décrit une intervention de quinze minutes réalisée une seule fois par animal, et signale des troubles moteurs possibles liés aux calcifications ainsi qu'une perte de poids après l'opération. Il annonce pourtant des points limites intermédiaires qui permettraient d'éviter l'euthanasie des animaux, alors que le protocole prévoit la mise à mort de tous. Les 480 souris sont tuées sous anesthésie pour analyse histologique du cerveau.
Objectifs
La forme familiale primaire de calcification cérébrale (PFBC) est une maladie rare présentant une calcification progressive des vaisseaux sanguins cérébraux amenant à leur dégénérescence. Un modèle murin portant une mutation génétique permet d’étudier cette pathologie : il présente une altération du réseau vasculaire et de ses propriétés. Des données préliminaires nous indiquent un lien entre l’altération du développement vasculaire cérébral observé dans ce modèle animal et les astrocytes. Le but de ce projet est de disséquer les voies moléculaires impliquées en diminuant l’expression de certains gènes dans les précurseurs d’astrocytes pendant les premiers stades postnataux.
Bénéfices attendus
Ce projet devrait permettre d'apporter un éclairage nouveau sur les mécanismes physiopathologiques impliqués dans la PFBC et dans le développement de l’unité gliovasculaire du cerveau. Ce projet apportera des éléments de connaissances essentiels sur les modalités des régulations astrocytaires et apportera un éclairage essentiel sur de nombreuses pathologies cérébrales dans lesquelles ces régulations sont altérées pour in fine proposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Procédures
Les interventions sous anesthésie générale (injection intracérébrale puis chirurgie terminale sous anesthésie sans réveil en vue du prélèvement du cerveau) durent 15 minutes et ne sont réalisées qu’une seule fois par animal.
Impact sur les animaux
Le modèle de souris utilisé présente également l’apparition de calcifications cérébrales, ce qui en fait un bon modèle de la pathologie humaine. Ces calcifications peuvent engendrer, chez certains individus, des problèmes moteurs qui seront surveillés. Par ailleurs, les animaux subiront une injection intracérébrale qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie. L'opération peut aussi être à l'origine d'une perte de poids transitoire. Enfin les manipulations par contention et l’injection d’analgésiques et d’anesthésiques peuvent engendrer un stress transitoire.
Devenir
L'euthanasie des animaux sous anesthésie générale est nécessaire pour les analyses histologiques.
Remplacement
L’expérimentation animale sur un système murin est essentielle, car nous ne pouvons le remplacer par un système in vitro où il est impossible de recréer les multiples interactions cellulaires d’un système complexe tels que les interactions entre les astrocytes, les neurones et les vaisseaux sanguins. Il n’existe pas non plus d’autres modèles à l’heure actuelle permettant de répondre à nos questions biologiques. Cependant, des études préliminaires in vitro permettent de valider les plasmides avant qu’ils soient utilisés chez les animaux.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés (480) sera réduit autant que possible et correspond au minimum nécessaire pour obtenir des résultats scientifiques significatifs. Après avoir vérifié la normalité des données et l’absence de différence entre les animaux de même génotype, les effets entreles différents groupes selon le génotype et les stades de développement seront évalués. En cas de non normalité, les tests non paramétriques seront utilisés. Pour réduire la surutilisation des animaux possiblement liée à la chirurgie, les expérimentateurs sont formés et supervisés de façon adéquate. Une attention particulière est portée à la stérilité de tous les instruments et de l'environnement. Pour nos questions, il faut obtenir des observations sur 4 animaux indépendant par condition. Ce chiffre est un minimum qui tient compte de la variabilité possible entre les animaux.
Raffinement
Les élevages sont effectués en groupe avec enrichissement de l’environnement (présence dans la cage de coton pour faire un nid et objets en carton) et toutes les précautions sont assurées afin de respecter au mieux le bien-être animal en accord et en dialogue avec notre SBEA et notre vétérinaire référente. Dans nos expériences où une anesthésie profonde est réalisée, la qualité de l'anesthésie sera systématiquement contrôlée par l'absence de reflexe réponse au pincement de la patte. Les souris subiront une injection intracérébrale de virus de type AAV (adenovirus associé) qui peut entrainer des effets modérés liés à la chirurgie. Les animaux opérés feront donc l'objet d'une surveillance accrue pendant la procédure de chirurgie et les jours suivants. Une procédure avec des points limites gradés a été mise en place pour la surveillance des animaux post opération. Elle est basée sur l'état du pelage (pelage légèrement hirsute, légère piloérection, horripilation marquée), le comportement (Bébé hors du nid (>15 min)), les fonctions corporelles (prise alimentaire, augmentation de la taille par rapport à la portée) et la locomotion (démarche/posture, problèmes de mobilité significatifs/réticence à bouger). Ces points limites intermédiaires permettent la mise en place de soins des animaux seront respectés évitant l'euthanasie des animaux.
Choix des espèces
La souris est un mammifère où les règles et les processus qui régissent le développement du système nerveux central et sa plasticité sont similaires à l'homme. Cette espèce est aussi choisie en raison de l’existence d’un modèle génétique déjà établi. Nous prévoyons 3 stades à étudier, choisis sur la base de nos études préalables (en particulier dans notre laboratoire) qui montrent qu’il existe dès la naissance une altération du répertoire moléculaire des astrocytes dans ce modèle, et une altération du réseau vasculaire dans les jours suivants. Il est par ailleurs important de déterminer si ce sont des phénomènes uniquement développementaux ou maintenu chez l’adulte.
Le rôle du récepteur CAR dans la formation de nouveaux neurones et la plasticité du cerveau
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Pour établir le rôle d'un récepteur dans la formation de nouveaux neurones chez l'adulte, 400 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cœur, du foie et des reins. Chaque animal reçoit une injection quotidienne pendant huit jours et un transpondeur RFID implanté sous la peau derrière l'oreille, avant vingt-quatre heures d'observation filmée par groupes de cinq. Le porteur justifie l'effectif par un calcul donnant dix souris par groupe, répété sur quarante groupes. Les souris dépassant le score de 15 sur la grille d'évaluation sont mises à mort avant le terme prévu.
Objectifs
Dans la présente étude, Nous étudierons le rôle de une protéine présente dans plusieurs parties du cerveau, mais sa fonction exacte reste peu connue. Des études suggèrent qu’il pourrait jouer un rôle important dans la production de nouveau neurones adulte, c’est-à-dire le processus par lequel de nouveaux neurones se forment dans le cerveau adulte, surtout dans l’hippocampe, une zone clé pour la mémoire et l’apprentissage. La production de nouveau neurones adultes est cruciale pour : la mémoire et l’apprentissage, la régulation de l’humeur, la réparation du cerveau après une lésion. Ces processus sont essentiels pour la santé mentale et sont probablement impliqués dans des maladies comme la dépression, la dégénérescence neuronale (maladies neurodégénératives) et la récupération après un traumatisme cérébral. Le projet vise à : Comprendre le rôle de cette protéine dans la production de nouveaux neurones : Étudier comment cette protéine aide à former et intégrer de nouveaux neurones dans une partie du cerveau appelée hippocampe, qui est essentielle pour la mémoire. Voir comment l’absence de cette protéine affecte le cerveau : Découvrir si le manque de cette protéine impacte la capacité du cerveau à s’adapter et à apprendre, ainsi que les fonctions cognitives. Examiner son lien avec les maladies neurodégénératives : Explorer si la perte de cette protéine pourrait être associée à des maladies du cerveau comme la maladie d’Alzheimer ou d’autres formes de dégénérescence neuronale. Une meilleure compréhension de ces mécanismes pourrait aider à développer de nouveaux traitements pour les maladies neurologiques.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre le fonctionnement du cerveau : Ce projet aidera à mieux connaître comment le cerveau produit de nouveaux neurones chez l’adulte et les mécanismes impliqués. Nouvelles pistes pour des traitements : Découvrir le rôle de cette protéine pourrait permettre de créer de nouveaux traitements pour des maladies comme Alzheimer ou des problèmes de mémoire. Progrès en neurosciences : Les résultats de cette recherche enrichiront nos connaissances sur la façon dont le cerveau s’adapte et se répare tout au long de la vie. Impact sur les maladies neurologiques : Les découvertes pourraient contribuer à des avancées pour soigner des maladies affectant le cerveau adulte, comme les maladies neurodégénératives
Procédures
Les souris recevront une injection chaque jour pendant 8 jours. Insertion du transpondeur RFID : sera inséré sous la peau, généralement derrière l’oreille. Test comportemental : Cinq souris sont placées dans une boîte d’observation pendant 24 heures, où elles ont accès à de la nourriture, de l’eau et des jouets. Elles sont filmées par des caméras situées au-dessus de la boîte. Grâce à un transpondeur RFID que chaque animal porte, nous sommes en mesure d’identifier et d’analyser le comportement de chaque souris de manière indépendante. Les souris recevront une injection quotidienne pendant 8 jours. Un transpondeur RFID sera inséré sous la peau, généralement derrière l’oreille. Un test comportemental sera ensuite effectué : cinq souris seront placées dans une boîte d’observation pendant 24 heures, avec accès à de la nourriture, de l’eau et des jouets. Elles seront filmées par des caméras situées au-dessus de la boîte. Grâce au transpondeur RFID, chaque souris pourra être identifiée, permettant une analyse individuelle de leur comportement. Pour le prélèvement du cerveau, une chirurgie terminale sous anesthésie sera réalisée. Après anesthésie profonde confirmée, les souris ne se réveilleront pas.
Impact sur les animaux
Injections répétées peuvent causer un stress temporaire ou un inconfort local. L’insertion de transpondeurs RFID sous la peau pourrait entraîner une douleur à court terme. Les interventions nécessitant une anesthésie générale (comme l’insertion de RFID) peuvent provoquer une légère gêne pendant la phase de réveil. La manipulation fréquente des souris pour les injections ou les observations comportementales peut générer du stress.
Devenir
Les animaux utilisés dans cette étude seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure, conformément aux protocoles éthiques approuvés. Cette décision est justifiée par la nécessité de prélever des échantillons des différents organes (comme le cœur, le foie, les reins, etc.) afin d’effectuer des analyses approfondies à la fois sur le plan histologique, moléculaire et biochimique.
Remplacement
Malgré les efforts pour développer des modèles alternatifs, l’utilisation des souris reste essentielle dans les études sur la neurogenèse adulte en raison de la complexité des processus biologiques impliqués et de la nécessité d’étudier ces mécanismes dans un contexte vivant. Bien que des cultures de cellules souches neurales et des organoïdes cérébraux puissent être utilisés pour étudier la neurogenèse, ils ne reproduisent pas les interactions complexes du microenvironnement cérébral (comme les interactions avec les astrocytes, microglies, et les cellules vasculaires) qui sont essentielles pour comprendre la neurogenèse dans un contexte naturel. Des avancées dans les modèles informatiques permettent de simuler certains aspects de la neurogenèse, mais ces simulations sont limitées par la quantité de données disponibles sur les processus biologiques sous-jacents et par la complexité des mécanismes neuronaux. Les souris ont une neurogenèse adulte active dans des régions spécifiques comme l’hippocampe, ce qui les rend très utiles pour étudier les mécanismes de la formation de nouveaux neurones. De plus, les souris sont génétiquement modifiables, ce qui permet de créer des modèles spécifiques à des moments précis et à des âges différents, pour étudier des gènes comme le récepteur CAR.
Réduction
Pour estimer le nombre d’animaux nécessaires dans notre étude, nous nous sommes basés sur des expériences précédentes et des données obtenues en laboratoire. Nous avons utilisé un outil de calcul statistique qui prend en compte la variabilité des résultats afin de déterminer le nombre optimal d’animaux. Ce calcul nous a permis de définir un nombre de 10 souris par groupe. Les données recueillies seront ensuite analysées avec des outils statistiques, et nous comparerons les résultats entre les groupes traités et les groupes placebo. Pour ce faire, nous aurons besoin de 40 groupes de 10 souris chacun, soit un total de 400 souri. Ce protocole permet de minimiser le nombre d’animaux tout en garantissant des résultats scientifiques fiables et éthiques.
Raffinement
Toutes les mesures nécessaires pour prévenir tout impact négatif sur le bien-être des animaux seront mises en œuvre tout au long du projet. L’expérience respectera les impératifs éthiques, en intégrant des méthodes d’hébergement adaptées, un enrichissement de l’environnement, ainsi que la prévention de toute douleur, inconfort, stress ou détresse chez les animaux. Ils seront placés dans des cages avec une maison en carton et du coton, pour répondre à leurs besoins physiologiques et comportementaux. La manipulation des animaux sera effectuée par un personnel qualifié en expérimentation animale, doté d’une expertise spécifique des procédures décrites. Les animaux seront surveillés quotidiennement et leur poids sera contrôlé une fois par semaine. Des anesthésiques et des analgésiques seront utilisés pendant les procédures afin de réduire la douleur. Après les interventions, de la nourriture et de l’eau gélifiée seront placées au sol pour faciliter leur alimentation. Enfin, des points limites précis ont été établis pour surveiller étroitement les effets des interventions. Les animaux présentant l’un des points limites ou une note supérieure à 15 sur cette grille seront systématiquement euthanasiés.
Choix des espèces
Dans cette étude, nous utiliserons des souris âgées de 2 à 3 mois, ce qui correspond à l’adolescence chez l’humain (environ 15-20 ans). Nous nous concentrons sur le rôle d’une protéine spécifique dans la production de nouveaux neurones chez l’adulte. À ce stade de leur vie, les souris présentent une activité maximale de création de nouveaux neurones, un processus qui diminue avec l’âge, tant chez la souris que chez l’humain. Nous inclurons des souris mâles et femelles car certaines régions du cerveau, ainsi que les risques, l’incidence et la gravité des maladies neurologiques, varient selon le sexe.
Neuroprotection dans le syndrome de déficit en GLUT1
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Implantés d'électrodes d'électroencéphalogramme dès l'âge de 14 jours, puis porteurs de mini-pompes osmotiques remplacées chaque mois, 200 rats sont utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue pour prélèvement d'organes. S'y ajoutent trois ponctions lombaires, trois examens par résonance magnétique sous anesthésie et un test de dépression associé à une restriction alimentaire. Il s'agit de tester des esters de cétones et du lactate comme substituts au régime cétogène chez un modèle de déficit en GLUT1, maladie rare dont un quart des patients ne répond pas à ce régime. Le porteur retient le rat plutôt que la souris parce que le modèle murin ne fait pas de crises d'épilepsie et parce que l'imagerie par résonance magnétique gagne en résolution sur un animal plus gros.
Objectifs
La diffusion du glucose à travers les barrières tissulaires est facilitée par une famille de protéines dont le transporteur de glucose de type 1 (GLUT1). Le syndrome de déficience en GLUT1 est un syndrome de défaillance énergétique cérébrale causée par une altération du transport du glucose à travers les barrières du tissu cérébral. Cette maladie rare est caractérisée par une épilepsie pédiatrique résistante aux traitements, un retard de développement et des troubles moteurs complexes. Les patients sont traités efficacement avec des thérapies diététiques cétogènes (régime riche en graisses) qui fournissent un carburant supplémentaire, à savoir des corps cétoniques (composés produits par le foie lors de la dégradation des acides gras), pour le métabolisme énergétique du cerveau. Cette thérapie est inefficace pour 1/4 des patients. Le projet vise à tester l'efficacité de l'apport de nouvelles sources énergétiques : des esters de cétones (permettant une cétose (brulûage des graisses pour produire de l'énergie) thérapeutique plus rapide que le régime cétogène) et le lactate, sur un modèle de rat génétiquement réprimé pour GLUT1.
Bénéfices attendus
Le bénéfice attendu est une neuroprotection de l'administration des esters de cétones ou du lactate, permettant de s'affranchir du régime cétogène. En effet, ce régime contraignant est souvent mal vécu par les patients. Si ces stratégies s'avèrent neuroprotectrice et peuvent remplacer ce régime, des études plus approfondies pourraient permettre la mise en place d'un protocole d'administration d'esters de cétones ou de lactate, améliorant la qualité de vie de ces patients.
Procédures
Les animaux subiront les interventions suivantes : - biopsie de la queue pour génotypage : 1 fois, 5 min - mise en place du système d'enregistrement EEG, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale , réalisée 1 fois, durée 20 min - implantation des mini-pompes osmotiques permettant de délivrer le lactate, sous anesthésie gazeuse : procédure chirurgicale, réalisée 1 fois par mois, 10 min. - injection intrapéritonéale : 2 fois, quelques secondes - ponction lombaire : prélèvement sur animaux anesthésiés , réalisés 3 fois, durée 10 min - prélèvements pour dosages biologiques : 4 fois, quelques secondes - examens par résonance magnétique nucléaire : examen non-invasif sous anesthésie gazeuse , réalisé 3 fois, durée : 45 min. gavage pré-IRM, réalisé 2 fois, durée 30 sec. La neuroprotection sera évaluée au niveau fonctionnel par des tests de comportements moteurs (1 fois, 10 min), de réflexes (3 fois, 5 min) et de mémoire (1 fois, 5 min). La dépression sera évaluée par un test comportemental associé à une restriction alimentaire (1 fois, test sur 4 jours).
Impact sur les animaux
La biopsie de la queue réalisée pour le génotypage entraînera une douleur légère de courte durée. L'implantation des mini-pompes osmotiques pourra entraîner une douleur modérée. Les prélèvements pour les mesures biologiques pourraient entraîner une nuisance légère. Les anesthésies (pose EEG et examens IRM) pourraient induire une détresse cardio-respiratoire, mesurée grâce à un capteur placé sous l'animal, du fait de la variabilité de la sensibilité aux anesthésiques. Une anesthésie prolongée pourrait mener à la déshydratation de l'animal. Suite à l'opération, la plaie suturée pourrait s'infecter ou présenter des difficultés à cicatriser (risque faible). Les différents tests comportementaux pourraient induire stress et anxiété pour les animaux. Lors du test de comportement de dépression, la nécessité d'une restriction alimentaire pourrait entraîner une perte de poids et être une situation angoissante pour les animaux (nuisance modérée).
Devenir
Mise à mort des animaux pour prélèvement d'organes pour une analyse post-mortem (n = 200)
Remplacement
Des modèles cellulaires de déficit en GLUT1 existent, cependant, ces modèles s'affranchissent de la (patho)physiologie de l'organisme entier. Le but final de ce projet de recherche a une envergure translationnelle et nécessite donc une approche intégrative. De ce fait, ce projet nécessitant le fonctionnement du cerveau dans son intégrité afin de tester l'effet neuroprotecteur des molécules et de pouvoir envisager une application rapide chez l'Homme, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle.
Réduction
Une réduction des animaux est rendue possible par le fait que l'imagerie par résonance magnétique est une technique d'investigation non-invasive qui permet un suivi des animaux ainsi que la réalisation de tests comportementaux, sur les mêmes animaux. Les différences intergroupes seront mises en évidence par des tests statistiques.
Raffinement
Au niveau de l'hébergement, les animaux seront acclimatés à leur arrivée et seront élevés en cage collective, sur une litière en peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi d'un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Les chirurgies (implantation des pompes osmotiques, pour le groupe traité avec du lactate et mise en place des systèmes d'enregistrement d'électroencéphalogramme, ponction lombaire) seront réalisées sous anesthésie avec une antalgie adaptée. Les règles d’asepsie seront respectées. Une surveillance accrue, des soins post-opératoires et des mesures de gestion de la douleur seront réalisés. Une évaluation objectivée de l’état des animaux avec l’utilisation de grille d’évaluation/fiche de suivi, suivie de soins en cas de détection de souffrance seront mis en place. Pour les imageries par résonance magnétique sous anesthésie, un monitoring de la respiration sera mené afin de prévenir tout arrêt cardiorespiratoire. Tout au long de l’étude, les points limites adaptés et gradés seront appliqués, avec si nécessaire une prise de décision de mise à mort.
Choix des espèces
Il existe un modèle du syndrome de déficit en GLUT1 chez la souris mais ce modèle en présente pas de crises d'épilepsie. De plus, l'imagerie par résonance magnétique est une technique non-invasive mais qui présente une faible sensibilité : plus les modèles sont gros et meilleure est sa résolution. Le rat est donc un modèle plus approprié que la souris. Les animaux seront utilisés de 14 jours de vie à 125 jours. Les dispositifs d'enregistrement d'électroencéphalogramme seront implantés à 14 jours de vie afin de pouvoir monitorer dès le sevrage les effets des différents traitements. Les animaux seront suivis jusqu'à 125 jours pour mesurer les effets des différents traitements sur le court et le long terme afin d'optimiser le pouvoir translationnel du projet.
Evaluation du Potentiel therapeutique et neuroprotecteur d’un estrogène naturel dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une incision entre l'œil et l'oreille, l'os du crâne dégagé pour poser une sonde laser-Doppler, et l'artère cérébrale moyenne obstruée pour provoquer un accident vasculaire : 186 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent la substance testée pendant les sept jours précédant l'opération, ou au moment où le sang est rétabli. Toutes sont tuées pour récupérer leur sang et leur cerveau. Le porteur écrit que "la chirurgie en soi n'induit pas de douleur ou de souffrance" et ne signale qu'une perte de poids d'environ 10 % dans les 48 heures, pour une intervention qui consiste à provoquer un infarctus cérébral.
Objectifs
L’accident vasculaire cérébral (AVC) constitue la première cause de handicap acquis chez l’adulte, la deuxième cause de démence et la deuxième cause de mortalité : c’est donc un enjeu majeur de santé publique. Dans 85% des cas, l’AVC est d’origine ischémique, c’est-à-dire qu’il provient de l’occlusion d’une artère cérébrale. Le seul traitement disponible en phase aiguë d’un AVC ischémique (dans les premières heures) consiste à déboucher l’artère occluse (recanalisation) pour restaurer le flux sanguin. A ce jour, il n’y a pas de traitement approuvé pour protéger le tissu cérébral. Cette étude s’inscrit dans le cadre de développement de stratégies neuroprotectrices après un accident vasculaire cérébral ischémique . Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un traitement par un estrogène naturel modulateur des récepteurs des oestrogènes qui affecte de manière minime les paramètres de coagulation, dans un modèle murin d’accident vasculaire cérébral. Le mode d’action unique de cet estrogène se traduit par un profil bénéfice/risque amélioré par rapport aux autres œstrogènes. Nous évaluerons l’impact du traitement sur le volume de la lésion cérébrale, de la perte des cellules neurales et des troubles neurologiques et moteurs. Nous utiliserons un modèle expérimental d’ischémie cérébrale par occlusion de l’artère cérébrale moyenne suivi de reperfusion .
Bénéfices attendus
Notre projet a pour objectif d’évaluer le potentiel thérapeutique et neuroprotecteur d'un eostrogène naturel dans un contexte d’accident vasculaire cérébral. Cette étude permettra d’apporter de nouvelles connaissances précliniques qui pourront être à la base d’une proposition de nouvelles stratégies neuroprotectrices susceptible de réduire le dommage ischémique cérébral et corriger les déficits neurologiques et moteurs après la survenue d’un accident vasculaire cérébral (AVC).
Procédures
Les souris subiront une chirurgie au niveau du cou qui dure moins de 20 min pour induire une ischémie cérébrale suivie de reperfusion.. Une substance susceptible de réduire les effets délétaires de l'ischémie ou son solvant sont injectés aux souris soit avant la chirurgie pendant 7 jours ( effet neuroprotecteur) soit après la chirurgie à la reperfusion (effet thérapeutique) La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale. Une incision de la peau est effectuée entre l’oeil et l’oreille gauches et l’os ducrâne est dégagé, pour poser une sonde de laser-Doppler sur la boîte crânienne afin de mesurer le débit sanguin cérébral dans le territoire de l’artère cérébrale moyenne. La peau est refermée après la pose de la sonde.
Impact sur les animaux
La chirurgie est pratiquée sous anesthésie générale . La chirurgie en soi n’induit pas de douleur ou de souffrance. Une perte de poids d’environ 10% peut survenir dans les 48h qui suivent la chirurgie.
Devenir
Tous les animaux du projet seront euthanasiés pour récupérer le sang et le cerveau afin de faire des analyses.
Remplacement
Ces études nécessitent des expériences in vivo utilisant des animaux. Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d’autres modèles n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants. Le projet a pour but d’étudier l’effet dans le contexte de l’ischémie cérébrale, qui met en jeu des mécanismes à l’échelle de l’organisme entier (système nerveux, système vasculaire et la connexion entre les organes). Il nécessite donc l’utilisation d’animaux vivants. Les AVC ont des impacts au niveau de différentes structures du cerveau ainsi que des conséquences physiologiques sur l’ensemble de l’organisme. Le modèle expérimental d’ischémie cérébrale in vivo permet de reproduire une grande partie des signes cliniques observés chez lles patients après AVC et d’évaluer in vivo les effets sur le cerveau et sur la récupération fonctionnelle (score neurologique, coordination motrice). Actuellement, Il n’existe aucun modèle in silico ou in vitro permettant de mimer les impacts d’un AVC ou d’étudier les effets d’un traitement. Les études in silico ou in vitro ne permettant pas d’étudier l’efficacité d’un traitement visant à limiter la taille des lésions cérébrales et les déficits sensori-moteurs. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable.
Réduction
Le nombre minimal et suffisant d’animaux à utiliser a été déterminé en tenant compte de la sensibilité des techniques utilisées et de la variabilité attendue du modèle sur la base de nos travaux antérieurs et de la littérature. Le nombre d’animaux par série expérimentale a été estimé au plus juste et est réduit au minimum, de façon à mettre en évidence des différences statistiques avec un risque d’erreur moins que 5%, sur la base de notre expérience de ce modèle et de nos études antérieures.. Nous avons optimisé les techniques de façons à évaluer le maximum de paramètres sur les mêmes groupes d’animaux (tests de comportement, taille de l’infarctus, et études immunohistochimiques au niveau du cerveau sont évalués sur les même lots d’animaux.
Raffinement
Les conditions de travail pour l’utilisation des souris ont été raffinées afin de limiter leur angoisse, stress et douleur lors des manipulations. Les expériences sont réalisées par du personnel qualifié en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Une attention particulaire est portée pendant la chirurgie en particulier le maintien de la température corporelle grâce à une couverture chauffante. lLs souris sont observées régulièrement (à 6h et quotidiennement après l’ischémie) - les souris sont pesées avant et quotidiennement après ischémie pour évaluer la perte de poids. Tout sera mis en œuvre pour réduire le stress, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées tout le long de l’étude jusqu’à la mise à mort de l’animal. Les critères d’arrêt de la douleur, de la souffrance et de l’angoisse seront pris en compte. Si après la chirurgie, un dépassement des points limites précédemment fixés est constaté, l’animal sera mis à mort dans des conditions éthiques.
Choix des espèces
La souris est un animal pour lequel les modèles d’étude in vivo sont bien établis et maitrisés. La souris (mus musculus) est avec le rat l’espèce animale la plus étudiée dans le domaine de l’ischémie cérébrale. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons rend cette espèce particulièrement intéressante dans le cadre de notre étude. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. La physiopathologie est bien établie, ce qui nous permettra d’interpréter nos résultats de manière fiable. Souris adultes (8-12 semaines) pour lesquels le modèle d’ischémie cérébrale est bien validé
Elevage avec identification et génotypage invasifs
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système nerveux
Rats : 1000
Produits sur place, dans une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat, 20 000 souris et 1 000 rats âgés de 7 à 21 jours vont être identifiés et génotypés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Chaque nouveau-né reçoit un tatouage digital ou une puce sous-cutanée, puis l'extrémité de sa queue est amputée, sans anesthésie ni analgésie locale, le porteur indiquant qu'un produit appliqué au bout de la queue serait léché par la mère. Hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère et modification du comportement liée à la douleur figurent parmi les effets indésirables reconnus, présentés comme très rares. Les animaux au génotype recherché partent en expérimentation ou en reproduction, les autres sont réorientés vers d'autres projets ou vers la formation, et ceux qui ne trouvent aucun emploi sont tués.
Objectifs
L'objectif de cette demande est d’identifier et de génotyper l'ensemble des animaux génétiquement altérés produits dans notre Etablissement Utilisateur, le génotypage permettant d'identifier les animaux porteurs d'une modification génétique d'intérêt. Il s’agit d’un double geste technique invasif qui consiste en un tatouage digital ou en l’implantation d’une puce d’identification, suivi d’une biopsie de queue réalisé sur animal âgé de 7 à 21 jours. Cette demande d’identification et de génotypage se justifie par la nécessité de : - sélectionner les animaux d’intérêt pour l’expérimentation (inclus dans d'autres demandes d'autorisation de projet) - sélectionner les animaux d'entretien des colonies - sélectionner les animaux pour la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d’organes ou de tissus pour des études ex vivo. Cette demande couvre environ une trentaine de lignées de souris et une lignée de rat.
Bénéfices attendus
Les bénéfices attendus de la procédure d’identification et de génotypage sont de permettre une sélection des animaux d’intérêt, à la fois pour l'élevage, la formation, le maintien des compétences, les prélèvements d'organes ou de tissus pour études ex vivo. L’identification par tatouage/pucage permet : - d’identifier individuellement les animaux ; - d’identifier un grand nombre d’animaux ; - d’identifier les animaux de manière permanente ; - de ne pas mutiler les animaux ; - d’éviter le recours à l’anesthésie. Le génotypage par biopsie de l’extrémité de la queue permet : - l’obtention de résultats fiables; - de minimiser les risques de contaminations entre échantillons ; - d’éviter le recours à l’anesthésie.
Procédures
Les animaux identifiés et génotypés sont soumis 1) à l'implantation en sous-cutané d'une puce ou en un tatouage digital ) 2) à une bisopsie du bout de la queue. L'implantattion d'une puce est réalisée une seule fois et le geste dure une dizaine de seconde. Le tatouage est réalisé une seule fois et la contention dure de 30sec à 1 min. La bisopsie de queue est réalisée une unique fois et dure 5sec.
Impact sur les animaux
le tatouage ou l'implantation d'une puce d'identification et la biopsie de queue peuvent entraîner une légère douleur. La contention de l'animal durant ces gestes peut être source de stress. Dans de très rares cas, certains effets indésirables supplémentaires peuvent survenir : hémorragie, rejet du nouveau-né par la mère, modification du comportement liée à la douleur.
Devenir
Les animaux ayant un génotype d'intérêt partirons en expérimentation ou seront utilisés pour perpétrer l'élevage. Les animaux dont le génotype n'a pas d'intérêt scientifique seront utilisés dès que possible dans d'autres projets ou pour formation. Les animaux ne pouvant être utilisés dans les projets, les formations ou l'élevage seront euthanasiés.
Remplacement
A ce jour, les prélèvements non invasifs à base de salive ou de poils ne permettent pas de procéder à l'identification d'animaux génétiquement modifiés de façon fiable. Un doute sur les résultats conduirait à la nécessité de procéder à nouveau à des prélèvements. Une erreur se traduirait par la mise en accouplement d’animaux n’ayant pas les caractéristiques attendues. Cela impliquerait : une augmentation du nombre d’animaux produits inutilement ; la naissance d’animaux non viables ; l’utilisation d’animaux génétiquement sans intérêt dans des projets expérimentaux induisant des résultats erronés et non exploitables (si l’erreur n’est pas détectée précocement). Il est donc indispensable de recourir à une méthode fiable. Or il n’existe pas actuellement de méthodes non invasives aussi performantes que les tatouages/puçage et la biopsie de queue.
Réduction
A ce jour, nous ne disposons pas d’autres moyens aussi efficaces nous permettant de sélectionner les animaux transgéniques. Le responsable de l’Etablissement et l'équipe de zootechnie établissent les plans d’élevage en amont, en concertation avec le porteur de projet, afin de réduire autant que possible le nombre d’animaux générés et donc d’animaux identifiés et génotypés. En outre, nous favorisons l’utilisation des animaux au génotype sans intérêt dans d’autres projets ou des formations afin de ne pas élever ces animaux à ces seules fins et de réduire le nombre d’animaux global produits dans l’Etablissement. De la même façon, certains animaux non utilisés dans les projets sont conservés avec d’autres animaux qui auraient été isolés sans cela.
Raffinement
Les actes d’identification et de génotypage sont réalisés par un personnel expérimenté, formé par tutorat. La parfaite maîtrise du geste par les agents qualifiés permet de réduire l’inconfort et le stress ressentis par l’animal. Ces identifications et génotypages des animaux sont réalisés avec du matériel approprié permettant un geste rapide et précis dans le respect des conditions d’asepsie établies dans l’Etablissement. Par ailleurs, la procédure est réalisée dans une salle d’expérimentation calme. Enfin, dès que la procédure est terminée, les nouveau-nés sont remis en présence de leur mère. Sur nouveau-nés pas de médication envisagée car tout anesthésique local serait difficilement applicable au bout de la queue et serait ensuite léché par la mère, ce qui engendrerait des effets indésirables. Dans la balance bénéfice risque, ce sont les gestes maitrisés et les instruments appropriés qui sont garant du raffinement de la procédure pour limiter toute douleur, souffrance et stress. Des points d'attention précis (points limites gradés) et des mesures conservatoires adéquates sont établis en cas notamment de saignement, rejet de la mère ou perte d'appétit. Si les actions misent en place n'ont pas les résultats escomptés, l'équipe de zootechnie prends la décision sans délai de mise à mort d'un animal. Les animaux sont hébergés dans une animalerie agréée avec eau et nourriture ad libitum, dans des conditions de température et d'hygrométrie contrôlées, avec un cycle jour/nuit de 12h. Ils sont hébergés en groupe sociaux avec un enrichissement adapté pour reproduire les comportements naturels (tunnel/dômes pour se refugier, pelote de bois pour la nidification, bâtons à ronger) et leur bien-être est évalué quotidiennement par des personnels formés et compétents.
Choix des espèces
Le modèle utilisé dans ce projet est le modèle rongeur. La souris et le rat représentent une espèce de référence pour l’étude du système nerveux central chez les vertébrés supérieurs. L’organisation du système nerveux du rongeur permet une extrapolation raisonnable des résultats obtenus à l’espèce humaine. Par ailleurs, les rongeurs peuvent être manipulés génétiquement, fournissant des outils essentiels à la compréhension des mécanismes neurobiologiques et des mécanismes neuronaux impliqués dans de nombreuses maladies et déficits cognitifs. Grâce aux modèles transgéniques, il est aussi possible de relier les données de la génétique humaine des maladies à l'altération de molécules/récepteurs spécifiques dont la fonction peut être analysée avec des modèles précliniques de ces maladies. Les rongeurs sont donc des animaux sur lesquels les évaluations comportementales dans le domaine des neurosciences sont faciles à conduire et maitrisées au sein du laboratoire. Ce sont des animaux de petite taille dont l'élevage est facilement réalisable et peuvent donc être facilement hébergés au sein de l'animalerie de l'unité. Pour la plus grande majorité des lignées, les animaux sont identifiés et génotypés entre 7 et 21 jours, âge où les gestes sont réalisés plus facilement et plus rapidement car la contention est plus facile. La biopsie est également plus aisée à cet âge et moins douloureuse car le cartilage n'est pas encore complètement formé. A cet âge : - les animaux sont aisément manipulables ; - le cartilage est souple ; - les groupes sociaux constitués sont stables. Toutefois, certains animaux peuvent être identifiés et génotypés précocement si les projets expérimentaux auxquels ils sont destinés l’exigent. Nous éviterons autant que possible l’identification et le génotypage d’animaux adultes avec ces méthodes.
impact du microbiote intestinal sur le comportement et le tractus gastrointestinal sur la souris dans le context de l’autisme
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
Gavées une fois par jour pendant douze semaines, soumises à des injections intrapéritonéales quotidiennes et à une incision du bout de la queue pour un prélèvement de sang, 5 832 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées pour prélever leurs organes. L'objet du projet consiste à reproduire chez la souris des anomalies de comportement et de transit intestinal associées à l'autisme, en administrant des métabolites bactériens à des animaux dès l'âge de quatre semaines. Le porteur annonce des batteries de tests évaluant le comportement social, les comportements répétitifs et l'anxiété, avec des durées allant de quatre minutes trente à soixante-douze heures, sans nommer un seul de ces tests.
Objectifs
Le microbiote intestinal est un partenaire crucial pour la santé humaine. Des études récentes montrent l’existence d’un axe de communication microbiote-intestin-cerveau par lequel le microbiote peut influencer le comportement. L'autisme, avec une prévalence de 1% s'accompagne de troubles comportementaux (déficits d'intéraction sociale, stéréotypies) et de comorbidités (anxiété, dépression, hyperactivité). Aussi les patients autistes ont fréquemment des symptômes gastro-intestinaux (constipation, diarrhée, douleurs abdominales, ballonnements) associés à des altérations des abondances de certaines bactéries de leur microbiote intestinal et des petites molécules qu’elles produisent, les métabolites microbiens. Ces anomalies sont aussi reproduites dans des modèles souris d’autisme. Les causes de l’autisme sont encore méconnues, mais des dérégulations de l’axe cerveau-intestin-microbiote semblent y jouer un rôle. Cela suggère que des thérapies ciblant les bactéries du microbiote ou bien les métabolites qu’elles produisent pourraient être bénéfiques, comme par exemple le transfert de microbiote, les probiotiques et les prébiotiques. Leur efficacité reste cependant à démontrer. Des métabolites issus de la dégradation de l’alimentation par les bactéries du microbiote présentent des niveaux anormalement élevés ou bas dans l'urine, le plasma et les selles de patients autistes. Les bactéries productrices et consommatrices de ces métabolites sont aussi fréquemment dérégulées chez les patients autistes. Dans ce projet de recherche, nous allons identifier parmi ces métabolites microbiens et ces bactéries ceux et celles capables d'induire chez la souris des anomalies comportementales et/ou gastro-intestinales. Aussi, nous identifierons leur mode d'action en utilisant des approches pharmacologiques. Également, nous identifierons des métabolites et des traitements probiotiques capables de restaurer les anomalies du comportement et les troubles gastro-intestinaux dans des modèles d’autisme. Ce projet ouvrira la voie à une meilleure compréhension de l’autisme et à de nouvelles thérapies.
Bénéfices attendus
Cette étude présente un intérêt translationnel car l'étude apportera des connaissances sur les mécanismes physiologiques et neurobiologiques fondamentaux responsables des troubles du spectre de l’autisme et de l’implication du microbiote intestinal. Ce projet permettra de faire avancer les connaissances sur l'étiologie de l'autisme et pourra contribuer à valider pré cliniquement dans des modèles animaux des stratégies thérapeutiques ciblant le microbiote pour les troubles du spectre de l'autisme.
Procédures
• Identification par injection sous-cutanée de puce : durée 10s ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Test de comportements évaluant le phénotype social : durée 4min30s, 10min, 12min, 25min et 72h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant les comportements répétitifs : durée 5 à 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Tests de comportements évaluant l’anxiété : durée 5min, 6min et 10min en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Evaluation de la physiologie intestinale : durée 60min, 90min et 6h en fonction des tests ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Prélèvement de sang de 100µL après incision de l’extrémité de la queue : durée 10min ; fréquence une seule fois dans la vie de l’animal. • Gavage : durée 5s ; fréquence allant d’une seule fois à une fois par jour pendant 12 semaines en fonction de la procédure. • Injections intrapéritonéales : durée 5s ; fréquence une seule fois à une fois par jour pendant 10 jours en fonction de la procédure. • Anesthésie à l’isoflurane et imagerie sur animal anesthésié : durée 10 min ; fréquence 5 fois sur 48h en fonction de la procédure.
Impact sur les animaux
Ce projet obéit à la règle des 3R. Cependant, certains des traitements proposés pourraient impacter le métabolisme, le comportement et\ou la physiologie intestinale des groupes d’animaux traités par rapport aux groupes témoins. Pour détecter ces changements, un suivi au moins 2 fois par semaine du poids des animaux, de leur consommation en eau et nourriture permettra d’évaluer l’état physiologique global de l’animal en réponse au traitement. Certains des tests comportementaux prévus dans les procédures sont générateurs d’un inconfort faible à moyen mais de courte durée et qui n’induisent pas de signes caractéristiques de mal-être chez la souris (perte de poids, prostration, poil hirsute, absence de toilettage ...). De plus, l’inconfort sera limité à la durée du test. Concernant l’évaluation de la physiologie intestinale, les tests provoqueront un inconfort mais limité à la durée du test. Un prélèvement sanguin sera réalisé lors du test de perméabilité intestinale, cependant un volume faible de sang sera prélevé et l’inconfort sera limité au temps nécessaire au prélèvement. Dans le cas du traitement administré par voie intrapéritonéale, une attention particulière sera portée à l’état du site d’injection (gonflement, rougeur).
Devenir
Les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure dans le but de réaliser des prélèvements d'organes pour analyses biologiques, indispensable pour une meilleure comprehension des mécanismes associés à notre contexte d'étude.
Remplacement
La littérature scientifique sur notre sujet a permis de sélectionner les métabolites microbiens, les bactéries et les substances pharmacologiques les plus pertinents, ainsi que les quantités et concentrations utilisées respectant un contexte physiologique. Avant les expérimentations sur l’animal, des expériences in vitro ont été et seront réalisées sur des cultures bactériennes permettant de mieux comprendre leurs mécanismes d’action. Cependant, pour évaluer l'impact du traitement avec des métabolites microbiens, des probiotiques et une substance pharmacologique à l'échelle de l'organisme entier au niveau gastro-intestinal et comportemental, le recours à l'animal sera nécessaire. En effet, l’étude du comportement animal fait intervenir des interactions systémiques entre plusieurs organes et des processus physiologiques intégrés. Notre étude doit donc nécessairement se faire sur l’animal entier car ce n'est pas modélisable in vitro pour l'instant.
Réduction
Pour l’obtention de résultats statistiquement exploitables, nous utiliserons des tailles d’échantillon garantissant une puissance statistique suffisante pour l’analyse des résultats comportementaux, le nombre de souris ayant été réduit autant que possible. Des calculs réalisés avec un logiciel dédié ont permis de déterminer les effectifs de groupe nécessaires pour observer des effets de taille moyenne avec les tests statistiques les plus pertinents. Les résultats seront analysés avec un logiciel dédié. Un total de 5832 animaux est requis pour ce projet.
Raffinement
Les paramètres suivants basés sur l'expérience de l'expérimentateur seront suivis pour nous permettre d'assurer le suivi du bien-être animal : le poids corporel, l'apparence physique, des signes cliniques objectifs tel qu’un changement de température corporelle suite à une alerte sur un animal, des comportements anormaux ou non provoqués, des réponses comportementales à des stimuli spécifiques ainsi que l'état général du site d'injection et un suivi de l’aspect des fèces indiquant ou non la présence de diarrhée. Nos conditions d’élevage comprennent une stabulation par groupes d'au moins quatre animaux, un enrichissement de l'environnement (coton pour nidifier, maison), ainsi qu'un contrôle strict de la température et de l'humidité. Un suivi quotidien des animaux est également assuré par le personnel animalier et par nous même dans le cadre des expérimentations. La majorité des procédures induiront un inconfort faible et de courte durée, sans causer de dommages. Pour les procédures affectant potentiellement le bien-être des animaux, un suivi basé sur une grille de score pourra être établi et permettra de détecter toute souffrance et de décider de la suite à donner, notamment en appliquant des points limites précoces et adaptés.
Choix des espèces
L'autisme cause des anomalies du comportement handicapantes. Toutes ces anomalies sont modélisables chez la souris à l’aide de batteries de tests de comportement réalisables chez la jeune souris ou l’adulte. Aussi, la physiologie intestinale de la souris (perméabilité, motilité intestinale et colonique) ne peut être appréciée que chez l'animal vivant. Les études précliniques sur l'autisme imposent donc des études in vivo, chez l’animal, afin d'identifier des mécanismes difficilement modélisables in vitro et de développer de nouvelles approches thérapeutiques. Puisque nous nous intéressons aux conséquences neurodéveloppementales de l’exposition aux métabolites Microbiens, nous préférons travailler dans une fenêtre où le système nerveux est encore capable d’une certaine plasticité (adolescence 4 semaines). Pour les procédures 1 et 2, nous recevrons les animaux à l'âge de 3 semaines, juste après le sevrage. Nous commencerons le traitement dans la 4ème semaine et évaluerons le comportement et le tractus GI après 4 semaines de traitement, soit lorsque les animaux auront entre 8 et 10 semaines. Pour les procédures impliquant un traitement pour restaurer les phénotypes induits par les métabolites microbiens (procédure 3), les animaux seront suivis jusqu'à l'âge de 14-16 semaines.
Modulation de la transmisson mecanosensorielle par les interneurones spinaux inhibiteurs dans un contexte de troubles autistiques
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Les souris chez qui l'isolement en couveuse ou les soins de blessures n'améliorent rien sont tuées. 270 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue pour le prélèvement de leur moelle épinière ou pour des enregistrements électrophysiologiques. Chacune subit, à un âge de 12 à 24 jours, une chirurgie d'une heure à une heure trente destinée à faire exprimer des virus porteurs de transgènes dans la corne dorsale de la moelle, et 120 d'entre elles reçoivent en plus trois à cinq injections d'un activateur neuronal. Le projet porte sur les troubles sensoriels de l'autisme, et le porteur annonce des tests de comportement sensitif et cognitif sans préciser lesquels, ainsi qu'un isolement des souris jusqu'à douze heures pendant ces essais.
Objectifs
Le projet vise à caractériser le rôle des neurones inhibiteurs de la moelle épinière dans le développement des troubles sensoriels qui accompagnent les troubles du spectre de l'autisme (TSA), dans le but 1) de mettre en place de nouveaux outils de diagnostic, et 2) de mettre au point et raffiner certains traitements existants.
Bénéfices attendus
Le projet permettra de mieux comprendre le rôle des réseaux spinaux inhibiteurs dans le controle de la transmission des informations mecanosensorielles. Il pourra servir de base au développement de nouvelles approches (médicamenteuses ou non) visant à corriger ou à réduire les déficits mécanosensoriels fréquemment présents chez les individus atteints de TSA. Un bénéfice annexe du projet pourrait résider dans le développement de nouveaux test diagnostics permettant de classer les troubles autistiques et préciser leur sévérité, de façon à mettre en place des stratégies thérapeutiques adaptées.
Procédures
Les animaux (270 au total) subissent une intervention chirurgicale d'une durée comprise entre 1h00 et 1h30 visant à exprimer des virus porteurs de transgènes dans la corne dorsale de la moelle épinière. Une partie des animaux (120) reçoit en outre des injections intrapéritonéales d'une substance pharmacologique (activateur neuronal, entre 3 et 5 injections par animal) avant d'être testés pour leur comportement sensitif et cognitif
Impact sur les animaux
L'injection spinale et/ou corticale de virus requiert une opération chirurgicale. On peut donc s'attendre à observer les effets indésirables classiquement associés aux chirurgie (douleurs post-opératoires, perte de poids, déshydratation, etc). Lors des éssais comportementaux, les animaux sont transitoirement isolés les uns des autres (maximum 12h00), ce qui peut constituer une source de stress.
Devenir
A la fin de chaque procédure tous les animaux seront mis à mort. Chaque expérience se termine par la mise à mort de l'animal, soit pour collecter les tissus (moelle épinière), soit pour des observations histologiques, soit pour des enregistrements électrophysiologiques.
Remplacement
Il n'existe pas à l'heure actuelle de méthode permettant de reconstituer les réseaux neuronaux à partir de cutlures cellulaires. Il n'exitse pas actuellement de modèle permattant de molèliser par des méthodes informatiques tout ou partie de la complexité des réseaux de la moelle épinière. Le projet comporte des expériences de comportement qui ne peuvent être réalisées que dans le cadre d'une expérimentation animale.
Réduction
Afin de ne pas utiliser plus que le nombre minimal d'animaux nécessaire, nous avons estimé, sur la base des études précédentes, le nombre d’animaux nécessaires pour atteindre une signification statistique (stratégie : études antérieures au sein de l'équipe et étude bibliographique). Dans la mesure du possible, les mêmes animaux sont utilisés pour l'ensemble des expériences de comportement.
Raffinement
L'ensemble des mesures suivantes sont mises en œuvre pour réduire l'inconfort des animaux i) Surveillance quotidienne assurée par des expérimentateurs formés à l'expérimentation animale et au bien-être animal. ii) Vérification de l'état de l'animal (avant chaque manipulation) selon les critères généraux ainsi que les signes cliniques spécifiques à la manipulation. iii) Les critères d’évaluation de souffrance sont l’apparence/état général ainsi que le comportement de l’animal. Tout signe de souffrance, douleur, détresse constaté lors de cette observation déclenchera une réponse immédiate et adaptée (mesures conservatoires à privilégier, par exemple : isolement temporaire de l’animal, réchauffement en couveuse, soins des blessures si bagarres entre congénères). Si aucune amélioration n'est constatée après cette intervention l’expérimentateur prendra la décision d’euthanasier l’animal (si nécessaire, en consultation avec le vétérinaire et l’équipe des zootechniciens). iv) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de raffinement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que NC3R. v) Adaptation des conditions d’hébergement : animaux maintenus dans des cages collectives avec l'enrichissement comprenant des tubes en carton et le matériel pour la nidification.
Choix des espèces
La souris est le modèle le plus pertinent pour étudier cette maladie. + il existe une abondante littérature sur les troubles du spectre de l'autisme chez la souris + le modèle murin Fmr1 présente des symptômes voisins de ceux rencontrés dans le modèle humain de chromosome X fragile + les lignées génétiques nécessaires à ce projet ne sont disponibles que chez la souris Les expériences sont réalisées sur des animaux agés de 12 à 24 jours au momment de la chirurgie, de façon à pouvoir réaliser les enregistrements sur des animaux relativement jeunes, 3 semaines plus tard, lors de la réalisation des enregistrements.