Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Création et maintien de lignées de poissons zèbres génétiquement altérées pour l’étude du cytosquelette des neurones.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système nerveux
Tués dès qu'ils ne portent pas la modification génétique attendue, pour ne pas garder d'animaux jugés "non nécessaires" au projet, la grande majorité des 4 040 poissons zèbres déclarés ne passent pas l'étape de la sélection. Ils vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger, sans qu'aucune intervention ne soit déclarée sur eux, la protéine fluorescente s'observant sur l'animal vivant. Les lignées sont créées pour rendre visibles des protéines du cytosquelette des neurones, et le porteur annonce que ces poissons se comporteront comme des animaux sauvages, tout en reconnaissant que la modification touche une protéine du système nerveux et pourrait entraîner une nage anormale ou une prostration. Une vingtaine de mâles et de femelles reproducteurs par an, gardés jusqu'à dix-huit mois, suffit à maintenir ces lignées, sans que l'écart avec l'effectif déclaré soit expliqué.
Objectifs
Le cytosquelette, une structure fibreuse présente dans nos cellules, joue un rôle crucial en agissant comme des piliers de soutien. Son bon fonctionnement est essentiel pour les neurones, mais des anomalies dans ces structures sont associées à diverses maladies neurologiques. Pour mieux comprendre ces structures et leurs rôles, nous utilisons des poissons-zèbres, un modèle particulièrement adapté à la recherche neurologique, car ils ont un système nerveux similaire au nôtre et sont transparents à un stade précoce de leur développement. Dans notre projet, nous allons introduire des modifications génétiques chez ces poissons pour qu'ils produisent une protéine fluorescente. Cela nous permet d’observer précisément où se trouvent les protéines du cytosquelette à l'intérieur du poisson et des suivre leur comportement alors que le poisson grandit et dans un contexte de maladie. L'objectif principal est de comprendre comment ces structures fonctionnent normalement lors du développement des cellules nerveuses, sans perturber le processus naturel. Cette compréhension pourrait éclairer les mécanismes sous-jacents aux maladies neurologiques associées au cytosquelette.
Bénéfices attendus
Ce projet nous permettra d'acquérir des connaissances fondamentales sur les fonctions des protéines du cytosquelette au cours du développement. Ces connaissances permettront la compréhension des mécanismes physiologiques impliquant les protéines du cytosquelette dans un contexte pathologique, avec l'objectif à long terme (>5 ans) de développer des stratégies thérapeutiques ciblant ces mécanismes.
Procédures
Aucun
Impact sur les animaux
D'après les connaissances, la modification de notre protéine d’intérêt avec une protéine fluorescente n'affecte pas la fonction de cette protéine. Par conséquent, nous nous attendons à ce que les poissons se comportent comme des animaux sauvages et nous ne prévoyons pas de nuisances indésirables pour les poissons génétiquement modifiés. Cependant, un suivi régulier des poissons-zèbres sera effectué pour garantir l’absence de développement d’effets indésirables Comme nous apportons une modification d'une protéine du système nerveux, les effets indésirables pourraient être liées à un système nerveux défectueux, avec des anomalies de comportement (prostration, comportement de fuite) ou une nage anormale dans l’aquarium (attitude de nage anormale, défaut de flottabilité).
Devenir
Les animaux d’intérêts (géniteurs et génitrices en nombre nécessaires) seront conservés jusqu’à leur 18 mois. Les autres seront mis à mort afin de ne pas garder d’animaux non nécessaires à la conduite de ce projet.
Remplacement
Le projet vise à mieux comprendre comment les protéines du cytosquelette fonctionnent dans les cellules nerveuses. Ces fonctions dépendent de processus comme la présence de certaines cellules qui protègent les nerfs. Les méthodes actuelles pour étudier cela en laboratoire ont des limites, car elles ne reproduisent pas fidèlement l'environnement complexe des tissus. Pour surmonter ces limitations, nous nous tournons vers des modèles de laboratoire appelés organoïdes, qui sont des petites structures cellulaires qui imitent certaines caractéristiques des tissus réels. Cependant, ces organoïdes sont difficiles à imaginer en direct, ce qui est important pour notre recherche. Ainsi, nous nous tournons vers les embryons de poisson-zèbre comme alternative. Ils possèdent un système nerveux similaire à l’homme, avec toutes les cellules nécessaires, et ils sont déjà fonctionnels dès leur stade larvaire. De plus, nous pouvons les rendre transparents sans les endommager, ce qui facilite l'imagerie des processus biologiques en direct. En bref, le poisson-zèbre est un modèle approprié pour répondre à nos questions biologiques car il combine la complexité nécessaire avec la capacité d'observer les processus en direct.
Réduction
Nous avons utilisé une technique qui nous permet de sélectionner et d’élever uniquement les poissons dont la modification génétique a réussi, et éviter d'élever ceux qui n'ont pas le modification de notre intérêt. Le nombre d'animaux nécessaires est strictement déterminé en fonction de la fréquence à laquelle la modification génétique est transmise à la prochaine génération, ainsi que du nombre de couples de poissons reproducteurs requis. Pour maintenir ces lignées génétiquement modifiées, nous conservons seulement un nombre limité de poissons, environ une vingtaine de mâles et de femelles reproducteurs par an.
Raffinement
Étant donné que la protéine fluorescente est observée sur l’animal vivant, cela nous permet d’éviter d'avoir à effectuer des prélèvements invasifs sur le poisson. Comme la modification génétique ne devrait pas altérer la manière dont les gènes sont exprimés ni les fonctions de la protéine, nous prévoyons que ces animaux se comporteront de la même manière que les animaux sauvages et qu'ils ne présenteront aucun changement dans leur apparence ou leur comportement. Cependant, une surveillance hebdomadaire sera effectuée. De plus, une évaluation sera réalisée lorsque les poissons seront autonomes pour se nourrir (après 5-6 jours) et lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle (environ 12 semaines), en utilisant une grille de score pour détecter toute anomalie éventuelle. Nous avons mis en place des points limites prédictifs et précoces pour identifier les signes de mal être chez le poisson. Les poissons atteignant l’un de ces points limites seront immédiatement mis à mort pour abréger toute souffrance.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un modèle privilégié pour l’étude des gènes et les protéines liés à la physiologie et aux maladies humaines en raison de la similitude fonctionnelle de ses gènes avec ceux de l'homme. Les embryons de poisson-zèbre partagent un système neuromusculaire similaire à celui de l'homme, incluant toutes les cellules pertinentes pour nos recherches. De plus, la transparence optique des embryons permet de suivre les processus biologiques dynamiques dans l'ensemble de l'organisme de manière non invasive. Les poissons présentant le bon génotype seront utilisés pour la reproduction lorsqu'ils atteindront la maturité sexuelle, généralement à l'âge de 3 ou 4 mois.
Étude d’un nouveau modèle murin pour comprendre une maladie humaine liée aux mutations d’un canal ionique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
576 souris subiront une chirurgie de trente minutes pour l'implantation d'électrodes, puis six heures d'enregistrement électroencéphalographique par semaine pendant un mois, avec un hébergement individuel de sept jours après l'opération. 1 728 souris au total vont être utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour le prélèvement du cerveau. Porteuses d'une mutation qui reproduit un syndrome humain rare, elles peuvent présenter déformations articulaires, faiblesse musculaire, difficultés respiratoires, crises d'épilepsie, troubles de l'équilibre et constipation sévère. 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif étalés sur six mois, sans que le résumé indique lesquels.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal sodique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.
Procédures
Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.
Devenir
L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.
Remplacement
Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal sodique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.
Raffinement
Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.
Caractérisation anatomique et fonctionnelle de la comorbidité entre la douleur chronique et les problèmes moteurs
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une compression mécanique du nerf sciatique installe une douleur chronique chez des souris qui subissent par ailleurs des chirurgies du cerveau et de la moelle épinière pour l'injection de virus. 1 290 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 450 dans des procédures d'un niveau de souffrance sévère et 840 d'un niveau modéré. Le porteur écrit que le bien-être des animaux non-humains sera "au cœur" de ses préoccupations, puis précise que la douleur chronique induite ne peut pas être soulagée puisqu'elle est l'objet même de l'étude. Les enregistrements électrophysiologiques durent quatre à cinq heures sous anesthésie sans réveil, et le système nerveux central est prélevé après la mise à mort.
Objectifs
La douleur chronique neuropathique est consécutive à une lésion ou une pathologie du système nerveux. Généralement chronique, avec une prévalence de 5 à 7 % dans la population, elle s’accompagne d’un fort risque de développement de troubles du mouvement ou moteurs, ceci constitue un enjeu important de santé publique. Les mécanismes neuronaux sous-jacents de cette comorbidité restent encore inconnus d'où la nécessité des études pré-cliniques. De nombreuses recherches se sont concentrées sur changements induits par la douleur dans les neurones de la moelle épinière, mais peu d'attention a été accordée aux composantes cérébrales. Pourtant les mêmes régions du cerveau et les mêmes composants neurochimies sont impliquées dans le mouvement et la perception de la douleur. Le but de ce projet est de caractériser les circuits neuronaux impliqués dans la perception de la douleur et le contrôle du mouvement. Pour ce faire, nous réaliserons des études anatomiques et électrophysiologiques.
Bénéfices attendus
Les bénéfices de cette étude concernent la caractérisation des circuits neuronaux communs impliqués dans la perception de la douleur et le contrôle du mouvement. Ce projet chez la souris est mené en même temps qu'une étude chez l’homme. Les expériences sur les souris nous permettent de mieux caractériser le circuit d'intérêt car elles nous permettent d'être plus invasives (manipulation avec dans le cerveau, la moelle épinière et le nerf sciatique). Dès que les expériences sur les souris nous apportent des réponses sur l'anatomie et la fonctionnalité du circuit d'intérêt, nous pourrons adapter les protocoles de stimulation cérébral (non invasif) chez l'homme de manière plus fine et plus sûre. L’innovation consiste aussi à cibler des circuits neuronaux spécifiques qui interviennent simultanément dans la douleur et sa comorbidité motrice. La douleur et les troubles du mouvement provoquent une dégradation générale de la qualité de vie et entraîne un coût économique très important (arrêt de travail, consultations médicales, prise en charge complexe des patients). Notre projet vise à décrire des mécanismes précis dans le cerveau et la moelle épinière et découvrir de nouvelles cibles possibles pour le traitement de la douleur et des troubles du mouvement associés.
Procédures
Les animaux seront soumis à des chirurgies dans le cerveau et la moelle épinière pour l’injection des virusses , respectivement (durée de la chirurgie approx. 45 mins, réveil après la procédure) et pour des enregistrement électrophysiologique (4-5 heures approx., sans réveil). Les animaux seront soumis aussi à une douleur chronique induit par une chirurgie qui nous permettra la compression mécanique du nerve sciatique (durée de la chirurgie 30 mins). Dans tous les cas les chirurgies sont faites sous anesthésie générale. Des analgésiques et anesthesies locaux sont utilisés pour la prise en charge de la douleur pendant la chirurgie.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables attendus sur les animaux comprennent : 1/ un risque de douleur durant la chirurgie et douleur aiguë lié à la récupération post-chirurgie, ce risque est compensé par l’analgésie. 2/ un risque d'infection lié aux chirurgies 3/ un risque de perte de poids et d'hypothermie lié aux chirurgies. La douleur chronique induit par la compression du nerf sciatique ne peut pas être soulagée car c’est le but de l’étude.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort et leur système nerveux central sera préservé et sera utilisée pour l'une des études suivantes concernant les différentes questions de l'étude : -études anatomiques pour caractériser les connexions entre les zones d'intérêt, ou études de l’activité neuronal des zones d'intérêt, ou des contrôles histologiques pour vérifier l’endroit d’enregistrement électrophysiologique
Remplacement
La souris est l'espèce de choix pour étudier le système nerveux des vertébrés, ce qui fournit des informations très facilement transposables à l'homme. Pour vérifier et valider le concept du projet dans des approches plus intégrées, il est nécessaire d’utiliser des approches ex vivo et in vivo avec des animaux de façon à observer le cerveau en fonctionnement. Le recours au modèle animal est indispensable aucun modèle in vitro (cellules ou tissus) ne peut reproduire les conditions des pathologies étudiées
Réduction
Nous avons adopté des mesures visant à réduire le nombre d'animaux lié à leur mode production : en utilisant pour la réalisation de ce projet tous les animaux quel que soit leur sexe. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes, l’utilisation de tests statistiques ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
A chaque étape du projet, le bienêtre de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Nos animaux naitront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventiles, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptes aux procédures de chirurgie. L’expérimenter a une forte expérience pour toutes les procédures proposes. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des vertébrés. L'organisation du système nerveux central de cette espèce est assez similaire à celle de l'homme, ce qui permet d'extrapoler les résultats obtenus dans cette espèce à l'espèce humaine pour mieux comprendre les mécanismes cellulaires au niveau comportemental. Les propriétés du système nerveux central de la souris présentent de nombreuses similitudes avec d'autres mammifères, dont l'homme. Ainsi, les enseignements tirés de l'étude des tissus de la souris sont largement transférables à l'homme. Les procédures expérimentales seront réalisées sur des animaux âgés de plus de 8 semaines, ce qui correspond à l'âge adulte chez cette espèce lorsque l'animal est en pleine capacité d'apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d'implantation.
Latéralisation fonctionnelle du cerveau en réponse aux odeurs chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Une narine bouchée par un tampon posé sous anesthésie, puis une semaine de restriction alimentaire ponctuée de quatre séances quotidiennes de recherche d'odeurs : c'est le protocole que subissent 75 des 441 souris de ce projet. Toutes sont tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, 146 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger et 295 un niveau modéré. 150 autres souris subissent une chirurgie de trente minutes pour recevoir des vecteurs viraux dans le cerveau, et des souriceaux sont exposés dès la naissance et jusqu'au sevrage à une odeur nouvelle chaque jour, le porteur reconnaissant que cette nouveauté peut stresser la mère et modifier son comportement envers ses petits. La question posée, savoir pourquoi une information est traitée par un hémisphère cérébral plutôt que l'autre, relève de la recherche fondamentale, les liens avec l'autisme, la schizophrénie ou la maladie d'Alzheimer étant évoqués comme perspectives.
Objectifs
L'objectif du projet est d'apporter des éléments de réponses à la question de savoir pourquoi nous avons en quelque sorte deux cerveaux. En effet, le cerveau est constitué de deux hémisphères cérébraux, un gauche et un droit, et il établi que certaines fonctions activent plutôt l’un ou l’autre hémisphère cérébral. Ainsi, chez l’Homme, le langage résulte de l’activité de régions cérébrales situées dans l’hémisphère gauche. Une latéralisation de l’activité du cerveau a aussi été décrite pour l’attention, la mémoire ou pour le traitement des émotions. Il est établi également que les processus de latéralisation cérébrale ne sont pas propres à l’Homme comme cela a pu être initialement suggéré mais qu’ils sont une caractéristique générale de l’organisation fonctionnelle du système nerveux. On retrouve une spécialisation des hémisphères cérébraux dans différentes fonction par exemple chez les gastéropodes ou les insectes, les oiseaus, les poissons et bien sur les mammifères. Le fonctionnement asymétrique de nos cerveaux droit et gauche constitue certanement un avantage, une proposition étant que le traitement d’une information par une région cérébrale donnée d’un seul côté, libère des ressources neuronales équivalentes de l’autre côté du cerveau, pour faire autre chose, ce qui améliorerait les performances cognitives. Cependant, pourquoi une information donnée est traitée par un hémisphère ou un autre reste largement méconnu. Le projet se propose d’utiliser le traitement de l’information olfactive chez la souris pour pouvoir manipuler la nature de l’information et enregistrer l’activité cérébrale, pour mettre au jour les règles qui sous tendent la latéralisation cérébrale et mieux comprendre son rôle.
Bénéfices attendus
L’intérêt pour l’étude de la latéralisation cérébrale est portée par les découvertes récentes d’une altération de la latéralisation cérébrale dans différents maladies ou dysfonctionnements du cerveau comme l’autisme, la schizophrénie, ou encore la dyslexie. Ces maladies, qui émergent au cours du développement du cerveau, suggèrent que l’environnement précoce de l’individu joue un rôle dans la latéralisation du cerveau, question que le projet va aborder. A l’autre extrémité de la vie, les patients atteints de maladie neurodégénératives comme la Maladie d’Alzheimer ont aussi des altérations de la distribution de l’activité cérébrale entre les hémisphères gauche et droit du cerveau, qui pourraient contribuer à leurs troubles de mémoire ou de raisonnement. Dans ce projet, nous souhaitons tirer parti de la modalité olfactive, particulièrement importante pour guider le comportement chez la souris, pour développer un modèle d’étude de la latéralisation cérébrale et pouvoir apporter des éléments de réponses aux questions concernant le rôle de l’environnement dans la mise en place de la latéralisation cérébrale pendant le développement de l’individu, et le rôle de la latéralisation dans la réalisation de tâches quotidiennes de perception et d’apprentissage. Nous souhaitons ainsi contrinuer à une meilleure connaissance du fonctionnement du cerveau sain et malade.
Procédures
150 souris seront soumises à une chirurgie d’environ 30 minutes sous anesthésie générale, pour l’injection de vecteurs viraux dans les structures cérébrales d’intérêt en vue de mesurer ou de modifier l’activité neuronale. D’autres souris (75) seront soumises à l’occlusion d’une narine par mise en place en 2 à 5 minutes, d’un bouchon par les voies naturelles sous anesthésie générale. L’ensemble de ces animaux subiront après récupération une restriction alimentaire contrôlée pendant environ une semaine. Pendant cette semaine, les animaux participeront à 4 sessions par jour d’un test d’apprentissage aucours duquel ils sont placés sur une planche percée de trous odorisés. Les animaux sont laissés libres de leurs mouvements et leur comportement d’exploration des odeurs est mesuré. Le reste des animaux (225) sera exposé soit en continu, soit une à deux fois par jour pendant quelques minutes à des odeurs nouvelles dans une cage d’hébergement habituelle. Leur comportement libre d’exploration de l’odeur sera mesuré.
Impact sur les animaux
Des souris seront soumises dès leur naissance et jusqu’au sevrage, à un enrichissement olfactif consistant en la présentation d’une odeur nouvelle chaque jour, placée dans une boule à thé suspendue dans un coin de la cage. La présence d’une odeur nouvelle, comme tout élément nouveau de l’environnement, va attirer l’attention de l’animal (but recherché dans l’enrichissement) et pourrait aussi constituer une source de stress léger qui affecte le comportement de la mère vis-à-vis des jeunes. C’est en fait l’objet de l’expérimentation de mesurer ce possible effet. Chez la souris adulte, mâle ou femelle non allaitante, l’enrichissement olfactif est classiquement décrit comme ayant des effets bénéfiques sur les performances cognitives, mais nous n’avons pas de données équivalentes sur la souris femelle qui élève ses petits. Certains les animaux subissent des chirurgies pouvant induire des effets secondaires indésirables (perte de poids, douleurs, stress, apathie, stéréotypie etc). Puis, 1 mois après la chirurgie, ils sont mis en restriction alimentaire modérée 3 jours avant le début de tests comportementaux (apprentissages associatifs) et pendant toute la durée du test (5 à 7 jours). Cette restriction peut créer un état de faim chez l’animal. Enfin, certains des animaux subiront l’occlusion d’une narine ce qui crée un inconfort correspondant au fait d’avoir une narine bouchée. Cette procédure a été utilisée dans le passé au laboratoire sans être accompagnée de perte de poids ou d’apparition de signes de souffrances. Dans les jours qui suivent l’occlusion de la narine, les animaux sont mis en restriction alimentaire, avec les mêmes effets que décrits plus haut (état de faim).
Devenir
A l'issue des expériences, les souris sont mises à mort pour pouvoir récupérer les cerveaux accéder aux corrélats cellulaires des comportements observés.
Remplacement
L’étude des processus physiologiques et plus particulièrement l’étude des bases neurales du comportement et de la mémoire, et de la latéralisation cérébrale sous-jacente, requièrent l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur des modèles strictement in vitro.
Réduction
Le nombre d’animaux pour les approches comportementales est fixé à 15 individus par groupe. Ce chiffre dérive de nos études antérieures et prennent en compte au plus près la taille des effets attendus en comportement et l’influence de la variabilité interindividuelle. Pour renforcer la fiabilité de la comparaison avec les groupes contrôles, ces derniers sont randomisés avec les animaux expérimentaux. Les données comportementales sont corrélées aux données cellulaires sur les mêmes animaux. L’analyse complète des données cellulaires permet d’extraire de nombreux paramètres comme l’activité dans l’ensemble du cerveau, une évaluation de la connectivité fonctionnelle. Par l’utilisation des outils mathématiques de la théorie des graphes, des données de connectivité seront exploitées pour mettre en évidence les principaux nœuds théoriques du réseau, qui permettront de rationaliser les expériences prévues en limitant le nombre de structures cérébrales à tester et limiter ainsi le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Les bases neurales de la perception olfactive et sa latéralisation seront étudiées par des manipulations ou des mesures in vivo chez l’animal qui se comporte et post mortem à l’échelle cellulaire par la révélation et l’analyse quantitative du marqueur d’activité neuronale c-fos de façon à recueillir des données multidimensionnelles sur un même animal.
Choix des espèces
Nous avons choisi la souris car son comportement et l’importance écologique de la fonction olfactive de cette espèce sont très bien adaptés à la question de recherche qui nous intéresse. De plus, l’ensemble des données antérieures sur les bases neurales de la perception olfactive a été obtenu chez cette espèce, elle est classiquement utilisée dans ce type d’étude. Nos données pourront être comparées à nos données antérieures et à celles de la littérature. En particulier, le projet proposé s’appuie sur des premiers résultats obtenus chez cette espèce. C’est pourquoi nous utiliserons ce même modèle d’étude. Certaines procédures sont réalisées sur des animaux adultes jeunes, âgés de 2 à 3 mois. Une expérience concerne des animaux nouveau-nés avec un suivi selon les groupes jusqu’à juste après le sevrage ou jusqu’à l’âge adulte. Cette procédure permet la modulation précoce de l’expérience olfactive et l’analyse de ses conséquences en termes de performances olfactives et de connectivité cérébrale, chez le jeune puis chez l’adulte.
Etude d’un nouveau modèle murin pour comprendre une maladie humaine liée aux mutations d’un canal ionique
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
576 souris sont opérées pendant une demi-heure pour se faire implanter des électrodes, puis enregistrées six heures par semaine pendant un mois afin de détecter leurs crises d'épilepsie. 1 728 souris au total vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement du cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Porteuses d'une mutation d'un canal ionique humain, elles peuvent présenter des déformations articulaires, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires, des troubles du sommeil, une constipation sévère et une léthargie qui gêne leur alimentation. Le porteur annonce que 672 d'entre elles passeront des "tests standardisés" de développement moteur et cognitif pendant six mois, sans dire lesquels.
Objectifs
L’objectif de ce projet est d’étudier l’effet d’une mutation d’un canal ionique (c’est-à-dire une protéine impliquée dans l’excitabilité des cellules) retrouvée chez l’Homme et qui engendre, chez les patients atteints, de graves altérations du développement du système nerveux. Ce projet se déroulera dans 2 établissements utilisateurs, nommés ci-après EU1 et EU2.
Bénéfices attendus
Les objectifs du projet sont les suivants : (1) Comprendre quels sont les mécanismes moléculaires à l’origine du syndrome CLIFAHDD (Congenital contractures of the LImbs and FAce, hypotonia, and Developmental Delay / Contractures congénitales des membres et du visage, hypotonie et retard de développement) ; (2) Déterminer le rôle du canal calcique responsable de ce syndrome dans le développement du cerveau et du cervelet. (3) Tester et vérifier l'efficacité du modèle murin comme représentation préclinique du syndrome CLIFAHDD, dans le but ultime d'évaluer des possibilités de traitement.
Procédures
Pour ce projet, nous évaluerons un total de 1728 animaux, qui seront utilisés comme suit: • 672 animaux seront évalués pour détecter, au travers de tests standardisés, des retards dans leur développement, ainsi que dans leurs capacités motrices et cognitives. Ces évaluations se dérouleront sur une période d'environ 6 mois. Pour les souris agées de moins de 21 jours, les tests sont limités à deux min par test et sont réalisés sur une plaque chauffante maintenue à 23°C. Ces tests seront réalisés dans l'EU1 • 576 animaux subiront une chirurgie d’environ 30 min afin de permettre l'enregistrement d'électroencéphalogrammes (EEG). L'EEG sera enregistré pendant environ 1 mois, avec une séance de 6 heures par semaine pour chaque animal. Ces expériences seront réalisées à l'EU1 • 480 animaux participeront à une étude longitudinale où des échographies du cerveau et du cervelet seront réalisées pour examiner les paramètres anatomiques et fonctionnels. Ces échographies seront effectuées lors de courtes séances d'acquisition, d'une durée de 15 minutes, sous anesthésie. Il est important de noter que certains des tests impliquent des procédures potentiellement stressantes pour les animaux, notamment un hébergement individuel temporaire. Néanmoins, toutes les mesures nécessaires seront prises pour assurer leur bien-être tout au long de l'étude. Cette étude longitudinale sera réalisée dans l'EU2.
Impact sur les animaux
Pour des animaux porteurs de la mutation, les symptômes présentés par les patients suggèrent qu'ils peuvent présenter des retards dans leur développement et leurs capacités cognitives, ainsi que des problèmes physiques tels que des déformations articulaires, des traits physiques inhabituels, une faiblesse musculaire, des difficultés respiratoires et de sommeil, des perturbations du rythme circadien, des crises d'épilepsie, des troubles de l'équilibre dus à une détérioration du cervelet et une constipation sévère et une importante léthargie peut également affecter leur capacité à se nourrir. Les études comportementales ainsi que les examens d'échographie sont non invasifs et indolores en eux-mêmes. Cependant, pour minimiser tout stress causé par la manipulation par les expérimentateurs, les séances d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation à la manipulation d'au moins 5 jours. Le suivi des crises d'épilepsie à travers l'enregistrement électroencéphalographique (EEG) nécessitera une intervention chirurgicale (anesthésie, acte chirurgical, gestion de la douleur post-opératoire, risque d'infections). Toutes les précautions seront prises pour éviter toute douleur liée à la chirurgie. Après l'opération, les animaux seront hébergés individuellement pendant le temps nécessaire à la guérison ; ce temps n'excédera pas 7 jours.
Devenir
L’ensemble des animaux contribuant aux 3 procédures de ce projet seront euthanasiées. Les organes, tout particulièrement le cerveau, seront prélevés en post-mortem pour des analyses histologiques.
Remplacement
Le développement, déjà précédé d'une étape de validation in vitro, et la caractérisation d'un modèle murin sont essentiels pour étudier le syndrome CLIFAHDD. Ce modèle animal sera utilisé exclusivement pour des expériences in vivo et ex vivo (prélèvements d'organes) qui ne peuvent être effectuées sur des modèles in vitro ou via des simulations informatiques de la maladie. Pour l’instant, les conséquences fonctionnelles de la mutation du canal calcique responsable du syndrome CLIFAHDD sont examinées à travers des expériences d'électrophysiologie sur des lignées cellulaires, et des simulations informatiques seront développées pour modéliser ces conséquences sur l'excitabilité neuronale. Ces approches in vitro et in silico permettent de comprendre l'impact de la mutation au niveau cellulaire, mais elles ne peuvent pas rendre compte des effets sur l'ensemble de l'organe, en l'occurrence le cerveau, car les réseaux neuronaux établis pendant le développement cérébral ne peuvent pas être reproduits en culture ou par simulation informatique. Pour ce qui est de l’étude des caractéristiques phénotypiques telles que les problèmes de locomotion, les troubles du sommeil et les désynchronisations des rythmes circadiens, elles ne peuvent être étudiées que sur des animaux vivants.
Réduction
Le nombre d'animaux utilisés pour ce projet, estimé à 1728, a été soigneusement déterminé pour nous permettre d'atteindre nos objectifs scientifiques de manière statistiquement significative. Nous avons élaboré une stratégie de croisement optimale pour maximiser l'efficacité de nos expériences. En utilisant des individus des deux sexes, nous cherchons à réduire le nombre total d'animaux nécessaires à produire. Dans la mesure du possible, nous réaliserons les expériences comportementales (in vivo) et les analyses anatomiques, tissulaires et cellulaires sur les mêmes animaux. Pour déterminer statistiquement la taille des groupes d'animaux à tester, nous nous sommes basés sur des recherches publiées ainsi que sur l'utilisation d'un logiciel spécialisé pour évaluer statistiquement le nombre d'animaux requis. Les tailles de chaque groupe d'animaux à générer pour ce projet ont été calculées en utilisant des tests paramétriques capables de détecter des différences significatives. Cela garantit que nos résultats seront robustes et fiables, tout en minimisant le nombre d'animaux nécessaires pour mener à bien nos études.
Raffinement
Le suivi de l'état de santé des animaux sera rigoureusement respecté et effectué de manière régulière. Des critères spécifiques ont été définis pour détecter les signes de détresse (comme une perte de poids continue et excessive, une prostration, des poils ébouriffés, un arrêt de l'alimentation, etc.), et des mesures de raffinement seront mises en place pour assurer une prise en charge adaptée des animaux. Cela peut inclure l'utilisation d'analgésiques et, dans les cas les plus graves, la décision d'euthanasie. Pour minimiser le stress des animaux causé par la manipulation par les expérimentateurs, les sessions d'évaluation seront précédées d'une période d'habituation d'au moins 5 jours. En ce qui concerne les douleurs liées à la chirurgie (pour les mesures d'EEG par exemple seront réalisées sous anesthésie générales pour éviter toute souffrance associée à l'intervention. Après la chirurgie, les animaux seront hébergés individuellement pendant la période de cicatrisation, qui ne dépassera pas 7 jours.
Choix des espèces
La souris représente le modèle animal le mieux adapté pour notre recherche. Il offre en effet le meilleur moyen pour tenter de reproduire la maladie étudiée de manière contrôlée. Nous pourrons aussi examiner en détail les effets sur le cervelet, une région du cerveau qui semble particulièrement atteintes chez les patients. Grâce à ces souris, nous pouvons gérer quand et où la mutation apparaît dans les organes. Pour notre étude, nous utiliserons des souris à différents âges, de la naissance à l'âge adulte. Cela nous aidera à comprendre les conséquences développementales de l'expression de la mutation, notamment en regardant des aspects comme la taille, le poids, les caractéristiques physiques inhabituelles, les problèmes de mobilité, l’apparition de crises d’épilepsies et les troubles de l’équilibre.
Etude de la physiologie cellulaire de l’hippocampe chez le modèle murin
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes finissent sur la table d'opération, dans une chirurgie terminale de moins de vingt minutes à l'issue de laquelle elles sont tuées pour prélever le cerveau. 2 944 souris vont être utilisées, 1 206 opérées sous anesthésie sans jamais se réveiller, 1 738 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit d'abord une injection de vecteur viral dans le cerveau, qui peut provoquer une douleur pendant 24 à 48 heures et une perte de poids, pour étudier la physiologie des neurones de l'hippocampe et son rôle dans la mémoire sociale. Le porteur affirme par ailleurs que trois semaines d'environnement enrichi transforment les connexions entre ces neurones et souligne "les effets néfastes de l'appauvrissement environnemental", constat qu'il tire d'animaux élevés en cage puis tués.
Objectifs
Bien que la capacité de former et de rappeler des souvenirs soit essentielle à la survie, elle est également cruciale pour établir des relations avec autrui et définir notre sens de soi. L'hippocampe est depuis longtemps reconnu comme une structure fondamentale pour l'apprentissage et la formation de la mémoire. De nombreuses études de lésions chez des patients humains ont révélé que l'hippocampe est nécessaire à la formation de souvenirs épisodiques à long terme. Le projet se concentre sur une région du cerveau : l'hippocampe, qui est essentielle pour la mémoire sociale et est un site de génération de l'activité cruciale pour la cognition. De plus, cette région présente une vulnérabilité unique et marquée dans de nombreuses maladies psychiatriques et neurodégénératives. Des preuves indiquent que lors du déclenchement d'une psychose, l'hippocampe est l'un des premiers à présenter une diminution de la fonction, car l'incapacité à reconnaître correctement sa famille et ses connaissances est fréquemment un symptôme précoce et un fort prédicteur du pronostic du patient. Contrairement à d'autres régions du cerveau qui ont fait l'objet de recherches depuis de nombreuses décennies, la neurophysiologie des neurones pyramidaux de l’hippocampe est largement méconnue. Les résultats de ce projet permettront de mieux comprendre les cellules hippocampiques, avec des implications considérables pour plusieurs maladies neurodégénératives et troubles psychiatriques.
Bénéfices attendus
Les objectifs de ce projet sont de mieux comprendre comment l'environnement et l'expérience influent sur la formation de la mémoire. Nous cherchons à découvrir comment les mécanismes moléculaires contrôlent l'activité des cellules nerveuses dans une partie peu étudiée du cerveau appelée l'hippocampe. Nos recherches ont montré que trois semaines d'enrichissement environnemental chez des souris adultes ont un impact significatif sur les caractéristiques et la plasticité des connexions entre ces neurones. En considérant que cet environnement enrichi représente une simulation plus réaliste de la vie pour une souris, nos résultats soulignent les effets néfastes de l'appauvrissement environnemental, tant dans des contextes sains que pathologiques. Ainsi, notre étude contribuera à mieux comprendre les mécanismes biologiques sous-jacents à l'apparition de la psychose et, nous l'espérons, ouvrira des perspectives pour inverser ces altérations. Les troubles neurologiques ont un coût social élevé, estimé à 798 milliards d'euros en 2010, et touchent environ un Européen sur trois, directement ou indirectement, chaque année. Les perturbations de la cognition sociale sont des symptômes centraux de maladies comme la schizophrénie, et les altérations dans ce domaine sont souvent parmi les premiers signes de ces troubles, étant fortement liées à un mauvais fonctionnement global. Par conséquent, il est essentiel de mieux comprendre les circuits cérébraux impliqués dans la cognition sociale pour les troubles neuropsychiatriques. Des recherches post- mortem ont révélé que l'hippocampe est particulièrement vulnérable et souvent affectée précocement au début de diverses maladies. Ce projet vise à approfondir notre compréhension des mécanismes moléculaires qui régulent l'activité des neurones en réponse à l'expérience. L'hippocampe joue un rôle crucial dans plusieurs fonctions, notamment l'émotion et la mémoire, et nous nous concentrons spécifiquement sur la région qui est importante pour la mémoire sociale. Cette région est affectée de manière unique dans des pathologies telles que la schizophrénie, la démence et la maladie d'Alzheimer. Malgré l'intérêt croissant pour l’hippocampe, les conséquences de ses altérations lors d'expériences ou dans des contextes pathologiques ne sont pas encore entièrement comprises.
Procédures
Une partie des animaux subissent une injection cérébrale de vecteur viral sous analgésie et anesthésie générale permettant d’exprimer des marqueurs fluorescents. Cette procédure dure moins de 30 minutes et elle est réalisée une seule fois. Tous les animaux seront impliqués dans une chirurgie terminale sous anesthésie et analgésie à l’issue de laquelle ils seront euthanasiés en vue des prélèvements pour analyses. Cette procédure dure moins de 20 minutes.
Impact sur les animaux
La chirurgie injection cérébrale peut entraîner une perte de poids transitoire (inférieure à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48 heures. L’anesthésie au cours de l’acte terminal pourrait également provoquer des nuisances très courtes et temporaires, notamment l'hypothermie, l'hypertension, et des risques cardiorespiratoires. Néanmoins, ces interventions sont indispensables à notre projet, car seules ces procédures permettent d'exprimer les protéines requises pour la manipulation de la transmission synaptique chez les animaux adultes.
Devenir
Tous les animaux seront euthanasiés, soit afin de prélever le cerveau pour analyse des caractéristiques fonctionnelles du tissu cérébral soit afin de prélever le cerveau pour analyse histologique.
Remplacement
Le cerveau est un organe d'une extrême complexité, composé de milliards de neurones de centaines de types différents, chacun établissant des milliers de connexions avec d'autres neurones. Ces éléments sont regroupés en structures fortement interconnectées, que ce soit entre elles ou avec d'autres organes. En raison de cette complexité, il n'existe actuellement aucune alternative non animale pour étudier les propriétés physiologiques et cellulaires de l'hippocampe, en particulier dans le contexte des modifications induites par l'expérience. De plus, étant donné que l'on sait si peu de choses sur l'hippocampe et sur son rôle dans la formation de la mémoire, les modèles computationnels sont totalement insuffisants.
Réduction
Le nombre d'animaux par groupe a été déterminé en tenant compte de l'expertise de l'équipe en chirurgie, électrophysiologie et histologie, des résultats précédemment obtenus au laboratoire, ainsi que des données de la littérature. Nous avons mis au point une méthode de préparation de tissu à partir d'un seul cerveau, ce qui permet d'obtenir entre 16 et 20 tranches utilisables pour la physiologie. Cette méthode permet à plusieurs expérimentateurs de partager une seule préparation, réduisant ainsi l'utilisation globale d'animaux. Compte tenu de l'expertise de l'équipe et des taux de succès obtenus au laboratoire au cours des 12 dernières années, le nombre de souris transgéniques a été réduit. La taille des effectifs a été établie par un calcul de puissance et des tests statistiques seront réalisés afin d’avoir une interprétation fiable des résultats. Au total, nous estimons que pour réaliser ce projet, 2944 souris sont nécessaires pour obtenir des résultats scientifiques significatifs.
Raffinement
Pour l'hébergement, toutes les directives sont respectées. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Les souris seront observées quotidiennement. Des points limites sont définis et respectés de manière à éviter toute souffrance des animaux. Pendant la chirurgie, l’animal reçoit une injection d’un analgésique général pour prévenir la douleur, puis est placé sous anesthésie générale gazeuse et disposé sur un tapis chauffant, puis reçoit une injection d’un anesthésique local avant la première incision. Pendant l’opération, les yeux sont protégés par un gel ophtalmique. Les yeux sont également protégés de la forte lumière chirurgicale. Pour les procédures avec réveil, l’animal reçoit après chirurgie une injection de solution saline en sous-cutané afin de prévenir la déshydratation et est placé dans une cage posée sur un tapis chauffant jusqu’au réveil. Après récupération, il réintègre sa cage d’origine, son comportement est surveillé et la suture est sous observation quotidienne pour évaluer sa bonne cicatrisation. Chaque animal sera suivi tout au long de l’expérience afin de détecter tout indicateur de souffrance et déterminer si besoin l’arrêt de l’expérimentation en accord avec la structure locale de bien-être animale et les conseils vétérinaires. Après chirurgie, l'état de santé des animaux sera surveillé quotidiennement par du personnel compétent afin de détecter tout signe de douleur ou stress et de traiter les animaux si besoin avec des antalgiques.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme modèle animal pour ce projet en raison de la similitude de son système nerveux central avec celui des humains et de la disponibilité de lignées génétiquement modifiées. De plus, la souris est le modèle animal le plus couramment utilisé dans ce domaine de recherche, ce qui permet des comparaisons avec d'autres études et l'utilisation des résultats d'autres recherches pour réduire le nombre d'animaux nécessaires. Le réseau hippocampique continue de se développer et subit des changements dans la transmission synaptique et la plasticité jusqu'au jour postnatal 35. Pour cette raison, nous effectuerons toutes les injections cérébrales ainsi que les expériences de physiologie et d'histologie chez des souris âgées d'au moins 6 semaines.
Stimuler le potentiel neurogénique des cellules gliales de Müller afin de régénérer les photorécepteurs et offrir de nouvelles pistes thérapeutiques aux maladies dégénératives de la rétine : ETUDE PRELIMINAIRE.
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système nerveux
Poissons zèbres : 260
Le xénope et le poisson zèbre sont retenus parce qu'ils régénèrent naturellement leur rétine, capacité que les mammifères ont perdue. 600 xénopes et 260 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. Les poissons reçoivent une injection dans l'œil sous anesthésie générale, 560 têtards sont maintenus dans le noir de sept à trente-cinq jours dans des bains de solution, dont 240 pendant vingt-cinq jours de plus dans une seconde solution, et 40 xénopes adultes reçoivent une injection d'hormones pour déclencher la ponte. Tous les poissons et tous les têtards sont tués pour examiner leur rétine, les 40 adultes restant en élevage et recevant de nouvelles injections hormonales tous les quatre mois, sur une période reproductive que le porteur évalue à quinze ans au moins.
Objectifs
Les maladies dégénératives de la rétine sont dues à la perte progressive et irréversible des cellules de la rétine. Dans le cas de la rétinite pigmentaire ou de la DMLA (Dégénérescence Maculaire Liée à l'Age), ce sont les photorécepteurs, les cellules photosensibles de la rétine qui sont affectées, et leur disparition entraine une perte de la vision. Comme ces maladies restent pour la majorité incurable, il est essentiel d’approfondir nos connaissances en recherche fondamentale afin de trouver de nouvelles pistes thérapeutiques. Le xénope et le poisson-zèbre, contrairement aux mammifères, ont la capacité de régénérer leur rétine grâce à leurs cellules gliales de Müller qui se comportent comme des cellules souches en cas de dégénérescence. Chez l’homme, ces cellules ont perdu la capacité de réparer la rétine suite à une lésion. De récents travaux ont néanmoins montré, via l’ajout de facteurs de croissance ou la surexpression de facteurs de transcription, que ces cellules de Müller chez les mammifères ont gardé un potentiel régénératif. Cependant, ce potentiel reste très limité et les cellules de Müller réactivées régénèrent très peu, voire pas du tout, les photorécepteurs, le sous-type même de cellules rétiniennes qui doivent être remplacées chez les patients. Il est donc essentiel de trouver des molécules capables de stimuler la régénération des photorécepteurs, et en particulier des cônes, responsables de notre vision diurne. Nous avons développé récemment un modèle de dégénérescence des cônes chez le xénope) et avons montré que bien que cet amphibien possède la capacité de régénérer les photorécepteurs à bâtonnets, il ne régénère que très peu les cônes dans ce modèle lésionnel, contrairement au poisson-zèbre. Bien que ne représentant que 5% des photorécepteurs chez l’homme, les cônes sont essentiels pour la vision des couleurs. L’objectif du projet est d’étudier les mécanismes responsables de cette différence entre xénope et poisson zèbre afin d'identifier des facteurs capables de promouvoir la régénération des cônes chez les mammifères.
Bénéfices attendus
Ce travail préliminaire a pour but de tester la pertinence du projet visant à comparer les caractéristiques distinctes des cellules de Müller à régénérer les cônes, entre le poisson-zèbre et le xénope. Selon les résultats obtenus, il permettra de décider ou non de poursuivre l’étude. Celle-ci a pour objectif d’identifier les voies de signalisation contrôlant les processus régénératifs à partir des cellules de Müller et ainsi fournir des informations essentielles qui permettraient de stimuler la régénération des photorécepteurs chez les personnes atteintes de pathologies dégénératives de la rétine.
Procédures
- 260 poissons zèbre adultes recevront, sous anesthésie générale, une injection intra vitréenne. La procédure s’effectuera en 30 secondes environ le temps de placer correctement l’animal pour réaliser l’injection. L’injection en elle même ne prendra que quelques secondes. - 560 xénopes au stade têtard seront placés en bain dans une solution dans le noir entre 7 et 35 jours. - 240 d’entre eux seront ensuite placés dans une autre solution pendant 25 jours. Les solutions seront changées tous les 2 à 3 jours. - 40 xénopes adultes recevront une injection sous cutanée. La procédure s’effectuera en 30 secondes environ le temps de placer correctement l’animal pour réaliser l’injection. L’injection en elle-même ne prendra que quelques secondes.
Impact sur les animaux
L’injection intra vitréenne est un acte de chirurgie légère. Chez l’homme, les effets indésirables décrits sont une irritation de l’œil (ce qui peut se traduire par une sensation de brulure, de grains de sable ou de picotements), un saignement de la conjonctive, la sensation d’un corps étranger ou l’apparition de tâches dans le champ visuel. Cela reste des symptômes bénins qui se résorbent en quelques jours. Afin de maintenir les poissons immobiles pendant la procédure, les animaux seront placés sous anesthésie générale. Les effets indésirables potentiels sont la désorientation passagère lors du réveil et le risque d’asphyxie entrainant la mort de l’animal si l’anesthésie est trop longue en raison de l’arrêt de l’irrigation des branchies. À la dose utilisée, les traitements sont considérés comme étant non toxiques. Les effets indésirables possibles restent l’apparition d’œdèmes. De plus, le fait que les animaux seront conservés dans le noir pendant la durée de certains traitements est susceptible de leur causer du stress (de 7 à 35 jours) ou de la dépigmentation. L’administration d’hormones par injection sous cutanée chez le xénope adulte pour déclencher les pontes n’est pas connue comme entrainant des effets secondaires indésirables. Un court stress est généré le temps de la contention.
Devenir
Tous les poissons seront euthanasiés afin d’étudier la régénération de la rétine. Tous les xénopes adultes utilisés seront maintenus en élevage. Tous les têtards de xénopes seront euthanasiés afin d’étudier la régénération de la rétine.
Remplacement
La nécessité d’avoir recours à des animaux se justifie par le fait que les cellules de Müller n’ont pas le même comportement in vivo au sein de la rétine et en culture cellulaire. Elles sont en effet fortement influencées par le micro-environnement et en particulier le contexte inflammatoire, qui ne peut être reproduit en culture cellulaire. Ainsi, il n’est pas possible de se passer de l’utilisation d’animaux et d’utiliser des méthodes alternatives au vu de la finalité de ce projet. L’induction de la ponte chez le xénope constitue la seule façon d’obtenir des ovocytes matures de manière non-invasive (sans chirurgie).
Réduction
L’objet de cette demande d'autorisation de projet est de réaliser des expériences préliminaires à un projet plus large afin de tester la pertinence du projet et minimiser le nombre d’animaux utilisés. - Le nombre d’animaux prévu pour cette DAP correspond au minimum nécessaire pour une démonstration convaincante des principes scientifiques étudiés sur la base d’arguments statistiques valides. En prenant en compte les variabilités biologiques individuelles et techniques, nous avons déterminé que chaque lot comprendra 10 animaux pour les lignées sauvgaes et 20 animaux pour les lignées transgéniques et nos expériences seront réalisées en tripliqua. - Nous utiliserons des poissons réformés (poisson de lignée sauvage trop âgés pour continuer à faire de l’élevage) et non utilisable pour d’autres projets. - Nous limiterons le nombre d’animaux adultes transgéniques au minimum requis afin de maintenir une lignée transgénique stable. - Le développement d’une lignée rapportrice fluorescente permettra l’observation des phénotypes de dégénérescence puis de régénération sur animaux vivants en continu et par conséquent permettra de réduire le nombre d’animaux nécessaires. - Les femelles xénopes adultes utilisées pour générer des embryons sont réutilisés tous les 4 mois. Ces animaux ayant une période reproductive longue (au moins 15 ans), ils peuvent être induits de nombreuses fois, ce qui permet de réduire le nombre d’individus utilisés. - Pour les animaux transgéniques, nous avons prévu de ne faire que des fécondations naturelles afin d’éviter de devoir sacrifier des mâles. Les mâles peuvent donc être utilisés plusieurs fois pour la reproduction donc là aussi cela permet de réduire le nombre d’animaux utilisés.
Raffinement
Le projet repose sur l’étude de processus de dégénérescence et régénération spécifiques à un organe non-vital et la dégénérescence cellulaire au niveau de la rétine, comme dans la DMLA, est un processus indolore. Les injections intravitréennes chez le poisson se font sous anesthésie générale. Les animaux sont ensuite surveillés jusqu’au réveil puis quotidiennement jusqu’à la fin de l’expérience. L’utilisation des xénopes adultes par roulement (possiblement tous les 4 mois pour les femelles, et tous les mois pour les mâles) permet le renforcement positif lors des manipulations ce qui réduit leur stress. Tout au long des procédures, nous évaluerons en continue l’état des animaux à l’aide de fiches d’évaluation de points limites adaptés à l’espèce et à l’âge des animaux et procéderons à des soins ou à l’euthanasie des animaux si cela s’avère nécessaire. Le développement d’une lignée inductible et réversible permettra de cibler la dégénérescence à une sous population de cellules, et de limiter le traitement dans le temps.
Choix des espèces
L’objet de cette étude vise à étudier et comparer les mécanismes de régénération dans des espèces qui sont naturellement capables de régénérer leur rétine. A ce jour, cela n’a été décrit que chez le poisson, les amphibiens et l’embryon de poulet. Le poisson-zèbre et le xénope constituent des espèces faciles à manipuler et à maintenir en laboratoire et pour lesquels sont établis des protocoles d’élevage et d’utilisation à des fins scientifiques. Par ailleurs, nous disposons des génomes pour les deux espèces et leur analyse montre d’importantes similitudes avec le génome humain (plus de 70% des gènes identifiés dans des maladies humaines ont leurs équivalents chez le xénope et le poisson-zèbre). Les poissons-zèbre seront utilisés soit à l’âge adulte (4-6 mois, taille 3cm), soit au stade juvénile (1 mois, taille 1cm) afin de comparer les capacités de régénération de la rétine à ces deux stades. Les xénopes des lignées transgéniques seront utilisés au stade têtards car l’article de référence sur cette lignée indique qu’à ce stade le phénotype obtenu est plus homogène d’un individu à l’autre. Les xénopes adultes utilisés afin d’établir une nouvelle lignée transgénique seront utilisés à un stade mature sexuellement. Du fait de la longue durée de vie du xénope et de sa longue période de maturité sexuelle, les animaux peuvent avoir entre 2 et 20 ans.
Étudier le rôle des astrocytes cérébraux dans la régulation du métabolisme énergétique chez le modèle murin
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toutes opérées sous anesthésie pour recevoir des vecteurs viraux dans le cerveau et y implanter une fibre optique, 300 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit jusqu'à deux injections intrapéritonéales par jour pendant cinq jours, un régime riche en gras et en sucre pendant un à deux mois, un jeûne de cinq heures, puis sept prélèvements sanguins en deux heures. Le porteur reconnaît que la chirurgie peut provoquer des douleurs après l'opération malgré l'analgésie, et que le port de la fibre optique gêne les déplacements. L'objet reste la compréhension du rôle des astrocytes de l'hypothalamus dans le métabolisme énergétique, le porteur espérant seulement que manipuler ces cellules permettrait un jour de contrôler certaines maladies métaboliques.
Objectifs
Le maintien de l'équilibre énergétique est essentiel pour la santé. Le dysfonctionnement de ce processus conduit à une variété de maladies métaboliques pour le cerveau et le corps. Particulièrement, l'hypothalamus dans le cerveau représente un centre de signalisation pour la régulation du métabolisme énergétique du corps. Comprendre les mécanismes sous-jacents à la signalisation cellulaire dans l'hypothalamus dans le contexte du métabolisme énergétique, est la base pour contrôler les maladies métaboliques. L'objectif de ce projet est d'utiliser des modèles de souris pour comprendre le rôle des astrocytes hypothalamiques dans le contrôle du métabolisme énergétique du corps, via l'angle des interactions entre astrocytes et neurones.
Bénéfices attendus
Comprendre la participation des astrocytes dans le métabolisme énergétique fera progresser nos connaissances sur la façon dont le cerveau régule l'énergie du corps. De plus, ce projet découvrira également de nouvelles voies moléculaires qui pourraient être poentiellement ciblées pour améliorer les syndromes métaboliques. En particulier, nous espérons qu’en manipulant directement ces cellules, nous pourrions contrôler certaines maladies métaboliques.
Procédures
1) L'injection intrapéritonéale d'un médicament chimique sur une partie des animaux vigiles (10 secondes, au maximum 2 fois par jour pendant cinq jours); 2) Procédure chirurgicale effectuée sous anesthésie générale/locale et analgésie pré et post-opératoire sur tous les animaux (30 min chaque); 3) Expériences in vivo sur une partie des animaux: les souris qui se déplacent librement portent une fibre optique légère pendant 15-20 min pour chaque enregistrement. 4) Alimentation riche en sucre et gras: pour étudier l'adaptation métabolique, les souris reçoivent un régime riche en gras et sucre pendant 1 à 2 mois sur une partie des animaux. 5) mise à jeun: une partie des souris qui subissent des tests de métabolisme sont à jeun pendant 5 heures. 6) Tests métaboliques impliquant une administration (1 gavage ou 1 injection unique) puis 7 prélèvements de faible volume sur une durée de 2h pour une partie des animaux. 7) Euthanasie d'une partie des souris pour prélèvement sous anesthésie et analgésie, durée 20 minutes.
Impact sur les animaux
1) L’administration d’une hormone pour induire le modèle génétiquement modifié peut entrainer des irritations, un stress et une douleur de courte durée au site d'injection. 2) Une intervention chirurgicale sera effectuée pour délivrer des gènes portés par des vecteurs viraux et implanter un système de fibre optique. Cette chirurgie pourra entrainer des douleurs en post-opératoire malgré la prise en charge analgésique. 3) le port d'une fibre optique peut légèrement influencer la liberté de mouvement des souris; 4) Au cours des tests métaboliques, les animaux seront mis à jeun pendant cinq heures, ils pourront donc ressentir une sensation de faim durant une courte période. Une solution de glucose sera administrée par injection intrapéritonéale ou oralement : un stress lors de la contention et une légère douleur peut être ressentie au point d'injection ou lors de l'introduction de la canule de gavage dans la cavité buccale. 5) Des prélèvements sanguins de faible volume seront effectués pour mesurer la glycémie, une légère douleur peut être ressentie lors du prélèvement de sang. 6) Lors des procédures mentionnées, il existe un risque d'infection au niveau des sites d'injection (par exemple, par la voie sous-cutanée ou intrapéritonéale) et de prélèvement, des risques liés à l'anesthésie, à la chirurgie et à un régime alimentaire riche en graisse.
Devenir
Les souris seront euthanasiées. En effet, les tissus prélevés pour les analyses biochimiques et immunohistochimiques (analyse de la pathologie, de l'inflammation, changements dans chaque type de cellule) et pour les études moléculaires et génomiques nécessitent l’euthanasie de l’animal.
Remplacement
Dans le présent projet, le remplacement des modèles animaux par des approches in vitro ne permet pas l’étude de l'effet des astrocytes sur le métabolisme du corps. En outre, il est connu que les astrocytes in vitro ont des caractéristiques biologiques différentes de leurs états in vivo, ce qui rend indispensable l'utilisation de modèles animaux pour comprendre l'interaction complexe avec les neurones dans l'environnement natif.
Réduction
L'estimation du nombre d’animaux et les tests statistiques utilisés sont basés sur les études standards dans le domaine du métabolisme. Nous avons minimisé le nombre d'animaux, à un niveau qui permet d'être sûr de répondre aux questions scientifiques proposées de ce projet, et prend également en compte les échecs occasionnels lors des procédures expérimentales. La quantification statistique de nos données a besoin d'au moins 20 animaux par groupe et par condition. De plus, il faut prendre en compte le risque chirurgical en ajoutant 5 souris par lot, ce qui conduit à un nombre total de 300. C’est le nombre permettant d'atteindre des résultats scientifiquement solides statistiquement.
Raffinement
Tout au long du projet, les animaux seront hébergés avec un cycle jour/nuit adapté et avec la boisson et la nourriture ad libitum. Ils feront l’objet d’un contrôle quotidien par une personne professionnelle, en complément de celle des expérimentateurs. L’anxiété des animaux sera réduite par un maintien en groupe social et par une manipulation régulière de la part de l'expérimentateur. Par ailleurs, les souris seront placées dans des cages avec des enrichissements environnementaux, y compris rouleaux en carton, coton, bûchettes en bois, etc, afin de leur permettre de manifester leurs comportements naturels. Les signes d'anomalie seront renseignés comme l'aspect des souris, un comportement irrégulier, des blessures, ou perte de poids. En outre, une analgésie sera mise en place afin de réduire ou supprimer la douleur, la souffrance et l’angoisse des animaux. Si les souris montrent une souffrance ou une douleur mise en évidence par une modification comportementale ou physique, une analgésie supplémentaire sera administrée. Les souris ayant atteint un point limite seront euthanasiées. Ces contrôles permettent d'identifier des animaux malades ou blessés et de prendre les mesures appropriées. L'ensemble du suivi se fait en coordination avec la SBEA (Structure chargée du Bien Etre des Animaux) et le vétérinaire référent.
Choix des espèces
Il s’agit ici d’études physiologiques et de comportement métabolique qui ne peuvent être reproduites par des systèmes, autres que celui de l’animal vivant. Les effets alimentaires et la régulation métabolique peuvent être étudiés avec pertinence chez la souris en comparaison avec l’homme. La souris permet aussi de manipuler certains gènes permettant d’accéder à la partie plus mécanistique des processus dans un environnement physiologique comparable à l’homme. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (à partir de 2 mois) afin que les réseaux neuronaux et astrocytes soient bien établis et que les expériences ne soient pas perturbées par une plasticité neuronale ou le développement des astrocytes.
Étude des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l’addiction aux opiacés chez la souris et des troubles comorbides.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises chaque jour pendant dix jours à des épisodes de défaite sociale face à des mâles agresseurs, opérées au cerveau pour y implanter une fibre optique, puis injectées de morphine de façon répétée jusqu'au sevrage, 2 978 souris vont être utilisées. Toutes sont tuées à l'issue, et toutes relèvent d'un niveau de souffrance sévère. Le porteur écrit que "bien que les procédures de stress soient sévères, le bien-être animal prime", et annonce des tests comportementaux évaluant les propriétés récompensantes de la morphine et les comportements sociaux sans préciser lesquels. Les cerveaux sont prélevés après les tests, pour des mesures électrophysiologiques ou pour vérifier que les injections virales et les fibres ont été placées au bon endroit.
Objectifs
La forte prévalence des comorbidités entre dépression et addiction aux drogues a un impact majeur sur la santé mentale et les systèmes de santé. En témoigne l'épidémie d'opioïdes touchant les Etats-Unis, où la consommation de drogues est fortement associée à des symptômes de dépression, et a fait chuter l'espérance de vie jusqu’à son plus bas niveau. La comorbidité entre l’addiction aux drogues d’abus et la dépression ainsi que l’impact du stress sur la rechute après sevrage et la dépression, s’expliquent en partie par le fait que des circuits cérébraux communs sont mis en jeu, notamment le circuit dit de la récompense. Ainsi, des recommandations récentes soulignent que les développements thérapeutiques futurs doivent se concentrer sur les comorbidités, plutôt que de traiter chaque maladie indépendamment. Nous avons identifié un mécanisme cellulaire clé au sein du circuit de la récompense qui est constitué d’un réseau de neurones permettant la communication de différentes régions cérébrales entre elles ; ce mécanisme repose sur l’interaction physique au sein des neurones du système de récompense entre deux entités moléculaires appelés récepteurs. Cette interaction entre récepteurs régule les comportements dépressifs et d’addiction. Pour ce projet, nous allons étudier comment cette interaction entre récepteurs modifie l’activité de différents types de neurones au sein de ce circuit de la récompense.
Bénéfices attendus
Nous avons développé des outils qui permettent de cibler très spécifiquement des interactions entre récepteurs au sein du circuit de la récompense. Sur des prélèvements de cerveaux provenant de patients ayant soufferts de dépression et/ou de dépendance aux drogues, nous avons pu détecter des variations dans l’interaction entre ces récepteurs. Le présent projet permettra d’élucider le rôle de ces interactions entre récepteurs dans des modèles de troubles psychiatriques. Ce nouveau mécanisme identifié représente un intérêt thérapeutique permettant de proposer potentiellement un nouveau traitement dans pour les pathologies comorbides telles que l’addiction et la dépression. Ce projet revêt donc un fort potentiel translationnel car il ouvre la porte à de futurs développement thérapeutiques pour traiter à la fois les addictions et la dépression en même temps.
Procédures
Les animaux seront soumis à des épisodes de stress sociale dans les 4 procédures pour une durée maximale de 5 minutes par jour sur une période de 10 jours. Une chirurgie cérébrale est également pratiquée avec implantation de fibre et/ou d’outils génétique pour l’apport de molécule d’intérêt sur une partie des animaux. Les animaux subiront différents tests comportementaux permettant d’évaluer les propriétés récompensantes de la morphine, son sevrage, et les comportements sociaux. Des injections répétées de morphines, anesthésiques, saline seront également réalisées.
Impact sur les animaux
Le projet s’intéresse à la composante addictive de la morphine et la dimension stressante de l’exposition à des stimuli aversifs à l’âge adulte. Ainsi les effets indésirables seront principalement liés à la dérégulation de ces grands systèmes et pourront se manifester à l’échelle comportementale par des traits dépressifs et un ressenti de manque de la substance. Ces stress n’induisent pas des dérégulations profondes des systèmes de la douleur mais provoque des stress psychologiques. Le protocole d’administration de morphine induisant l’apparition de signes de sevrage se manifestant également à l’échelle somatique (tremblements etc…) que nous étudions. Les chirurgies provoqueront des douleurs au niveau du site d'incision cutanée et d'injection par perforation du périoste. Les tests de comportement seront pour la plupart sans douleur et basés sur la tendance naturelle des animaux à explorer ou éviter une zone nouvelle ou un nouveau congénère. Certains animaux dans le cas des stress sociaux peuvent ne pas ou peu prendre de poids. Les injections répétés peuvent générer une sensibilité de la zone accrue et un risque d’infection (il est prévu d’alterner les injections entre la droite et la gauche afin de réduire nettement ce risque).
Devenir
Procédure 1 à 4 : Après les tests comportementaux, les souris seront mises à mort pour prélèvement de cerveau dans le but de réalisée des mesures électrophysiologiques ou afin de vérifier la justesse des injections virales et du placement des fibres d’enregistrements.
Remplacement
Notre projet reposant en grande partie sur des approches de physiologie intégrée. Il n’existe à l’heure actuelle aucune méthode substitutive qui pourrait remplacer l’utilisation de l’animal dans nos expériences. Les structures étudiées étant très conservée entre l’Homme et la souris, cela en fait un modèle de choix pour notre projet. De même, l’utilisation de virus et de lignée génétiquement modifiée permettent un ciblage précis des structures et récepteurs altérés par le stress ou l’exposition à la morphine.
Réduction
Le nombre d’animaux nécessaire dans chaque procédure est calculé au mieux afin d’utiliser le moins d’animaux possible mais de maintenir un niveau de significativité statistique suffisante. Le projet requiert des mâles et des femelles afin d’être le plus représentatif possible de la population et éviter un biais lié au sexe.
Raffinement
Bien que les procédures de stress soient sévères, le bien-être animal prime et par conséquent nous faisons attention à l’enrichissement des cages, à limiter au maximum le stress des animaux en dehors de la procédure, définition et suivi de l’animal adapté à chaque situation. En effet, les risques éventuels de blessures ou de déshydratation sont plus élevés lors de l'exposition à la défaite sociale ou à une chirurgie par exemple. C'est pour cela que la fréquence d'observation des animaux seront proportionnés aux potentiels risques encourus Ainsi, lors des chirurgies, une hydratation sous cutanée pré et post opératoire sera réalisée, de même que l’injection d’analgésique avant et une administration d’antiinflammatoire/analgésique pendant 5 jours post-opération. Un tapis chauffant est placé sous l’animal lors de la chirurgie (régulation via sonde rectale) et également sous les cages de réveil afin de faciliter ce dernier et éviter une hypothermie. Les souris auront accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. Chaque cage possède des bâtons en bois à ronger, un abri et des cotons pour la nidification
Choix des espèces
Les caractéristiques morphologiques et physiologiques des souris sont largement documentées. Elle possède une proximité évolutive, un cycle de vie cours permettant de répéter les expériences afin de s’assurer de la robustesse des résultats, ce qui constitue un atout pour développer efficacement notre projet. C’est un excellent modèle pour l’étude des conséquences du stress et de la morphine d’un point de vue physiologique, comportemental ou cellulaire. Les mécanismes moléculaires du stress ainsi que les propriétés neuronales de ces rongeurs au niveau des structures sous-corticales étudiées sont très proches de ceux du cerveau humain. Cela nous permettra de réaliser des études dont l’impact sera important pour la compréhension des effets du stress et de l’addiction, et ainsi de pouvoir mieux cibler les approches thérapeutiques. Nous disposons de techniques adaptées à cette espèce (électrophysiologie, comportement, chirurgie). De ce fait, la souris est un bon modèle pour notre étude. Les CD1 agresseurs sont des anciens mâles reproducteurs de plus de 6 mois.
Rôles de l’interleukine-1beta (IL-1β) en conditions physiopathologiques (1/2).
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Des composés injectés provoquent chez les souris des crises de type épileptique que le porteur reconnaît douloureuses. 8 704 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 3 456 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère et 5 248 un niveau modéré. Toutes subissent injections, chirurgies d'environ 40 minutes et tests comportementaux quotidiens de cinq minutes pendant une semaine, une partie passant en plus trente minutes en imagerie. Le porteur annonce l'administration d'antalgiques au titre du raffinement, puis écrit qu'il n'est pas possible d'en utiliser dans les expériences sur l'inflammation, "afin de ne pas modifier les résultats expérimentaux".
Objectifs
I'interleukine (IL1) est une molécule essentielle dans l’initiation de l’inflammation suite à une infection ou une lésion. Cette molécule est en outre impliquée dans le développement de nombreuses pathologies comme l’arthrose, la polyarthrite rhumatoïde, le diabète de type 2 et contribue au développement de maladies de type auto-inflammatoire. De nombreuses études suggèrent également que cette molécule modulerait de nombreux processus physiologiques ou pathologiques comme la mémoire ou la douleur. Cependant, en l’absence d’outils pertinents permettant d’étudier cette cytokine dans le temps et dans l’espace, les rôles précis de l'IL1 secrétée par différents types cellulaires selon le contexte physiopathologique ne sont pas connus ou controversés. Notre équipe a récemment développé un modèle de souris exprimant un capteur de l’IL1 qui émet de la lumière. Cette souris ‘2 en 1’ permet 1/soit de visualiser chez l’animal de façon spatiale et temporelle la production d’IL1 par mesure de la luminescence, 2/ soit d’inactiver spécifiquement la synthèse de l’IL1 dans un type cellulaire donné. Basé sur ce modèle murin innovant, ce projet a pour but de déterminer précisément le rôle de l’IL1 et les voies de signalisation cellulaire gouvernant sa libération, dans différents contextes physiologiques et pathologiques. A terme, ce projet devrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de différentes pathologies impliquant l’IL1. Ce projet sera réalisé dans deux établissements utilisateurs (EU1 et EU2).
Bénéfices attendus
Les bénéfices espérés du projet sont multiples : Il est attendu une meilleure compréhension du rôle de l’ IL1 dans divers contextes physiopatholoqiues et ainsi proposer de nouvelles pistes therapeutiques ciblant l’inflammation. Plus précisément, grâce à l’utilisation d’animaux exprimant un capteur de l’ IL1, nous pourrons définir précisément la provenance de cette molécule et la signalisation cellulaire associée à sa libération. De plus, l’invalidation génique de l’IL1 dans un type cellulaire donné nous permettra d’évaluer spécifiquement la contribution de l’ IL1 dans le développement de l’inflammation, des douleurs associées et des comorbidités anxio-dépressives.
Procédures
L'ensemble des animaux recevront des injections, des chirurgies et feront des tests comportementaux. Dans l'EU1, les expériences d'injection, de chirurgies et de tests comportementaux seront réalisés. Dans l'EU2, l'imagerie des animaux sera réalisée ainsi que des injections. Les tests comportementaux permettront de déterminer les troubles des fonctions motrices et cérébrales. Les animaux seront gardés en vie deux mois, le reste des animaux sera gardé en vie au maximum 15 jours après l'induction de l'inflammation. Les test comportementaux ont une durée de 5 minutes quotidiennes, pendant une semaine. Les chirurgies ont une durée d'environ 40 minutes. L'imagerie des animaux dure 30 minutes.
Impact sur les animaux
Des douleurs légères des injections par piqure, des douleurs à prendre en charge pendant et après des chirurgies. Des composés vont induire des crises de type épilepsie qui sont douloureuses pour les animaux. Les tests de comportement vont induire un stress modéré dans certaines conditions.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés afin de prélever les organes d'intérêt.
Remplacement
Ce projet s’appuie sur l’utilisation d’un modèle murin unique et innovant permettant de suivre précisément dans le temps et dans tout l’organisme l’expression d’une molécule pro-inflammatoire. Il permettra également de ne plus avoir l'expression, spécifiquement dans un type cellulaire donné, de cette interleukine afin de definir de nouvelles pistes therapeutiques. Il n’est donc pas possible de s’affranchir de l’utilisation d’animaux vivants. Enfin, notre projet s’appuie sur différents tests comportementaux chez l’animal ainsi que l’obtention d’organes pour en étudier les caractéristiques histologiques.
Réduction
Le nombre d’animaux utilisés pour ce projet a été défini au plus juste pour nous permettre d’atteindre nos objectifs scientifiques et être statistiquement pertinents. L’avantage de notre souris exprimant le capteur de l’IL1 est la réutilisation possible d’un même animal pour un suivi longitudinal, notamment lors de la mesure de bioluminescence in vivo à différents temps, permettant ainsi de réduire le nombre d’animaux utilisés. Par ailleurs, nous avons défini des stratégies de croisement de manière à limiter au maximum la production d’animaux qui ne seraient pas utiles pour l’expérimentation. Il est bien établi qu’il existe un important dymorphisme sexuel dans les mécanismes inflammatoires. Les études seront donc réalisées à la fois chez le mâle et la femelle. Les tests comportementaux et l’analyse des tissus seront effectués sur les mêmes animaux afin d‘en réduire le nombre. Pour définir statistiquement la taille des lots d'animaux à tester, nous nous appuyons sur des travaux publiés, ainsi que sur l'utilisation du logiciel G Power (ver 3.4.10) approprié pour l'évaluation statistique du nombre d’animaux requis. La taille de chacun des lots d’animaux à générer pour ce projet a été calculée sur la base de tests paramétriques permettant de détecter une différence significative sur la base d’un risque d’erreur α fixé à 5% et une puissance de 0.80.
Raffinement
Le suivi de l’évaluation de l’état de santé des animaux sera strictement respecté et effectué régulièrement. Des points limites spécifiques ont été définis (perte de poids continue et excessive; prostration ; poils ébouriffés, arrêt d’alimentation, etc.) et le raffinement (adminstration d’antalgiques ou analgesiques) s’appliquera pour une prise en charge adaptée des animaux. Pour les scores les plus importants, cette prise en charge pourra conduire à l'euthanasie de l’animal. Dans la partie de notre projet s’intéressant à l’inflammation dans différents contextes inflammatoires, il n’est pas possible d’utiliser des analgésiques ou des antalgiques afin de ne pas modifier les résultats expérimentaux. Pour le transport des animaux, nous suivrons la procédure validée par le réseau des animaleries de Montpellier, après demande d'autorisation auprès du vétérinaire et de la direction départementale de la protection des populations. Nous ajoutons à la litière des frisottis et/ou des buchettes en bois, des aliments et du gel hydrique.
Choix des espèces
La souris est un modèle bien connu dans la caractérisation des mécanismes sous-tendant l’inflammation. Ce modèle permet également l'utilisation de souris invalidées pour nos cibles d'intérêt ou exprimant des biosenseurs, ce qui permet de facilement considérer les rôles et fonctions de différentes protéines. De plus, les études précédentes de référence ont été réalisées sur des souris, ce qui permet de se baser et de comparer directement les résultats qui seront obtenus Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (entre 2 et 6 mois), ce qui permet de s’affranchir des effets développementaux et de senescence.
Rôle des Facteurs de Croissance dans la régulation centrale de la cognition au cours du vieillissement cérébral chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Toutes tuées à l'issue, 1 560 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont une perfusion intracardiaque terminale. Les interventions comprennent des injections intracrâniennes de 25 minutes, la pose de canules et de pompes osmotiques sous la peau, puis des tests de mémoire épisodique, contextuelle et spatiale, ce dernier répété quatre fois par jour pendant neuf jours. L'objet déclaré est le lien entre le déclin de certains facteurs de croissance avec l'âge et la baisse des performances de mémoire, étudié sur des souris de 3 et de 16 mois. Le porteur justifie le sort des animaux en une ligne : ils seront mis à mort "selon le respect des 3R".
Objectifs
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence et de caractériser le rôle des hormones au niveau des processus de mémorisation du cerveau et de déterminer un lien possible entre le déclin de des facteurs de croissance observe avec l'âge et la diminution des performances de mémoire au cours du vieillissement. Tout comme l’homme, les souris possèdent également ces récepteurs et hormones d’intérêt que nous pouvons suivre et étudier au cours de leur vieillissement.
Bénéfices attendus
En résumé, ce projet pourrait permettre de conduire au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ou préventif pour ralentir et limiter les issues du vieillissement.
Procédures
- Injections intrapéritonéales et/ou sous cutanées. - Injections des hormones par pousse seringue (durée 2 min) - Contention (max = 2 min). - Procédures chirurgicales : injections intracraniennes (25 min par souris) ; pose de canules (10 min par souris); pose de pompes osmotiques sous-cutanée (10 min par souris). - Tests comportementaux : mémoire épisodique : test sur 15 minutes ; mémoire contextuel : test sur 4 minutes ; mémoire spatiale test sur 4 x 2minutes par jour sur 9 jours. - Perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les différentes injections sous cutanées ou intrapéritonéales peuvent induire un stress et une douleur légère de courtes durées. Lors de l’intervention chirurgicale (25 minutes par souris), l’anesthésie conduit à des modifications physiologiques transitoire de l’animal. La mise en cadre stéréotaxique entraine une compression légère et temporaire des tissus cutanés le temps de l’intervention chirurgicale. La perforation et l’ouverture du plan cutané entrainera une nuisance directe de cet acte le temps de la cicatrisation des tissus osseux et cutanés d’une durée de plusieurs jours. Suite à la chirurgie, les plaies chirurgicales peuvent présenter des signes d'infections ou d'inflammation. La pose de pompes osmotiques et de canules d'administrations locales peut entrainer une gêne légère et nécessitera un temps d'adaptation pour les souris. Pour les administrations locales, la contention de l'animal peut générer également un stress transitoire. Lors des tests comportementaux, des changements d’environnement peuvent générer un stress temporaire et très modéré de courtes durées mais nécessaires à la stimulation des processus physiologiques de mémorisation.
Devenir
Les animaux seront mis à mort selon le respect des 3R
Remplacement
Une veille bibliographique a été réalisée pour ce contexte scientifique. A ce jour, il n’existe pas dans la littérature de modèle de remplacement pour étudier le comportement animal. Pour réaliser les tests de comportement, nous devons utiliser des modèles in vivo.
Réduction
Des prélèvements auront lieu pour des analyses histologiques après la mise à mort, de biologie cellulaire et moléculaire afin d’extraire le maximum de données de chaque expérimentation. Le nombre de souris par groupe se composeront de 20 souris car pendant les tests de comportement les variabilités inter individuelles sont importantes. Cet effectif pour chacun des groupes a été déterminé afin de pouvoir réaliser une analyse statistique.
Raffinement
La chirurgie sera faite une semaine après la période d'acclimatation des animaux aux conditions d'hébergement, sous anesthésie générale profonde pour éviter toute douleur et des antalgiques sont prévus en pré et post-opératoire. Pour assurer le bien-être des souris, elles seront placées en cages groupées par 5 individus dans un milieu enrichi pour réaliser une nidification à façonner (matière fibres végétales). Les souris seront sous surveillance journalière et des points limites ont été établis, entrainant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire.
Choix des espèces
L'objectif de ce projet est de mettre en évidence et de caractériser le rôle des facteurs de croissance au niveau des processus de mémorisation du cerveau et de déterminer un lien possible entre le déclin de des facteurs de croissance observé avec l'âge et la diminution des performances cognitives au cours du vieillissement. Le projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales sur animal vigile qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro. Des animaux âgés de 3 mois (jeune adulte) et de 16 mois (adulte âgé) seront utilisé pour ce projet axé sur le vieillissement. La souris constitue un excellent modèle pour ce projet : -Les gènes d'intérêt sont exprimés dans le cerveau de la souris comme dans celui de l'homme ; - Nous disposons de nombreux outils spécifiques de la souris ; -La durée de vie des souris et leur capacité reproductive sont particulièrement adaptées à ce projet.
Etude des cellules de l’engramme avec Cal-light dans le cortex préfrontal
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
150 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune passant cinq semaines seule en cage à cause de la prothèse fixée sur son crâne. Deux interventions chirurgicales, de 45 à 90 minutes puis de 90 à 120 minutes, ouvrent la peau et le crâne pour une injection stéréotaxique et la pose d'une lentille dans le cerveau. Les souris sont ensuite habituées à porter un appareil d'imagerie sur la tête, puis soumises à une tâche d'apprentissage que le porteur qualifie de légèrement désagréable. L'étude vise la compréhension des mécanismes de la mémoire, les retombées annoncées pour Alzheimer ou Parkinson étant renvoyées à un "à terme" sans échéance.
Objectifs
La mémoire est la clé de notre existence. Les mécanismes fondamentaux de la mémoire ont été étudié depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention sur le cerveau a été possibles. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet est de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères. Pour mener ces études, nous souhaitons étudier, en temps réel, l’activité des neurones du cortex préfrontal impliqués dans une tâche d’apprentissage associatif. Nous analyserons, ensuite, l’activité associé aux différentes phases de la tâche, ainsi que la réactivation de ces neurones dans les jours qui suivent la séance d’apprentissage.
Bénéfices attendus
Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.
Procédures
Tous les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : la première durera environ 45 à 90 minutes, et la deuxième durera de 90 à 120 minutes. En outre, ils subiront une intervention sous sédation (sans acte invasif) d'une durée d'environ 60 minutes pour la pose d'une prothèse sur la tête. Pour des raisons techniques liées à la présence d'une prothèse, il est nécessaire d'adapter les conditions d'hébergement. Les animaux seront hébergés individuellement pendant une période de 5 semaines, avec des périodes d'échange entre congénères. Les animaux seront progressivement habitués à accepter la pose d'un appareil d'imagerie sur leur tête au cours de séances d'entraînement, dont la durée augmentera progressivement de 2 à 30 minutes. Par la suite, les animaux effectueront une tâche comportementale légèrement désagréable d'environ 30 minutes en présence de l'appareil d'imagerie, qui sera positionné sur leur tête. Le lendemain, ils seront de nouveau exposés à la tâche comportementale, cette fois pendant environ 20 minutes.
Impact sur les animaux
Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur modérée de 2 jours, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent suite à l'incision de la peau, la craniotomie, l'injection stéréotaxique, l'installation de la lentille GRIN et la réalisation des points de sutures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront soumis à une tâche comportementale légèrement désagréable et stressante pour l'animal. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement par le séparateur en plexiglasse.
Devenir
L'ensemble des animaux est euthanasié à la fin de la procédure afin de réaliser des expériences histologiques.
Remplacement
En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.
Réduction
Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Pour estimer correctement le nombre d'animaux nécessaires, nous avons sollicité l'avis de deux experts renommés dans le domaine. Dans une optique de réduction, nous avons également prévu des études pilotes permettant l’évaluation de la faisabilité technique de certains aspects de notre étude. Nous avons également intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure dès leur obtention. Cela nous offrira, si nécessaire, la flexibilité de réduire le nombre d'individus requis pour atteindre nos objectifs scientifiques, tout en garantissant la validité et la robustesse de nos conclusions.
Raffinement
i) Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation. iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'une crème pour les yeux et d'un tapis chauffant pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation des techniques de manipulation prévu pour réduire le stress de la manipulation viii) Habituation à la salle de comportement, ix) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. x) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs en bien être animal, consultation d'experts dans le domaine.
Choix des espèces
La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes neuronaux sur l’adaptation comportementale. De plus, les modèles génétiques murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions pathologique. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 32 semaines d’âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.