Système nerveux
- Autre recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Multisystémique
- Oncologie
- Organes sensoriels
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système gastrointestinal
- Système immunitaire
- Système musculosquelettique
- Système respiratoire
- Système urogénital
Régulation de la réponse de la microglie aux cytokines et de la clairance des dépôts amyloïdes et des agrégats de tau par le remodelage des glycanes sulfatés
- Recherche fondamentale
- Système immunitaire
- Système nerveux
Environ 80 % des souris porteuses du gène Tau sont mortes à l'âge de 12 mois, et leur faiblesse des pattes évolue vers une paralysie entre 7 et 10 mois, avec une posture voûtée et des difficultés à s'alimenter. 2300 souris, dont des souris porteuses des gènes hAPP ou Tau liés à la maladie d'Alzheimer, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère : toutes ont le bout de la queue coupé sous anesthésie pour le génotypage, et 366 sont destinées aux expériences sur cinq ans. Chez les petits de femelles porteuses du gène hAPP, la mortalité atteint environ 15 % sur les six premiers mois. Le porteur écrit pourtant que les lignées utilisées "ne présentent aucun problème physique ou physiologique". Toutes les souris sont tuées à la fin du protocole, après anesthésie et analgésie, sans que le texte précise le rôle des souris génotypées au-delà des 366 destinées aux expériences.
Objectifs
Le projet de recherche vise à comprendre comment les molécules cérébrales appelées glycanes sulfatés régulent l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer par les cellules immunitaires du cerveau dans des modèles de souris. Nous étudierons si un modèle de souris dont le gène d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés est augmenté ou un modèle de souris dont le gène d'une enzyme générant des glycanes sulfatés n'est pas fonctionnel dans les cellules immunitaires du cerveau, serait bénéfique pour l'élimination des substances responsables de la maladie d'Alzheimer in vivo. Des études animales sont nécessaires pour examiner ces possibilités de limiter la progression de la maladie par l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés ou par l'élimination d'une enzyme génératrice ou d'une molécule de protéine présentatrice dans de cerveau de modèles murins de la maladie d'Alzheimer.
Bénéfices attendus
La modification des glycanes sulfatés dans les cellules immunitaires du cerveau in vivo aura un impact sur la recherche en matière de neuroinflammation et de neurodégénérescence. L'analyse des rôles régulateurs des glycanes sulfatés nous permettra de comprendre en détails les mécanismes moléculaires par lesquels les cellules immunitaires cérébrales éliminent les substances responsables dans le cerveau de la maladie d'Alzheimer. Notre analyse des cellules immunitaires du cerveau in vitro est applicable au criblage de composés chimiques susceptibles de potentialiser le traitement thérapeutique des patients affectés par la neurodégénérescence. Les résultats du profilage de l'expression des gènes et de la mise en évidence d'une expression génétique altérée permettraient de découvrir de nouvelles cibles pharmacologiques impliquées dans la cause de la maladie d'Alzheimer. Nos données déjà obtenues montrent que l'augmentation d'une enzyme dégradant les glycanes sulfatés améliore l'élimination des maladies cérébrales responsables de la maladie in vitro, indiquant la faisabilité du projet proposé et ouvrant la voie à de nouvelles approches pour contrôler les causes de la maladie d'Alzheimer. Les concepts innovants concernant la modification des glycanes sulfatés dans le cerveau seront étendus à un autre modèle murin de la maladie d'Alzheimer appelé tauopathie. Dans l'ensemble, notre objectif ultime est de développer une nouvelle stratégie de traitement de la maladie d'Alzheimer, afin de contribuer à l'amélioration de la santé et du bien-être, ainsi qu'au bien-être social et économique. Il s'inscrit dans la priorité nationale « Plan maladies neurodégénératives ».
Procédures
Le bout de la queue (
Impact sur les animaux
Les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer, que nous utiliserons dans ce projet, présentent des déficits de la mémoire spatiale et de l'apprentissage. Les petits nés de femelles porteuses du gène responsable de la maladie, appelé hAPP, ont un taux de mortalité d'environ 15 % au cours des six premiers mois de leur vie. Environ 80 % des souris porteuses d'un autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, meurent à l'âge de 12 mois, avec la survie médiane d'environ 9 mois. Elles présentent une rétraction des pattes lorsqu'elles sont soulevées par la queue, suivie d'une faiblesse des pattes. Ces déficits moteurs évoluent vers une paralysie à l'âge de 7 à 10 mois, avec une posture voûtée et des difficultés à s'alimenter. Une légère diminution du poids est observée à l'âge de 11 mois. La coupe de la queue pour le génotypage entrainent une douleur légère de courte durée. Les souris seront mises à mort après anesthésie et analgésie.
Devenir
Pendant la durée de la procédure, les animaux sont maintenus en vie. Puis, à la fin du protocole, toutes les souris sont euthanasiées selon la procédure.
Remplacement
Des lignées de cellules immunitaires cérébrales de souris immortalisées et des essais biochimiques et biologiques seront utilisés en parallèle dans le laboratoire. Les objectifs du projet proposé sont d'étudier les effets bénéfiques d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés sur les fonctions des cellules immunitaires cérébrales et d'examiner si l'augmentation d'une enzyme de dégradation des glycanes sulfatés pourrait réduire la masse des matériaux responsables de la maladie dans le cerveau des souris modèles de la maladie d'Alzheimer in vivo en facilitant l'activité soutenue des cellules immunitaires cérébrales au fil du temps. Dans cette phase, l'utilisation d'animaux est essentielle.
Réduction
Le nombre de souris est réduit en utilisant chaque hémi-cerveau pour deux expériences différentes. Le nombre de souris par groupe est réduit au minimum afin de garder une analyse statistique fiable. Ce plan expérimental a déjà été publié dans la littérature ce qui permet de réduire au minimum statistique le nombre d'animaux nécessaires à l'étude.
Raffinement
Les souris seront hébergées en groupe de cinq dans un milieu enrichi (un bâton, un tunnel ou dôme ou papier craft) dans des cages de taille suffisante et avec un accès libre à l’eau et à la nourriture. Le bien-être des animaux sera surveillé tous les jours. Les différentes lignées utilisées dans nos procédures ne présentent aucun problème physique ou physiologique. L’ensemble des expérimentations est mené par du personnel qualifié et formé afin d’éviter tout stress ou inconfort de l’animal avec une attention particulière sur la gestion de la douleur. Nous serons attentifs à observer si les animaux souffrent ou présentent un comportement anormal en lien avec le responsable du bien-être animal en observant les paramètres cliniques suivants Les points limites : -Perte de poids rapide 15 à 20% en quelque jours, longue période de perte de poids -Poil hérissé, dos rond, abdomen distendu ou léthargie -Diarrhée -Toux, râles, respiration pénible, écoulements nasaux -Signes d’atteinte du Système nerveux central -Tout autre signe clinique, jugé par le technicien expérimenté Ce suivi sera réalisé en lien avec le responsable du bien-être animal. Les animaux présentant un de ces critères seront mises à mort.
Choix des espèces
La souris est l'animal classiquement utilisé pour les études sur la maladie d'Alzheimer. Les modèles murins de la maladie d'Alzheimer sont largement utilisés pour les études de recherche fondamentale. De plus, de nombreux outils sont disponibles chez la souris (anticorps, kit et appareil), permettant une exploitation maximale des tissus obtenus. Des souris âgées de 3 mois, 6-9 mois et 15-18 mois seront utilisées. Dans le modèle de souris de la maladie d'Alzheimer, qui surexprime le gène responsable de la maladie, appelé hAPP, les niveaux de matériaux responsables de la maladie dans une région particulière du cerveau, importante pour la mémoire, commencent à augmenter vers l'âge de 6 semaines. Les substances pathogènes deviennent évidentes dans les régions particulières du cerveau nécessaires à la mémoire. Ce phénotype est progressif, avec des pics importants à l'âge de 8-10 mois. Une augmentation significative de l'activation des cellules immunitaires du cerveau a été observée dans ces régions à l'âge de 6-9 mois. Dans le modèle de souris qui exprime l’autre gène responsable de la maladie, appelé Tau, les matériaux responsables de la maladie qui affectent directement les cellules neuronales et provoquent une perte de mémoire commencent à apparaître vers l'âge de 6 mois. Ces phénotypes ont fait l'objet de nombreuses publications dans le monde entier et ont permis d'accumuler des données utiles pour l'étude de la maladie d'Alzheimer.
Evaluation de l’effet neuroprotecteur de la photobiomodulation sur des modèles murins de la maladie de Huntington.
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
366 souris, de deux souches porteuses de la maladie de Huntington et de souches témoins, vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur cerveau. Cinq jours par semaine, elles sont immobilisées 90 secondes pour un traitement de la tête par la lumière, avec des prises de sang éveillées tous les quinze jours, des IRM sous anesthésie jusqu'à une fois par mois et des tests de mouvement et de mémoire que le texte ne nomme pas. Si cette première partie est concluante, une seconde ajoute une chirurgie de 90 minutes pour implanter une source de lumière dans le cerveau. Dans les deux parties, les souris sont tuées dès que leurs symptômes moteurs évoluent "au-delà d'une gêne modérée". Le porteur compte parmi les bénéfices des "publications scientifiques et présentations en congrès", et renvoie un éventuel essai clinique à des "études complémentaires". Il présente aussi la seconde partie comme un moyen de limiter "le nombre de gros mammifères" d'une étude ultérieure.
Objectifs
Des études ont démontré que la lumière ralentie la maladie de Parkinson. La maladie de Huntington touche 6000 personnes en France. C’est une maladie génétique rare qui se traduit par la mort de neurones. Les symptômes handicapent grandement le quotidien des patients, et la maladie n’a pas à ce jour de traitement . La maladie de Huntington présente des similarités avec la maladie de Parkinson. Les objectifs de ce projet sont 1. d’évaluer sur des modèles souris de la maladie de Huntington si un traitement par la lumière permet de ralentir le développement de la maladie, au même titre que pour la maladie de Parkinson et 2. de préciser la région du cerveau la plus à même de recevoir le traitement.
Bénéfices attendus
La réalisation de ce projet permettra d’évaluer si le traitement par la lumière protège les neurones, comme cela a été observé dans la maladie de Parkinson. Les travaux seront aussi valorisés au travers de publications scientifiques et présentations en congrès. La deuxième partie du projet permettra de préciser les régions du cerveau les plus appropriées pour recevoir le traitement par la lumière. Si l’effet de protection des neurones par la lumière est avéré, comme il l’a précédemment été pour la maladie de Parkinson, des études complémentaires pouvant conduire jusqu’à un essai clinique, porteur d’espoir pour les patients, seront envisagées.
Procédures
Dans la première procédure, les animaux subiront une contention 5 jours par semaine de 90 secondes afin de permettre le traitement. Les animaux sont préalablement habitués à cette contention. Le traitement est indolore, et n’induit pas de gêne ou inconfort. Pour évaluer l’effet du traitement nous mesurerons les mouvements des animaux et leur mémoire (tests n’excédant pas 15 minutes) et feront des IRM réguliers (n’excédant pas 1 heure) : initialement puis pour les plus fréquents tous les mois (pour les animaux dont l’espérance de vie est réduite), et tous les 3-4 mois pour les animaux avec une espérance de vie normale. Les IRM seront réalisées sous anesthésie générale. Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront effectués tous les 15 jours. Si besoin un prélèvement de queue de quelques millimètres pourra être réalisé de facçon unique sur animal anesthésié pour sa caractérisation génétique. Les animaux seront euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au delà d’une gêne modérée. Si l’efficacité du traitement est concluante, la deuxième partie du projet nécessitera une chirurgie (maximum 90 minutes) pour placer un implant délivrant de la lumière directement dans le cerveau, pour définir quelle région est la plus appropriée pour recevoir le traitement. Le traitement, permis par l’implant ne nécessitera plus de contention car la lumière sera contrôlé à distance. Les animaux seront évalués comme précédemment (même fréquence et durée pour les prélèvements sanguins, l’IRM et les tests comportementaux), et euthanasiés sous anesthésie générale avec administration préalable d’antalgique dès que les symptômes moteurs de la maladie évolueront au-delà d’une gêne modérée.
Impact sur les animaux
Certains modèles animaux Huntington utilisés conduisent naturellement à une perte progressive des possibilités de mouvement de l’animal ; l’animal se nourrit et boit moins facilement et perd du poids progressivement. Certains animaux ont une durée de vie plus courte que la normale, et ne peuvent plus se déplacer correctement en fin de vie. La contention pour illuminer la tête des animaux ainsi que la réalisation des tests comportementaux peut engendrer de façon temporaire, le temps que l’animal s’habitue à l’expérimentateur, à une peur légère. Le traitement en lui-même n’induit ni chaleur, ni douleur. La chirurgie induit de façon temporaire (24-48h) et maitrisée une douleur modérée du fait des points de suture. Par expérience, les animaux tolèrent ensuite bien le dispositif qui est adapté à leur morphologie.
Devenir
Les animaux subiront un traitement par la lumière pour évaluer si cela permet de limiter le développement de la maladie de Huntington. Si les animaux de mise au point n’ont pas besoin d’être euthanasiés pour les mises au point sur pièce anatomique, ils seront utilisés dans les mises au point de la procédure 2. A l’issue de ces procédures, et en compléments des évaluations et de l’imagerie, les animaux seront euthanasiés pour récupérer leur cerveau pour évaluer si le traitement a protégé les neurones.
Remplacement
La littérature permet de savoir que le traitement par la lumière est efficace dans la maladie de Parkinson. C’est un élément très encourageant pour espérer obtenir des résultats positifs pour la maladie de Huntington, car ces 2 maladies ont de nombreux points communs. Les études des effets de la lumière sur des modèles cellulaires ont mis en évidence une difficulté de transposition des résultats obtenus sur les modèles physiologiques in vivo (absence d’effet, ou modalités d’illumination complètement différentes de celles effectives in vivo). Les effets du traitement par la lumière impliquent probablement un intermédiaire encore non identifié, et non présent dans les cultures de cellules, empêchant ainsi l’anticipation des effets de la lumière in vitro. L’évaluation des effets neuroprotecteurs du traitement dans le cadre de la maladie de Huntington nécessite donc une évaluation chez l’animal, d’autant plus pour mesurer l’impact sur les performances motrices et cognitives. Les modèles de souris étant bien décrits et facilement manipulables sont adaptés pour une première évaluation. Des souches de souris de même fond génétique sont utilisées pour les mises au point, car il n’est pas nécessaire d’utiliser une souche à phénotype dommageable pour mettre au point les différentes étapes de l’étude. La deuxième partie du projet permettra de limiter le nombre de gros mammifères qui seraient nécessaires dans une étude ultérieure.
Réduction
Les données seront analysées par des tests statistiques. Des animaux au phénotype non dommageable seront utilisés pour les mises au point afin d’optimiser l’utilisation des animaux Huntington. La phase de mise en place sera stoppée dès que toutes les procédures seront maitrisées et reproductibles sur 3 animaux consécutifs. Les animaux n’ayant pas besoin d’être euthanasiés à l’issue des mises au point de la première procédure seront utilisés pour la procédure 2. L’évaluation des effets du traitement nécessite 2 souches complémentaires de souris Huntington, et des contrôles associés au phénotype non dommageable. On estime à 10% le nombre de souris qui seront euthanasiées précocement ne permettant pas de recueillir les données de façon adéquate. Deux types distincts et incompatibles d’analyse des pièces anatomiques sont nécessaires. La deuxième partie du projet ne sera réalisée que si les résultats de la première partie sont concluants. Elle reproduira la première étude en comparant 3 régions du cerveau pouvant recevoir le traitement (traitement localisé). Le total maximal de souris nécessaires pour ce projet sera de 366.
Raffinement
Les animaux seront surveillés de façon journalière. Le traitement, les tests et l’IRM ne sont pas douloureux ; une habituation préalable à la contention et aux expérimentateurs permettra de réduire le stress des animaux. Les IRM seront effectuées sous anesthésie générale. Les animaux réintègreront leurs groupes sociaux dès les tests effectués. Dans la deuxième partie du projet, les chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale et traitement antalgique. De l’hydrogel sera mis dans la cage et les animaux pesés chaque semaine pour évaluer et limiter la perte de poids naturelle de ces souris (du fait de la maladie). Les euthanasies seront effectuées sous anesthésie générale et antalgie, dès que les points limites sont atteints permettant de limiter la durée pendant laquelle la souffrance due au phénotype dommageable atteint un stade sévère.
Choix des espèces
L’effet d’un traitement et son impact sur les mouvements, la mémoire et l’espérance de vie, ne peut s’évaluer que sur un organisme entier. Les souris sont des modèles bien connus, et une première évaluation ne nécessite pas d’organisme plus évolué. La littérature permet de bien connaitre les modèles d’étude, et d’adapter le protocole pour évaluer l’impact de notre traitement. Les animaux seront réceptionnés à l’âge de 3 semaines afin d’être sevrés, et de démarrer le traitement en phase précoce de développement de la maladie, l’espérance de vie étant assez courte (3 mois) pour l’une des souches, et les symptômes de la maladie apparaissant assez rapidement, comme c’est le cas dans la maladie humaine.
Etude de l’implication des neurones sensoriels dans le cancer du côlon et immunité
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système immunitaire
- Système nerveux
Laparotomie pour injecter des produits dans la paroi intestinale ou directement dans des adénomes, injections entre les vertèbres, dépôt de cellules tumorales dans le rectum, biopsie de queue : 458 souris subissent ces gestes, dont 252 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, et toutes sont tuées à l'issue. Le porteur indique que les tumeurs intestinales peuvent provoquer douleur et prolapsus rectal, et que les chirurgies peuvent entraîner des délabrements. L'objet déclaré est de comprendre le rôle des neurones sensoriels dans la croissance des tumeurs du côlon, une étape amont dont les retombées thérapeutiques restent à l'état d'hypothèse. Une grille de score doit repérer les 16 % d'animaux susceptibles de perdre du poids et de développer une anémie, sans que le RNT dise d'où vient cette proportion.
Objectifs
Les tumeurs solides sont souvent infiltrées par des fibres nerveuses, qui peuvent participer dans l'initiation et/ou la progression tumorale. Par exemple, dans les cancer de la peau, les cellules cancéreuses interagissent avec les terminaisons nerveuses sensorielles en produisant des neuropeptides, qui influencent la croissance tumorale par divers mécanismes incluant le contrôle de l'activité des cellules immunitaires infiltrées. Par ailleurs, l'absence des fibres nerveuses sensorielles dans des modèles animaux de colites exacerbe l'inflammation et la pathologie, et l'inflammation chronique intestinale est établie comme un facteur de risque du cancer colorectal. Néanmoins, le rôle des neurones sensoriels reste à identifier précisément dans le cadre du cancer colorectal, et des intéractions entre ces neurones et les cellules immunitaires restent à examiner dans le cadre de cette pathologie. Nous avons donc proposé d'étudier le rôle des neurones sensoriels dans la croissance tumorale et la surveillance immunitaire au cours du cancer colorectal. La présente saisine couvre donc des aspects initiaux de notre projet, incluant la création de modèles animaux de carcinogénèse intestinale et de co-cultures cellulaires in vitro.
Bénéfices attendus
Sur le plan fondamental, le rôle du systeme nerveux sensoriel dans la croissance tumorale intestinale sera comprise chez la souris. Sur le plan translationnel, les résultats permettront d'envisager d'utiliser l'activité nerveuse, pour modifier la croissance tumorale au cours du cancer colorectal. Parmi les hypothèses, l'identification des neuropeptides sécrétés par les neurones sensoriels pourraient suggérer des traitements afin d'agir sur le système immunitaire, sur les tumeurs, ou potentialiser des traitements déjà connus.
Procédures
Nous réaliserons les gestes suivants: Traitement pour l'induction des tumeurs intestinales : durée 3 minutes incluant la prise en main (1x/jour pendant 5 jours). Injections inter-vertebrales: durée 10 minutes par souris ; Injections dans le parois intestinale ou dans des adénomes intestinaux: durée 30 minutes comprenant la laparotomie (1/souris) ; Injections de cellules tumorales dans le rectum : durée 20-25 minutes incluant le positionnement sur le masque d'anesthésie (1/souris). Biopsie de queue à 14j pour génotypage: durée 30sec/souris (1/souris)
Impact sur les animaux
Le modèle animal que nous utiliserons développent des tumeurs dans l'intestin qui peuvent provoquer de l'inconfort et/ou de la douleur lorqu'elles sont trop nombreuses et/ou trop grosses, voire induire un prolapsus rectal. De même, l'implantation dans le rectum de cellules tumorales de stade plus avancé peut provoquer de la douleur dûe à la croissance de la tumeur, voire un prolapsus rectal. Les chirurgies nécessaires à la réalisation des injections intra-tumorales ou dans la paroi intestinale ou intrathécales, peuvent induire des délabrements et/ou des douleurs post-chirurgicales. Les différents traitements en i.p. peuvent générer un stress et une douleur légère transitoire. Les biopsies de queues pour le génotypage peuvent générer une douleur légère de courte durée.
Devenir
Toutes les souris seront mises à mort
Remplacement
Les expériences in vitro ont permis d'identifier des intéractions de terminaisons nerveuses avec des cellules tumorales et/ou immunitaires, et nous exploitons ces données. Nous reprendrons cette approche pour une partie de notre projet, ce qui limitera le nombre d'animaux requis et le caractère invasif de certaines experiences in vivo (susceptibles de générer des informations équivalentes). Des analyses de bases de données publiques in silico permettront de sélectionner des candidats moléculaires. Néanmoins, certaines observations ne peuvent être réalisées en dehors du contexte de l'animal, telles que les études des intéractions multicellulaires, de la morphologie des structures. Enfin, le contrôle sélectif des neurones sensoriels in vitro requiert au préalable la manipulation génétique des neurones sensoriels matures, in vivo, afin d'obtenir des phénotypes les plus fidèles à la physiologie.
Réduction
Le nombre d'animaux à utiliser pour chaque obejctif a été rigoureusement calculé pour réduire un maximum le nombre d'animaux tout en gardant une puissance statistique adaptée qui permettra de conclure sur les résultats. Pour ce projet nous pouvons utiliser les mâles et les femelles.
Raffinement
Les souris seront hébergées avec un enrichissement (frizottis, rouleaux de coton, lambeaux de papier, abri en carton ou en plastique rouge) qui sera modifié qualitativement après chaque change. Afin de lutter contre l'isolement de mâles, notre première mesure est de conserver un frère pour compagnie. Quand cela n'est pas possible (un mâle sans frère), notre animalerie propose un hébergement avec une femelle de compagnie n'étant plus en âge de mettre bas. Pour la chirurgie abdominale, les animaux seront habitués au chirurgien pendant quelques jours avant la chirurgie et des conditions d'asepties seront rigoureusement appliquées pour éviter la perte d'animaux dûe à des infections post-chirurgicales et pour éviter d'utiliser plus d'animaux afin d'obtenir un résultat significatif. Les prises en charge avant les chirurgies sont une analgésie locale, une analgésie générale et un traitement anti-inflammatoire. Après la chirurgie abdominale, les animaux recevront pendant 5j consécutifs d'un anti-inflammatoire et un analgésique contre la douleur. Une grille de score sera également utilisée. Le raffinement spécifique au phénotype dommageable consiste à étudier les animaux avant qu'ils développent les signes d 'inconfort. De plus, une grille de score sera utilisée pour identifier les 16% d'animaux qui pourraient développer des signes de mal être tels que perte de poids et anémie et ces animaux seront immédiatement mis à mort.
Choix des espèces
Les souris présentent plusieurs avantages pour l'étude. Certaines lignées récapituleront la tumorigenèse précoce observée chez l'homme et seront utilisées lorsque les tumeurs sont développées (120-150j). Le contrôle de la génétique de la souris permet d'identifier des types cellulaires précis (dans cette saisine les neurones sensoriels) et ainsi de limiter le nombre d'animaux utilisés. Elles seront utilisées à l'âge adulte, entre 7 et 15 semaines afin que l'intestin soit mature totalement.
Etude de l’implication de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) dans les processus de remyélinisation du système nerveux périphérique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Soumises à une lésion chirurgicale du nerf sciatique de 45 minutes sous anesthésie, 912 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère, toutes tuées pour le prélèvement de leurs nerfs sciatiques. 304 d'entre elles sont d'abord prélevées vers six jours pour génotypage, et toutes passent ensuite des tests de démarche, de récupération motrice et de récupération sensitive de dix minutes chacun. L'objectif déclaré est de confirmer le rôle de l'activateur tissulaire du plasminogène dans la remyélinisation du nerf après lésion. Le porteur classe le projet en souffrance sévère et décrit un simple affaiblissement de la patte arrière gauche qui disparaît en quelques jours, tout en indiquant que le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse selon "l'aisance des expérimentateurs".
Objectifs
Des études préliminaires ont montré que l'activateur tissulaire du plasminogène (tPA) était une molécule impliquée dans les processus de myélinisation, c'est à dire la formation de la gaine de myéline entourant les neurones du système nerveux central. De plus, des études de la littérature ont mis en évidence une implication de cette molécule (tPA) dans la myélinisation périphérique puisqu'elle est exprimée dans les cellules responsables de la myélinisation (cellules de Schwann) et qu'elle joue un rôle dans la récupération fonctionnelle (motrice et sensitive) après lésion du nerf sciatique chez la souris. Ainsi, le tPA est impliqué dans les processus de myélinisation centraux et périphériques, dans certaines conditions physiologiques ou pathologiques. C'est pourquoi l'objectif de ce projet est d'étudier l'implication du tPA dans les processus de myélinisation induite après lésion du nerf sciatique chez la souris, ainsi que d'étudier le rôle et les mécanismes impliquant le tPA exprimé par les cellules de Schwann en contexte de remyélinisation.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra alors de confirmer l'implication du tPA en contexte de remyélinisation dans le système nerveux périphérique et de pouvoir définir les mécanismes l'impliquant dans cette remyélinisation en contexte de lésion du nerf sciatique.
Procédures
Tous les animaux à génotyper seront prélevés (vers 6 jours) pour génotypage (n=304) et peuvent présenter une légère douleur de courte durée. Chaque animal fera l'objet d’une lésion du nerf sciatique (n=912, durée de la procédure : 45min) grâce à une chirurgie réalisée sous anesthésie et analgésie. Les animaux seront soumis à des tests fonctionnels qui permettront l'évaluation de la démarche, l'évaluation de la récupération motrice et l'évaluation de la récupération sensitive (n=912, durée de chaque test : 10min). Tous les animaux (n=912) seront mis à mort à l'issue du projet afin de récupérer et étudier les nerfs sciatiques.
Impact sur les animaux
Certains animaux peuvent montrer des signes de douleur dans les premières heures après la chirurgie. Un affaiblissement de la patte arrière gauche (correspondant à la zone du nerf sciatique lésée) qui disparaît dans les premiers jours/semaines après lésion du nerf sciatique. Certains animaux peuvent présenter des signes d'inconfort ou de légère douleur (courte durée) au moment des tests permettant l'évaluation de la démarche, de la récupération motrice et de la récupération sensitive.
Devenir
A l'issue de chaque procédure, les animaux seront mis à mort, ce qui permettra de prélever leurs nerfs sciatiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants car des techniques de remplacement ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, l'étude de l'expression des protéines dans le nerf sciatique, l'étude de l'ultrastructure des cellules myélinisantes ainsi que la récupération fonctionnelle sont des paramètres qui ne peuvent être étudiés via l'utilisation de méthodes alternatives.
Réduction
Nous utiliserons le nombre minimal d’animaux, déterminé par l'utilisation d'outils statistiques, afin de souscrire au principe de réduction. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité/sensibilité des méthodes utilisées, nos travaux précédemment publiés et la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de l'aisance des expérimentateurs.
Raffinement
Afin de souscrire au principe de raffinement, les animaux seront anesthésiés et analgésiés durant chaque procédure. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Le bien-être des animaux sera suivi quotidiennement par du personnel qualifié 7j/7, cela pendant toute la durée du projet. Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Pour éviter de stresser les animaux, les cages seront isolées de tout bruit extérieur et l’accès à l’eau et à la nourriture sera ad libitum. Des dômes de cellulose et des carrés de cotons seront placés dans chaque cage. Enfin, une importance particulière sera apportée au bien-être des animaux. Tout sera mis en oeuvre pour réduire l’angoisse, la souffrance et la douleur de chaque animal, pouvant être occasionnées pendant le projet. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Des points limites seront mis en place afin de réduire ou arrêter toute souffrance occasionnée chez l'animal.
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l'espèces animale la plus étudiée dans le cas des modèles de lésion du nerf sciatique. Les techniques employées concernant ce modèle animal sont bien connues. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait de ce modèle utilisé dans ce projet une approche expérimentale fiable. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend ces espèces particulièrement intéressantes pour cette étude. Les animaux utilisés seront âgés de 6 à 10 semaines concernant la cohorte corerspondant aux "jeunes adultes" et entre 26 et 30 semaines concernant la cohorte correspondant aux "adultes âgés". L'étude sera réalisé chez le "jeune adulte" et chez "l'adulte âgé" afin de pouvoir comparer la différence de récupération fonctionnelle ainsi que les paramètres histologiques pouvant potentiellement différer entre ces deux stades de développement chez la souris. Nous réaliserons nos modèles sur des adultes afin de pouvoir pratiquer sur des animaux du même stade de développement que ceux utilisés en majorité dans les modèles de lésion du nerf sciatique.
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Identifiées par ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, 1 320 souris subissent ensuite jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de leur vie, sur animal vigile sous contention. 880 sont opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 relèvent de procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Le porteur qualifie la biopsie de phalange de non douloureuse au motif que les fibres nerveuses ne sont pas encore myélinisées à cet âge, et écrit que ces procédures n'entraînent "généralement pas de souffrance", tout en listant les signes qui déclenchent une mise à mort immédiate : posture inhabituelle, poil hérissé, dos voûté, retrait des congénères. Les souris dont le gène est inactivé dans l'intestin peuvent développer des diarrhées et des troubles de la croissance, et toutes sont tuées pour prélèvement d'organes.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée, ces animaux ayant une inactivation au niveau de l’intestin, un dysfonctionnement digestif pouvant entrainer des diarrhées. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Génotypage de poissons zèbres, sans phénotype dommageable, pour l’étude de mécanismes impliqués dans un type de mémoire , l’habituation.
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
8 000 poissons zèbres vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger. À deux mois, chaque poisson est anesthésié à la tricaïne par balnéation, puis une extrémité de sa nageoire caudale est coupée sur une surface inférieure à 0,25 mm², en moins de deux minutes. L'objectif déclaré est de repérer les poissons hétérozygotes pour organiser les croisements, les expériences sur la mémoire portant ensuite sur des larves de moins de cinq jours, hors du champ réglementaire. Seuls les hétérozygotes sont gardés vivants pour la reproduction, tous les autres génotypes sont tués, et tout poisson présentant un trouble de la flottabilité, une immobilité, une scoliose ou, pour les femelles, un ventre rempli d'œufs est tué immédiatement.
Objectifs
Le projet est une caractérisation génétique de 8 lignées de poissons âgés de 2 mois, génétiquement modifiés. Ces poissons seront ensuite élevés puis croisés entre eux afin d'obtenir des larves âgées de moins de 5 jous, non soumis à l'expérimenation animale, pour les études afin de comprendre comment les animaux apprennent et forment des souvenirs. S'il est clair que les souvenirs se forment grâce à la plasticité des réseaux neuronaux, de nombreuses questions restent ouvertes. Par exemple, dans un circuit neuronal complexe de vertébrés, lesquels et combien de neurones sont soumis à la plasticité ? Quels sont les mécanismes moléculaires impliqués dans cette plasticité ? Pour répondre à cette question des poissons zèbres sont utilisées car leur cerveau est relativement simple (~100 000 neurones), petit (0,25 mm3) et l'activité de tous les neurones peut être mesurée de façon indépendante. Lorsqu'il est stimulé par un flash de lumière ou un bruit, le poisson zèbre réagit par un sursaut. En cas d'éclairs ou de bruits répétés, cette réponse diminue, formant un type de mémoire à long terme connu sous le nom d’habituation. Afin d'étudier cette habituation, nous disposons de 8 lignées de poisson zèbre portant des mutations, non dommageables, sur différentes protéines. Ces poissons seront croisés entre eux pour étudier le comportement de leur descendance, âgèe de moins de 5 jours et donc non soumise à l'expérimentation animale. L'étude du comportement des poissons correspondra à l'étude de leur habituation suite à l'extinction de la lumière.
Bénéfices attendus
La caractérisation génétique des lignées pour optimisation de la gestion des élevages est nécessaire car l'étude de l'habituation chez le poisson zèbre âgé de moins de 5 jours, nécessite d'avoir tous les génotypes possibles analysés en simultanée dans la même expérience. Par exemple pour un simple mutation, en croisant deux poisson +/-, nous aurons des larves âgées de moins de 5 jours ayant les généotypes +/+;+/- et -/-. Le fait de garder, après génotypage, les parents sous forme +/- est le seul moyen, le plus rationnel, d'avoir les larves âgées de moins de 5 jours avec les 3 génotypes voulus.
Procédures
Les poissons agès de 2 mois, seront génotypés par prélèvement d 'une partie infime de leur nageoire caudale afin de ne garder que les individus hétérozygotes. Le génotypage sera fait par balnéation et anesthésie du poisson à la Tricaine; un bout de la nageoire caudale sera coupée . Le temps total de la procédure sera le plus court possible (moins de 2 min). Les poissons seront placés rapidement dans un bac de réveil rempli d'eau avant d'être transféré dans son aquarium. Cette procédure concerne tous les poissons de cette demande mais seuls le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffre donnés sont donc des maximums et le prélèvement sera le seul geste invasif faits sur les animaux et une seule fois dans leur vie.
Impact sur les animaux
Le génotypage des poissons se fera par découpe d'une extrémité de la nageoire caudale d'une surface inférieure à 0.25 mm2 sous anesthésie dans un délai très court. Les nuisances ou effets indésirables, extrêment rares avec ce protocole établi et utilisé en routine, seront visibles au moment de l'endormissement, du réveil (trop long ou visualisé par une nage inhabituelle), des lésions suite à la biopsie ou de la non repousse, dans des cas exceptionneles, de la nageoire (qui doit être totale au bout de 15 jours). Tout phénotype inhabituel entrainera la mise à mort immédiate du poisson.
Devenir
Les poissons une fois génotypés seront divisés en deux catégories. Les poissons hétérozygotes seront maintenus en vie pour être mis en croisement afin de faire des expériences d'habituation sur leurs descendants âgès de moins de 5 jours (non sousmis à une demande) et pour être mis en croisement pour obtenir la génération suivante. Les poissons ayant tous les autres génotypes possibles seront mis à mort car nous souhaitons maintenir les lignées sous forme hétérozygote. En effet, ce n'est que par croisement de poissons hétérozygotes entre eux que nosu obtiendrons des larves (non soumis à une dap) ayant tous les génotypes souhaités.
Remplacement
Au niveau du génotypage aucun remplacement n'est possible pour la biopsie de la nageoire caudale. L'étude de la mémoire et du comportement ne peut se faire que sur un cerveau entier, dans des animaux vivants. Le poisson zèbre présente le modèle vertébré ayant un cerveau le plus simple nécessaire pour entreprendre ces expériences visant à comprendre la plasticité neuronale dans le cerveau des vertébrés. En tant que vertébrés, le cerveau et le génome du poisson zèbre partagent des homologies majeures avec les mammifères et les humains. Travailler sur un modèle vertébré est essentiel pour nos projets visant à découvrir les mécanismes conservés de plasticité et leur pertinence potentielle pour la fonction psychiatrique humaine et le dysfonctionnement du cerveau dans les maladies neurologiques. Nous utilisons des lignées transgéniques connues pour être impliquées dans l'habituation afin de comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires mis en jeu et mieux caractériser l'action de certaines molécules impliquées dans les défauts de mémoire. Aucun modèle cellulaire in vitro ne peut se substituer à cette étude.
Réduction
Nous faisons une nouvelle génération que les 8 à 10 mois (au lieu de tous les 6 mois) ce qui permet sur 5 ans de diminuer le nombre de générations. Un nombre minium de 20 individus est élevé pour maintenir la lignée et obtenir des alevins. Ce chiffre permet d'avoir suffisament de mâles et femelles pour les accouplements. Seul le nombre de poissons nécessaires à obtenir les effectifs souhaités subiront le génotypage, les autres ne seront pas génotypés dés lors que les effectifs voulus sont atteints. Les chiffres donnés sont donc des maxima. Nous ne gardons que les poissons hétérozygotes (au lieu de garder des +/+ et -/-) car en le croisant entre eux nous obtenons tous les génotypes voulus pour vos expériences sur des larves de moins de 5 jours. Les études sur la mémoire se font sur des larves âgées de moins de 5 jours, non soumises à une DAP. Les poissons possèdent deux ou trois mutations, nous permettant ainsi de ne pas maintenir des lignées avec une seule mutation. Les lignées non utilisées dans le futur seront cryoconservées.
Raffinement
Tout poisson, quel de soit sont stade de développement, qui présente un comportement anormal, ou un signe de mal être a ou un des points limites tels que problème de flottabilité, immobilité, mouvements anormaux, scoliose, siphose, femelle avec ventre rempli d'oeufs, sera mis à mort immédiatement. Les poissons sont maintenus dans les aquariums en nombre suffisant pour leur permettre de se déplacer en banc. Une fois par jour des artémias vivants leur sont donnés afin de maintenir leur activité de prédation. Le prélèvement pour le génotypage sera le seul geste invasif fait sur les animaux et une seule fois dans leur vie. Lors du processus de génotypage, les poissons sont maintenus par deux par bac de 700 ml un minimum de temps ne dépassant pas 48h. Durant ces 48h, les poissons sont maintenus deux par deux dans les bacs avec un séparateur entre les deux afin de pouvori les identifier suite au génotypage.
Choix des espèces
Le poisson zèbre est un animal modèle facile à élever (animal petit, robuste, possédant d'excellentes capacités de reproduction). De plus, 70% des gènes du poisson zèbre ont un équivalent chez l'homme. Enfin, ce génome s'est montré facilement manipulable, ce qui a conduit à la création de milliers de mutants dont ceux utilisés dans ce projet. Les études comportementales associées à des approches d’imagerie sur l’organisme entier, à une résolution pouvant atteindre l’échelle cellulaire (poisson optiquement transparent jusqu'à 4 semaines) fait du poisson zèbre un modèle pertinent. Ces approches d'étude de comportement à haut débit et l'imagerie sur animal entier, ne sont absolument pas applicables en routine sur d'autres modèles vertébrés ce qui fait du poisson zèbre comme modèle vertébré un modèle idéal. Du plus il s'agit d'un modèle dont le cerveau est relativement simple comparativement à d'autres modèles et il est donc plus facile d'obtenir des résultats interprétables Les lignées sont déjà établies. Les génotypages des adultes pour chaque génération se feront au stade 2 mois. A ce stade les poissons sont assez grands pour que le génotypage de la nageoire caudale se fasse sans séquelle, celle-ci étant assez développée
Etude de l’incidence d’un gène sur le développement de la souris EU : 1/2
- Recherche appliquée
- Troubles gastrointestinaux
- Recherche fondamentale
- Biologie du développement
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
Toute souris qui montre une posture inhabituelle, le poil hérissé, le dos voûté ou un retrait de ses congénères est sortie de l'étude et tuée immédiatement. 1 320 souris vont être utilisées, 880 opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil, 440 engagées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, dont 120 réutilisées ensuite dans d'autres expériences. Chaque animal est identifié par l'ablation de la dernière phalange entre 7 et 10 jours après la naissance, puis peut subir jusqu'à trois prélèvements sanguins au cours de sa vie, sur animal vigile sous contention. Le porteur indique que les souris produites servent d'abord au maintien des lignées et à la fabrication des cohortes nécessaires aux expériences, pour un gène dont il annonce ne pas connaître précisément le rôle.
Objectifs
L’absence de la protéine fonctionnelle étudiée augmente considérablement le risque de fausse couche, et les patients mutés présentent des troubles neurologiques. De plus, ces patients présentent des troubles intestinaux. Notre étude vise à démontrer ses activités tissu-spécifiques. Cette étude sera multisite est se déroulera au sein de 2 établissements utilisateurs.
Bénéfices attendus
Ces études permettront de mieux comprendre les différents rôles du gène étudié.
Procédures
Les souris seront identifiées et génotypées par ablation de la dernière phalange au sein de l’EU1. Un groupe subira 4 prélèvements sanguins sur animal vigile sous contention, chaque prélèvement durera 1 minute au maximum et une prise de sang juste à la mise à mort sera réalisée. Le dernier groupe recevra, par animal vigile sous contention, une injection d’analgésique en intra-péritonéale, cette procédure durera un maximum d’1 minutes puis, 30 minutes plus tard elle sera suivie d’une injection IP d’anesthésique en dose léthale sous contention pour une durée maximale d’1 minute, cette chirurgie sera terminale sous anesthésie en vue du prélèvements d’organes. Les différentes expérimentations de l’étude seront réalisées dans les 2 établissements utilisateurs de ce projet (EU1 et EU2).
Impact sur les animaux
Pour les souris nulles, ayant le gène d’intérêt excisé, nous serons très attentifs aux phénotypes. Ne connaissant pas précisément le rôle du gène étudié, nous ne pouvons le prévoir. Pour les souris ayant une inactivation dans l’intestin, un impact sur les courbes de croissance et l’homéostasie phosphocalcique est anticipée. Pour les souris ayant une inactivation dans le cortex/neurones, le comportement sera surveillé. Les animaux issus des croisements sont identifiés amputation de la première phalange. Cette procédure est réalisée entre 7 et 10 jours après la naissance, âge en dessous duquel les fibres nerveuses sont non myélinisées. Le prélèvement de la biopsie est alors non douloureux. La phalangectomie nous permettra de récupérer une biopsie des animaux afin de déterminer leurs génotypes. Chaque animal subira au maximum 3 prélèvements sanguins au cours de sa vie. Pour l’ensemble des procédures, à l’exception de la chirurgie sans réveil, les expérimentations faites sur les animaux de l’études sont en classe modérée, les gestes expérimentaux réalisés pouvant provoquer un stress et un inconfort lors des prélèvements.
Devenir
Les animaux produits serviront au maintien des lignées et à produire les cohortes nécessaires aux expériences décrites dans la saisine, tous les animaux sont mis à mort en fin pour prélèvements d’organes
Remplacement
Le gène d’étude étant exprimé dans de nombreux tissus, les systèmes cellulaires ne sont pas appropriés pour modéliser la complexité du développement ou des fonctions intestinales et ses conséquences sur les autres tissus. Notamment l’homéostasie calcique qui implique de nombreux organes aux fonctions différentes (e.g. intestin pour l’absorption, reins pour l’excrétion, les os pour la résorption). Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles.
Réduction
Les différents protocoles expérimentaux ont été consciencieusement réfléchis et le nombre d’animaux utilisés sera réduit au strict minimum, tout en s’assurant que les cohortes utilisées permettent de conclure de manière significative. Ces expériences seront réalisées sur des souris mâles et femelles. Les analyses statistiques seront effectuées pour chaque lignée. Ce projet utilisera au maximum 1320 animaux sur 5 ans.
Raffinement
Les souris seront gardées par groupes sociaux dans des cages agrémentées avec un enrichissement (nid...) en animalerie. Pour l’ensemble des animaux, la surveillance sera visuelle, avec un suivi de l'aspect général de l'animal, sa posture et son comportement. Les animaux seront suivis, tout au long de leur vie, par observations de leur comportement général, par mesure de leurs poids de façon hebdomadaire. Nous effectuerons 3 prélèvements sanguins au cours de la vie de l’animal, en cas de saignement, un point de compression sera effectué pour le stopper. Les points de prélèvement seront surveillés et si une infection est constatée une désinfection sera faite. De plus, afin de compenser la baisse de volémie, nous réaliserons une injection sous cutanée de sérum physiologique réchauffé. Si, malgré tout, les signes d’une souffrance ou d’une douleur sont manifestés (posture inhabituelle, poil hérissé, dos vouté, retrait et absence d’interaction avec les congénères, état défensif), l’animal sera retiré de l'étude et sera mis à mort immédiatement. Nous prenons le parti de réaliser une injection d’analgésique avant l’anesthésie sans réveil pour éviter toute souffrance éventuelle. Par ailleurs, dans le laboratoire, les manipulateurs prévus pour ce projet possèdent une expérience importante dans la réalisation de ces procédures qui n’entraine généralement pas de souffrance pour les animaux. Le transfert des souris entre les 2 établissements utilisateurs sera effectué dans des boites prévues à cet effet et par du personnel compétent formé, les 2 animaleries appartenant au même site, le trajet sera fait en intérieur et durera 15 minutes avec une durée totale de transfert inférieur à 2h de la cage d’origine à la cage de destination.
Choix des espèces
La souris a été choisie comme animal modèle afin de mimer les pathologies humaines dues aux mutations du gêne d’intérêt. L’étude complète utilisera les stades 2 à 6 semaines correspondant à des enfants, 8 à 12 semaines correspondant à de jeunes adultes, 20 à 30 semaines correspondant à des adultes, 50 semaines et plus correspondant à des séniors, âges où des symptômes visibles apparaissent dans les physiopathologies humaines.
Détermination de l’implication du système sympathique dans la sclérose latérale amyotrophique
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Opérées pour l'implantation d'un capteur de pression artérielle pour 288 d'entre elles, dont 144 soumises en plus à un exercice de nage, 706 souris vont être utilisées et toutes tuées, 644 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. 120 autres nagent avant un prélèvement sanguin et 236 sont maintenues en vieillissement jusqu'à une perfusion intracardiaque sous anesthésie. Ces souris portent une mutation qui reproduit la sclérose latérale amyotrophique humaine et développent des altérations motrices, le projet cherchant des dérèglements de la pression artérielle avant l'apparition des symptômes. Le porteur justifie le recours à ces animaux par le "manque de connaissance" de la maladie et par l'impossibilité de suivre des paramètres physiologiques hors d'un "organisme entier", tout en annonçant qu'une grande partie du projet se fera ex vivo sur des tissus.
Objectifs
La moelle épinière thoracique contient l'essentiel des neurones à l'origine de la commande nerveuse autonome sympathique, un acteur majeur du maintien de l'homéostasie corporelle, responsable du contrôle d'un grand nombre d'activités automatiques de l'organisme. Les neurones préganglionnaires sympathiques (SPNs), étage de sortie de la commande sympathique, connectent au sein des ganglions sympathiques les neurones postganglionnaires sympathiques qui à leur tour connectent les organes cibles. Les SPNs sont des neurones qui sont moléculairement extrêmement proches des neurones qui commandent les muscles striés : les motoneurones (MNs). La sclérose latérale amyotrophique (SLA), troisième maladie neurodegerative après Alzeihmer et Parkinson est caractérisée par la perte des neurones moteurs corticaux et des MNs spinaux conduisant à une atrophie musculaire, à la paralysie progressive des malades et à leur décès par insuffisance respiratoire. Les causes précises de la dégénérescence des MNs sont à ce jour encore inconnues et nous ignorons encore si cette dégénérescence est initiée directement au niveau des MNs ou au niveau du muscle. Notre hypothèse est que les SPNs sont aussi atteints dans la SLA et participent via un dysfonctionnement du contrôle vasculaire musculaire à la dégénérescence du muscle et des MNs. L’objectif de ce projet est donc de mettre en évidence des altérations précoces (avant l'apparition des symptômes moteurs) de la régulation de la pression artérielle sur un modèle murin de la SLA.
Bénéfices attendus
Ce projet va permettre de mieux comprendre les mécanismes de la sclérose latérale amyotrophique (SLA) dont l'issu est aujourd'hui toujours fatale chez l'homme (dans les 3 à 5 ans suivant les premiers symptômes).
Procédures
Certains animaux subiront une chirurgie (n=288) et certains d'entre eux effectuerons un exercice de nage (n=144) . 236 animaux seront aussi maintenu en veillissement d'être perfusés en intracardiaque (sous anesthésie). 62 animaux serviront de mâles reproducteurs mais ne développeront pas la maladie. 120 animaux effectuerons un exercice de nage avant prélèvement sanguin.
Impact sur les animaux
La mutation portée par les animaux est similaire à celle de l'homme. Ces animaux vont présenter des altérations motrices qui seront surveillées de très près par une équipe compétente (50% des animaux de l'étude). Au cours des soins post opératoire et malgré l'administration de l'anti-inflammatoire, les animaux peuvent présenter un signe de douleur. L'exercice de nage peut générer un stress de l'animal.
Devenir
Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, des prélèvements de tissus seront faits. Cela permettra de faire des études histologiques et immuno-histologiques
Remplacement
Des études préliminaires sur tissus ont été faites afin d'orienter le projet. De plus, une grosse partie du projet se fera ex-vivo grâce à des techniques d'histologie et d'immuno-histologie. Il n'existe pas de modèle mathématique simulant les modifications induites par SLA sur les paramètres cardiovasculaires car les connaissances de cette maladie sont aujourd'hui limitées. De plus, le suivi de paramètres physiologiques au cours de la vie d'un animal n'est pas possible en dehors d'un système intégré comme un organisme entier. Il n'est donc pas possible de faire cela sur des tissus ex-vivo. C'est à cause du manque de connaissance de notre modèle (la SLA) que nous avons recours à l'utilisation d'animaux présentant cette maladie.
Réduction
Afin de déterminer au mieux le nombre d'animaux, nous avons calculé le n à l'aide de tests statistiques. Afin de réduire le nombre d'animaux utilisés, nous allons utiliser un système de mesure de la pression artérielle qui sera implanté. Ainsi, chacun des animaux sera enregistré à chaque temps permettant de ne pas multiplier le nombre d'animaux par le nombre de temps d'enregistrement. Une étude pilote sur très peu d'animaux (16) sera faite et conditionnera l'utilisation des autres animaux.
Raffinement
Les individus porteurs de la mutation seront suivi régulierement et l'évaluation des signes moteurs sera faite toutes les semaines, puis 2 fois par semaine, puis tous les 2 jours puis quotidiennement afin de ne jamais laisser un animal en souffrance. Sauf en cas d'avis vétérinaire pour un soin, aucun animal ne sera isolé afin de préserver le caractère grégaire de la souris. Lors de la chirurgie d'implantation, des soins post-opératoires seront faits (analgésie, antibiothérapie si nécéssaire sur avis vétérinaire, tapis chauffant pour le réveil), les conditions d'asepsies seront respectées (autoclavage, stérilisation à froids, matériels à usage unique stérile) et le personnel dédié à la chirurgie sera parfaitement formé (formation réglementaire et spécifique auprès d'un centre de formation dédié).
Choix des espèces
La souris est un modèle dont le génome est parfaitement connu. De plus, un modele murin de la sclérose latérale amyotrophique existe. Le système de reproduction des souris permet d'avoir régulièrement des animaux dans un espace relativement réduit. Enfin le choix de l'espèce est aussi conforme au R de réduire puisque nous avons choisi un modèle mammifère relativement petit. Les animaux de l'étude pilote seront implantés à P75 pour être enregistrés à partir de P90 Les animaux de l'étude complémentaire seront implantés à P30 pour être enregistrés à partir de P40 Les animaux devant être prélévés pour les études post-mortem sont prélevés à partir de P21
Evaluation de l’effet préventif d’un bloqueur de CCK2R sur la survenue de la neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Choisies pour leur faible variabilité, de même fond génétique, même âge et même poids, 68 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent des injections intrapéritonéales de paclitaxel ou d'oxaliplatine, deux anticancéreux neurotoxiques, une partie subissant en plus un gavage quotidien pendant huit jours et trois prélèvements sanguins par voie intraveineuse sur animal vigile contentionné. Toutes passent trois tests comportementaux nommés, un de sensibilité tactile et deux de sensibilité thermique, tous les trois jours pendant environ quatorze jours. Elles sont ensuite toutes tuées pour prélever peau, nerf et ganglions spinaux, le porteur précisant que les animaux montrant fatigue, troubles moteurs ou signes de souffrance sont retirés du protocole avant l'analyse.
Objectifs
Les neuropathies périphériques induites par la chimiothérapie sont le second effet indésirable le plus fréquent après l’hématotoxicité. Ces dernières sont principalement source de douleurs (à type de brûlures, piqure, fourmillements) altérant fortement la qualité de vie des patients en cours de traitement et/ou survivant à un cancer. Ces douleurs intenses peuvent être à l’origine d’une diminution des doses, d’un espacement des cycles voire d’un arrêt du traitement anticancéreux, et mettre ainsi en péril les chances de survie du patient. Pour autant, il n’existe à ce jour aucune stratégie pharmacologique préventive reconnue. Avec une incidence croissante de 25 millions de cancers par an à travers le monde, on comprend que le développement de stratégies neuroprotectrices contre ces neuropathies induites par la chimiothérapie constitue un enjeu de santé publique. Au cours d’un projet précédent, il a été mis en évidence que le récepteur à la cholécystokinine de type 2 (CCK2R) était exprimé par le système nerveux sensitif périphérique et que son blocage par un antagoniste industriel spécifique de CCK2R, prévenait le dévelopment de la neuropathie induite par la vincristine dans un modèle murin. La vincristine est un agent anticancéreux indiqué notamment dans la prise en charge des cancers hématologiques. L’objectif de ce nouveau projet est d’évaluer l’influence d’un traitement par cette molécule sur la neuropathie induite par le paclitaxel et l’oxaliplatine chez des souris. Le paclitaxel est un agent anticancéreux notamment indiqué dans la prise en charge des cancers du sein et des poumons, et l’oxaliplatine dans la prise en charge des cancers colorectaux. La vincristine, le paclitaxel et l’oxaliplatine sont trois agents anticancéreux représentatifs de trois classes de chimiothérapie particulièrement neurotoxiques. Chacune de ces molécules présente un mécanisme d’action cytotoxique différent contre les cellules cancéreuses, ainsi que des mécanismes de neurotoxicité spécifiques. Nous souhaitons vérifier si l’effet préventif de ce bloqueur de CCK2R observé dans le modèle de neuropathie induite par la vincristine, se produit également dans le cadre des neuropathies induites par le paclitaxel et l’oxaliplatine.
Bénéfices attendus
Particulièrement présent dans le système gastro-intestinal et dans le système nerveux central, le récepteur CCK2R est impliqué dans la satiété, l’anxiété et la douleur. Dans un modèle précédant, la vincristine induit une hypersensibilité tactile et une dégénérescence des nerfs sensitifs, deux phénomènes totalement prévenus par l’administration du bloqueur de CCK2R. Nous supposons que cette molécule pourrait également présenter des effets préventifs (analgésique et neuroprotecteur) sur deux autres modèles de neuropathies chimio-induite, le paclitaxel, et l’oxaliplatine. La molécule d'intérêt fait aujourd’hui l’objet de plusieurs essais cliniques et présente un bon profil de sécurité. Ainsi, la mise en évidence d’un effet neuroprotecteur dans nos modèles animaux permettrait de faciliter la translation chez l’Homme, avec la mise en place rapide d’un essai clinique évaluant son effet sur les neuropathies induites par la chimiothérapie.
Procédures
L'ensemble des animaux recevra des injections intrapéritonéales répétées tous les deux jours ou tous les trois jours pendant une période de 6 jours. Une partie d'entre eux recevront également le traitement par voie orale tous les jours pendant 8 jours, par gavage. Une partie des animaux subiront en plus trois prélèvements sanguins en intraveineux chacun à 7 jours d’intervalle, sur animal vigile contentionné. L'ensemble des animaux sera soumis à trois tests comportementaux; l'un évaluant la sensibilité tactile et deux autres évaluant la sensibilité thermique, tous les 3 jours pendant 14 jours environ.
Impact sur les animaux
Les injections intrapéritonéales tous les deux jours ou tous les trois jours pendant 6 jours (maximun 4 injections par animal) induiront une douleur légèreet un stress de courte durée . Au cours de l'administration du traitement par voie orale, les animaux pourront ressentir un stress lié à la préhension, le gavage peut être associé à un risque de fausse route. Les prélèvements sanguins peuvent être source de stress lié à la manipulation et la contention. Le prélèvement induira une douleur légère de courte durée. Le volume sanguin prélevé n'aura pas d'impact sur l'état général et le bien être de l'animal. Au cours des trois tests comportementaux, les animaux seront isolés de leurs congénères sur une période de courte durée ; ces tests produiront un stress le temps de la manipulation. Les tests comportementaux, évaluant la sensibilité tactile ou thermique, génèreront une gêne au moment du stimulus (de l'ordre d'une seconde). En dehors de la phase de test, les animaux ayant reçu du paclitaxel ou de l’oxaliplatine ont un comportement similaire aux animaux témoins et ne présentent aucun signe de souffrance ou de perte de poids.
Devenir
A la fin de chaque procédure, les éventuelles altérations associées au paclitaxel ou à l'oxaliplatine seront mises en évidence par une analyse histologique et immunohistologique. L'ensemble des animaux seront mis à mort, puis les tissus d'intérêt seront prélevés sur chaque animal.
Remplacement
Il n'y a actuellement aucune méthode de remplacement pour l'expérimentation animale qui reproduit tous les mécanismes impliqués dans la génération de douleur causée par les cytotoxiques anticancéreux. Nous avons choisi deux modèles qui suivent les protocoles d'injection des agents anticancéreux utilisé chez l'Homme. Une étude in vitro est en cours pour évaluer l'effet du traitement sur des neurones sensoriels humains dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC). Ce modèle cellulaire nous permet de déterminer les mécanismes physiopathologiques (neurotoxicité, hyperexcitabilité, dérégulation du transport axonal, etc.) impliqués au niveau des neurones sensoriels humains, mais exclut les phénomènes de neuroinflammation liés aux neuropathies induites par la chimiothérapie ainsi que la complexité des phénomènes qui aboutissent à la sensation douloureuse.
Réduction
Le nombre de 8 animaux par groupe pour l’étude principale a été déterminé avec un logiciel de calcul qui estime un nombre total de 56 animaux (avec 6 mesures de la sensibilité), soit 8 par groupes. Pour réduire le nombre d'animaux, chacun subira toutes les expérimentations les unes après les autres dans l'ordre chronologique : les injections, les tests de comportements puis la mise à mort pour prélèvements en fin d'expérimentation. Les prélèvements de tissus nerveux (peau, nerf et ganglions spinaux) seront effectués sur chaque animal mort avant qu'il soit placé dans le congélateur des cadavres. Les résultats générés par les animaux de l'étude pilote pourront être utilisés pour renforcer l'analyse statistique de l'étude principale.
Raffinement
Une étude pilote permettra d'évaluer l'effet du traitement sur l’état général des animaux et le développement d'une neuropathie sensitive sans troubles moteurs dans nos conditions d"hébergement : l’apparition de signes de souffrance ou de toxicité sera évaluée à l’aide d’une grille de suivi biquotidien et l'apparition de la neuropathie sensitive sera évaluée à l'aide de tests comportementaux. Si des signes de souffrance et/ou de toxicité sont observés, alors l’étude principale ne sera pas poursuivie. Si aucun signe de souffrance ou de toxicité n’est observé au cours de l’étude pilote, et que le traitement présente un effet analgésique et/ou neuroprotecteur sur la neuropathie alors nous procèderons à l’étude principale. Les animaux seront élevés dans des conditions d’hébergement (température et hygrométrie de l’environnement, densité d’animaux, présence systématique d’enrichissement, change régulier de la litière, nourriture et eau ad libitum, surveillance quotidienne de l’état général des animaux) qui respectent leur bien-être. Un temps d'habituation et/ou d’entrainement sera respecté pour chaque test comportemental afin de limiter le stress de l’animal et de réduire la variabilité des résultats. Seul des tests d'évitement seront utilisés pour l'évaluation de la sensibilité tactile et thermique, et une valeur limite est établie à partir de laquelle l’animal est soustrait au stimulus même s’il ne présente aucun signe d'évitement. Les animaux exposés au traitement et/ou au paclitaxel ou à l’oxaliplatine doivent présenter un comportement naturel similaire aux animaux Ctrl pour pouvoir participer à l'analyse comportementale. Les animaux présentant des signes de fatigue, troubles moteurs ou souffrance qui pourraient générer un biais dans les réponses aux tests comportementaux seront retirés du protocole. L’équipe de recherche maitrise les modèles de neuropathie chimio-induite et les tests de sensibilité associés qui requiert un savoir-faire et un suivi précis des réactions de l'animal.
Choix des espèces
Des modèles murins de neuropathie induite par la chimiothérapie chez la souris ont déjà été validés, publiés et ont montré leur intérêt pour tester l'effet neuroprotecteur de molécules. Leur physiopathologie est très proche de celle de l'Homme. Nous utilisons un équipement adapté à la souris. Ce matériel est maitrisé par l’équipe et le porteur de ce projet, ce qui permet de limiter les étapes de mises au point et d’éviter une source de stress supplémentaire pour l’animal. Pour obtenir des résultats statistiquement fiables, malgré les faibles effectifs par lot, nous utilisons des souris présentant le moins de variabilité : même fond génétique, même âge, poids identique.
Rôle des récepteurs au glutamate dans le développement cérébral et dans les maladies neurodéveloppementales
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Des femelles gestantes sont opérées trente minutes pour injecter de l'ADN modifié dans leurs embryons, et une partie des souriceaux qui en naissent reçoit ensuite une injection intrapéritonéale. 834 souris sont concernées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées pour analyse des cerveaux. Le projet exprime chez ces embryons des versions mutées de récepteurs NMDA identifiées chez des patients porteurs d'un syndrome de type autistique, afin d'en observer l'effet sur le développement cortical. Le RNT résume les nuisances à la chirurgie de la mère et à la douleur d'une piqûre, sans rien dire des effets attendus de ces mutations sur les souriceaux ni de la répartition des 834 animaux entre gestantes et petits.
Objectifs
Plus de 1 % des enfants naissent avec des troubles du développement du cerveau, comme l'autisme ou un retard de développement. Grâce au séquençage complet de l'ADN, on a fait d'importants progrès dans le diagnostic de ces troubles. Récemment, on a découvert que certains gènes liés aux récepteurs NMDA, qui jouent un rôle crucial dans le fonctionnement du cerveau, peuvent présenter des variations génétiques. Ces récepteurs, codés par les gènes appelés GRIN1, GRIN2A, et GRIN2B, sont importants pour la communication entre les cellules nerveuses. Des mutations dans ces gènes, notamment dans la partie des récepteurs qui organise leur position à la surface des neurones, peuvent entraîner un retard de développement. Le but de ce projet est de mieux comprendre comment ces récepteurs NMDA fonctionnent dans le développement du cerveau et quelles sont les conséquences des mutations observées chez certains patients.
Bénéfices attendus
Cette étude devrait permettre de caractériser des pathologies GRIN et de tester le potentiel thérapeutique de médicaments existants ou nouvelles molécules. Les pathologies GRIN sont un groupe de troubles neurologiques rares causés par des mutations dans les gènes GRIN (GRIN1, GRIN2A, GRIN2B, etc.). Ces gènes jouent un rôle crucial dans le fonctionnement des récepteurs NMDA, qui sont des protéines essentielles à la communication entre les cellules nerveuses du cerveau. Les mutations dans ces gènes peuvent perturber cette communication, entraînant des problèmes de développement et de fonctionnement du cerveau. Les personnes atteintes de pathologies GRIN peuvent présenter une variété de symptômes, tels que des retards de développement, des difficultés d'apprentissage, des problèmes moteurs, des crises d'épilepsie, et parfois des traits associés à l'autisme.
Procédures
Afin d’étudier le rôle de l’organisation des récepteurs NMDA dans le développement, nous mettrons en œuvre des approches chirurgicales pour injecter des préparations d'ADN modifiées dans les embryons (durée 30min) d'une femelle gestante permettant de visualiser les neurones et manipuler l’expression ou l’organisation des neurones corticaux afin de permettre une étude anatomique du développement cérébrale. Nous pourrons également caractériser l’impact de l’expression des sous unités du récepteur NMDA possédant une mutation identifiée chez un patient présentant un syndrome de type autistique sur le développement neuronal. Sur un nombre limité de souriceau, nous injecterons une molécule par voie intraperitonéale (durée 5min) pour induire des outils précedement electroporés. Pour cette étude, des souris gestantes et des souriceaux issus de ces souris gestantes mâles et femelles seront nécessaires. Nous analyserons les progénitures mâles et femelles en même temps pour exclure des effets sexes spécifiques.
Impact sur les animaux
Les nuisances majeures que peuvent subir les souris sont liés principalement à la chirurgie de la femelle gestante et pour les souris une douleur correspondant à une injection intrapéritonéale, via une seringue.
Devenir
A l'issu de la procédure les animaux sont mise à mort pour réaliser une analyse des cerveaux.
Remplacement
La validation des outils utilisé pour l'expérimentation in vivo sera réalisé in vitro soit sur des cellules hétérogogues et des neurones en culture, ce qui nous permet de remplacer un nombre important d'animaux juste qui aurait dû être utilisé pour valider nos outils. Toutefois les modèles animaux sont essentiels pour comprendre le développement car ils permettent de reproduire de manière plus fidèle et complète les processus biologiques complexes qui se déroulent dans un organisme vivant. Contrairement aux modèles cellulaires, les modèles animaux permettent l'étude des interactions dynamiques entre différents systèmes et organes au sein d'un environnement biologique entier. Grâce aux modèles animaux, il est possible de suivre l'évolution des cellules dans un contexte global, d'étudier des fonctions physiologiques complexes, et de comprendre comment des gènes spécifiques influencent le développement global d'un organisme. Les modèles cellulaires, bien que très utiles pour des études ciblées et mécanistiques, présentent des limitations importantes. Ils ne peuvent pas reproduire la complexité d'un organisme entier, notamment en ce qui concerne les interactions multicellulaires. Les cellules cultivées en laboratoire peuvent se comporter différemment de celles dans un organisme vivant, ce qui peut limiter la transposabilité des résultats. De plus, les modèles cellulaires ne permettent pas de simuler le développement complet d'un organisme, rendant difficile l'étude des processus qui nécessitent l'intégration de multiples signaux provenant de différents tissus et systèmes.
Réduction
L'utilisation de neurones en culture nous permet de faire un pre-screening des mutations GRIN. En l'absence de conséquences fonctionnelles sur nos tests in vitro, nous ne procèderons pas à des tests in vivo. Les femelles gestantes seront fournis par Janvier. Si cela représente une surcharge financière, cela a l'avantage d'éviter d'avoir un pool de mâles et de femelles dédiés à la reproduction et d'éviter également de produire des souris surnuméraires. L'exportation de cette compétence à l'avantage de laisser à notre fournisseur Janvier d'optimiser cette production à l'échelle de plusieurs clients. La force de notre hypothèse, les expériences pilotes précédentes ainsi que la qualité de nos procédures basées sur des années d'expérience, nous permettront de réduire significativement le nombre d'animaux utilisés. Le nombre d'animaux a été calculé par l'estimation de la variance observée avec ce type de donnée permettant d'atteindre une signification statistique. Nous utiliserons des tests statistiques appariés (t-test apparié pour des données paramétriques ou le test de Wilcoxon pour des données non parametrique).
Raffinement
A chaque étape du projet, le bien-être de nos animaux sera au cœur de nos préoccupations. Les souris gestantes en provenance de chez notre fournisseur seront acclimatés au moins 24h avant la chirurgie. Les femelles gestantes issues de chez Janvier ainsi que les animaux qui naitront, vivront dans notre animalerie de haut statut sanitaire, hébergés en cages collectives sur racks ventilés, garnies de litières leur permettant de reproduire un comportement naturel de fouissage et d’un enrichissement constitué d'un nid végétal et de tubes de cartons, pour leur permettre de construire des nids, de jouer, de ronger. Leur soin est confié à des personnels qualifiés et experts. Ils surveillent quotidiennement l’ensemble des animaux et de façon plus poussée et spécifique pendant les phases de récupération qui suit les procédures invasives (chirurgie). Nous utilisons des anesthésiques et analgésiques adaptés aux procédures de chirurgie. L’expérimentateur a une forte expérience pour toutes les procédures proposées. Des points limites suffisamment précoces sont définis pour éviter des souffrances aux animaux avec la mise en place de mesures pour les soulager comme une réhydratation, le réchauffement, une nourriture adaptée. Les bébés resteront avec leurs mères pendant toute la phase expérimentale. Les solutions injectées chez les bébés seront maintenus à 37°C et la procédure d'injection sera la plus courte possible pour réduire l'éloignement de la mère.
Choix des espèces
La distribution cellulaire et la maturation du cerveau est similaire entre la souris et l'homme. De plus, les mécanismes qui contrôlent le développement cérébrale ont été largement étudiés chez la souris, ce qui permet de pouvoir comparer nos résultats à ceux déjà publiés dans la littérature scientifique et d'utiliser les résultats que nous avons d'ores et déjà obtenu lors de la caractérisation de ce modèle. Nous travaillerons donc sur plusieurs stades de développement : au stade embryonnaire, mais aussi le jour de la naissance et 7, 14 et 21 jours après la naissance.
Etude anatomique et fonctionnelle de la fonction sexuelle chez le rat
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
Avant toute étude sur des rats paraplégiques, 68 rats et rates sains vont être utilisés pour mettre au point les procédures, dans des conditions impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués à l'issue. Vingt-quatre rates sont ovariectomisées et recevront une stimulation hormonale hebdomadaire pendant six mois au plus, pour servir de partenaires d'accouplement. Douze rats reçoivent un capteur de pression implanté dans le corps caverneux et douze autres dans les vésicules séminales, dix sont maintenus une heure en contention pour l'analyse du réflexe de dorsiflexion du pénis, dix reçoivent des électrodes dans le muscle bulbospongieux avant une heure de stimulation sensorielle du pénis sous anesthésie. Le porteur affirme que l'étude de la fonction sexuelle "nécessite un organisme entier" et qu'aucune modélisation ne permettrait de cribler les molécules visées.
Objectifs
Les lésions de la moelle épinière (LME) sont un problème de santé important, avec une incidence annuelle de 15 à 52.5 cas par million, touchant des individus jeunes et en bonne santé. Ces lésions provoquent des déficits sensoriels et moteurs (paralysie) bien connus, mais également une dysfonction du système autonome. Ces dysfonctions autonomes sont, entre autres, des dysfonctions cardio-vasculaires, génito-urinaires, gastro-intestinales… et altèrent considérablement la qualité de vie ainsi que l’espérance de vie du patient. Des études de qualité de vie ont montré que pour la majorité des paraplégiques, la récupération de la fonction sexuelle augmenterait drastiquement leur qualité de vie. Chez les rats avec une lésion haute, l’administration chronique d’un traitement sérotoninergique favorise la récupération fonctionnelle. Outre ce rôle démontré dans le contrôle moteur, la sérotonine joue également un rôle ubiquitaire dans le système cardiovasculaire, puisqu’elle module entre autres, le tonus des vaisseaux sanguins, qui est un mécanisme important dans la fonction sexuelle. De plus, il a été montré que des fibres sérotoninergiques innervent des motoneurones responsables de l’érection. Pour ces raisons, nous souhaitons développer un protocole expérimental basé sur l’utilisation de ces molécules chez des animaux sains (non-lésés) pour mieux comprendre les mécanismes de la fonction sexuelle et mettre en place une étude chez les rats paraplégiques.
Bénéfices attendus
Les lésions de la moelle épinière présentent une incidence dramatique sur tous les aspects de la vie quotidienne individuelle. Les études de qualité de vie montrent que la restauration de la fonction sexuelle chez les paraplégiques et les tétraplégiques améliorerait considérablement leur qualité de vie. Par ce projet, nous espérons en savoir plus sur les mécanismes spinaux de la fonction sexuelle, de manière à trouver un traitement compatible avec leurs déficits.
Procédures
12 animaux seront implantés avec un capteur de pression télémétrique dans le corps caverneux (temps de chirurgie : 30 minutes), et 12 seront implantés dans les vésicules séminales (temps de chirurgie : 30 minutes). Ces animaux seront isolés pendant 10 jours pour qu’ils soient sexuellement matures et seront mis en présence de femelles ovariectomisées pour enregistrer les pressions intra-caverneuse et intra-séminale pendant l’accouplement. Ces animaux serviront également à faire un criblage neuropharmacologique. Ces procédures auront une durée maximale de 6 mois. 10 animaux devront être en contention pour analyser leur réflexe de dorsiflexion du pénis (temps de manipulation : 1 heure). Cette procédure aura une durée maximale de 3 mois. 10 animaux subiront une procédure chirurgicale : l''implantation d'électrodes dans le muscle bulbospongieux (30 minutes). Après récupération, ils seront sous anesthésie pour réaliser la stimulation sensorielle du pénis (1 heure). Cette procédure a une durée de 6 mois. 24 rates seront ovariectomisées (procédure chirurgicale), elles seront également sous stimulation hormonale pour faciliter l'accouplement programmé, à raison d'une fois par semaine pendant maximum 6 mois.
Impact sur les animaux
Les procédures chirurgicales (implantations de capteur et d'electrodes, ovariectomies) peuvent conduire à de légères douleurs, normalement soulagées par des analgésiques. Les procédures nécessitant une anesthésie peuvent avoir des effets indésirables pour l'animal, mais nous prettons une attention particulière au raffinement de nos pratiques pour les limiter: tapis chauffant rétrocontrôlé à 37°C, utilisation de l'isoflurane qui est facile à contrôler en cas de sous ou sur anesthésie, hydratation de l'animal, analgésie. L'infection au niveau du site d'implantation ou au niveau de la suture est possible, mais encore une fois, le raffinement de nos pratiques chirurgicales permet de limiter fortement voire même supprimer le risque d'infection (travail en conditions stériles). L'isolement des animaux peut induire un stress chez les rats, mais le design de notre procédure est tel que la période d'isolement est trop courte pour induire un stress trop important. Les diverses injections peuvent induire un léger stress transitoire, mais les composés injectés ne sont en aucun cas délétères pour l'animal. La stimulation hormonale en elle même n'induit aucun stress physiologique car les femelles étant ovariectomisées, nous ne faisons que restaurer les niveaux d'hormones produites normalement par les ovaires. Enfin, la contention des animaux peut également engendrer un stress chez l'animal, mais le protocole que nous prévoyons met en place une phase d'habituation en douceur et avec récompense jusqu'à ce que l'animal ne soit plus stressé par l'expérience.
Devenir
Il est important de tirer un maximum d'information in vivo mais aussi ex-vivo afin de limiter l'utilisation des animaux. Ainsi, les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure, exceptée la procédure 5 où les animaux seront basculés en procédures 2 et 3 puis euthanaisés. Effectivement, nous récupérerons certains tissus afin de réaliser des analyses post-mortem.
Remplacement
La fonction sexuelle est possible grâce à l’interaction de multiples systèmes : systèmes hormonal, sensoriel, autonome et moteur. L’étude de cette fonction nécessite donc un organisme entier. De plus, Il n’existe pas de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet. S’agissant d’un nouveau projet, nous avons besoin d’apprendre à réaliser les procédures chirurgicales. C’est pour cela que nous avons fait des mises au point méthodologiques sur des cadavres de rats sortant d’expérimentation d’autres équipes, afin de maîtriser au mieux les méthodes avant de passer sur animal vivant. Le système nerveux central est complexe avec beaucoup de types ou sous-types de récepteurs différents qui se retrouvent à plusieurs niveaux tant centraux que périphérique : le groupe neuronal dont le neuromédiateur est la sérotonine, auquel nous nous intéressons particulièrement comporte une quinzaine de types ou sous-types de récepteurs différents. Il n'existe pas de modèle de modélisation de ce système qui permettrait de prédire les effets des molécules que nous souhaitons passer au crible dans ce projet.
Réduction
Notre équipe travaillant déjà sur la lésion de la moelle épinière depuis 5 ans, nous avons des retours d’expérience pour la détermination du nombres d'animaux dont nous avons besoin (afin de ne pas avoir trop, ni trop peu d’individus). Afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés dans cette DAP, plusieurs étapes de cette pré-étude seront faites sur les mêmes animaux. Enfin, Grâce à la télémétrie les injections pourront être faites sur le même lot d'animaux.
Raffinement
Les premières chirurgies seront faites en présence du vétérinaire pour limiter les erreurs pouvant engendrer des douleurs. De plus, nous avons prévu une analgésie multi-modale pré-opératoire et post-opératoire afin de prévenir d’éventuelles douleurs. Les animaux seront surveillés quotidiennement. Nous avons défini une grille de score avec un arbre décisionnel tenant compte de points limites adaptés et de critères d’arrêt de souffrance. Des soins seront apportés en cas de signes de mal être ou douleur et nous prendrons contact avec le vétérinaire dès le lendemain ou le jour même suivant le problème rencontré. En cas de point limite, les animaux seront euthanasiés. Tant que possible le caractère grégaire du rat sera préservé (hébergement par 2 – femelle/femelle ou mâle/femelle ovariectomisée). Nous devrons cependant isoler les mâles arrivant sur site pendant 10 jours pour qu'ils soient sexuellement matures, ensuite pour chaque semaine lors de la procédure, ils seront hébergés tel que : avec une femelle ovariectomisée pendant 4 jours puis re-isolés pendant 3 jours. L’environnement des animaux sera enrichi avec des tunnels et des matériels de nidification, ils seront tous hébergés dans la même pièce et pourront se voir et se sentir. Pour la contention des animaux, une phase d’habituation quotidienne avec récompense sera mise en place 7 jours avant le début de l’expérimentation.
Choix des espèces
Le rongeur est un modèle facile à héberger, dont la reproduction est rapide et dont la physiologie reste malgré ses différences, proches de celle de l’humain. Le rat est particulièrement compatible avec notre projet car sa taille supérieure à celle de la souris permet de faciliter les chirurgies comme la pose d’implant, l’injection de virus et les SCI, que nous réaliserons plus tard dans notre étude. De plus, il existe de nombreux points communs entre le rat et l’humain quant à la réparation cellulaire de la moelle épinière. Nous utiliserons des animaux adultes car ils doivent être sexuellement actifs (6 à 8 semaines au début des expérimentations)
Organisation anatomique et fonctionnelle des circuits moteurs cérébraux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1340 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère, toutes tuées à l'issue pour prélever leur tissu nerveux. Toutes subissent une chirurgie stéréotaxique du cerveau qui peut durer trois heures, 480 une lésion de la substance noire avec deux injections sous-cutanées par jour pendant 14 jours, et 960 passent à trois reprises des tests de marche en champ ouvert, sur tapis roulant et en couloir, et de nage en couloir. Des enregistrements électrophysiologiques de deux heures sont prévus sur 200 d'entre elles. Le projet vise à comprendre comment le cerveau choisit et active les circuits de la marche, de la préhension ou de la mastication, et comment un syndrome parkinsonien, induit chez une partie des souris, les altère. Le porteur affirme que les approches in vitro ou in silico ne peuvent pas "reproduire ou modéliser la complexité d'un organisme entier".
Objectifs
Le contrôle de nos mouvements repose sur des réseaux complexes de neurones dont le fonctionnement reste en grande partie mystérieux. Cela s'explique par le fait que chaque niveau du système nerveux central, du cortex cérébral à la moelle épinière, joue un rôle dans nos mouvements. Des études récentes montrent que certaines zones du cerveau, situées dans les régions bulbo-pontiques, sont organisées en modules spécialisés. Ces modules contrôlent différents types de mouvements comme la marche, la préhension, la mastication, et la succion. Ils envoient ensuite des signaux aux neurones moteurs situés dans le tronc cérébral et la moelle épinière pour exécuter ces mouvements. Cependant, nous ne savons pas encore précisément comment le cortex cérébral et les ganglions de la base choisissent et activent ces modules en fonction de nos besoins comportementaux. Notre projet de recherche vise donc à comprendre comment ces structures intermédiaires, situées entre le cortex et les ganglions de la base, contribuent à la sélection des modules de commande du tronc cérébral. Pour ce faire, nous allons étudier l'organisation en réseau des structures motrices du cerveau et déterminer le rôle de chaque composant dans la réalisation et la modulation des mouvements. En parallèle, nous allons examiner comment ces circuits sont affectés par la maladie de Parkinson. Notre objectif est de développer et tester des stratégies pour restaurer des mouvements adaptés en intervenant sur le fonctionnement des réseaux moteurs du cerveau. Nous espérons que ce projet, en plus de son intérêt scientifique, apportera des résultats pré-cliniques importants pour la compréhension et le traitement des maladies humaines, notamment dans le cadre des soins pour les patients.
Bénéfices attendus
Le projet a pour but de comprendre comment certaines structures du cerveau, qui sont connectées entre elles et forment des réseaux moteurs, contribuent à différents types de mouvements. Ces mouvements incluent atteindre un objet, le saisir, le manipuler, ainsi que marcher. Nous nous concentrons particulièrement sur des structures cérébrales qui pourraient être contrôlées par le cortex et les ganglions de la base, car ces derniers jouent un rôle crucial dans le choix des comportements moteurs.
Procédures
-Nous réaliserons sur 1340 animaux une chirurgie stéréotaxique de (maximum) 180 minutes durant laquelle ils recevront une injection i.p. (0,15 ml), 2 injections s.c. une sur la tête (0,05 ml) et une sur le corps (0,15 ml). Puis des soins post-opératoires durant lesquels ils recevront une injection s.c. (0,5 ml). -Nous réaliserons sur 480 animaux une lésion de la substance noire compacte durant laquelle ils recevront deux injections quotidiennes s.c. (0,2 ml, une le matin et une le soir) durant 14 jours. -960 animaux réaliseront des tests moteurs d’environ 5-10 minutes de types : marche en champs ouvert, marche sur tapis roulant, marche en couloir de marche, et de la nage en couloir de nage répartis sur 4 jours. Ces tests seront réalisés 3 fois avec 14 jours entre chaque répétition. -Des enregistrements électrophysiologiques d'une durée de 2h seront réalisés sur 200 animaux. Les animaux recevront une injection i.p. (0,15 ml). L’ensemble des injections dureront moins de 1 minute.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie les animaux pourront présenter une douleur transitoire. En outre les animaux pourraient présenter une légère déshydration. Suite à l’induction d’un syndrome parkinsonien les animaux seront affectés sur le plan moteur avec pour conséquence une diminution de l’activité et des comportements de rotation sans pour autant altérer leur capacité à se nourrir. En outre les animaux pourront présenter une perte de poids limitée dans le temps pouvant induire un stress transitoire chez les animaux. Enfin, les animaux seront manipulés ce qui pourra générer un léger stress chez ces derniers.
Devenir
Les animaux seront mis à mort afin de prélever le tissu nerveux pour des analyses histologiques.
Remplacement
Il n’y a au jour d’aujourd’hui aucunes méthodes alternatives nous permettant d’aborder notre projet sans passer par l’étude de modèles animaux, les approches in vitro ou in silico ne pouvant pas reproduire ou modéliser la complexité d’un organisme entier.
Réduction
Dans ce projet, des animaux mâles et femelles seront utilisés. Le nombre d’animaux utilisés dans le projet n'excèdera pas 12 à 20 animaux par groupe, c'est à dire le nombre d'échantillons permettant l'application de tests statistiques classiques dans le domaine.
Raffinement
Le laboratoire est doté de l'ensemble des infrastructures (animalerie, salles d'expérimentation etc.) nécessaires à la réalisation du projet et dispose de l'ensemble des agréments requis et délivrés par les services compétents. Les conditions d'hébergements et d'enrichissement respectent les normes dictées par les directives européennes. Nous sommes particulièrement vigilants en ce qui a trait au bien-être animal et la prise en charge de la douleur. Des points limites précoces et spécifiques de notre étude ont été fixés et des procédures adaptées ont été établies, les mesures analgésiques incluses dans protocoles permettant de garantir à la fois la pertinence des résultats et le bien-être des animaux. Les chercheurs participant au projet ont une solide expérience dans la manipulation de rongeurs et l'ensemble des compétences requises à sa réalisation (notamment chirurgicales). À ce titre, il convient de préciser d'une part que le chercheur par ailleurs référant en matière de bien-être animal au laboratoire prend part au présent projet et d'autre part que le projet est bâti en accord avec les recommandations et conseils de la vétérinaire de l’établissement. Cette dernière sera sollicitée chaque fois que nécessaire par le coordinateur du projet qui lui permettra en outre de suivre, bien que de façon externe, le déroulement du projet et de proposer des procédures de raffinement bénéfiques à tous les égards. Les procédures mises en place suivent également les normes en matière de raffinement des pratiques expérimentales. Les procédures chirurgicales sont réalisées sous anesthésies générale (isoflurane) et locale (lidocaïne) et sont associées à des traitements analgésiques (buprénorphine/meloxicam) qui seront maintenus tant que nécessaire en fonction de l'état des animaux par ailleurs suivis quotidiennement. La mise en place des points limites et des mesures analgésiques notamment chez l'animal repose sur une méthode de scoring comprenant 4 niveaux : normal, modérée, sévère, mise à mort. Cette méthode prend en considération la douleur et l'état général de l'animal (poids, hydratation, soin au pelage etc.). Un animal classé modéré ou sévère recevra un traitement adapté aux symptômes exprimés. L'ajustement des traitements sera évalué sur une base quotidienne.
Choix des espèces
Nous avons choisi d'utiliser des souris pour étudier les circuits moteurs et leurs altérations dans le cadre de la maladie de Parkinson. La maladie peut être reproduite expérimentalement chez la souris grâce à une neurotoxine. De plus, les souris transgéniques, combinées à l'injection de vecteurs viraux pour cibler des populations neuronales spécifiques, permettent d'explorer de manière précise l'organisation et le fonctionnement des réseaux neuronaux. Ces méthodes ne peuvent pas être appliquées chez l'homme. Les souris adultes seront utilisées pour ce projet, car elles correspondent aux objectifs scientifiques et méthodologiques, notamment pour les tests moteurs, les procédures chirurgicales et l'induction de la maladie de Parkinson.