Système nerveux

289 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chacun subit une chirurgie crânienne d'une heure trente, puis deux séances d'imagerie cérébrale d'une heure et demie à deux et quatre jours d'intervalle, certaines sur animal éveillé, d'autres sous anesthésie avec un courant électrique appliqué sur la patte. Le laboratoire évalue ainsi des candidats analgésiques non opioïdes qu'il a lui-même développés et dont il indique qu'ils ont déjà montré un effet chez le rat et la souris. La mise à mort est justifiée en ces termes : "dans un objectif de réduction de la douleur et pour le bien être des animaux, ils ne pourront pas être réutilisés".

Objectifs

Face à la crise des opioïdes largement répandue en Amérique du Nord, et qui menace aussi les pays européens, il est devenu essentiel de développer de nouveaux médicaments analgésiques non opioïdes, plus sûrs et sans risques d’addiction. L'objectif de ce projet est d'évaluer l'efficacité de nouveaux candidats-médicaments non addictifs et de mieux comprendre comment ils traitent la douleur. Les candidats- médicaments développés par le laboratoire ont montré un effet antidouleur significatif chez les rats et les souris. Pour renforcer ces résultats, nous utiliserons des techniques d'imagerie cérébrale pour observer les effets de ces médicaments sur le cerveau. Cette imagerie nous permet de visualiser et de comprendre les effets précis de ces molécules. Dans cette étude, nous utiliserons l'imagerie fonctionnelle pour observer la réponse du cerveau après l'administration des candidats-médicaments en les comparant à des analgésiques de référence. Cette méthode nous aide à mieux comprendre comment ces médicaments agissent sur le cerveau et à confirmer leur potentiel en tant que traitements sûrs et efficaces contre la douleur.

Bénéfices attendus

Les candidats médicaments développés par le laboratoire sont des molécules très affines et sélectives pour leur cible. Leur haute affinité les rend actives à faible dose et leur sélectivité limite les effets indésirables. Ces molécules ont montré des activités thérapeutiques très intéressantes lors d’études pré-cliniques. L’imagerie fonctionnelle permettrait d’apporter des informations complémentaires sur les mécanismes pharmacologiques de ces molécules et ainsi mieux comprendre leurs effets thérapeutiques. Dans ce projet nous nous intéresseront à leur effet analgésique et cela pourra aboutir au développement de potentiels nouveaux analgésiques plus sûrs pour les humains.

Procédures

Dans les deux expériences, chaque animal subira une chirurgie préalable (1h30) aux sessions d’imagerie. Cette chirurgie se fera sous anesthésie générale et sera complétée d’une anesthésie locale, d’une analgésie et d’une injection d’anti-inflammatoires. A J+2 et J+4 de cette chirurgie, 2 sessions d’imagerie d’une heure et demie (30 min de préparation + 1 heure d’acquisition) auront lieu. Les sessions d’imagerie se font chez l’animal éveillé libre des ses mouvements dans l'expérience 1 et sous anesthésie au cours de l'expérience 2. Au cours des sessions d’imagerie de l'expérience 2, le candidat-médicament sera injecté en sous-cutané puis un court stimulus sera appliqué par un courant électrique sur la patte de l'animal.

Impact sur les animaux

La chirurgie nécessaire pour préparer l'animal à l'imagerie, peut occasionner une douleur locale ainsi que du stress physique immédiatement après la procédure. Elle peut également conduire à une réduction temporaire de la prise alimentaire due à l'inconfort lors de la mastication et provoquer une perte de poids. De plus, l'implantation d'un dispositif pour l'imagerie éveillée, le cas échéant, peut engendrer une douleur post-opératoire et une gêne. Au cours de l’acquisition d’imagerie, le stimuli électrique appliqué provoquera une douleur courte et transitoire de la patte

Devenir

Dans un objectif de réduction de la douleur et pour le bien être des animaux, ils ne pourront pas être réutilisés. Ils seront donc euthanasiés à la fin de chaque procédure.

Remplacement

L’objectif du protocole est d’étudier la réponse du cerveau à l’effet analgésique d’un candidat médicament. La douleur étant un processus physiologique complexe, il n’existe pas actuellement de modèle in vitro permettant d’étudier l’intégration et le traitement du message nerveux douloureux dans sa globalité.

Réduction

Les analyses seront effectuées avec 8 animaux par condition, afin d’assurer une puissance statistique suffisante. Pour la procédure 1, ce nombre a été augmenté à 9 du fait d’une possible perte des dispositifs de maintien de la sonde. Pour réduire le nombre d’animaux, chaque animal pourra réaliser jusqu’à trois acquisitions d’imagerie

Raffinement

La douleur sera prise en charge à chaque étape de l’expérience (pré, per et post-opératoire) afin d’être minimisée. Les animaux seront suivis quotidiennement à l’aide d’une grille de score permettant dévaluer leur état général selon différents critères (apparence, comportement, poids). En cas de mal-être constaté, des mesures seront prises pour améliorer l’état de l’animal. Le stress sera minimisé grâce à une habituation aux expérimentateurs, un hébergement en groupe et des enrichissements. Le nombre d’animaux utilisés sera réduit au minimum selon les résultats de tests statistiques. En cas d'atteinte de points limites, les animaux seront euthanasiés.

Choix des espèces

Le rat est une espèce utilisée très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments et l’étude physiopathologique du système nerveux central. Les premières études précliniques caractérisant les effets analgésiques du candidat médicament ont été réalisées chez le rat. Dans un souci de reproductibilité, le rat semble donc l’espèce la plus adapté à notre étude . Il s’agit également d’une espèce bien adaptée à la méthode d’imagerie. Les rats seront âgés de 6 semaines (225-250g) à leur arrivée au laboratoire afin d’étudier l’effet des agents pharmacologiques sur des cerveaux pleinement développés.

Deux chirurgies cérébrales à cinq jours d'intervalle, la première pour déclencher une épilepsie, la seconde pour reprogrammer les cellules gliales en neurones : sur 561 souris, 516 passent sur la table stéréotaxique et 378 y reviennent une seconde fois, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Toutes sont tuées entre trois jours et huit semaines après l'opération pour le prélèvement du cerveau. Les 327 souris transgéniques reçoivent en plus deux injections par jour pendant deux semaines pour déclencher l'expression de leur transgène, après une biopsie de la queue au sevrage. Le porteur écrit que l'état de mal épileptique qui suit la chirurgie "n'est pas douloureux", que les crises ultérieures ne le sont pas davantage et que les troubles de mémoire et l'anxiété observés n'induisent pas de douleur, tout en déclarant l'ensemble du projet en souffrance modérée.

Objectifs

Le cerveau adulte est incapable de se régénérer, ce qui veut dire que les neurones détruits lors d’une pathologie sont définitivement perdus et les symptômes associés permanents. Dans de nombreuses pathologies, la mort des neurones est associée à la multiplication de cellules non neuronales, les cellules gliales ou glies, qui vont changer d’état et devenir réactives. Récemment, la reprogrammation cellulaire, qui consiste à transformer les cellules gliales en nouveaux neurones, a émergé comme une nouvelle stratégie thérapeutique afin de remplacer les neurones perdus et restaurer les fonctions cognitives. Plusieurs équipes, dont la nôtre, ont déjà démontré qu’il était possible de reprogrammer différentes catégories de cellules gliales en nouveaux neurones en exprimant dans les glies des facteurs de reprogrammation. Plus spécifiquement, nous avons récemment démontré dans un modèle d’épilepsie chez la souris que les cellules gliales qui se multiplient dans les premiers temps de la pathologie peuvent être reprogrammées en nouveaux neurones, dits induits, capables de réduire de moitié les crises d’épilepsie. Ces résultats démontrent pour la première fois l’intérêt de la reprogrammation cellulaire pour le traitement des épilepsies. Cependant, il reste encore beaucoup de choses à comprendre sur les mécanismes impliqués dans la reprogrammation des glies en neurones. En particulier, le type de cellules gliales qui est reprogrammé avec succès reste à ce jour inconnu. Par ailleurs, il est important de comprendre si la multiplication et la réactivation de ces cellules gliales impacte leur capacité à être reprogrammées en neurones. Enfin, il est essentiel d’étudier les changements de l’expression des gènes des cellules gliales permettant l’expression progressive des gènes neuronaux durant la reprogrammation. Notamment le rôle spécifique d’acteurs épigénétiques, c'est-à-dire d’acteurs capables de contrôler l’expression des gènes, dans ce processus reste à être élucidé. Utilisant un modèle murin d’épilepsie, les objectifs du présent projet sont : 1) Déterminer quel type de cellules gliales peut être reprogrammé durant la phase de développement de l’épilepsie. 2) Comprendre comment les gènes des cellules gliales de départ et leur modification impacte la reprogrammation des glies en neurones. Ceci permettra d’identifier ce qui rend certaines glies reprogrammables. 3) Évaluer le rôle spécifique de deux acteurs épigénétiques dans la reprogrammation glie-neurone.

Bénéfices attendus

Le cerveau adulte étant incapable de se régénérer, le développement de stratégies thérapeutiques visant à remplacer les neurones perdus en cas de traumatisme ou de maladie cérébrale pourrait avoir à terme un fort impact dans le domaine de la santé. Nous avons précédemment démontré que la reprogrammation cellulaire, qui consiste à convertir les cellules gliales résidant au site de la lésion en neurones induits fonctionnels, permettait de réduire les crises dans un modèle murin d’épilepsie réfractaire aux médicaments. Ces résultats sont très encourageants et représentent une première preuve de concept de l’utilisation de la reprogrammation pour le traitement des épilepsies. Cependant, de nombreuses limites doivent être surmontées avant de pouvoir envisager une thérapie en clinique (ex: identification du type de glies reprogrammées, impact de la prolifération, rôle des facteurs épigénétiques). En nous permettant de comprendre les mécanismes impliqués dans la reprogrammation cellulaire des glies réactives proliférantes, ce projet donnera des pistes essentielles pour dépasser ces limites et envisager des thérapies cellulaires futures pour le traitement des épilepsies pharmacorésistantes. Par ailleurs, une meilleure compréhension des mécanismes impliqués dans la reprogrammation cellulaire ouvrira la porte vers la généralisation de cette stratégie à d’autres pathologies où la prolifération gliale est limitée.

Procédures

Une partie du projet implique des animaux transgéniques (327 souris) pour lesquels il est nécessaire de déterminer le génotype. Une petite biopsie de queue est réalisée au sevrage afin de mesurer la présence des transgènes par PCR. Elle sera réalisée en moins d’1 min et sous anesthésie locale pour éviter toute douleur. Plusieurs injections d’un produit (2X/jour pendant 2 semaines) sont ensuite nécessaires pour déclencher l’expression du transgène chez ces animaux. Chaque injection est réalisée rapidement (

Impact sur les animaux

Les animaux subiront une à deux chirurgies stéréotaxiques sous anesthésie générale complétée d’une analgésie locale. Il est nécessaire d’immobiliser l’animal en le prenant par la peau du dos pour injecter les produits anesthésiques et analgésiques. Cette immobilisation entraîne un léger inconfort et du stress pendant quelques secondes. La piqûre d'aiguille pour l’injection entraîne une douleur légère très brève. Le traitement de la douleur post-opératoire s’effectue par plusieurs injections d’analgésiques. La piqûre d’aiguille pour l’injection induit une douleur légère très brève. Dans les heures suivant la chirurgie visant à générer le modèle murin d’épilepsie, les animaux sont en « état de mal épileptique » non convulsif, c’est-à-dire que des décharges de pointes sont enregistrées sur un EEG dans leur cerveau. Celui-ci est associé à un arrêt du comportement naturel et à la présence de stéréotypies. Cet état de mal n’est pas douloureux mais les animaux vont moins s’alimenter durant cette période, pouvant entraînant une perte de poids transitoire (48h). Une fois cette période passée, le comportement des animaux est normal malgré la survenue de crises d’épilepsie focales non convulsives dans l’hippocampe. Celles-ci sont non douloureuses mais s’accompagnent de l’arrêt de l’activité de l’animal. Par ailleurs, les animaux épileptiques présentent quelques légers troubles de mémoire et une faible élévation de l’anxiété. Ces légers troubles n’impactent pas le comportement général de l’animal, ni sa capacité à se déplacer et se nourrir. Ils n’induisent pas non plus de douleur. Le génotypage des souris transgéniques sera effectué par biopsie d’un petit morceau de queue sur animal vigile sous analgésie locale. Ceci nécessite l’immobilisation des animaux qui peut entraîner inconfort et stress. Ces animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’un produit permettant de déclencher l’expression du transgène (2X/j pendant 10j). La piqûre d’aiguille pour l’injection induit une douleur légère très brève.

Devenir

Les expériences réalisées dans ce projet nécessitent de prélever le cerveau pour soit (1) isoler les cellules gliales de départ et celles en cours de reprogrammation et analyser quels gènes sont exprimés, soit (2) effectuer des analyses histologiques directement sur tranches de cerveau. Ces différentes analyses n’ont pas d’alternative qui éviterait la mise à mort des animaux.

Remplacement

Ce projet consiste spécifiquement à étudier, dans le contexte de l’épilepsie, ce qui rend les glies qui se multiplient lors des phases précoces de la maladie particulièrement sensibles à la reprogrammation. De plus, l’environnement cérébral, dont la complexité ne peut pas être reproduite en culture, a un impact sur la reprogrammation glie-neurone. Ceci ne peut donc être étudié que dans le cerveau d’un animal rendu épileptique.

Réduction

Toutes les expériences sont planifiées avec le nombre minimal d’animaux permettant de garantir des résultats robustes, nombre qui a été déterminé préalablement grâce à des calculs statistiques et basé sur les données de la littérature. Pour déterminer les différences dans l’expression des gènes dans les cellules gliales de départ et au cours de la reprogrammation, nous effectuerons différentes techniques d’analyse sur les mêmes cellules, permettant ainsi de réduire de moitié le nombre d’animaux utilisés dans ces expériences. Par ailleurs, ces expériences permettront de générer un grand nombre de données dont l’analyse s’étendra au-delà de ce projet. Des analyses comparées de ces données avec d’autres présentes dans la littérature devraient permettre d’étudier un certain nombre de questions sans passer par l’utilisation de nouveaux animaux. Enfin, nous avons défini des points d’arrêt à différentes étapes du projet nous permettant d’évaluer si nous devons procéder ou non à la suite des expériences en fonction des résultats déjà obtenus. Ceci permettra de réduire le nombre d’animaux utilisés le cas échéant.

Raffinement

Toutes les chirurgies se dérouleront sous anesthésie générale et analgésie locale renforcée pour éviter toute douleur ou souffrance durant l’opération. Pour éviter toute douleur postopératoire, les animaux recevront par ailleurs plusieurs injections d’analgésique. Une surveillance sera mise en place en postopératoire avec un suivi renforcé dans les 72h post-chirurgie. Les animaux seront scorés selon une grille d’évaluation clinique adaptée à notre étude. En cas de signes de douleur, les animaux recevront une analgésie supplémentaire. Les animaux pourront également se voir présenter de la nourriture liquide et supplémentée afin de faciliter leur récupération après l’opération. L’interruption des expériences pourra intervenir pendant la chirurgie ou en postopératoire dans le cas d’apparition de signes indicatifs de gêne/douleur sévères. Raffinement des conditions d’hébergement : Une fois que les animaux ont récupéré de la chirurgie, ils sont regroupés avec leurs congénères. Les animaux bénéficient d’un milieu d’hébergement enrichi (nid en fibres de coton, tunnels en carton, igloos teintés en polycarbonate). Cas des animaux transgéniques : Le déclenchement de l’expression du transgène pourra se faire par gavage oral (3X, tous les 2j) pour réduire l’inconfort des animaux si cela s’avère aussi efficace que les injections répétées.

Choix des espèces

Ce projet fait suite à un projet précédent réalisé dans un modèle d’épilepsie chez la souris et vise à déterminer (1) les mécanismes impliqués dans la reprogrammation des glies se multipliant dans la phase précoce de la maladie et (2) l’impact de la modulation de deux facteurs épigénétiques sur l’efficacité de reprogrammation glie-neurone dans le contexte de l’épilepsie. Ce projet doit donc être réalisé dans le même modèle afin que les résultats obtenus soient directement comparables aux données précédemment générées Ce modèle d’épilepsie généré chez la souris que nous utilisons reproduit la plupart des aspects de la pathologie humaine et a été amplement validé. Les injections intracérébrales seront réalisées chez des souris adultes d’au moins 8 semaines afin de rester dans les mêmes conditions expérimentales que celles utilisées dans les études précédentes, pour permettre une comparaison directe entre les résultats obtenus dans nos précédentes études et les résultats générés lors de ce projet.

Cinq séances hebdomadaires de neurostimulation par ultrasons, doublées d'une électromyographie, puis dix minutes d'échographie cérébrale avec agent de contraste et d'imagerie photoacoustique : 320 souris et 320 rats mâles vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tués après la cinquième semaine. Le projet compare des sondes ultrasonores pour trouver la configuration la plus efficace, l'espoir déclaré étant de stimuler le cerveau "sans générer de lésions". Le groupe témoin reçoit de la cocaïne, dont le porteur indique qu'elle peut provoquer des troubles locomoteurs, une modification de la prise alimentaire et une hausse de l'anxiété. La pose d'un cathéter et la suture de la peau du crâne apparaissent seulement dans la liste des douleurs attendues, sans figurer dans la description des procédures.

Objectifs

Dans le cadre de cette étude nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore non-invasive, précise et efficace chez la souris et le rat.

Bénéfices attendus

Nous espérons trouver une configuration de sondes et paramètres ultrasonores donnant le plus d'efficacité de stimulation cérébrale, sans générer de lésions.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs interventions comme la neurostimulation ultrasonore, pour une durée de 5 minutes, répétee 5 fois à raison de 1 fois par semaine. L'electromyographie sera réalisée en parallèle de cette neurostimulation avec la même durée et fréquence. Une échographie cérébrale avec agents de contraste ainsi qu'une imagerie photoacoustique seront réalisées successivement après la neurostimulation pendant 10 minutes et en suivant la même fréquence de 1 fois par semaine pendant 5 semaines. Enfin, l'injection de puces d'identification sera effectuée une fois pour une durée de 2 minutes.

Impact sur les animaux

Parmi les nuisances ou effets indésirables, il est possible que l'animal ait des douleurs au réveil suite à la pose du cathéter. Une gêne peut aussi être ressentie après l'apposition de la sonde ultrasonore de stimulation. Il est aussi possible que la suture de la peau sur le crâne soit douloureuse. L'injection de cocaïne au groupe contrôle afin de vérifier la capacité de l'imagerie ultrasonore d'observer les modifications vasculaires peut induire des problèmes locomoteurs, une modification de la prise de nourriture et une augmentation de l'anxiété des animaux.

Devenir

Nous conservons les animaux en vie jusqu'à la 5ème semaine de traitement par neurostimulation ultrasonore. Après les dernières imageries échographique et photoacoustiques, les animaux seront euthanasiés.

Remplacement

Dans une première approche expérimentale, nous avons mis en place et validé un dispositif expérimental permettant la stimulation ultrasonore. Dans la continuité de ce projet, nous souhaitons évaluer différentes sondes ultrasonores pour réaliser une stimulation ultrasonore précise et efficace chez la souris et le rat. Par conséquent, à cette étape du projet, le modèle animal ne peut être substitué par un autre modèle d'étude in-vitro ou in-silico.

Réduction

Sur la base de nos études antérieures et en raison des variables mesurées, notre étude nécessite 320 souris et 320 rats. Les groupes contrôles et expérimentaux seront constitués de 8 animaux. Nous réaliserons une étude statistique pour déterminer si les effets de la neurostimulation induisent une modification significative des variables mesurées.

Raffinement

Les animaux seront hébergés par groupe de 8 pour les souris et par 2 pour les rats en présence d'un ou plusieurs objets d'enrichissement. L'ensemble des stimulations et imagerie sur animaux endormis seront faites sous anesthésie gazeuse pour réduire les douleurs des animaux. Des points limites adaptés à chaque intervention seront suivis au cours du temps.

Choix des espèces

Le choix de ces deux espèces se justifie pour l'analogie des zones cérébrales et de la neurobiologie entre le rongeur et l'humain. Certains aspects de la stimulation ultrasonore chez la souris et le rat ont également été validés dans la littérature. Des animaux de sexe mâle seront utilisées afin d’éviter toute altération des résultats par le cycle menstruel femelle. Les souris BALB/cByJRj et les rats Sprague-Dawley seront adultes (âgées de 9 semaines) à J0 de l'expérimentation afin de comparer les effets d’une stimulation ultrasonore chez des animaux dont le phénotype comportemental est stabilisé (période neuro-développementale terminée).

Une lésion du nerf sciatique ou une injection d'agent inflammatoire installe chez 180 souris une douleur persistant plus de six semaines, avec allodynie mécanique, hyperalgésie au chaud et au froid et douleur spontanée. Toutes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré et tuées à l'issue, aucune réutilisation n'étant envisageable après la chirurgie. Chaque animal passe trois séances d'IRM d'une heure sous anesthésie et des tests comportementaux de deux heures, deux jours par semaine, pour cartographier les régions du cerveau activées selon le type de douleur. Le porteur écrit qu'en dehors de la douleur induite aucune procédure n'entraîne d'effet indésirable majeur, et présente la mise à mort finale comme un moyen d'éviter aux souris "toute souffrance inutile".

Objectifs

Les douleurs chroniques sont très fréquentes et les traitements disponibles souvent peu efficaces. Une des raisons à cet échec est qu’il n’y a pas une mais des douleurs chroniques. En effet, les douleurs chroniques se manifestent par plusieurs symptômes : douleurs spontanées, et douleurs provoquées par une stimulation normalement non douloureuse (allodynie) ou douloureuse (hyperalgésie). Chaque symptôme dépendant de mécanismes distincts, un médicament efficace sur l’un ne le sera donc pas nécessairement sur un autre : d’où la nécessité de traitements spécifiques pour chacun d’eux. Nous nous intéressons aux mécanismes de l’allodynie mécanique, un des symptômes les plus fréquents observés chez les patients douloureux chroniques. Comment le toucher devient-il douleur ? Normalement, ces sensations sont indépendantes. Les nerfs véhiculant les messages douloureux se terminent dans les couches superficielles de la moelle épinière et ceux véhiculant les messages tactiles dans les couches profondes. Cependant, suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique, les informations tactiles peuvent accéder aux neurones de la douleur des couches superficielles via un ‘court-circuit’ et provoquer ainsi une allodynie mécanique. Un petit nombre de neurones appartenant à ce circuit a été identifié, mais le manque d’informations concernant le réseau dans son ensemble et ses caractéristiques propres constituent une barrière majeure contre la mise en place d’une thérapeutique ciblée et efficace. Quels sont les structures cérébrales activées ? Diffèrent elles selon si l'origine de la douleur apparait suite à une lésion nerveuse ou une inflammation périphérique? En utilisant de l'imagerie fonctionnelle chez des souris atteint de douleurs neuropathiques ou inflammatoire, nous effectuerons différentes stimulation mécanique ou thermique afin de déterminer les régions cérébrales activées dans ces deux types de douleur chronique selon la nature du stimulus effectué et ainsi déterminer si les circuits cérébraux différent selon l'étiologie de la douleur.

Bénéfices attendus

Ce projet devrait permettre de comprendre les structures cérébrales impliqués dans les douleurs neuropathiques et inflammatoire selon les modalités sensorielles mobilisées.

Procédures

Tous les animaux subiront une analyse par IRM de leur activité cérébrale. Les animaux seront analysés par IRM fonctionnelle pendant toute l'expérimentation afin d'évaluer les changements d'activités neuronales au cours du temps, sur une période de 6 à 12 semaines, chaque séance durant environ 1h. Chaque animal subira 3 sessions d'IRM, espacées de 10 jours chacune, afin d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. L'ensemble de ces animaux seront également testés pendant 2 jours chaque semaine pour étudier leur comportement avant et après induction des modèles de douleur. Ces tests comportementaux permettront d’évaluer la douleur mécanique statique, dynamique et thermique, respectivement. Chaque session de comportement dure environ 2h. L'induction des modèles de douleur se fera sous anesthésie générale

Impact sur les animaux

Aucune des procédures décrites dans ce projet, en dehors de la douleur induite dans les modèles de douleur, n'induit d'effets indésirables majeurs. Les données de la littérature indiquent néanmoins une comorbidité anxio- dépressive dans les modèles de douleurs utilisés dans ce projet, comme décrit par les patients atteints de douleurs persistantes. La douleur induite par les modèles de douleurs inclut : -une allodynie mécanique statique et dynamique persistante -une hyperalgésie thermique au chaud et au froid persistante -une douleur spontanée persistante. L'expérience du laboratoire avec ces modèles reporte que ces douleurs persistent environ 1 semaine dans le modèle CFA, et plus de 6 semaines dans le modèle SNI.

Devenir

L'ensemble des animaux ayant subi une procédure chirurgicale, il n'est pas envisageable de les réutiliser dans un autre projet. Toutes les souris seront euthanasiées à la fin de chaque procédure afin de leur éviter toute souffrance inutile.

Remplacement

Aucune méthode alternative n'existe pour prévenir l'utilisation d'animaux dans ce protocole : en effet, il est nécessaire de réaliser ces études chez l'animal car l’intégration du toucher et de la douleur implique de nombreux neurones organisés en réseaux complexes et méconnus du système nerveux central et périphérique. Seuls des animaux permettent de visualiser l'activité cérébrale en temps réel par MEMRI.

Réduction

Le nombre de souris par groupe (n=20) est réduit au maximum tout en permettant de discriminer un effet significatif entre les traitements, et calculé par des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Les animaux sont stabulés dans des cages contenant au maximum 4 males ou 5 femelles dans une pièce thermorégulée (22 ± 1 °C) avec hygrométrie contrôlée ; accès à la nourriture et à l’eau ad libitum ; changement de litière 1 fois par semaine. Les animaux seront hebergés en milieu enrichi (social et environnemental) afin de respecter au mieux leur confort et leur niveau de stress. Les tests comportementaux à la douleur seront réduits au minimum (fréquence et intensité des tests) et réalisés selon des protocoles expérimentaux établis et acceptés par la communauté scientifique de la Recherche sur la douleur. Les expérimentations seront réalisées au sein d'une plateforme d'imagerie ayant une expérience reconnue dans les approches décrites dans ce projet. Aucun des modèles de douleurs décrits dans ce projet n'induit de déficit locomoteur sévère pouvant influer sur les besoins physiologiques de l'animal.

Choix des espèces

L'utilisation du manganèse est proscrite chez l'homme nécessitant de faire cette étude chez l'animal, nous utiliserons le modèle souris en lien avec les données préliminaires obtenues au laboratoire. Nous utiliserons des souris adultes pour comparaison avec les autres données de la littérature

Les souris qui perdent 20 % de leur poids de départ ou qui présentent des lésions cutanées sont retirées de l'étude. 978 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une injection de peptide directement dans le cerveau sous anesthésie, un jeûne de seize heures par semaine pendant quatre semaines, des incisions de la queue pour des prélèvements sanguins étalés sur trois heures, et un test d'évitement passif qui délivre un stimulus aversif dans les pattes. L'objet réel est de mesurer chez des souris rendues amnésiques et diabétiques l'effet d'une molécule tirée d'une plante, dont le passage en clinique reste une perspective annoncée.

Objectifs

Trouver un traitement contre la maladie d’Alzheimer est aujourd’hui une priorité. La maladie d’Alzheimer est une pathologie neurodégénérative liée au grand âge et est souvent compliquée de pathologies associées. Parmi celles-ci, le diabète est un facteur de risque et de complication de la maladie. Des processus neurodégénératifs communs s'expriment dans les cellules nerveuses (neurone, glie) et dans les cellules du pancréas. Parmi les cibles communes,nous étudions au laboratoire de nouvelles molécules, qui s'avèrent d'excellents neuroprotecteurs. Le but de notre projet est de caractériser ces nouvelles molécules dans des modèles de souris présentant des symptomes Alzheimer compliqués de diabète.

Bénéfices attendus

Le projet a pour but de mesurer l'efficacité d'une molécule neuroprotectrice d'origine naturelle sur des modèles murins de maladie d'Alzheimer compliquée de diabète et permettre un développement clinique. Le projet permettra également d'établir des modèles complémentaires de comorbidité Alzheimer-diabète afin d'explorer des pistes thérapeutiques spécifiques, notamment reposant sur un molécule issue de plante.

Procédures

Les injections des molécules à tester seront faites en intrapéritonéal sur animal vigile quotidiennement pendant deux semaines (moins d'une minute). Les animaux subiront un jeûne (durée 16 h) chaque semaine durant 4 semaines. Une incision caudale sur animal vigile (anesthésie locale par une crème anesthésiante) sera faite pour prélèvements sanguins (6 gouttes de sang sur une durée de 3h avec un animal remis dans sa cage entre chaque prélèvement) une fois par semaine et durant 6 semaines pour permettre de suivre l'évolution dans le temps des altérations de la fonction pancréatique. Les autres animaux auront une chirurgie permettant l'injection d'un peptide directement dans le cerveau. Cette intervention est d'une durée de 2 minutes maximum entre le début de l'anesthésie gazeuse et la fin de l'inoculation du peptide. Ensuite, durant une semaine, les animaux recevront une injection par voie intrapéritonéale des molécules à tester une fois par jour (moins d'une minute) pendant 1 ou 7 jours. Suite à ces traitements, les capacités de mémoire des animaux seront analysées, en effectuant des tests comportementaux (entre 90 secondes et 10 minutes selon les tests).

Impact sur les animaux

La chirurgie permettant l'injection d'un peptide directement dans le cerveau afin d'induire les symptômes de la maladie d'Alzheimer se fait sous anesthésie. Cette procédure sera suivie par 7 jours d'injections intrapéritonéales qui pourra engendrer une légère douleur de courte durée et du stress chez l'animal. Le test d'évitement passif permettant d'évaluer la mémoire à long terme va délivrer un stimulus aversif au niveau des pattes de la souris.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à la fin de la procédure afin de récupérer tous les tissus d'intérêt et procéder à des tests biochimiques post- mortem.

Remplacement

L’utilisation de modèles murins de la maladie d'Alzheimer pour ce projet est indispensable car ces modèles sont le seul recours « in vivo » autre que l’humain à présenter les symptômes pathologiques de la toxicité touchant le cerveau dans une fenêtre de temps relativement courte permettant l'élaboration d'un traitement curatif plus rapidement.

Réduction

Les molécules sont testées sur une gamme de doses réduite (4 doses seulement). Les animaux subiront différents tests comportementaux de façon à mesurer différents types de mémoire . Enfin, les analyses statistiques sont optimisées de façon à limiter le nombre d'animaux par groupe (généralement 15 souris/groupe pour les tests comportementaux). Ce nombre de 15 souris par groupe a été déterminé en tenant compte de la force des tests statistiques appliqués aux réponses comportementales.

Raffinement

Nous procéderons à l’enrichissement du milieu avec un accès à des maisons en cartons et des carrés de coton afin de créer un environnement sécurisant permettant la création d'un nid. L’état des animaux sera suivi quotidiennement en suivant la courbe de poids des animaux. Après les tests comportementaux les animaux sont directement remis dans la cage d’origine afin de retrouver leur environnement sécurisant. Dans le cas où le traitement pharmacologique serait à l’origine de douleur visible ou de détresse le traitement serait immédiatement interrompu et, si nécessaire, l'animal serait retiré de l'étude. Ce sera le cas lorsque l'animal perdra 20% de son poids de départ ou lorsque celui-ci présentera des lésions cutanées signe d’un stress ou d'une agressivité vis à vis de ses congénères. Les animaux seront aussi manipulés tous les jours afin de créer une habituation diminuant ainsi le stress quotidien que peut représenter la présence de l'expérimentateur.

Choix des espèces

Les modèles de souris utilisées dans cette étude présentent rapidement les symptômes de la maladie d'Alzheimer et permettent d'obtenir des données préliminaires transférables en essai clinique. Les animaux seront utilisés à l'âge adulte soit à partir de 6 semaines. C'est à cet âge que les effets de la molécules ont été caractérisés dans les projets antérieurs