Système nerveux

Une IRM de trois heures sous anesthésie, puis deux à cinq chirurgies pouvant durer huit heures pour fixer sur le crâne un plot de contention et une chambre d'enregistrement, nettoyée ensuite trois fois par semaine. 3 macaques rhésus et 3 macaques à longue queue vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Cinq jours par semaine, la tête maintenue jusqu'à trois heures d'affilée, ils exécutent des tâches visuelles récompensées par de l'eau, leur ration quotidienne étant contrôlée pour entretenir la motivation, ce que le porteur reconnaît pouvoir provoquer soif, déshydratation et perte de poids. Les six seront réutilisés dans d'autres protocoles, le porteur expliquant qu'un animal déjà entraîné évite d'en former un nouveau.

Objectifs

L’étude de la relation entre l’anatomie et les fonctions du cerveau et plus particulièrement le lien entre la vision et les mouvements des yeux est principalement réalisée par IRM (imagerie par résonnance magnétique). Cette technique d’imagerie reste limitée par sa précision dans l’espace et le temps pour les études pour permettre de visualiser l’activité cérébrale. Afin d’améliorer sensiblement l’étude du lien entre la vision et les mouvements des yeux, un système échographique sera utilisé dans ce projet. Cette technique échographique permet de voir les flux vasculaires rapides dans les petits vaisseaux avec une meilleure précision et sensibilité que l’IRM. Notre objectif est double, comprendre le fonctionnement du lien entre la vision et les mouvements des yeux avec une précision jamais atteinte et développer des outils d’imageries performants et robustes pour qu’ils soient transférés en clinique pour le diagnostic de problèmes de traitement de l’information visuelle chez l’Homme. Afin de prouver la cohérence des résultats obtenus par imagerie échographique, nous ferons également des mesures d’enregistrement de l’activité électrique des neurones, des acquisitions par imagerie échographique et des tests de comportement sur les réflexes des mouvements des yeux.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus sont : 1- Mieux comprendre le fonctionnement du lien entre la vision et les mouvements des yeux dans son ensemble avec une précision jamais atteinte et développer des outils d’imageries performants et robustes pour qu’ils soient transférés en clinique pour le diagnostic chez l’Homme. 2- Permettre d’envisager de nouveaux essais cliniques de la technique de neuro-modulation (moduler l’activité des neurones) par ultrasons en améliorant la technique notamment dans le choix des paramètres ultrasonores. 3- Enfin la technique d’imagerie ultrasonore fonctionnelle ultrarapide a également pu montrer son intérêt sur le modèle rongeur. Le développement et la validation de cette technique chez le primate serait une étape importante en vue de son transfert en imagerie médicale chez l’homme sain et les patients.

Procédures

- Tous les animaux sont habitués aux différents dispositifs permettant de diminuer le stress de l’animal afin de réaliser les tâches comportementales, au personnel- Imagerie à Résonnance Magnétique (IRM) : Les 6 animaux réaliseront une seule IRM avec une durée d’anesthésie d’environ 3 heures et 2h environ d’acquisition. - Afin de pouvoir maintenir la tête lors des enregistrements et permettre l’acquisition de données, les 6 animaux sont implantés sous anesthésie générale avec un dispositif placé sur la tête permettant la fixation de la tête et d’une chambre permettant les enregistrements. La mise en place de la chambre facilite l’enregistrement de l’activité cérébrale. Les animaux auront au minimum 2 chirurgies sous anesthésie générale (1 pour la mise en place du plot de fixation de la tête, 1 pour la mise en place de la chambre) et au maximum 5 chirurgies (les deux précédentes, 1 pour la mise en place d’une deuxième chambre et 2 pour la remise en place du dispositif et pour entretiens des implants, si nécessaire). La remise en place du système sera réalisée après l’accord vétérinaire. Ces chirurgies seront réalisées sous anesthésie générale pour une durée maximale de 8 heures. - Les dispositifs implantés (chambres et plot de fixation) seront nettoyés au minimum 3 fois par semaine pour chaque animal. - Les 6 animaux implantés participeront à des enregistrements de l’activité du cerveau et des neurones pendant qu’ils réaliseront des tâches visuelles. Ces enregistrements dureront au maximum 3 heures et auront lieu quotidiennement, 5 fois par semaine maximum. ***Ces enregistrements pourront nécessiter une injection intraveineuse d'un agent de contraste, après habituation de l'animal via un renforcement positif, et après avoir défini l'ensemble des paramètres d'enregistrement lors d'anesthésies dediées (duree 2h, maximum 10 par animal)***. Afin de favoriser la motivation des animaux pendant les tâches comportementales, ceux-ci seront récompensés à l’aide d’une récompense hydrique qui constituera une partie de leur apport journalier en eau. Les animaux ne réalisent pas de tâches comportementales le week-end, ils ont un apport en eau plus important dans leur hébergement. Un retour progressif à un apport à volonté est effectué 2 fois une semaine chaque année. Une surveillance quotidienne des apports en eau de chaque animal est réalisée afin de toujours couvrir leur besoin afin de garantir un bon état d’hydratation et les maintenir en bonne santé.

Impact sur les animaux

- Des douleurs liées à la chirurgie, après la chirurgie de la pose de l’implant et des chambres d’enregistrements. - Un stress/ contrainte peut être induit lors des séances d'électrophysiologie où l'animal doit être fixé jusqu’à 3h. - Des risques d'infection sur les implants et lors de l'introduction des électrodes peuvent se produire. - La restriction hydrique peut également induire un stress pour l’animal, entrainer une sensation de soif, de la déshydratation, une perte de poids. - Le stress de l’hébergement en captivité peut également être induit chez les animaux notamment pendant la première période d’acclimatation au laboratoire. - Les risques de perte d’implant peuvent survenir suite à un rejet du matériel bio-compatible provoquant chez certains animaux une réponse inflammatoire chronique et un rejet du matériel chirurgical. - Les risques liés à l’anesthésie peuvent également survenir lors des premières anesthésies et spécificité de réponse aux produits pharmacologiques et/ou lors du réveil. Les risques anesthésiques existent pour toutes les interventions qui vont nécessiter cette mise en place, avec la tolérance/réaction individuelle aux molécules utilisées ainsi que la capacité de la récupération propre à chaque animal.

Devenir

Tous les animaux (total 6 individus) seront réutilisés pour poursuivre l’acquisition de données sur ce sujet de recherche afin de privilégier la réutilisation d’un animal déjà entrainé par rapport à un animal naïf (réduction du nombre d’animaux). Cette réutilisation se fera en accord avec l’équipe vétérinaire et dépendra de l’état de bien-être des animaux.

Remplacement

L’étude portant sur un système intégré dans sa globalité (de l’œil jusqu’au cerveau), il est impossible de remplacer les animaux par des cultures de cellules des simulations ou autres. Des comportements cognitifs complexes impliquant des tâches d’inhibitions du mouvement nécessitant le cortex pré-frontal (zone avant du cerveau) sont très difficilement voire jamais atteints chez les rongeurs ou d’autres petits primates non humains (par exemple : tâche où les individus doivent regarder dans la direction opposée à un point en inhibant le mouvement réflexe d’observer le point).

Réduction

Les normes de publication indiquent que les données doivent être reproduites pour au minimum 2 animaux (parfois jusqu’à 4 si les mesures intra-individuelles sont trop importantes) afin d'obtenir des données fiables et interprétables. Les animaux participeront à plusieurs tâches comportementales (la quantité de données récoltées par animal permet un traitement statistique en s’affranchissant du petit nombre d’individu) et/ou de perturbations d'activité cérébrale cela afin de limiter le nombre d'animaux. La participation des animaux aux protocoles de recherche peut également permettre la stimulation sensorielle et motrice ainsi que participer à une occupation interactive journalière. Le nombre d’animaux nécessaire pour cette étude a été déterminé par des calculs de puissance. Il a été ainsi établi que 6 animaux seront essentiels pour la réalisation de ce projet.

Raffinement

L’état de bien-être de l’animal est primordial et à la moindre anomalie des mesures seront prises pour le restaurer. Des points limites ont été établis pour assurer une prise de décision rapide et efficace pour s’assurer que le bien-être de l’animal sera là aussi toujours préservé. L’hébergement, l’enrichissement ainsi qu’une alimentation adaptée seront mis en place pour stimuler les animaux et limiter les comportements anormaux (stéréotypies, prostration…). Une sortie du protocole est possible si le comportement de l’animal est contraire à son bien-être. L’entraînement régulier par renforcement positif permettra d’instaurer une routine limitant les contentions et le stress lors des manipulations et les tâches demandées. Les hébergements en paire sont favorisés, à défaut l’animal sera seul en conservant les contacts visuels/olfactifs avec ses congénères. Le contrôle hydrique sera adapté à la demande de chaque animal en ayant intégré les particularités individuelles. Lors des chirurgies et IRM : ces interventions sont réalisées sous anesthésie générale avec la mise en place d’anti-douleurs adaptés (avant, pendant et après, une réévaluation avec le vétérinaire est disponible si besoin) lors des anesthésies, une surveillance des constances physiologiques (rythmes cardiaque et respiratoire, température…) est toujours mise en place Le dispositif implanté sera le plus petit possible pour le confort de l’animal et limiter la gêne. Il sera posé dans des règles strictes d’asepsie. Le post-opératoire sera surveillé avec une ide à l’alimentation pour faciliter la récupération, des enrichissements et une taille de la cage adaptés pour stimuler l’animal et faciliter les déplacements. La récupération complète est vérifiée avant la poursuite du projet. Une surveillance renforcée des comportements alimentaires, individuels et sociaux. Sur le plan scientifique : - l’acquisition de données sera arrêtée lorsque la quantité obtenue sera statistiquement suffisante pour les analyses pour utiliser les animaux pour ce qui est strictement nécessaire.

Choix des espèces

Les fonctions cérébrales et l’anatomie du système oculomoteur chez le macaque (Macaca mulatta et Macaca fascicularis) se rapprochent fortement de celles de l’Homme, en plus des similitudes cognitives. Notre objectif est d’améliorer, chez l’Homme, les outils d’imagerie ainsi que les connaissances biologiques nécessaires pour le diagnostic des pathologies cérébrales. Pour cela, nous utilisons l’imagerie de l’activité du cortex frontal (zone avant du cerveau) et de modulation de l’activité des neurones avec des ultrasons via la rétine (œil). Ce modèle animal est le plus pertinent car le plus proche et transférable à l’homme. Concernant le système cérébral gérant les mouvements des yeux, aucune donnée comportementale et/ou physiologique n’ont mis en évidence une différence associée au sexe des animaux quant au contrôle des mouvements des yeux chez les primates. Par ailleurs, le nombre d’animaux de chaque espèce est dépendant des disponibilités d’approvisionnement (3 par espèce). Les animaux de ce projet sont adultes ou jeunes adultes (superieur à 3ans) car à cet âge, le cerveau est suffisamment mature. Les animaux sont tous identifiables par un tatouage réalisé par l’éleveur après leur naissance qui est obligatoire pour ces espèces et leur exportations/importations au laboratoire.

Deux à trois cents ovocytes prélevés chaque semaine sur un même animal, six prélèvements par an pendant cinq ans : 30 xénopes vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque prélèvement passe par une immersion de quarante à quarante-cinq minutes dans un bain anesthésiant, une incision abdominale d'un centimètre et demi et une suture. Le porteur qualifie la technique de méthode alternative permettant de s'affranchir de manipulations in vivo, alors que ces manipulations sont exactement ce qu'il décrit, l'ovocyte servant de support pour étudier des canaux ioniques humains. Le champ structuré du devenir ne déclare aucun animal maintenu en vie, quand le texte indique que les xénopes sont réutilisées d'un projet à l'autre et gardées jusqu'à leur mort naturelle.

Objectifs

​L’ovocyte de xénope est un système d’expression hétérologue pour des études fonctionnelles in vitro, des canaux ioniques humains ou de mammifères. Cette technique d‘étude fonctionnelle in vitro est centrale dans nos thématiques de recherche dont les objectifs principaux sont les suivants : ​études pharmacologiques cellulaires et moléculaires, caractérisation du mode d’action de ligands naturels ou synthétiquec des canaux ioniques, étude du mode d’action de médicaments ou de toxines, caractérisation de l’impact fonctionnel par approche in vitro de variants de gènes de canaux ioniques, suspectés associés à des pathologies humaines ,​ études des relations structure-fonction des canaux ioniques (caractérisation des domaines fonctionnels), études toxicologiques (évaluation de l‘activité de certaines substances ou molécules sur des canaux ioniques, reflétant leur toxicité au niveau cellulaire, neurotoxicité, cardiotoxicité...).​

Bénéfices attendus

Ce projet va permettre d'apporter des connaissances scientifiques dans différents domaines, tels que : 1) mieux comprendre les effets bénéfiques ou averses d'agents pharmacologiques actifs sur les canaux ioniques (médicaments, toxines, toxiques...), 2) caractériser les impacts fonctionnels par une approche alternative, de mutations desgènes de canaux ioniques causant des pathologies parfois graves. La procédure de prélèvement des ovocytes a peu d'impact sur la santé des xénopes, étant donné les précautions prises, telles que l'anesthésie, le repos entre chaque prélèvement et l'attention des expérimentateurs vis-à-vis des animaux. Selon notre expérience dans le domaine, le comportement des xénopes en captivité dans un environnement enrichi n'est pas affecté par la procédure.

Procédures

Les xénopes sont anesthésiés par immersion dans un bain d'anesthésie pendant 40 à 45 minutes. Après induction de l’anesthésie, une incision de 1,5 cm maximum est réalisée pour accéder aux sacs ovariens. Après prélèvement, la plaie est suturée immédiatement; cette étape durant environ 10 minutes. Pour préserver la bonne santé des animaux, chaque prélèvement sur un même animal doit être espacé de 2 mois.

Impact sur les animaux

La procédure de prélèvement des ovocytes a peu d'impact sur la santé des xénopes, étant donné les précautions prises, telles que l'anesthésie, le repos entre chaque prélèvement et l'attention des expérimentateurs vis-à-vis des animaux. Selon notre expérience dans le domaine, le comportement des xénopes en captivité dans un environnement enrichi n'est pas affecté par la procédure.

Devenir

200-300 ovocytes prélevés sur un animal par semaine. Après prélèvement, les xénopes sont mis au repos pendant 2 mois. Nous avons une utilisation continue des xénopes : avec 6 prélèvements annuels, durant 5 ans . Les xénopes ont une longévité de 15 ans en moyenne.

Remplacement

​L’ovocyte de xénope est un système d’expression hétérologue pour des études fonctionnelles in vitro, des canaux ioniques humains ou de mammifères. Cette technique d‘étude fonctionnelle in vitro est incontournable pour l’investigation au niveau cellulaire et moléculaire des effets toxiques, du mode d’action de médicaments, voire de l’impact de certains variants sur la fonction des canaux ioniques. ​Cette technique permet également de s’affranchir de manipulations in vivo coûteuses en animaux. Cette approche constitue une méthode alternative à l’utilisation des rongeurs pour réaliser des cultures primaires de neurones, par exemple. ​

Réduction

​Pour un projet visant à caractériser l’impact fonctionnel d’une mutation ou l’effet d’une molécule, les analyses statistiques nécessitent l’utilisation de 10 ovocytes par mutation ou concentration de molécule, provenant de 3 animaux différents. Etant données nos activités de recherche, ceci implique l'utilisation de 30 xénopes pour 5 ans au maximum. Les animaux sont préservés jusqu‘à leur mort naturelle. Ils sont utilisés ou réutilisés dans plusieurs projets. Un vétérinaire les examine 1 fois par an au minimum pour vérifier leur état de santé.

Raffinement

​​Le prélèvement est réalisé sur des animaux anesthésiés. Les sutures sont réalisées avec un fil résorbable. Les animaux sont ensuite réveillés progressivement par rinçage à l’eau claire, et surveillés avant d’être replacés avec leurs congénères. Les aquariums sont enrichis avec des pots en terre cuite qui leurs servent de cachettes.

Choix des espèces

Les xénopes produisent des ovocytes de grande taille (1-1,5 mm) qui facilitent leur transfection par injection intracellulaire de matériel génétique. L’ovocyte de xénope constitue un système d’expression hétérologue incontournable pour les études électrophysiologiques et pharmacologiques des récepteurs et des canaux ioniques, depuis 1990. L’utilisation de ce modèle cellulaire est très pratique pour des études pharmacologiques in vitro, assez simple à réaliser, et permet de s’affranchir de manipulations in vivo coûteuses en animaux. Les animaux sont utilisés au stade adulte (1-5 ans) correspondant à un stade où les femelles produisent de nombreux ovocytes.

Tuées à l'issue pour prélever leur cerveau, 120 souris rendues dépressives vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Le protocole les expose pendant trois semaines à deux stress modérés par jour, puis mesure leur "comportement de désespoir" en les suspendant par la queue, deux fois à un mois d'intervalle. Après une chirurgie du crâne de deux heures, chacune vit seule, reliée par un câble au système d'enregistrement du sommeil, et subit deux privations de sommeil paradoxal. Quatre tests comportementaux sont annoncés pour vérifier que les animaux sont bien dépressifs, sans que le porteur précise lesquels, et le bénéfice attendu reste au conditionnel, de nouveaux traitements pour les 30 % de patients qui résistent aux antidépresseurs actuels.

Objectifs

La dépression est un trouble de l’humeur très répandu, 1 personne sur 5 en souffrira dans sa vie. Les mécanismes à l’origine de cette pathologie restent mal connus. Le sommeil paradoxal (SP) jouerait un rôle clef dans sa mise en place et son maintien, les patients dépressifs montrant des augmentations de SP, sans que l’on sache pourquoi. Dans ce contexte, notre projet vise à étudier le SP dans un modèle de dépression chez la souris. Dans une précédente étude ex vivo, nous avons montré qu’il y avait une zone du cerveau (cortex rétrosplénial) qui présentait moins d’activation pendant le SP chez les souris une fois dépressives comparés aux contrôles. L’idée de ce projet est d’abord de vérifier les résultats déjà obtenus en enregistrant directement in vivo l’activité des neurones du cortex rétrosplénial pendant l’installation de la dépression des souris. Ensuite, nous voulons activer artificiellement les neurones du rétrosplénial pendant le SP puisqu'ils diminuent leur activité à cause de la dépression. Pour ce faire, nous utiliserons de l'optogénétique pour grâce à des stimulations lumineuses tenter de rétablir un phénotype contrôle chez des animaux dépressifs.

Bénéfices attendus

Le lien entre SP et dépression a été établi depuis plus de quarante ans. Il a ainsi été rapporté chez les patients dépressifs une augmentation des quantités de SP au cours de la nuit et du nombre de mouvements rapides des yeux caractéristiques à ce stade. Ces résultats ont été confirmés sur les modèles rongeurs de dépression. Nos résultats pourraient ouvrir des perspectives nouvelles en remettant au gout du jour l’impact délétère du SP dans la dépression, ouvrant également la porte au développement de nouveaux traitements plus ciblés dans un contexte où 30% des patients résistent aux antidépresseurs actuels.

Procédures

Les animaux transgéniques subissent un prélèvement du bout de la queue à 6 jour pour vérifier leur fond génétique, ce qui génère une légère douleur de très courte durée. Chirurgie/anesthésie et récupération postopératoire : Les animaux sont anesthésiés et des prototoles avec traitement anti-douleur pré et post-chirurgie sont prévus (Durée de la chirurgie : 2 heures). Privation et rebond (hypersomnie) de sommeil paradoxal : Permet d’obtenir plus de sommeil paradoxal sur une période de 2/3 heures. Deux privations/rebond sont prévues à un mois d’intervalle. Tests comportementaux : Pour vérifier que les animaux sont bien dépressifs, 4 tests comportementaux sont réalisés. Isolement durant le protocole : Les souris étant reliées par un câble au système d’acquisition sur ordinateur pour enregistrement les signaux de sommeil elles devront être logées dans des cages individuels pendant la durée du protocole. Modèle de dépression : Le modèle de stress utilisé permettant d’induire un état dépressif consiste en l’exposition des animaux pendant 3 semaines à deux stress modérés par jour. Suspension Tail Test : Effet stressant de courte durée (5 min) pour pouvoir mesurer le comportement de désespoir des animaux, symptôme essentiel de la dépression. Les animaux sont testés deux fois à un mois d’intervalle.

Impact sur les animaux

Premier effet indésirable concernant la chirurgie. Nous observons dans de très rares cas une hémorragie, une hypothermie très sévère ou une absence de réveil après une demi-heure de fin d’anesthésie. Les animaux sont suivis ensuite en post-op tous les jours et une fiche de score est remplie et si un animal montre des douleurs trop importantes il est mis à mort. Ensuite, concernant le protocole de dépression, nous n’attendons pas de dégradation sévère de l’état général des animaux. Néanmoins, face à des signes de souffrance physique évidents (automutilation, stéréotypie sévère, anorexie) les animaux sont mis à mort immédiatement. Branchement et câblage des animaux : les animaux sont « branchés » pendant toute la durée de l’expérience, via un câble qui s’insère sans difficulté dans l’implant localisé sur leur tête. Les animaux ne ressentent aucune douleur et le branchement ne nécessite pas de contention, puisque les animaux seront habitués à la manipulation. Le câble est relié à une plaque tournante au sommet de la cage, ce qui permet de suivre les moindres mouvements des animaux et un peu de mou est laissé pour que l’animal ne ressentent pas le poids du fil. Rebond et privation : il a été mesuré que la privation sélective de sommeil paradoxal n’entraînait pas de changement du sommeil lent des animaux. De plus, les dosages de corticostérone ont montré que les animaux n’étaient pas stressés après 48 heures de privation.

Devenir

Tous les animaux de la procédure expérimentale subiront l’euthanasie pour collecter les cerveaux afin de réaliser des études d’immunohistochimies.

Remplacement

Les alternatives actuelles telles que la modélisation sur culture cellulaire ne sont pas encore suffisamment développées pour permettre une analyse poussée des phases de sommeil et des mécanismes neuronaux. De plus, nous proposons ici d’induire volontairement la dépression chez des souris avant de tenter de réverser le phénotype dépressif via les stimulations lumineuses de neurones transfectés avec des virus. Par conséquent, nous utiliseront ici des souris génétiquement modifiées pour analyser ces processus neurobiologiques complexes

Réduction

La détermination de la taille de l’échantillon nécessaire est absolument cruciale pour assurer la reproductibilité et la véracité des résultats ainsi obtenus. Des données préalablement obtenues dans l’équipe ont été utilisées pour calculer la variabilité interindividuelle des phénotypes dépressifs ainsi obtenus par protocole de stress chronique. Ce qui donne un total de 90 animaux.

Raffinement

Les animaux avant expérimentation sont hébergés dans des conditions optimales, 3 ou 4 par cage pour permettre des interactions sociales normales. Des enrichissements environnementaux systématiques sont mis en place pour améliorer leur bien-être, tel que des carrés de coton à déchirer pour faire le nid ou encore des bâtonnets de bois à ronger. Les conditions d’élevages, les soins post-traitements et les différentes étapes de la procédure sont contrôlés pour réduire ou éliminer toute détresse potentielle. De plus, nous avons récemment substitué à l’injection intrapéritonéale classiquement utilisée une ingestion orale volontaire (sans gavage) des molécules d'intérrêt à donner aux souris qui sont dissoutes dans de la gelée aromatisée à la fraise. Une fiche de suivi est également tenue pour chaque animal, depuis la chirurgie implantatoire jusqu’à l’euthanasie. Pour le bien-être de l’animal et pour les besoins d’analyse de l’expérience, le poids et l’état du pelage sont mesurés quotidiennement. Un animal qui dépasse un des points limites détaillés dans les procédures expérimentales est retiré des échantillons expérimentaux et euthanasié sans délai.

Choix des espèces

Notre projet repose sur l’utilisation d’une lignée de souris doublement transgénique. Les modèles murins sont fréquemment utilisés pour modéliser la dépression humaine étant donné la pertinence et similitude des symptômes observés. Le phénotype dépressif ainsi créé chez les animaux sont sensibles aux mêmes antidépresseurs que ceux utilisés chez les patients dépressifs. Cette combinaison de modèle de souris dépressive et transgénique constitue une approche innovante et puissante pour étudier les mécanismes physio-pathologiques complexes sous-jacents de la dépression. Nous utiliserons des animaux âgés de 8-10 semaines, puisqu’il s’agit de l’âge de référence le plus communément utilisé pour le modèle de dépression et le cycle veille-sommeil est mature chez ces jeunes adultes.

Jusqu'à deux chirurgies crâniennes de une à cinq heures par animal, cinq semaines de restriction hydrique et trois mois de restriction alimentaire, pour 800 souris utilisées dans des procédures d'un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Des électrodes implantées dans le cerveau enregistrent l'activité neuronale pendant que les souris cherchent une récompense en eau ou en nourriture, la tête parfois maintenue fixe près d'une source d'odeur. Le porteur signale que les souris modèles de la maladie d'Alzheimer utilisées ici présentent parfois des crises d'épilepsie. L'arrêt des séances est fixé par la dégradation des signaux enregistrés, en général au bout de trois mois, le porteur expliquant vouloir maximiser les données obtenues par animal.

Objectifs

La capacité de former des associations entre des stimuli sensoriels spécifiques et des informations vitales constitue une fonction centrale de la mémoire : elle permet à l’organisme d’adapter ses comportements en fonction de son vécu. L’odorat est une modalité sensorielle majeure chez les rongeurs, nécessaire à l’établissement de comportements cruciaux pour la survie de l’individu (alimentation, reproduction, interactions sociales…). La signification associée aux odeurs rencontrées, qui permet la production de comportements adaptés, est très souvent apprise par expérience. Notre projet a pour but d’identifier les substrats neurophysiologiques qui permettent la formation de traces mnésiques olfactives en conditions physiologiques et pathologiques. Il vise notamment à comprendre le rôle des odeurs dans la mémoire spatiale et la mémoire sociale. Ces deux types de mémoire étant fortement impactés chez les patients touchés par la maladie d’Alzheimer (chez qui des défauts d’olfaction précèdent souvent l’arrivée des symptômes cognitifs) notre étude présente un intérêt pour la santé humaine.

Bénéfices attendus

Notre projet qui vise à comprendre le rôle des odeurs dans la mémoire spatiale et la mémoire sociale ainsi que les mécanismes neuronaux impliqués. Ces deux types de mémoire sont fortement impactés chez les patients touchés par la maladie d’Alzheimer et il a été montré que des défauts d’olfaction précèdent souvent l’arrivée des symptômes cognitifs associés à cette maladie. Ce projet apportera donc des éléments essentiels pour la compréhension du fonctionnement du cerveau en conditions normales mais aussi pathologiques. Une telle compréhension contribuera ainsi, sur le long terme, à améliorer la santé humaine dans nos sociétés vieillissantes.

Procédures

Les souris seront utilisées lors de tâches comportementales en présence d’odeurs. Elles seront notamment entraînées à associer une odeur et une récompense ou bien une odeur et une trajectoire dans une arène. L’apport en eau ou en nourriture des souris entraînées sera contrôlé pour garantir leur motivation à réaliser les tâches. Cependant, les souris seront pesées quotidiennement (

Impact sur les animaux

Dans cette étude, certaines souris seront soumises à des tests comportementaux de mémoire dans lesquels elles devront trouver une récompense hydrique. Dans ce cas, pour les motiver à effectuer ces tâches, la totalité de l'apport hydrique quotidien nécessaire aux souris sera fournie pendant les tests comportementaux. Dans un autre type de tâches, un apport de nourriture contrôlé permettra également d’augmenter la motivation des souris qui devront alors trouver des sources de nourriture appétitives dans l’arène de comportement. Le fait de ne pas avoir un accès libre à la nourriture ou à la boisson pendant une partie de la journée peut légèrement incommoder les souris. Pour pouvoir enregistrer l’activité des neurones dans les souris, nous utiliserons des électrodes très fines placées au préalable dans les régions cérébrales impliquées. L’identification et l’étude du rôle de certains sous-types de neurones nécessitera de faire exprimer des molécules spécifiques dans le cerveau des souris adultes grâce à l’expression d’adénovirus injectés aussi au préalable. Le placement des implants et les injections cérébrales seront réalisés lors de chirurgies qui pourraient entraîner des douleurs légères sans anesthésie, analgésie et soins post-opératoires adaptés. Les souris pourront ensuite être connectées via un câble fin au système d’enregistrement ce qui peut générer une légère gêne. De plus, les odeurs étant très volatiles, il nous faudra maintenir la tête des souris proches de la source d’odeurs dans certaines expériences, en réalisant une fixation de leur tête limitée dans la durée. La contention qui en résulte peut stresser légèrement les animaux mais n’induit pas de douleur. Enfin, les souris modèles de la maladie d’Alzheimer, nécessaires à l’étude de la pathologie humaine, présentent parfois des crises d’épilepsie qui seront surveillées attentivement.

Devenir

L’euthanasie des animaux en fin d’expérimentation sera nécessaire pour prélever leur cerveau et faire l’analyse post-mortem des tissus cérébraux. Cette procédure sera réalisée par des expérimentateurs compétents et soucieux du bien-être animal, sous anesthésie profonde avec le degré d’analgésie recommandé par les services vétérinaires. La mise à mort sera ainsi indolore pour les animaux, avec une perte de conscience rapide. Ceci concerne les souris adultes dans lesquels des enregistrements valides auront été menés. Les souris pour lesquels la première chirurgie n’aurait pas fonctionné de par sa complexité (ex : canule nasale bouchée) ou les souris qui auraient atteint les points limites généraux seront euthanasiées.

Remplacement

Ce projet vise à comprendre les mécanismes qui sous-tendent une fonction cognitive complexe : la formation des traces mnésiques olfactives à l’échelle du cerveau entier. Le cerveau doit donc être intact pour que les connections entre les différentes aires cérébrales soient maintenues et que nous puissions étudier leur interactions réciproques. De plus, nous étudions le fonctionnement des circuits neuronaux alors même que le sujet est en train d’apprendre : il nous faut donc travailler avec des animaux vivants et vigiles. Pour ces raisons, il nous est impossible de conduire cette étude in vitro sur des cultures de neurones dissociés. Enfin, dans l’état des connaissances actuelles, les questions que nous adressons ne peuvent pas être réalisées in silico.

Réduction

Le nombre d’animaux requis (800 sur 5 ans) sera restreint grâce aux méthodes d’enregistrement utilisées qui permettent de collecter des données extrêmement riches en information (> 100 neurones enregistrés simultanément par session), plusieurs jours durant. Nous utiliserons cependant des études pilotes pour raffiner nos protocoles et ainsi éviter de collecter des données inexploitables (mauvaises coordonnées stéréotaxiques, variabilité comportementale…) tout en limitant leur variance. L’estimation du nombre d’animaux nécessaires ne peut se baser sur une étude de puissance statistique car notre étude ne vise pas à comparer des groupes d’animaux, mais des neurones individuels via de nombreux tests indépendants. Le nombre d’animaux dépendra du nombre de neurones que nous réussirons à enregistrer à chaque expérience. Enfin, nous utiliserons autant que possible des lignées consanguines ou congéniques pour limiter la variabilité liée la diversité allélique.

Raffinement

Nos souris seront hébergées en portoir ventilé, dans des conditions qui favorisent l’expression de leurs comportements naturels : petits groupes sociaux (maximum 5 souris par cage) au moins jusqu’au début des tests comportementaux, cages enrichies d’éléments permettant de construire un nid (carré de coton, petites maisons en carton, frisures de papier kraft) ou de favoriser l’exploration (jouets). Les animaux seront acclimatés à leurs lieux d’hébergement/expérimentation et habitués de manière progressive aux expériences qu’ils vont rencontrer (notamment la contention et l’interaction avec l’expérimentateur pour éviter le stress). Le bien-être de chaque animal sera évalué quotidiennement et une fiche de suivi individuel sera créée pour chaque procédure expérimentale. A partir des critères et des points limites définis dans ces fiches, les expérimentateurs et techniciens animaliers seront informés des procédures à suivre pour limiter toute souffrance chez nos souris. L’utilisation de substances anesthésie et analgésique permettront de supprimer la souffrance des animaux lors des procédures qui le nécessitent.

Choix des espèces

Notre but est de comprendre les mécanismes impliqués dans une fonction cognitive complexe, à l’échelle de large ensemble neuronaux. Nous avons choisi le modèle souris car le cerveau murin présente de grandes similarités avec d’autres cerveaux de Mammifères, y compris l’Homme, et permet d’étudier les fonctions cognitives qui nous intéressent. Ce modèle est d’autant plus pertinent que l’olfaction est une modalité sensorielle essentielle chez les rongeurs qui joue un rôle fondamental pour leur survie. Le projet sera réalisé sur des animaux de 2-6 mois ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte où l’animal est en pleine capacité d’apprentissage. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d'injection et/ou d’implantation.