Système nerveux

458 souris pour une injection unique sous la plante de la patte chacune, suivie de tests de douleur mécanique et thermique dans les vingt-quatre heures. Toutes sont tuées, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, puis disséquées pour prélever la patte, les ganglions rachidiens et la moelle épinière. Le porteur explique que le seuil de douleur est "repéré par l'animal lui-même", le test s'arrêtant au retrait de la patte. L'objet réel est de savoir si des vésicules issues de tumeurs pancréatiques rendent les nerfs plus sensibles, question posée loin en amont de toute application pour les malades.

Objectifs

Le cancer du pancréas est de très mauvais pronostic et douloureux. Nous pensons que cette douleur est causée par des substances libérées par les cellules cancéreuses. Ces substances peuvent rendre les nerfs plus sensibles à la douleur et favoriser leur croissance dans la tumeur, mais leur nature exacte demeure inconnue. Nous proposons d’étudier le rôle potentiel des petites vésicules extracellulaires (appelées EVs) dans ce processus. Notre objectif est de caractériser l’impact des EVs produites par les cellules cancéreuses pancréatiques sur les réseaux nerveux et la douleur associée au cancer chez les souris. Pour cela, nous voulons observer si l'injection de ces EVs dans les pattes des souris provoque : 1/ Une sensibilité accrue à la douleur 2/ Des changements dans l’innervation de la patte 3/ Une activation des circuits neuronaux impliqués dans la douleur.

Bénéfices attendus

A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale et la génération de la douleur dans le cancer. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer et de la douleur afin d’améliorer la qualité de vie des patients.

Procédures

Les animaux auront une injection intraplantaire unique avant de subir les tests de comportements pour évaluer la douleur.

Impact sur les animaux

Les injections intraplantaires peuvent causer de la douleur suite à la pénétration de la peau avec l’aiguille au moment de l’injection. Les souris peuvent donc développer un stress, pour éviter cela, elles seront anesthésiées sous isoflurane. Pour les tests de comportement, le stimulus mécanique ou thermique peut provoquer de la douleur qui sera visualisée par un retrait de la patte de l’animal. Le point limite (seuil nociceptif) est donc repéré par l’animal lui-même. Le test est arrêté au retrait de la patte de l’animal donc on ne dépassera pas le seuil. Les expériences sont arrêtées au maximum à 24h post-injection. Une grille de score servira de repère pour vérifier l’état de l’animal.

Devenir

Ces animaux ne peuvent être réutilisés pour d’autres procédures. Par conséquent, à la fin de chaque procédure, les animaux seront mis à mort puis disséqués pour récupérer différents organes (patte, les ganglions de la racine dorsale et la moelle épinière) afin d’être analysés.

Remplacement

Notre recherche vise à comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires de la douleur associée au cancer. Nous explorons l'idée que les petites vésicules (EVs) provenant des tumeurs pancréatiques pourraient causer une sensibilité accrue à la douleur en modifiant les nerfs dans la tumeur. Pour étudier cette question, notre projet nécessite l’utilisation d’animaux et ne peut recourir à des stratégies de remplacement par des méthodes in-vitro. En effet, la douleur ne peut être dissociée du système physiologique global de l’animal. Ainsi, l’observation du comportement animal est nécessaire pour comprendre comment la douleur est perçue et transmise au cerveau. Cette approche est d’autant plus pertinente que des différences comportementales entre mâles et femelles peuvent également influencer la façon dont les signaux sensoriels sont traités à différents niveaux dans le corps. En résumé, l'utilisation de souris est essentielle pour étudier les causes pathophysiologiques de la douleur cancéreuse et mener à bien notre projet de recherche.

Réduction

Nous mettrons en place des stratégies pour limiter l'utilisation d'animaux supplémentaires tout en collectant suffisamment de données pour répondre à nos questions de recherche. Cela implique de définir précisément nos protocoles comportementaux et de choisir judicieusement nos contrôles. Nous utiliserons également des outils statistiques pour estimer le nombre optimal d'animaux nécessaires. En contrôlant les paramètres environnementaux et en surveillant la santé des animaux, nous réduirons la variabilité des résultats expérimentaux et, par conséquent, le nombre d'animaux nécessaires pour obtenir des résultats statistiquement significatifs. Ces procédures sont bien établies dans notre institut et nos chercheurs sont expérimentés dans leur mise en œuvre et dans l'évaluation de l'impact sur le bien-être des animaux. En optimisant notre plan expérimental et en analysant attentivement le nombre d'animaux requis, nous minimisons ainsi l'utilisation d'animaux tout en maintenant la qualité et la validité de nos résultats scientifiques.

Raffinement

Les souris utilisées dans notre projet seront élevées en groupes sociaux et bénéficieront d'un environnement enrichi avec du coton et/ou un dôme pour assurer leur bien-être et favoriser un comportement normal, réduisant ainsi au maximum leur stress. L'élevage des souris est effectué dans notre établissement agréé par une équipe de cinq personnes dédiées à leur organisation et leur entretien. Nous contrôlons quotidiennement la santé et les conditions environnementales des animaux pour assurer leur bien-être. Les procédures expérimentales seront minutieusement planifiées, y compris la disponibilité des locaux, du matériel et la période d'acclimatation des animaux, afin de minimiser leur stress et d'assurer la fiabilité des résultats. Avant les tests comportementaux, les souris seront habituées pendant 45 minutes dans l'enceinte pour s'adapter à leur environnement. Nous établirons également des points limites les plus précoces possibles en fonction des tests comportementaux utilisés. Toutes ces mesures sont mises en place dans le but de réduire, voire d'éliminer, la souffrance des animaux et d'assurer leur bien-être tout au long de l'étude.

Choix des espèces

Chez la souris, les populations de neurones spécialisés dans l’intégration des stimuli douloureux sont similaires à celles décrites chez l’homme. Travaillant sur la physiologie d’animaux adultes, nos tests comportementaux et nos analyses moléculaires seront réalisés sur des souris âgées de 8 à 12 semaines.

Deux chirurgies, d'une heure puis d'une heure quarante-cinq, pour implanter des électrodes dans le cerveau, une électrode sous la peau du thorax et une canule dans le nez. 128 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour l'analyse histologique de leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles passent ensuite jusqu'à trois heures par jour la tête fixée sur une roue pendant une semaine, certaines étant entraînées une à deux heures par jour pendant plusieurs mois à une tâche auditive, avec des jets d'air et des goûts amers comme stimuli aversifs. Une partie reçoit des substances qui augmentent l'anxiété ou la sensation de panique, que le porteur ne nomme pas, en indiquant seulement que la hausse du stress dure "au maximum quelques heures".

Objectifs

La perception, implicite ou explicite, que nous avons de l’état de notre corps repose sur un sens, appelé interoception. Ce sens participe à réguler nos états affectifs (émotionnels ou motivationnels) et donc affecte les décisions que nous prenons. En conséquence, une dérégulation de cette perception peut être liée à des maladies psychiatriques. Cependant les bases neuronales qui nous donnent accès à l’interoception sont mal connues. Nous ne savons pas par exemple quelle région de notre cerveau représente notre fréquence cardiaque ou respiratoire et avec quelle précision. L’objectif de ce projet est d’une part d’étudier comment le cerveau représente ces informations. D’autre part, nous testerons si cette représentation est modifiée dans des conditions liées à l’anxiété ou les crises de panique. Pour ce faire nous administrerons des agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie qui augmentent ou diminuent respectivement le niveau d’anxiété ou de panique de l’animal. Finalement, nous évaluerons ci cette représentation est modifiée pendant la prise de décision. Pendant ces expériences, le nombre d’animaux nécessaire et le nombre de sessions d’enregistrement seront réduits grâce à l’utilisation de systèmes d’enregistrement de point permettant d’acquérir une grande quantité de données en peu de sessions. De plus, nous raffinerons le protocole en utilisant des traitement anesthésiques et analgésiques adaptés, administrés selon des points limites clairement établis à l’avance et évalués à l’aide de grilles d’évaluation. Nous développerons et calibrerons des méthodes d’enregistrement non-invasifs pour la respiration qui pourront aussi être utile pour la communauté plus largement. A chaque étape, puisque nous enregistrons non seulement le comportement de l’animal mais aussi son état corporel, nous disposerons d’un suivi fin et en temps réel de son état. Ce projet permettra de mieux comprendre notre capacité à percevoir notre corps et contribueront, à plus long terme, à la meilleure compréhension de la participation de notre corps aux états affectifs et à établir comment cette perception intéroceptive peut être dérégulée.

Bénéfices attendus

Il existe de nombreuses hypothèses suggérant que notre corps influence notre état émotionnel et donc les décisions que nous prenons. Ceci découle en partie de l’expérience subjective du lien très fort entre notre état émotionnel et notre corps mais également de mesures en laboratoire qui ont montré que l’état de notre corps et comment nous le percevons varie avec nos émotions. De plus lorsque cette perception du corps dérégulée, des troubles psychiatriques peuvent résulter. Celles-ci peuvent être liées à une intéroception de précision réduite (autisme, trouble du déficit de l’attention) ou hypersensible (anxiété, syndrome de l’intestin irritable). Cependant les zones cérébrales qui sous-tendent cette perception et comment elle est modifiée dans des états émotionnels normaux et pathologiques reste mal connu. Ce projet permettra d’identifier des mécanismes par lesquels le cerveau représente ce que nous percevons de notre corps (par exemple : quelle est notre fréquence cardiaque ? quelle est notre fréquence respiratoire ?). En particulier nous pourrons identifier où dans le cerveau ces informations sont représentées et avec quelles précision. De plus nous testerons si la façon dont notre cerveau représente notre corps est modifié dans deux conditions : d’une part dans des états liés aux crises de panique ou l’anxiété (grâce à l’utilisation d’agents pharmacologiques utilisés en psychiatrie) et d’autre part lors de la prise de décisions difficiles suscitant des émotions. Une retombée concrète du projet sera de mieux connaître quelles régions corticales encodent l’état de notre corps. Ceci peut permettre de cibler plus efficacement les études de neuro-imagerie chez l’humain qui étudient ces déficits intéroceptifs. De plus, ces mesurer l’impact d’agents pharmacologiques utilisés dans le cas de maladies psychiatriques sur la représentation neuronale de l’état corporel. Ceci permettra d’évaluer si ces agents agissent directement sur la perception du corps, permettant de préciser leurs mécanismes d’action.

Procédures

Tous les animaux sont soumis à deux chirurgies pendant lesquelles nous implantons des électrodes cérébrales, une électrode sous-cutanée au niveau du thorax et une canule nasale. Les chirurgies durent respectivement 1h et 1h45 maximum et sont séparées d’au moins 5 jours ou plus pour que l’animal récupère un état ‘normal’ d’après notre grille d’évaluation. Tous les animaux sont également soumis à des sessions d’enregistrement allant jusqu’à 3h par jour pendant un maximum de 7 jours. Pendant ces sessions, les animaux sont maintenus en contention mais peuvent exprimer divers comportements (course sur une roue, sommeil, toilettage). Un sous-ensemble d’animaux sont également entraînés dans une tâche auditive pendant une à deux heures par jour sur une durée pouvant aller jusqu’à plusieurs mois selon la vitesse à laquelle les animaux acquièrent la tâche. A la fin des procédures, les animaux subissent une chirurgie sans réveil pour prélévement du cerveau.

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, les animaux peuvent présenter une activité réduite et ressentir une douleur légère à modérée au niveau de la zone opérée en fonction de la réponse aux traitements antalgiques administrés. Le protocole de contention peut engendrer l’inconfort chez l’animal, surtout lors des premières sessions d’habituation. Un sous ensemble d’animaux recevra l’administration d’agents pharmacologiques liés à l’anxiété ou les crises de panique. Parmi ces agents, 2 ont tendance à diminuer soit l’anxieté soit la sensation de panique . Les 2 autres ont tendence à augmenter soit l’anxiété soit la sensation de panique. Dans ce cas, nous utilisons des doses calibrées pour que l’augmentation du stress dure au maximum quelques heures. Pendant le protocole, l’animal sera soumis à de brefs stimuli légèrement aversifs (goût amer ou jet d’air) qui pourront engendrer une gêne.

Devenir

A la fin de chaque procédure, l’animal est mis à mort afin de réaliser l'analyse histologique du cerveau.

Remplacement

Le projet vise à comprendre comment le cerveau réagit à l’état du corps et donc nécessite une interaction intacte entre les deux, il est donc impossible in vitro ou in silico. De plus, afin de relier l’interoception à l’état affectif, il est essentiel d’effectuer notre étude chez un animal éveillé qui montre une grande diversité d’états et effectue une tâche sensorielle. Finalement, chez l’animal anesthésié, l’encodage neuronal est profondément modifié et le système cardio-respiratoire dans un état très ralenti, totalement différent de l’éveil. D’éventuels résultats obtenus sous anesthésie seraient donc très difficiles à généraliser.

Réduction

Les souris sont particulièrement adaptées à l’étude grâce aux outils performants d’enregistrement électrophysiologies et somatique qui existent. Ces outils permettent d’obtenir très efficacement de grandes populations de neurones et donc de réduire à la fois le nombre d’animaux et le nombre de sessions d’expérience nécessaire pour échantillonner les différentes régions d’intérêt. Nous avons un protocole adapté à cette diminution : - L’utilisation d’électrodes implantées « en aigu » permet d’enregistrer à un endroit différent chaque jour et donc de couvrir efficacement une grande zone anatomique - Nous utiliserons des électrodes qui contiennent un grand nombres de sites d’enregistrement. Ceci augmente l’efficacité de la récolte de données.

Raffinement

Hébergement : Les animaux ont accès à un enrichissement (dôme, coton) et sont hébergés ensemble sauf s’il y a de l’agressivité entre individus dans quel cas ils peuvent être isolés. Chirurgie : Nos procédures sont optimisées pour diminuer la souffrance et le risque anesthésique. Pendant la chirurgie, l’état de l’animal est suivi à intervalles réguliers pour adapter le niveau d’isoflurane. De plus un analgésique systémique et une analgésique locale sont administrées avant et après l’intervention. En post-opératoire, les animaux reçoivent une analgésie supplémentaire ajouté dans l’eau de boisson ou Dietgel pendant 5 jours) et les animaux sont suivis quotidiennement. Manipulations : Les animaux seront d’abord habitués à la manipulation manuelle nécessaire pour les transporter jusqu’à l’environnement de l’expérience. Toute manipulation par la queue sera évitée. Contention en tête fixée : L’animal est habitué en augmentant progressivement les durées. De plus, il est placé sur une roue où nous avons observé des comportements divers (sommeil, course, toilettage) dans des proportions similaires à un animal libre de ces. A chaque session la respiration, l’activité cardiaque et la température sont enregistrés et le comportement de l’animal suivi par vidéo. La mesure de toutes ces variables permettra, en temps réel, de surveiller très finement l’état de l’animal. Développement de procédures raffinées : Pendant ce projet nous enregistrons la respiration avec une canule intranasale, ce qui nécessite une chirurgie invasive. Nous essayerons de raffiner ce protocole en mettant en œuvre des mesures non-invasives de la respiration : soit avec un capteur externe de pression soit par suivi vidéo en caméra thermique des narines de l’animal. La canule intranasale étant la méthode de référence donnant les informations les plus précises, nous devons d’abord calibrer les autres méthodes contre celles-ci avant d’éventuellement utiliser ces nouvelles approches moins invasives. Utilisation de statistiques adaptées : Les analyses statistiques utilisées dans cette étude seront basées sur le nombre de neurones enregistrés et non le nombre d’animaux. Puisque nos méthodes permettent d’enregistrer un grand nombre de neurones par session et par animal, ceci permet d’acquérir une grande puissance statistique avec peu d’individus. Nous utiliserons des statistiques paramétriques et appariées.

Choix des espèces

Il est essentiel d’utiliser un mammifère dans cette étude puisque le système cardio-respiratoire est radicalement différent chez les invertébrés ou les amphibiens et reptiles (pas de poumons, pas de flux d’air nasal ou buccal pour les premiers, non-homéothermes pour les seconds). La souris est un excellent modèle pour acquérir efficacement (donc avec peu d’animaux et dans un temps d’expérience réduit) de grandes populations de neurones parce que les outils d’enregistrement massifs ont été mises au point chez cet animal (implantation aigue d’électrodes multi-sites). De plus, des développements ultérieurs de cet axe de recherche nécessiteront l’utilisation d’outils de manipulation qui reposent sur notre excellente connaissance génétique de la souris. Finalement, l’équipe possède une grande expertise dans la chirurgie et le comportement chez la souris, ce savoir-faire assure une application de qualité des procédures. Les souris étudiées seront adultes (plus de 8 semaines) au début des expériences. A cet âge, leur cerveau a fini son développement, ce qui est critique pour le bon positionnement des implants dans les régions visées.

Nées avec une mutation qui bloque la dégradation du céramide, les souris de ce projet ont une espérance de vie de 100 jours et développent dès trois semaines un retard de croissance, un gonflement du foie et de la rate et une faiblesse musculaire qui leur rend l'accès à la nourriture difficile. 1 456 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, pour tester des vecteurs viraux censés apporter une copie fonctionnelle du gène ASAH1. Chaque mois, elles subissent un prélèvement sanguin sous anesthésie au sinus rétro-orbital ou à la mandibule, une mesure de conduction nerveuse de vingt minutes et une heure trente d'observation de leur activité, avant un prélèvement terminal de muscles et une perfusion de fixateur par le flux sanguin. Les souris qui héritent de la mutation partent toutes en expérimentation puis sont tuées, celles qui n'en héritent pas sont mises à la reproduction pour entretenir l'élevage ou tuées faute d'usage.

Objectifs

La maladie de Farber et l’amyotrophie spinale associée à une forme d’épilepsie progressive myoclonique (SMA-PME) sont deux maladies génétiques rares causés par des mutations dans le gène ASAH1. Ce gène produit une enzyme appelée céramidase acide, qui décompose une substance appelée céramide dans les cellules. Lorsque ce gène est défectueux, l'enzyme ne fonctionne pas correctement, entraînant une accumulation toxique de céramide dans les cellules. Ces maladies affectent principalement le système nerveux et d'autres tissus du corps. Actuellement, il n'existe aucun traitement curatif pour ces maladies. Notre projet vise à développer une thérapie génique pour traiter le déficit en céramidase acide. Pour cela, nous utilisons de virus modifiés appelées AAV comme transporteurs pour introduire une version correcte du gène ASAH1 dans les cellules des patients. Nous avons testé cette thérapie chez des souris modèles représentant la maladie de Farber. Deux méthodes d'injection ont été explorées : l'injection dans tout le corps et l'injection directement dans le cerveau. Les deux méthodes ont montré une amélioration de la survie des souris et une correction des symptômes de la maladie. Cependant, l'utilisation de ce vecteur à des fortes doses peut provoquer des altérations dans certains tissus après injection dans tout le corps. Par conséquence, l'objectif actuel de notre projet est de tester de nouveaux virus AAV qui ciblent plus efficacement les cellules malades. Cela nous permettrait de réduire la dose nécessaire pour obtenir un effet thérapeutique après injection dans tous les corps, minimisant ainsi les risques d'inflammation. Enfin, pour l’injection directe dans le cerveau il est important de confirmer si une telle méthode d’administration pourrait représenter une stratégie efficace pour traiter les formes du déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Bénéfices attendus

Cette étude permettra d’identifier de nouveaux candidats médicaments et d’investiguer sur des défauts tissulaires dû à la maladie pour à terme apporter une solution thérapeutique adaptée aux patients qui aujourd’hui n’existe pas. D’abord nous allons investiguer sur la présence ou non d’une atteinte au niveau de la barrière hémato-encéphalique. Si cette hypothèse se révèle correcte, nous en tiendrons compte pour ajuster la conception des thérapies, y compris le choix du vecteur et la dose, afin de favoriser une distribution optimale du traitement. Par la suite, nous espérons choisir un vecteur AAV qui cible mieux les cellules affectées par la maladie. Cela nous permettrait d'utiliser une dose plus faible pour obtenir une correction complète, réduisant ainsi les coûts de production du produit et les effets secondaires liés aux doses élevées, comme observé lors des études précédentes. Enfin, nous aurons une vue plus claire sur l'efficacité de l'injection directe dans le cerveau comme méthode d’administration pour traiter les formes de déficit en céramidase acide qui affectent principalement le système nerveux central et, secondairement, les autres organes.

Procédures

Le prélèvement d’un petit bout de queue (2/5 mm) sera effectué sur des souris à la naissance ou à 15 jours de vie (5sec). L’administration des vecteurs AAV sera réalisé par voie intraveineux (15sec si volume ≤100 µL/20g; jusqu’à 1min si volume ≤ 250µL/20g) et par voie intra-cérébro-ventriculaire (ICV) (15sec). Afin d’évaluer l’efficacité du traitement lors des études, des tests fonctionnels pourront être réalisés chez des animaux vigiles : évaluation de leur activité tous les mois pendant 1h30 et analyse de leur force musculaire toutes les semaines pendant 10min. La force spécifique d’un muscle sera étudié chez d’autres animaux anesthésiés pendant 1h15 par animal une seule fois lors de l’étude. L’analyse de la transmission électrique entre les nerfs et les muscles sera réalisée chez des animaux anesthésiés pendant 20min tous les mois lors de l’étude. Chaque mois afin d’évaluer l’efficacité thérapeutique, tous les animaux seront anesthésiés pendant moins de 5min pour réaliser un prélèvement de sanguin. En fin d’étude, des prélèvements de muscles (5min) ainsi que l’injection d’un fixateur par perfusion via le flux sanguin (5min) seront réalisés sous anesthésie générale et sans réveil pour l’animal.

Impact sur les animaux

La mutation dans le gène Asah1 chez la souris entraîne une accumulation toxique de céramide dans plusieurs organes de l’animale en accord avec les manifestations cliniques aussi décrites chez l’homme. Les animaux ont une espérance de vie de 100 jours, avec des symptômes apparaissant dès 3 semaines de vie : retard de croissance, gonflement du foie et de la rate, et faiblesse musculaire généralisée, rendant les déplacements et l'accès à la nourriture difficiles. Le test d'échappement peut causer une légère nuisance avec un pincement de la queue, provoquant rarement un léger saignement. Les injections et les prélèvements sanguins peuvent occasionner une douleur légère liée à la piqûre.

Devenir

Certaines souris issues des croisements mais ne présentant pas de pathologie seront utilisées pour les accouplements nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage. Les animaux issus des croisements mais ne présentant pas de pathologie et non nécessaires au maintien et à l'amplification de l'élevage seront euthanasiées. Toutes les souris présentant le phénotype pathologique seront incluses dans les procédures expérimentales et seront euthanasiées à la fin de la procédure expérimentale ou en cours de procédure si leur état de santé le nécessite.

Remplacement

Le modèle murin utilisé dans ce projet est le premier modèle pertinent publié dans la littérature qui récapitule les symptômes retrouvés chez les patients affectés par la maladie de Farber. Des modèles in vitro 2D existent, mais ils ne permettent pas d’étudier certains défauts majeurs de la pathologie, tels que l'infiltration de cellules immunitaires dans les organes cibles de la maladie. Les modèles in vitro 3D (ou organoïdes) ne possèdent pas à ce jour toutes les structures anatomiques spécifiques de chaque organe. De plus, on ne peut pas reproduire exactement la biodistribution du vecteur après administration dans le corps entier, ce qui limiterait les informations collectées pendant les études pour la transposabilité des résultats vers des études précliniques. Les modèles animaux sont donc nécessaires pour cette étude.

Réduction

Le nombre minimal d’animaux nécessaires pour chaque étape de ce projet a été déterminé à l’aide de calculs statistiques. Cela permet d’observer les différences entre les animaux sains et malades concernant la barrière hémato-encéphalique, d’étudier le potentiel thérapeutique de chaque vecteur testé et de maintenir les lignées tout au long du projet.

Raffinement

Les animaux seront hébergés tout au long de l’étude dans des cages enrichies avec du coton et de bâtons à ronger dans un environnement exempt d’organismes pathogènes. Concernant les souris porteuses de la mutation pour le gène Asah1, des observations attentives et des mesures de poids seront effectuées 2 fois par semaine, en plus de l’observation quotidienne des animaux. De plus, un aliment hydratant et nourrissant sera de plus placé au sol dans la cage pour faciliter l’accès à la nourriture des souris malades. Afin de réduire la souffrance et le stress de ces animaux, des points limites ont été établis pour chaque procédure et manipulation. En cours du suivi du traitement, pour prévenir la douleur provoquée par le prélèvement sanguin par voie mandibulaire ou rétro-orbitale, les animaux seront anesthésiés par voie gazeuse et le prélèvement sera au maximum du 10% de volume sanguin total de la souris. La méthode de prélèvement sanguin sera adaptée et réalisée au sinus rétro-orbital dans le cas où un processus de cicatrisation serait en cours (présence de croute, hématome, rougeur ou gonflement). L’œil sur lequel le prélèvement est effectué sera noté sur la fiche de suivi de l’animal afin de privilégier l’autre côté pour un prélèvement le mois suivant. Raffinement pour analyses fonctionnelles et prélèvement des muscles : afin de réaliser une mesure de force musculaire, l’animal recevra une injection d’analgésique en sous-cutanée, ce qui permettra de soulager les douleurs intenses éventuelles, et sera anesthésié par voie intrapéritonéale. L’animal sera également disposé sur un support chauffant tout au long de l’anesthésie.

Choix des espèces

Pour évaluer des stratégies thérapeutiques contre le déficit en céramidase acide, le modèle murin porteur d’une mutation dans le gène Asah1 a été choisi car il reproduit très fidèlement les symptômes de la maladie observées chez l’homme. Pour générer les animaux nécessaires à l’étude, les souris seront mises en reproduction entre l’âge de 8 semaines et 6 mois. Afin d’investiguer un défaut de la perméabilité de la barrière hémato-encéphalique, les animaux contrôles et malades seront injectés à l’âge de 7 semaines et euthanasiés 8 jours après le traitement. À ce stade, la pathologie est suffisamment avancée pour déterminer si une altération existe et pour étudier les conséquences à court terme sur la capacité du vecteur à atteindre les régions touchées par la maladie. Lors de l’étude visant à identifier la combinaison vecteur-dose la plus efficace après injection via la veine de la queue, les souris seront traitées à l’âge de 7 semaines. Pour évaluer si l’injection directement dans le cerveau de vecteurs sélectionnés peut prévenir l’état inflammatoire dans le système nerveux central ainsi qu’au niveau des tissus périphériques pour les formes les plus sévères et précoces de la maladie, les animaux seront traités le jour de leur naissance.

Pour observer en temps réel l'activité des neurones du cortex préfrontal pendant un apprentissage associatif, 260 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées à l'issue. Chacune subit une chirurgie d'une heure pour injection virale et implantation de fibres optiques, et 150 d'entre elles une seconde chirurgie quelques semaines plus tard pour implanter un miniscope sur le crâne. Le porteur signale le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et de perte de poids inhérent à ces interventions, l'hypothermie et les troubles respiratoires liés aux deux anesthésies, et la contrainte posturale que représente le port permanent d'un appareil d'imagerie sur la tête. Sur la réduction, il décrit une conception expérimentale soigneuse et des études pilotes, sans donner un seul effectif par groupe ni justifier le chiffre de 260.

Objectifs

La mémoire est la clé de notre existence. Les mécanismes fondamentaux de la mémoire ont été étudié depuis plusieurs décennies par les neuroscientifiques, mais c’est seulement récemment que la démonstration expérimentale des conséquences physiologiques de l’expérience vécue et de sa rétention sur le cerveau a été possibles. Il a notamment été montré que des groupes de neurones – les cellules constituant le cerveau et briques élémentaires de la cognition – dispersés dans diverses régions cérébrales étaient nécessaires et suffisants pour permettre l’encodage et le rappel de la mémoire. Ces groupes constituent l’engramme. L’objectif global de notre projet est de comprendre les processus d'encodage et de stockage de la mémoire, chez les mammifères. Pour mener ces études, nous souhaitons étudier, en temps réel, l’activité des neurones du cortex préfrontal impliqués dans une tâche d’apprentissage associatif. Nous analyserons, ensuite, l’activité associé aux différentes phases de la tâche, ainsi que la réactivation de ces neurones dans les jours qui suivent la séance d’apprentissage.

Bénéfices attendus

Notre objectif est la compréhension des mécanismes fondamentaux de la mémoire. Néanmoins, leur bonne connaissance nous permettra à terme de mieux comprendre les pathologies qui sont associées à des troubles de la mémoire, comme les maladies neurodégénératives - Alzheimer, Parkinson – ainsi que les pathologies génétiques liées aux déficits cognitifs.

Procédures

- Procédure 1 :10 animaux; L’ensemble de ces animaux subiront une chirurgie pour infection virale avec implantation de fibres optiques 1h de chirugie en totale maximum. Cette procédure à pour but de mettre en place et optimiser le protocole utiliser pour soit campari2 ou cal-light. - Procédure 2: 100 animaux,les mémes étapes que la procédure vont se dérouler que la promiére procédure. - Procédure 3 :150 animaux, Une implantation de miniscope va se faire aprés quelques semaines de la premiére chirugie (implantation de fibre +injection virale) afin de permettre un minimum de rétablissement .

Impact sur les animaux

Les animaux seront soumis à deux interventions chirurgicales sous anesthésie et analgésie : le risque d'inconfort, de douleur, d'infection et/ou de perte de poids est inhérent à ces procédures. Ils seront à nouveau endormis, exposant ainsi un risque d'hypothermie ou de problèmes respiratoires temporaires. Ils seront entraînés à porter un appareil d'imagerie sur leur tête, ce qui représente une contrainte pour la posture de l'animal. La pose d'une prothèse implique également une contrainte pour l'animal, ce qui nous obligera à adapter les conditions d'hébergement.

Devenir

L'ensemble des animaux sont mis à mort à la fin de chaque procédure afin de réaliser des expériences d'électrophysiologie in vitro et des études histologiques.

Remplacement

En l’état actuel de nos connaissances, la recherche proposée ne peut pas être substituée par des approches in silico car le projet traite de fonctions cérébrales complexes à la base de la mise en place de la mémoire chez les mammifères. Il n’y a donc aucune alternative à l’utilisation d’animaux. La culture cellulaire n’est pas appropriée car les propriétés synaptiques de réseaux sont modifiées dans ces préparations. Déterminer comment les informations cognitives et sensorielles sont traitées exigent que l'animal soit intact.

Réduction

Nous avons réfléchi à notre projet de recherche de façon à réduire au minimum le nombre d’animaux utilisés. La conception expérimentale soigneuse de notre projet permettra une stratégie de réduction à minima de nombre des animaux nécessaires à l’exploitation statistique des résultats. Dans une optique de réduction, nous avons également prévu des études pilotes permettant l’évaluation de la faisabilité technique de certains aspects de notre étude. Nous avons également intégré une stratégie permettant une évaluation précoce de nos résultats au fur et à mesure dès leur obtention. Cela nous offrira, si nécessaire, la flexibilité de réduire le nombre d'individus requis pour atteindre nos objectifs scientifiques, tout en garantissant la validité et la robustesse de nos conclusions.

Raffinement

Surveillance quotidienne. ii) Vérification de l'état de l'animal avant et après chaque expérience ou manipulation.iii) Perfectionnement des procédures chirurgicales pour réduire le risque de douleur ou de souffrance : utilisation d'un gel oculaire pour éviter le dessèchement des yeux et d'un tapis chauffant (avec sonde rectale) pour maintenir la température de l'animal. Utilisation d'anesthésiques et d'analgésiques pour chaque intervention chirurgicale. Ajout d'un analgésique local à longue durée d'action et d'un anti-inflammatoire lors de la deuxième intervention chirurgicale. Formation spécialisée de l'expérimentateur. iv) Application de soins préventifs après la chirurgie : administration de sérum physiologique, nourriture humide placée sur le sol de la cage. v) Animaux manipulés quotidiennement avant les séances de comportement afin de réduire le niveau de stress. vi) Entraînement à la porte de l'appareil d'imagerie, vii) Utilisation d'un tube de transfert. viii) Habituation à la salle de comportement. ix) Hébergement en binôme jusqu'à l'implantation de la lentille. Utilisation d'une double enrichissement. Pendant la période d'utilisation des séparateurs, les souris bénéficieront également d'une séance d'exploration "supervisée" de 45 minutes par jour. x) Définition de points limites spécifiques et de mesures conservatrices pour chaque phase de la procédure. xi) Mécanismes d'intégration des nouvelles techniques de perfectionnement : formation régulière des expérimentateurs, consultation de sites éducatifs tels que le NC3R, consultation d'experts dans le domaine.

Choix des espèces

La souris est une espèce de choix pour les études sur le système nerveux central des mammifères. L’organisation du système nerveux central de cette espèce est proche de celle de l’homme, ce qui permet une extrapolation des résultats obtenus chez cette espèce à l’espèce humaine afin de mieux comprendre l’importance des mécanismes synaptiques sur l’adaptation comportementale. De plus, les modèles génétiques murins sont des modèles d'expérimentation animale de choix pour l’étude du système nerveux en conditions pathologique. Le projet sera réalisé sur des animaux de 6 à 32 semaines d'âge, ce qui correspond chez cette espèce à l’âge adulte. Leur poids et leur taille sont stabilisés, et la taille du cerveau est homogène garantissant ainsi une bonne reproductibilité des sites d’injection.

240 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, tous tués pour prélèvement du cerveau. Chacun subit une chirurgie d'une demi-heure pour la pose d'un cathéter permanent dans la veine jugulaire, puis s'auto-administre cocaïne et alcool pendant environ quatre mois, avec jusqu'à trois prises de sang par ce même cathéter. Le porteur attend un taux d'attrition de 20 % sur la durée et prévoit deux cohortes de trente rats par variable testée. Il présente le choix de l'espèce comme un compromis évolutif, le rat étant assez proche de l'humain pour valoir modèle et assez éloigné des primates non-humains, qu'il range parmi les espèces plus sensibles.

Objectifs

La cocaïne est la deuxième drogue illégale la plus consommée en Europe et son utilisation a augmenté au cours des 10 dernières années. Cette consommation est souvent associée à une consommation d’alcool. Notre projet a pour but d’étudier chez le rat de laboratoire l’influence de l’alcool sur la prise de cocaïne et d’identifier la signature neurobiologique de cette influence en mesurant l'activité globale du cerveau. Selon notre hypothèse générale, l’état d’intoxication produit par l’usage d’alcool devrait non seulement inciter à une consommation accrue de cocaïne mais aussi à un affaiblissement des capacités de contrôle sur cette consommation, notamment dans les situations qui requièrent qu’un tel contrôle soit exercé. Au plan neurobiologique, l’influence de l’alcool sur la consommation de cocaïne devrait se traduire par une diminution correspondante de l’activité neuronale dans les régions du cerveau responsables du contrôle de la récompense et de la motivation.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera de préciser la nature de l’influence de l’état d’intoxication produit par l’usage d’alcool sur la perte de contrôle sur la consommation de cocaïne. Le second bénéfice sera d’identifier les régions du cerveau responsables de cette influence grâce à une mesure de l'activité globale du cerveau.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique et sous analgésie. Un prélèvement de sang veineux (0,15 ml) sera réalisé pour mesurer l’alcoolémie et certains métabolites de la cocaïne. Ce prélèvement sera effectué via le cathéter intraveineux installé à demeure dans la jugulaire. Cette méthode de prélèvement est indolore. Ce prélèvement sera répété au maximum 3 fois, avec un intervalle d’au moins 2 semaines entre prélèvements.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité principal est léger et qui ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, traitement antibiotique, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool, hormis un possible risque d’infection lié à l’utilisation chronique de la voie d’administration intraveineuse. Les animaux seront sous surveillance quotidienne pour repérer et prévenir tout problème éventuel.

Devenir

A la fin de la procédure, les animaux seront euthanasiés et leurs cerveaux seront prélevés post-mortem pour effectuer une mesure de l'activité globale du cerveau.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) l’éthique humaine actuelle interdit l’utilisation d’interventions invasives chez l’homme, compliquant ainsi l’étude directe des relations causales entre usages de différentes drogues ; 2) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales ; 3) l’influence de l’usage d’alcool sur la prise de cocaïne ne peut pas être récapitulée sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la bonne réalisation du projet sera réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales propres au projet et les différentes variables à tester. Pour tester chaque variable, il faudra deux cohortes de 30 rats chacune (une de mâles et une de femelles) pour un obtenir un effectif final suffisant, prenant un taux d’attrition de 20 pourcents au bout de 4 mois. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour tester les quatre variables du projet sera égal à 240 rats.

Raffinement

Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi contenant un tunnel en carton et un os à ronger afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie, sous anesthésie chimique et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures de nursing avec un accès facilité à l’aliment (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique. L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique. Enfin, si cela ne suffit pas au rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire (R. Norvegicus, lignée Wistar) constitue une sorte de compromis du point de vue de l'évolution biologique. Cette espèce est suffisamment proche de l'espèce humaine (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 MYA) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple, les invertébrés, à l’exception sans doute des céphalopodes) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (par exemple les primates non-humains). Les espèces invertébrées (par exemple, C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider certains mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux des drogues mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’être humain pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes au début des expériences (âge moyen 3 mois demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction.