Système nerveux

Une à six heures de chirurgie pour implanter des électrodes dans le cerveau, puis des séances d'enregistrement la tête fixée, montant progressivement jusqu'à deux ou trois heures. 720 souris vont être utilisées ainsi dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, toutes tuées sous anesthésie terminale pour prélever le cerveau et vérifier la position des électrodes. Elles subissent aussi une biopsie de la queue, un gavage quotidien démarré neuf jours avant le premier enregistrement et un hébergement individuel. Ces souris portent une trisomie qui modélise le syndrome de Down, et le porteur écrit que le phénotype n'est pas considéré comme dommageable, tout en décrivant l'isolement et la perte de liberté de mouvement comme des inconforts modérés.

Objectifs

L'objectif de ce projet est d'examiner le fonctionnement des circuits corticaux sur des souris modèles du syndrome de Down afin de mieux comprendre les mécanismes responsables des déficits cognitifs et comportementaux associés à cette pathologie et si possible comment les corriger. En effet cette maladie, liée au développement anormal du système nerveux à cause de facteurs génétiques (trisomie), se caractérise par des troubles du comportement, de l'humeur, des relations sociales, et des déficits cognitifs extrêmement invalidants. Les souris modèles du syndrome de Down présentent des déficits génétiques dans des gènes impliqués dans le développement du cerveau et le retard mental. Notre hypothèse principale, que nous testerons par des enregistrements électrophysiologiques et comportementaux, est que certains éléments des circuits neuronaux du cortex sont défaillants sur ces modèles, entrainant une activité cérébrale anormale qui perturbe l'encodage et la computation neuronale. Nous évaluerons également l'action sur le fonctionnement des circuits corticaux de 2 drogues (candidats médicaments) récemment proposées comme ayant un intérêt clinique potentiel contre le syndrome de Down. Ces drogues, qui affectent les mécanismes intracellulaires au sein des neurones, permettraient potentiellement de restaurer des interactions neuronales normales dans ces pathologies, contre lesquelles aucun traitement pharmacologique efficace n'est à ce jour disponible.

Bénéfices attendus

Les avantages escomptés sont une meilleure compréhension du fonctionnement cérébral et de ses pathologies, notamment neurodéveloppementales telles que retard mental et syndrome de Down, ce qui représente un intérêt sociétal considérable.

Procédures

Les animaux seront soumis à 7 types d'intervention, sur une durée totale de 2 à 4 semaines : biopsie de la queue pour phénotypage, procédure instantanée (fraction de seconde), traitement pharmacologique par gavage (1 ingestion par jour, démarrage 9j avant le premier enregistrement); procédures chirurgicales (implantation, sous anesthésie, d'électrodes ou d'une barre miniature pour enregistrement chez l'animal vigile), d'une durée de 1 à 6h suivie d'une période de récupération d'au moins une semaine; procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre, d'une durée de 7j, ou en mode tête-fixée, par sessions quotidiennes de quelques minutes au départ (période d'acclimatation d'1 à 2 semaines) puis progressivement jusqu'à 2 ou 3h (période d'apprentissage et d'entrainement, sur 1 à 2 semaines); procédure d'enregistrement sur l'animal anesthésié, d'une durée de 3 à 6h; et enfin anesthésie terminale pour prélèvement du cerveau, procédure d'une durée de 30 à 60 min, au cours de laquelle l'animal est mis à mort.

Impact sur les animaux

La biopsie de la queue pour phénotypage génère une douleur légère et de courte durée. Le traitement pharmacologique par gavage (1 ingestion par jour, démarrage 9j avant le premier enregistrement) représente un stress physique et psychologique léger, mais n'est associé à aucune douleur. Les procédures chirurgicales (implantation d'électrodes ou d'une barre miniature sur l'os cranien), d'une durée de 1 à 6h, sont effectuées sous anesthésie générale et donc sans douleur ni inconfort. L'acte chirurgical n'est associé à aucune perte de fonction. La récupération post-chirurgicale est accompagnée de traitement analgésique (démarré dès avant l'acte chirurgical), ce qui limite la douleur à un niveau modéré. La procédure d'enregistrement sur l'animal vigile libre ou en mode tête-fixée n'est associée à aucune douleur particulière. En plus de l'hébergement individuel (isolement), compensé par un enrichissement de l'environnement et des interactions quotidiennes avec l'expérimentateur, l'inconfort lié à la fixation de la tête (perte de liberté de mouvement) est modéré car mitigé par les interactions avec l'expérimentateur (handling, enrichissement comportemental lié à la tâche) et par une habituation très progressive (sessions quotidiennes de quelques minutes au départ). Les procédures d'enregistrement sur l'animal anesthésié et de prélèvement du cerveau sont effectuées sous anesthésie générale sans réveil, complétée par un traitement antalgique, et donc sans aucune perception de la part de l'animal.

Devenir

Tous les animaux sont mis à mort. Ceci est indispensable pour caractériser l'état histologique du cerveau et pour s'assurer de la localisation des électrodes (identifiée par un marqueur florescent, le DiI) après les enregistrements in vivo.

Remplacement

L'étude des propriétés des circuits neuronaux impliqués dans la cognition nécessite l'observation et la manipulation de systèmes neuronaux intacts, et ne peut donc se faire que sur le cerveau issu de l'animal vivant. Il est en effet à ce stade de nos connaissances impossible de modéliser de façon réaliste le fonctionnement cognitif in vitro ou in silico. Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car elle présente le meilleur équilibre entre les bénéfices (accessibilité expérimentale et pertinence par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation dont actes chirurgicaux, perfusion transcardiaque ou mise à mort en cas d'atteinte de point limite).

Réduction

Seules les expériences absolument indispensables ont été prévues, nous avons évité la répétition inutile d'études antérieures, et le protocole expérimental est soigneusement préparé. Une difficulté notable dans le calcul a priori du nombre d'animaux nécessaire est que les variables étudiées sont nouvelles, et leurs paramètres statistiques (moyenne et variance) par conséquent inconnus. D'après la littérature du domaine, un scénario plausible pour les variables que nous caractérisons est d'être en mesure de détecter une différence de 25% entre 2 échantillons de petite taille issus de distributions suivant une loi Normale dont l'écart type est d'environ 20% de la moyenne. Il faut ainsi un échantillon de 10 animaux pour détecter avec une certitude de 95% (risque α de type I) et une puissance de 0.8 (risque β de type II) une différence de 25% entre 2 moyennes dont les distributions suivent une loi Normale (µ, σ=0.2µ). Le nombre d'animaux retenu dans notre protocole, nécessaire pour garantir un pouvoir statistique suffisant pour chacune de nos expériences réalisée avec un taux de succès de 50%, est donc de 20 par lot expérimental. Toutefois, les animaux sont préparés par petites séries de 4 ou 5 et les résultats analysés au fur et à mesure, ce qui permet d'ajuster le nombre final d'animaux utilisés, la procédure s'arrêtant dès que le nombre de 10 expériences réussies par groupe est atteint.

Raffinement

Les dommages en termes de souffrance animale sont minimisés par les conditions d'élevage (cages collectives et enrichies de carré de coton jusqu'à la chirurgie et autant que possible après), le suivi des règles de l'art pour les interventions chirurgicales (aseptie, anesthésie et antalgie), le suivi régulier (quotidien dans les periodes péri-opératoires) des animaux par le chercheur responsable et par le personnel animalier (définition de points limites de bien être général qui déclenchent soins particuliers, voire euthanasie, selon leur gravité : cf fiche de suivi en annexe). Les animaux utilisés sont des souris d'une lignée transgénique modèle du syndrome de Down. Ce modèle a pour but de reproduire les altérations développementales des circuits neuronaux qui sous-tendent la pathologie chez l'homme. Toutefois, aucune étude à notre connaissance ne montre que les troubles associés au développement des circuits neuronaux dans le modèle que nous utilisons soient douloureux pour l'animal, et le phénotype n'est pas considéré comme dommageable.

Choix des espèces

Nous avons opté pour l’utilisation de la souris car cette espèce présente des similitudes neuronales et cognitives suffisantes pour assurer la pertinence des investigations menées par rapport au cerveau humain. Elle est également une espèce de choix pour modéliser les pathologies cérébrales concernées par cette étude, représentant un bon équilibre entre les bénéfices (disponibilité d'outils de biologie moléculaire, de génétique et de pharmacologie, facilité d'élevage, pertinance par rapport aux pathologies chez l'homme) et les dommages escomptés (souffrance liées aux conditions d'élevage ou d'expérimentation). En outre, une quantité de données considérable dans le domaine des Neurosciences Cognitives a été obtenue avec cette espèce, ce qui nous permet une comparaison des résultats obtenus et une minimisation du nombre d'animaux utilisés en s'appuyant sur des données publiées par d'autres équipes et obtenues à l'aide de protocoles expérimentaux similaires. Les animaux utilisés seront de jeunes adultes (8-12 semaines), car c'est la tranche d'âge qui donne les meilleurs résultats (meilleure récupération post-chirurgicale, enregistrements plus faciles sur cerveau jeune du fait des propriétés physiques de la dure mère et du tissu cérébral probablement moins myélinisé) tout en permettant une expérimentation sur un système nerveux qu'on considère mature, et en minimisant autant que possible la durée d'élevage en condition d'animalerie de laboratoire.

472 souris privées du récepteur aux LDL vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, chacune soumise à un régime enrichi en cholestérol pendant deux à cinq mois et à une IRM de deux heures et demie. Jusqu'à 260 d'entre elles reçoivent six à dix injections dans la veine de la queue ou dans l'abdomen, geste qui peut entraîner une nécrose au point de piqûre. Le porteur annonce des œdèmes de la face et des membres en fin de régime, une insuffisance cardiaque possible et une prostration, chaque animal atteignant un de ces seuils étant tué et ses organes prélevés. Le bénéfice avancé, une meilleure prise en charge des patients atteints de démence vasculaire, est renvoyé au long terme et conditionné à des résultats concluants.

Objectifs

Les maladies neurodégénératives sont des maladies qui affectent le cerveau. Les plus connues sont la maladie d’Alzheimer ou de Parkinson. Il en existe de nombreuses autres comme une maladie connue sous le nom de Niemann-Pick qui est dû à l’accumulation de cholestérol directement dans les cellules du cerveau. Cette accumulation de cholestérol a également été montrée dans la maladie d’Alzheimer. Ce cholestérol, peut également s’accumuler dans les parois des vaisseaux sanguins qui irriguent le cerveau, formant des lésions d’athérosclérose qui empêchent une bonne oxygénation des neurones et aboutit à une altération du fonctionnement cognitif : la démence vasculaire. L’objectif de ce projet est l’identification des mécanismes par lesquels des protéines spécifiquent régulent le taux de cholestérol dans la cellules. Nous étudierons comment ces proteines sont impliquées dans l’apparition des altérations cognitives, morphologique du cerveau et métaboliques liées à la démence vasculaire et aux maladies neurodégénératives.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra une connaissance fine de la survenue des phénomènes de démence vasculaires liés aux dépôts de cholestérol dans les artères et de déterminer si l’injection d’anticorps anti-proteine X (confidentiel) est en mesure de prévenir ou diminuer la gravité de ces atteintes cérébrales et cardiovasculaires. A long terme, si les résultats obtenus sont concluants, cette études permettra une meilleur prise en charge des patients atteint de démence vasculaire et autres maladies neurodégénératives liées à une perturbation du métabolisme du cholestérol.

Procédures

Les animaux seront soumis à un régime riche en cholestérol pendant 2 mois ou 5 mois. Certains animaux (au maximun 260) seront soumis à 6 injections (protocole de 2 mois de régime) ou 10 injections (protocole de 5 mois de régime) dans la veine caudale (processus de 10 minutes environ) ou intrapéritonéale (2 minutes environ). Les animaux pourront subir un stress léger lors des manipulations. Les animaux seront soumis également à une IRM (durée 2 à 2,5H).

Impact sur les animaux

Les animaux peuvent développer des oedème faciaux et des membres en toute fin de la période de régime proathérogène. Un stress engendré par les injections à la queue ou intrapéritonéale et lors de l'anesthésie finale en IP. L'injection à la queue peut potentiellement entrainer une nécrose au point d'injection. Le traitement (en début de régime et après traitement avec les anticorps) peut potentiellement entraîner une perte de poids.

Devenir

Les animaux soumis à un régime riche en cholestérol et traité par anticorps seront euthanasiés pour prélever les organes à des fins de caractérisation histologiques et biochimiques et ainsi répondre aux objectifs de l'étude.

Remplacement

ll n'est pas encore possible de nos jours de modéliser les processus cognitifs de façon assez fiable et complète dans un modèle in silico des pathologies étudiées. Il est donc nécessaire de recourir à des modèles animaux dont on analyse la relation entre la neuropathologie, la connectivité cérébrale et les performances cognitives. Pour le projet concernant la démence vasculaire, l’athérosclérose est un phénomène multifactoriel qui ne peut être totalement décrit par un modèle cellulaire et nous devons intégrer les facteurs présents in vivo qui sont responsables de la survenue de cette pathologie.

Réduction

Si nous obtenons des résultats significatif avant la fin de l'étude, nous n’utiliserons pas le nombre total d’animaux demandé (472 animaux sur 5 ans au total). Nous utiliserons également nos souris SmWnt5a, SmLRP1 afin de faire des cultures de cellules musculaires de vaisseaux sanguins et de cellules cardiaques, dans le but d’identifier les mécanismes cellulaires par lesquels Wnt5a protège de l’accumulation du cholestérol. La partie « culture de cellules » permettra de limiter le nombre d’animaux nécessaire à notre étude, car nous utiliserons peu d'animaux pour mettre en culture les cellules musculaires lisse, alors que cette même étude mécanistique In vivo nécessiterait un plus grand nombre d'animaux. Pour chaque étude, la taille des groupes a été déterminée mathématiquement et les résultats obtenus seront analysés par des tests statistiques pour mettre en évidence le rôle de la protéine wnt5 dans les troubles cognitifs vasculaires et les maladies neurodégénératives.

Raffinement

Nous mettrons en place différents points limites dans notre expérimentation pour atténuer autant que faire se peut la gêne de nos animaux liée au régime riche en cholestérol : ces points limites sont définis en tenant compte de l’aspect et du comportement des animaux au cours du régime (oedèmes dû à l’insuffisance cardiaque qui peut s’installer, prostration). Le suivi de l’état des animaux sera quotidien et les animaux seront soumis à une inspection visuelle. Dès qu'un animal atteint un des points limites, il sera euthanasié et ces organes prélevés pour étude.

Choix des espèces

La souris est l’espèce animale la plus utilisée pour les délétions de gènes (souris Knock Out conditionnel ou non). Nous utilisons un modèle de souris génétiquement modifiée sur un fond génétique C57BL/6J, LDL-/- (Low Density Lipoprotein). Ces souris sont KO pour le récepteur aux LDL afin d’accélérer la formation de lésions d’athérosclérose lorsqu’elles sont soumises à un régime riche en cholestérol (paigen). Ce fond génétique n’a aucun impact sur la longévité ou le bien être des souris hors régime paigen. Pour les groupes avec un régime standard ou proathérogène de type paigen pendant 2 à 5 mois, nous utiliserons des souris adulte de 3 mois, afin de déterminer l‘évolution de la maladie sur les plans histologique, biochimique et fonctionnelle (IRM ) et cognitif (Arène ouverte). Les souris de 3 mois ont atteint leur taille et poids adulte, ce qui permet une meilleur reproductibilité des résultats.

Opérés trente minutes sous anesthésie pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure, 300 rats mâles et femelles s'administrent ensuite eux-mêmes de l'alcool par voie orale et de la cocaïne par voie intraveineuse, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. L'expérience dure cinq à six mois, avec un taux d'attrition que le porteur estime à 20 %, et il s'agit de mettre au point un modèle de polyconsommation qui n'existe pas encore. Il liste après la chirurgie des risques d'inflammation, d'infection, de plaies dues à un toilettage excessif et de lâchage des points de suture. Il écrit ensuite n'anticiper aucune nuisance particulière pendant l'auto-administration de cocaïne et d'alcool, tous les rats étant tués à la fin pour prélever leur cerveau.

Objectifs

La polyconsommation est la norme, et non l'exception, chez les utilisateurs de drogues. Elle peut prendre plusieurs formes mais elle implique presque toujours le co-usage d'au moins un produit licite (par exemple, ingestion d'alcool) et d'une substance illicite (par exemple, inhalation ou injection intraveineuse de cocaïne). L'objectif principal de ce projet vise à développer et valider un modèle animal de polyconsommation d’alcool et de cocaïne. Il s’agira d’étudier l'influence du co-usage d'alcool sur le développement, le maintien et l’abstinence de la prise de cocaïne chez le rat. Des rats mâles et femelles auront un accès concomitant à l'alcool (par voie orale) et à la cocaïne (par voie intraveineuse). Pendant cet accès concomitant, ils pourront co-utiliser les deux substances librement avant de s'installer dans un profil de polyconsommation donné parmi les nombreux possibles (6 au total, en incluant la possibilité d’un mono-usage d’alcool ou de cocaïne). Ce projet de recherche est conçu pour permettre la découverte et l’étude de différents profils de polyconsommation d’alcool et de cocaïne, de leur développement et de leur fréquence relative, notamment en fonction du sexe (Objectif 1). Ce projet devrait également fournir d’importantes informations sur l'influence du co-usage d'alcool sur le développement initial, le maintien (Objectif 2), l’abstinence et la rechute de la consommation de cocaïne (Objectif 3). Enfin, ce projet permettra aussi la collecte et le stockage de tissus cérébraux issus d’individus ayant développé différents profils de polyconsommation pour des analyses neuromoléculaires futures.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus du projet sont essentiellement d’ordre scientifique. Le premier bénéfice sera la validation d’un modèle animal de co-usage d’alcool et de cocaïne. Un tel modèle n’existe pas actuellement. Les autres bénéfices attendus incluront le recueil d’informations uniques sur les différents profils de polyconsommation d’alcool et de cocaïne, sur leur développement, sur leur fréquence relative, notamment en fonction du sexe, et, à plus long terme, sur leurs corrélats moléculaires dans le cerveau. Enfin, ce projet devrait également fournir d’importantes informations sur l'influence du co-usage d'alcool sur le développement initial, le maintien et l’abstinence de la prise de cocaïne.

Procédures

Tous les rats seront soumis à une chirurgie intraveineuse de courte durée (30 min en moyenne) pour la pose d'un cathéter intraveineux à demeure. Cette chirurgie est effectuée sur couverture chauffante en conditions aseptiques alors que les animaux sont sous anesthésie chimique et sous analgésie.

Impact sur les animaux

Les animaux seront testés dans des procédures dont le degré de gravité ne dépassera pas le degré modéré. Bien que toutes les précautions soient prises afin de prévenir ou de minimiser les nuisances au maximum (anesthésie, analgésie anti-inflammatoire, conditions aseptiques, suivi post-opératoire…), il est possible que certaines nuisances ou effets indésirables puissent survenir suite à la chirurgie ou pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool. Les nuisances attendues après la chirurgie comprennent : un possible risque d'inflammation ou d'infection ; une apparition de plaies dues à un toilettage excessif de la zone opérée ; une perte des points de suture avant cicatrisation complète. Nous n’anticipons pas de nuisances particulières pendant l’auto-administration de cocaïne et d’alcool mais les animaux seront sous surveillance pendant les premières séances de polyconsommation pour repérer et prévenir tout problème éventuel.

Devenir

Les animaux ayant complété toutes les procédures expérimentales seront mis à mort afin de prélever leurs cerveaux pour des analyses moléculaires futures.

Remplacement

Ce projet recourt exclusivement à l’utilisation du rat de laboratoire (Rattus Norvegicus, jeunes adultes, mâles et femelles), vivant en groupe dans un environnement enrichi. Ce recours à l’animal se justifie pour les raisons éthiques suivantes : 1) il n’existe pas encore de modèles mathématique ou in silico valides et réalistes permettant d’étudier ces relations causales et 2) les polyconsommations de substances dans l’addiction ne peuvent pas être récapitulées sur des lignées cellulaires (humaine ou animale) ou tout autre modèle in vitro cellulaire ou subcellulaire.

Réduction

Le nombre d'animaux nécessaire à la bonne réalisation du projet sera réduit au minimum. Ce nombre représente un compromis rationnel entre le principe de réduction, les contraintes expérimentales propres au projet et les différents objectifs à remplir. Pour répondre à chaque objectif du projet, il faudra deux cohortes de 50 rats chacune (une de mâles et une de femelles). Ce nombre permettra d’avoir assez d’individus répartis dans les nombreux profils de polyconsommation possibles (6 au total, en incluant la possibilité d’un mono-usage d’alcool ou de cocaïne), tout en tenant compte d’un taux d’attrition estimé à 20 pourcents après 5 à 6 mois d’expérience. Donc le nombre total d’animaux utilisés pour répondre aux trois objectifs du projet sera égal à 300 rats. Les résultats seront analysés grâce à des tests statistiques appropriés.

Raffinement

Les animaux seront logés par groupe de 2 dans des cages munies d’un environnement enrichi afin de limiter le stress et l’ennui. Toutes les chirurgies (30 min en moyenne par animal) seront réalisées sous analgésie (anti-inflammatoire non-stéroïdien), sous anesthésie chimique (mélange de kétamine et de xylazine) et en conditions aseptiques sur couverture chauffante. En fin de chirurgie, l’animal recevra une injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl) pour favoriser la réhydratation. L’animal sera ensuite placé dans une cage de réveil sur une couverture chauffante jusqu’au réveil avec libre accès à l'eau et à la nourriture. Après le réveil complet, l'animal sera relogé dans sa cage de stabulation avec son congénère. Les animaux seront sous surveillance quotidienne afin de pouvoir détecter d’éventuels signes d'inconfort, de stress ou de douleur et y remédier rapidement. Nos méthodes d’interventions pour réduire ou supprimer l’inconfort ou la douleur seront gradées. Quand nous constaterons les premiers signes d'inconfort chez un animal, nous mettrons en place des mesures pour faciliter l'accès à l’alimentation (nourriture posée sur le sol de la cage). Si cela ne suffit pas, l’animal recevra plusieurs doses d’analgésique (anti-inflammatoire non-stéroïdien). L'animal sera aussi réhydraté par injection sous-cutanée de sérum physiologique (NaCl). Enfin, si cela ne suffit pas au bon rétablissement de l'animal, celui-ci sera mis à mort sans souffrance.

Choix des espèces

Le choix du rat de laboratoire (R. Norvegicus) constitue une sorte de compromis phylogénétique. Cette espèce est suffisamment proche d’H. Sapiens d’un point de vue phylogénétique (même classe [Mammalia], divergence de leur ancêtre commun il y a environ 100 millions d'années) pour servir de modèle animal valide des phénomènes d’addiction par rapport à d’autres espèces moins sensibles éthiquement (par exemple, les invertébrés, à l’exception sans doute des céphalopodes) et en même temps suffisamment éloignée par rapport à d’autres espèces plus sensibles (par exemple les primates non-humains). Les espèces invertébrées (par exemple, C. Elegans, D. Melanogaster, A. Californica) peuvent être utilisées pour élucider certains mécanismes neuronaux ou génétiques de certains effets comportementaux des drogues mais l’organisation nerveuse et comportementale de ces espèces est beaucoup trop éloignée de celle de l’être humain pour constituer des modèles animaux valides dans le domaine des addictions. Les animaux utilisés seront tous de jeunes adultes en fin d’adolescence au début des expériences (âge moyen 2 mois et demi). Cette période du développement correspond à la période de plus grande vulnérabilité face à l’addiction

Jusqu'à trois séances d'IRM de trois heures sous anesthésie, avec quatre prises de sang par séance et des bouchons de mousse enfoncés dans les conduits auditifs pour amortir le bruit de l'aimant : 228 souris vont être utilisées ainsi, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est soumise six semaines à un régime hyperlipidique qui provoque hyperlipidémie et résistance à l'insuline. L'objet est de suivre l'effet de la neuro-inflammation d'origine alimentaire sur l'activité cérébrale, le cerveau étant prélevé après la mise à mort. Le porteur qualifie pourtant ces procédures de "non-invasives" et estime que le régime n'altérera pas "drastiquement" la qualité de vie des souris.

Objectifs

L'un des plus grands défis dans un environnement obésogène tel que nos sociétés modernes est la gestion du poids à long terme, la plupart des tentatives de perte de poids se soldant par une reprise de poids ultérieure (effet "yo-yo"). Le système nerveux central joue un rôle clé dans le maintien de la balance énergétique en régulant les apports (comportement alimentaire, incluant les dimensions homéostatiques et hédoniques) et les dépenses énergétiques. La plupart des études se sont intéressées à la régulation homéostatique du comportement alimentaire. De nombreuses études ont ainsi montré chez la souris mais aussi chez l’Homme qu’une exposition chronique à un aliment riche en lipides (connue pour conduire à terme à une surchage pondéral voire une obésité) conduit à des modifications neuro-anatomiques, une neuro-inflammation, et ce particulièrement au niveau de l’hypothalamus. Malgré l'accumulation de preuves révélant les interactions entre les régulations homéostatiques et non-homéostatiques du comportement alimentaire, des données manquent sur l’effet d’une exposition chronique à une alimentation hypercalorique sur les réseaux cérébraux sous-jacents. De plus peu de données existent concernant l’effet de la neuro-inflammation induite par un régime riche en lipides sur l’activité cérébrale.

Bénéfices attendus

Les données issues de ce projet contribueront à une meilleure compréhension de l’effet de la neuro-inflammation induite par le régime hyperlipidique sur l’activité cérébrale et la connectivité fonctionnelle et éclaireront sur les mécanismes cérébraux qui sous-tendent les modifications du comportement alimentaire (y compris dans l’addiction à la nourriture, le « binge eating » ou l’anorexie). De plus, l’approche par imagerie dans le modèle animal est non seulement une méthode non-invasive mais également une approche facilement transférable à l’Homme.

Procédures

Les souris seront soumises à des anesthésies pour l'acquisition par IRM. Une session d'acquisition durera au maximum 3h et une souris réalisera au maximum 3 sessions d'acquisition. Dans la procédure 1, des prises de sang seront effectuées pour mesurer la glycémie. Elles dureront quelques secondes et seront au nombre de 4 par session d'acquisition IRM pour chaque animal. Dans la procédure 3, une partie des souris sera exposée à un régime hyperlipidique pendant 6 semaines.

Impact sur les animaux

La prise chronique sur des temps longs (>8 semaines) d’un aliment HFD conduit à une prise de poids, des perturbations métaboliques et des modifications de l’activité locomotrice et potentiellement de l’humeur. La période d’exposition au HFD de 6 semaines dans notre projet perturbera le métabolisme des animaux (hyperlipidémie, résistance à l’insuline) mais n’altérera pas drastiquement, à ce stade, la qualité de vie des animaux. Les nuisances liées à l'IRM étant de nature sonores, des protections auditives en mousse seront positionnées dans le conduit auditif des animaux afin d'éviter une dégradation de leur audition.

Devenir

A l'issue des procédures les animaux seront mis à mort selon la réglementation en vigueur. Le contrôle de l'intensité de l'inflammation par des approches de biologie moléculaire nécessite le prélèvement du cerveau et donc l'euthanasie des animaux. D'autres organes pourront être prélevés pour des analyses tissulaires post-mortem complémentaires (par ex: tractus digestif). Un entraînement et le raffinement des gestes techniques employés seront réalisés en amont des prélèvements décrits précédemment.

Remplacement

Cette étude de mesure de la neuroinflammation, de l’activité cérébrale et la de connectivité fonctionnelle entre des structures cérébrales ne peut être réalisée in vitro ni modélisée in silico. En effet, le nombre, la complexité des structures cérébrales mises en jeu, leur activité et leurs interactions dans un contexte intégré ne permet pas de réaliser cette étude sur des modèles cellulaires qui sont insuffisamment représentatifs à l'heure actuelle. De plus, dans la perspective de pouvoir transposer les données générées dans cette étude à l'Homme, l'utilisation d'animaux présentant une bonne analogie fonctionnelle ainsi qu'une bonne homologie anatomique, physiologique et génétique avec l'Homme est requise. Dans cette étude, les travaux seront menés sur la souris.

Réduction

Le nombre d’animaux prévu a été déterminé grâce à des données publiées générées par les responsables du projet. Le nombre d’animaux prévu permet d’effectuer des analyses statistiques qui permettront de déterminer la pertinence de poursuite ou non de la méthode mise au point. Plus précisément, pour les différents paramètres d'imagerie considérés, des tests statistiques permettant une analyse temporelle et/ou de l'effet de traitements entre plusieurs groupes et/ou de l'effet sexe des animaux lors de mesures répétées en utilisant des tests paramétriques ou non paramétriques selon la distribution des données. Grâce à l'utilisation d'un suivi longitudinal (mesures répétées chez un même animal), le nombre total d'animaux inclus dans l'étude est réduit.

Raffinement

Les procédures expérimentales prévues sont non-invasives. Les prélèvements pour l’analyse histologique sont post-mortem. Le suivi du poids et une observation clinique quotidienne des souris permettront d’évaluer les points limites. La durée d’exposition à l’aliment HFD permet de limiter les conséquences négatives sur l’animal.

Choix des espèces

Le modèle souris est largement utilisé pour les recherches sur le comportement alimentaire, notamment dans l’obésité en raison de ses réponses reproductibles permettant une robustesse des résultats générés. L’abondance des données dans la littérature sur les mécanismes de régulation de la prise alimentaire dans cette espèce permet d’autre part le raffinement des méthodes (outils analytiques disponibles évitant la mise au point de certaines méthodes sur des animaux supplémentaires). Enfin, nous disposons déjà de données préliminaires sur ce modèle animal. Nous avons décidé de travailler sur individus « jeune adulte » âgées de 7-8 semaines pour éviter les effets liés au développement d’une part et au vieillissement d’autre part.

Former des techniciens à trois examens fonctionnels et caler les protocoles : 64 souris vont être utilisées pour cela, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque animal subit les trois actes, une exploration respiratoire de 22 minutes, une échographie musculaire de 30 à 60 minutes sous anesthésie générale, puis une mesure de la force de flexion du pied sous anesthésie, avec des aiguilles de stimulation plantées dans le muscle. Le porteur signale des réveils spontanés possibles, des détresses respiratoires pendant l'anesthésie et des douleurs post-opératoires liées aux piqûres. Il présente l'opération comme un moyen de réduire "considérablement" le nombre d'animaux dans les projets à venir, et précise que ces 64 souris étaient de toute façon promises à la mort, leur génotype ne servant aucun projet.

Objectifs

L’objectif de cette demande a pour but de développer nouvelles techniques in vivo chez la souris contribuant à l'avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires et de former les applicateurs. La mise en place de ces études permettra d’ajouter de nouvelles évaluations et ainsi proposer aux équipes de recherche des projets plus complets. Les différents actes réalisés seront l’échographie de muscles squelettiques, l'évaluation de la fonction respiratoire et de la force générée lors d’une flexion du pied. La technique d’élastographie par échographie permet de mesurer l'élasticité des différents tissus dans un muscle d'intérêt. Cette technique, nécessitant seulement une anesthésie générale, a pour but d’observer le développement des différents tissus composant le muscle dans les modèles murins de maladies neuromusculaires. Cet examen peut être réalisé plusieurs fois permettant un suivi régulier sur un même lot expérimental. Le nombre d’animaux inclut dans les projets scientifiques sera considérablement réduit et favorisera l’obtention de meilleurs résultats en éliminant la variabilité inter-individuelle. Le pléthysmographe est une exploration fonctionnelle respiratoire. Elle mesure l’ensemble des volumes gazeux pulmonaires. Cela indiquera également la contribution du diaphragme dans le système respiratoire. Cet examen est rapide, indolore et non invasif pour l’animal. L’évaluation de la force générée lors d’une flexion plantaire consiste à mettre en évidence les défauts de contractilité musculaire. Elle se déroule sous anesthésie générale accompagnée d’un analgésique et n’est pas terminale. Ces évaluations pourront être répétées sur un même lot expérimental permettant un suivi régulier de l’évolution des symptômes de la maladie neuromusculaire. Cette technique permettra de réduire considérablement le nombre d’animaux utilisés dans les projets scientifiques.

Bénéfices attendus

L’objectif de cette demande a pour but de développer de nouvelles techniques in vivo contribuant à l'avancée de la recherche sur les maladies neuromusculaires et de former les applicateurs. La réalisation de cette étude pilote peut s'avérer très utile pour la détermination précise des points limites, et pour la formation complète des techniciens. Cette étude utilisant un nombre restreint d'animaux peut aider à déterminer la durée de l’acte et la fréquence des observations nécessaires des lots dans les futurs projets expérimentaux. Ce projet de formation, préliminaire aux études des équipes de recherche peut également donner une indication de la variance des réponses entre les groupes de traitement, laquelle peut être alors utilisée pour estimer plus précisément la taille appropriée des groupes des projets expérimentaux. De plus, mener une expérience pilote offre l'occasion de se familiariser avec les signes et symptômes attendus et de conseiller au mieux les concepteurs de projets par la suite.

Procédures

La totalité des animaux inclus dans ce projet seront soumis aux trois techniques d'études fonctionnelles décrites : - L'évaluation de la fonction respiratoire sera réalisée 1 seule fois par animal et durera approximativement 22 minutes. - Une échographie de muscles squelettiques réalisée également 1 seule fois par animal. L'examen durera 30 à 60 minutes et se réalise sous anesthésie générale. - L'évaluation de la force musculaire lors d'une flexion plantaire sera le dernier test effectué 1 seule fois par animal. Il nécessite l'anesthésie des animaux et l'ajout d'un anti-douleur. Il dure environ 15 à 20 minutes. Ces trois actes consitant à analyser trois paramètres physiologiques permettront d'évaluer l'efficacité d'un nouveau traîtement thérapeutique, de caractériser un nouveau modèle murin de maladies neuromusculaires. Ces équipements modernes sont similaires à ceux utilisés chez l'homme et vont permettre la réalisation d'étude complète et abouties. Le nombre d'animaux inclut dans les projet expérimentaux s'appliquant à la recherche des maladies neuromusculaires se verra considérablement réduit.

Impact sur les animaux

Lors de la pléthysmographie, seul le stress peut survenir pendant l’acte dû à la manipulation des animaux. Pendant une échographie, le réveil spontané d’un animal peut être attendu ainsi qu’une détresse respiratoire lors de l’anesthésie. Lors de l'évaluation de la force générée lors d'une flexion plantaire, les nuisances tels qu’un réveil spontané, une détresse respiratoire, des douleurs post-opératoires dues aux piqûres des aiguilles de stimulation et à la contraction involontaire appliquée peuvent être attendus. Durant la semaine de stabulation suivant l’échographie, le stress et l’inconfort dû au réveil après l’anesthésie générale est à prévoir.

Devenir

Les animaux utilisés dans cette procédure étaient initialement voués à l'euthanasie dû à un génotype sans intérêt pour les projets scientifiques. Ils seront donc euthanasiés à la fin de cette procédure.

Remplacement

Ces techniques qui permettent une analyse fonctionnelle de la physiologie animale suite à des traitements thérapeutiques ne peuvent être remplacées actuellement par des méthodes alternatives ou in vitro. Tous les projets nécessitant l'utilisation de ces techniques pour évaluer les nouveaux traitements thérapeutiques en cour de test utilisent les modèles murins qui restent une source unique et indispensable permatant l'évaluation d'une amélioration histologique et fonctionnelle induite par les traitement testés. Les modèles de culture in vitro disponibles ne permettent pas de récapituler la complexité physiologique in vivo. Cette étude permettra d’inclure au sein d’un même projet un ensemble de techniques qui amènera à la réalisation d’une recherche plus complète et aboutie.

Réduction

Cette étude pilote utilise un nombre d’animaux restreint et donnera une meilleure estimation du nombre nécessaire d’animaux dans la réalisation de ces actes au sein des projets expérimentaux. Les souris utilisées seront celles issues de la reproduction de lignées et qui étaient vouées à l'euthanasie à cause de leur mauvais génotype (sans phénotype dommageable). 10 animaux par sexe pour les groupes "jeunes" et "adultes" et 12 animaux par sexe pour le groupe "agées" sont nécessaires pour maitriser parfaitement les techniques, déterminer la taille des cohortes appropriées, la fréquence des observations nécessaires à l’établissement d’un point limite. Ce nombre est également suffisant pour déterminer la variance des réponses entre les futurs groupes de traitement. Aucun test statistique ne sera utilisé pour cette étude. Le nombre total des animaux s'inscrivant dans ce projet est de 64.

Raffinement

L’ensemble des animaux sera hébergé en pièce de stabulation dans des portoirs ventilés. Ces pièces sont équipées de cycle jour/nuit permettant un cycle de réveil et de sommeil constant et sain pour l’animal. Ils auront accès à de la nourriture et de l’eau (système d’abreuvement automatique) à volonté. Les zootechniciens de l’animalerie s’occuperont du nettoyage de la litière une fois par semaine et mettra dans chaque cage de l’enrichissement (maisonnettes et lanières de papier kraft (nid)). La température et l’hygrométrie seront contrôlés quotidiennement. Les animaux sélectionnés seront au minimum 2 et maximum 5 par cage. Aucun animal isolé ne sera choisi pour ce projet. Les animaux seront surveillés quotidiennement tout au long du projet en suivant la grille de scoring. Afin d’éviter le stress lors de la pléthysmographie, une séance d’entrainement est prévue deux jours avant. Suite aux 30 minutes d’anesthésie pendant l’échographie, seul un stress de réveil peut être ressenti par l’animal. Une semaine de stabulation sera appliquée afin de l’éviter au maximum. Si des douleurs légères post-opératoires (selon grille de scoring) sont observées après l'évaluation de la force de la flexion plantaire, une injection sous-cutanée d’analgésique sera réalisée.

Choix des espèces

La souris est le modèle commun le plus utilisé par les équipes de recherche, de l'animalerie expérimentale, œuvrant pour la recherche sur les maladies neuromusculaires. Les trois stades de développement chez les souris (jeunes/adultes/vieilles) ont été choisis afin d’expérimenter en fonction de la taille et du poids changeant des animaux, de comprendre les différents résultats obtenus pour chaque lot et de préciser les points limites pouvant être modifié avec l’âge.