Système nerveux

95 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Tous reçoivent une injection directe dans le liquide céphalorachidien sous anesthésie, 64 subissent en plus une chirurgie préparatoire d'une heure la veille de l'imagerie, et 32 d'entre eux portent un "chapeau" implanté au cours d'une chirurgie supplémentaire pour être imagés éveillés, après une à deux semaines d'habituation. Le porteur reconnaît qu'une injection mal placée peut endommager le tronc cérébral et provoquer une perte de poids, une incapacité à marcher ou une perte de conscience. Sur le remplacement, il affirme en une phrase que l'étude des interactions entre système vasculaire et système glymphatique ne peut pas être menée in vitro.

Objectifs

Le système glymphatique est une découverte récente qui joue un rôle crucial dans le cerveau. Il aide à circuler le liquide céphalo-rachidien, qui apporte des nutriments et nettoie le cerveau en éliminant les déchets. Ce système est également essentiel pour que les médicaments injectés directement dans ce liquide se répandent efficacement dans le cerveau, ce qui est nécessaire pour le traitement de certaines maladies. Toutefois, nous comprenons encore mal comment ce système fonctionne, notamment l'effet des changements de diamètre des vaisseaux sanguins du cerveau sur ce processus de nettoyage. Pour mieux comprendre ces mécanismes, nous voulons développer et utiliser des techniques d'imagerie du cerveau de pointe (tomographie par émission de positons et imagerie fonctionnelle ultrasonore). Ces techniques nous permettront d'observer comment le système glymphatique opère sous différentes conditions, telles que pendant le sommeil, l'éveil, l'anesthésie, ou lorsque les vaisseaux sanguins du cerveau changent de taille de manière rythmique. Ces recherches, menées sur des rats, ont pour but d'améliorer notre compréhension du nettoyage du cerveau et de la distribution des médicaments.

Bénéfices attendus

La modulation du système glymphatique à des fins thérapeutiques, que ce soit pour augmenter l’élimination des déchets toxiques dans les maladies neurodégénératives ou encore pour améliorer la diffusion de médicaments par voie intrathécale dans diverses indications (notamment les maladies neurologiques génétiques) présente un grand potentiel thérapeutique. Ce potentiel est pour le moment sous-exploité par manque de compréhension des mécanismes qui régissent ce système, malgré la mise en évidence récente d’un rôle du tonus vasculaire cérébral. Cette étude sera donc très importante pour le développement d’outils de neuroimagerie adaptés à l’étude simultanée du système vasculaire et du système glymphatique, permettant à moyen terme de mieux comprendre comment amplifier le fonctionnement du système glymphatique par le biais du système vasculaire dans un but thérapeutique.

Procédures

La totalité des animaux de l’étude recevra une injection directe dans le liquide céphalo-rachidien sous anesthésie (15 minutes), soit 95 rats. En termes d’imagerie, 15 rats ne seront exposés à aucune autre nuisance, 16 rats recevront une seule session terminale d’imagerie de tomographie par émission de positons d’une durée d’une heure maximum sous anesthésie, 48 rats recevront une première session d’imagerie ultrasonore d’une durée d’une heure, suivie d’une session d’imagerie de tomographie par émission de positons de 30 minutes et 16 animaux recevront une seule session d’imagerie ultrasonore d’une durée d’une heure. Les rats utilisés en imagerie ultrasonore, soit 64 rats, recevront tous une procédure de chirurgie préparatoire à l’imagerie sous anesthésie et analgésie (durée 1h) la veille de recevoir l’examen d’imagerie ultrasonore. Cette imagerie se fera sous anesthésie terminale pour 32 rats, pour les 32 autres, elle se fera sans anesthésie (nécessitant une semaine avant l’imagerie une première chirurgie de pose d’un chapeau nécessaire à l’imagerie éveillée, sous anesthésie pendant 1h, suivie d’une période d’habituation progressive aux sessions d’imagerie sur une à deux semaines - sessions d’habituation croissantes, de 5 minutes les premiers jours à 1 heure le dernier jour).

Impact sur les animaux

L’injection directe dans le liquide céphalo-rachidien est une injection modérément invasive. Bien réalisée, elle n’induit pas de signe indésirable neurologique. Des complications peuvent apparaitre en cas de dommage du tronc cérébral (perte de poids, inabilité à marcher, perte de conscience). L’imagerie ultrasonore nécessite une chirurgie préparatoire, ce qui peut occasionner une inflammation locale, et éventuellement une chirurgie pour l’implantation d’un chapeau chez les animaux prévus pour un examen d’imagerie éveillé, ce qui peut occasionner une gêne et une inflammation locale.

Devenir

Tous les animaux sont euthanasiés à la fin de chaque procédure pour prélèvement et analyses histologiques.

Remplacement

L’objectif de l’étude est de mieux comprendre les interactions entre le système vasculaire et le système glymphatique dans le système nerveux central cela ne peut donc pas être atteint avec des modèles in vitro.

Réduction

Selon notre expérience en termes de variabilité et de taille d’effet sur ces données d’imagerie, le nombre d’animaux par groupe pour les techniques d’imagerie in vivo a été estimé à 8 sur la base d’un calcul de puissance statistique. Les mêmes animaux seront étudiés pour l’étude du système glymphatique et du système vasculaire, permettant une réduction du nombre d’animaux.

Raffinement

Les injections et la chirurgie seront réalisés sous anesthésie générale et analgésie locale. Les animaux seront surveillés régulièrement grâce à une grille de score et des points limites adaptés prenant en compte les éventuels troubles liés à l’injection, l’amincissement du crâne et la fixation du chapeau. En cas de signes de détresse, (une perte de poids> 20 % ; respiration difficile ; comportement très altéré - vocalisations non sollicitées, ou immobilité ; œdème ou écoulement au niveau du point d’injection ; atteinte d’un score global trop élevé – voir grille de scores), la procédure sera interrompue et la mise à mort de l’animal serait effectuée. Pour les examens d’imagerie effectués chez les animaux vigiles, les rats seront progressivement habitués à la procédure au préalable afin de limiter tout stress.

Choix des espèces

Le rat est une espèce utilisée très régulièrement dans le développement préclinique de médicaments en général, et l’étude physiopathologique du système nerveux central. Il s’agit également d’une espèce bien adaptée aux méthodes d’imagerie que nous souhaitons utiliser pour l’étude du système vasculaire et du système glymphatique. Adulte, afin d’étudier les mécanismes de biodistribution des molécules injectés et le système glymphatique sur des cerveaux pleinement développés.

Biopsiés vigiles avant sept jours de vie pour le génotypage, gavés chaque jour du quatorzième au vingt-et-unième jour, les souriceaux attendent ensuite des mois avant des tests comportementaux à neuf ou dix mois, certains répétés six jours de suite. 802 souris porteuses d'une mutation qui déclenche une maladie d'Alzheimer vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Le porteur signale une diarrhée possible après les antibiotiques, une perte de poids, et une agressivité qui augmente avec l'âge, source de bagarres et de blessures. Une partie de l'effectif ne sert qu'à maintenir la lignée et sera tuée en fin de période reproductive, sans même un prélèvement.

Objectifs

La maladie d’Alzheimer (MA) est une pathologie incurable, diagnostiquée des années après son début. Comprendre les altérations pathologiques cliniquement silencieuses au stade latent de la maladie (c'est-à-dire avant les premiers déficits de mémoire et la neurodégénérescence irréversible) est essentiel pour identifier de nouvelles cibles pour un traitement précoce et probablement plus efficace. Depuis quelques années, le microbiote intestinal est reconnu comme un important acteur en santé humaine. Des dysbioses (altérations quantitatives, qualitatives et fonctionnelles) ont été décrites dans de nombreuses pathologies intestinales mais également dans de nombreuses maladies psychiatriques (autisme, anxiété, dépression) et neurodégénératives (MA, maladie de Parkinson). Cependant, le lien entre microbiote intestinal et santé humaine est encore majoritairement basé sur des corrélations, et des études fonctionnelles sont nécessaires afin de mieux comprendre ce lien et de pouvoir proposer des thérapies efficaces et potentiellement personnalisées, ciblant le microbiote intestinal. Dans le cas de la MA, le microbiote des patients au stade avancé de la maladie est caractérisé par une augmentation du nombre des bactéries pro-inflammatoires et une diminution des bactéries anti-inflammatoires. La modulation du microbiote peut ralentir la pathologie de la MA et améliorer les performances cognitives chez les patients au stade précoce de la MA dont l’alimentation a été supplémentée par les bactéries anti-inflammatoires. L'objectif principal de notre projet est d’étudier l'impact de la modification du microbiote par un traitement antibiotique sur l'activité neuronale qui survient très tôt dans la pathologie et d’évaluer ses conséquences sur le dysfonctionnement cognitif qui en découle, mais n’est détectable qu’à des stades avancés. A terme, ce projet devrait permettre de mieux comprendre des aspects émergents de la physiopathologie de la MA, et ouvrir de nouvelles pistes dans le développement de stratégies innovantes pour le traitement de cette maladie neurodégénérative plus précoce et donc probablement plus efficaces qu’actuellement.

Bénéfices attendus

Ce projet fait permettra d’évaluer l’impact du traitement antibiotique sur les capacités cognitives et les performances sensori-motrices des animaux aux stades symptomatiques de la maladie d'Alzheimer. S’il s’avère que la modulation de microbiote intestinal a un impact bénéfique sur la progression de la maladie d’Alzheimer en atténuant ou en ralentissant la détérioration des fonctions cognitifs, nos recherches pourraient révéler les aspects émergents de la physiopathologie de la maladie d’Alzheimer, et ouvrir de nouvelles pistes dans le développement de stratégies innovantes pour le traitement non-invasif de cette maladie neurodégénérative incurable qui est à ce jour la plus fréquente des maladies neurodégénératives avec 1 million de malades en France et 35,6 millions de malades dans le monde.

Procédures

Les animaux modèles de la Maladie d’Alzheimer développent une maladie neurodégénérative avec des déficit cognitif au cours du temps. Les animaux seront identifiés génétiquement à l’aide d’une biopsie (faible taille) effectuée de manière précoce sur animal vigile. Au cours de ce projet, les animaux seront soumis à des administrations orales quotidienne durant 7 jours entre 14 et 21 jours de vie (environ 20 secondes par administration). Deux prélèvements sanguins seront réalisés au maximum sur chaque animal vigile (environ 30 secondes à 1 minutes par prélèvement). Les animaux seront prélevés à 2 semaines avant et au moment de l’euthanasie pour réaliser les différentes analyses nécessaires. Des tests comportementaux seront effectués à l’âge de 9-10 moise afin d'évaluer les capacités cognitives des animaux. Ces tests durent entre 5 et 20 minutes chacun ; certains ne sont effectués qu’une seule fois, d’autres sont répétés tous les jours pendant 6 jours. Les souris seront habituées au lieu d’évaluation au préalable et auront un repos de 24h minimum entre chaque test. Enfin, les animaux seront euthanasiés par une méthode réglementaire à l’issue de la période de maintien prévue en vue des prélèvements et analyses.

Impact sur les animaux

Les souris utilisées dans le projet développent une maladie neurodégénérative avec des déficits cognitifs au cours du temps. Cela pourrait entrainer des troubles du comportement et potentiellement une agressivité accrue avec l’âge source de bagarre et donc de blessures/lésions potentielles (rare). La biopsie effectuée chez les souriceaux vigiles de moins de 7 jours permettant l’identification génétique des animaux peut être génératrice de stress, d’inconfort et d’une douleur de courte durée. Un léger stress thermique est possible lors de la réalisation de cet acte en raison de la sortie des petits du nid durant quelques instants. La diarrhée pourrait survenir suite au traitement aux antibiotiques chez les souriceaux. Toutefois, ces troubles se résolvent spontanément sans mortalité associée. Un autre effet indésirable est la perte du poids, la raison pour laquelle la surveillance du poids sera inclus dans le protocole. De même, plusieurs prélèvements de sang seront nécessaires et potentiellement générateurs de stress et de douleur. Les tests de comportement seront potentiellement générateurs de stress et ou d’angoisse en raison de la néophobie du modèle rongeur. Enfin, l’anesthésie précédant l’euthanasie des animaux pour les prélèvements implique une injection intrapéritonéale pouvant induire un stress en raison de la contention et une douleur de courte durée liée à la piqûre ainsi qu’un éventuel stress thermique ou en cas de mauvaise réaction pouvant conduire à une détresse respiratoire.

Devenir

A l’issue des procédures, les animaux seront tous euthanasiés par des méthodes réglementaires. Une première partie dans le cadre du maintien des lignées sera euthanasiés en fin de période reproductive sans réalisation de prélèvement. Une seconde partie euthanasiée afin de prélever les organes pour réaliser différentes analyses biologiques.

Remplacement

L’ensemble de ce projet vise à évaluer le lien entre microbiote intestinal et fonctionnement cognitif dans le contexte de la Maladie d’Alzheimer. Il nécessite donc l’utilisation d’un organisme vivant et intégré, incluant et modélisant au mieux la physiologie du système nerveux central et de ses altérations, ainsi que ses interactions complexes et encore mal connues avec le microbiote intestinal. Il n’est pas possible de recréer in vitro la complexité d’un organisme entier avec tous les acteurs cellulaires rentrant en jeu les différents types de cellules tels que les neurones, cellules microgliales et astrocytes dans le cerveau et les cellules épithéliales qui forment la barrière intestinale.

Réduction

Ce projet impliquera un total de 802 animaux. Nous limitons au maximum le nombre d’animaux par groupe de façon à obtenir des résultats statistiquement fiables. A cause des variabilités individuelles et intergroupes, qui augmentent avec l'âge, un nombre trop restreint d’animaux engendrerait des résultats trop variables et non valides. Compte tenu des données de la littérature (variabilité attendue), des résultats obtenus sur notre précédent projet et d’après nos expériences sur le sujet, nous avons définis la taille des groupes expérimentaux afin d’utiliser le minimum d’animaux requis tout en assurant une validité des effets attendus. De plus, une partie de l’effectif est dédié au maintien de la lignée transgénique (élevage). Les procédures expérimentales ont été affinées pour éviter l'utilisation inutile de souris. Les souris utilisées pour une partie des analyses biologiques seront les mêmes animaux que ceux utilisés pour les tests comportementaux dans un souci de réduction. Par ailleurs, une analyse statistique sera réalisée et nous adapterons chaque test statistique en fonction du type de résultats et d’analyse à effectuer.

Raffinement

Dans la réalisation de ce projet, l’ensemble des procédures a été mise au point afin de permettre une interprétation fiable dans le respect du bien-être animal, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, formation, suivi, etc.). Les conditions d’hébergement sont conformes à la réglementation, les animaux disposent de nourriture et d’eau ad libitum. Le milieu est enrichi à l’aide de coton de nidification ou de maison de type igloo. Nous nous efforçons à chaque instant de raffiner nos procédures afin de garantir le bien-être des animaux en cours de procédure grâce à une surveillance attentive (point limite) et des soins adaptés (anesthésie, analgésie, etc.). De plus, la lignée utilisée est déjà bien caractérisée et connue de l’équipe, et les actes mis en œuvre sont parfaitement maitrisés par le personnel et adaptés au modèle animal. En cas d’agressivité accrue, nous mettrons en place un renforcement de l’enrichissement incluant plusieurs éléments (matériel de nidification en coton et bois, refuge type igloo en polycarbonate rouge transparent, bâton à ronger, etc.) permettant de prévenir augmentation de l'agressivité avec l'âge. Concernant les troubles pouvant être liés aux traitements antibiotiques administrés oralement, nous mettrons en place un suivi rigoureux incluant le suivi de la bonne croissance et de la qualité des fèces.

Choix des espèces

Justification de l’espèce : La souris est une espèce largement caractérisée et validée chez laquelle ont été développés de nombreux modèles expérimentaux des pathologies neurodégénératives telle que la Maladie d’Alzheimer. Nous utiliserons un modèle de souris transgénique qui développe la maladie d’Alzheimer au cours du temps. Justification des stades de développement : Dans le cadre de l’entretien des modèles transgéniques à phénotype potentiellement dommageable, les animaux seront utilisés à partir de la maturité sexuelle (8 semaines). Les animaux seront traités aux antibiotiques avant sevrage (J14 à J21) ce qui correspond à une fenêtre de temps cruciale au cours de laquelle les interactions hôte-microbiote intestinal participent au développement des systèmes nerveux et immunitaires. Les animaux seront ensuite analysés à différents âges : - à 7 semaines et 3 mois, des souris seront analysés pour évaluer l'impact précoce du traitement antibiotique. - à 9-10 mois qui correspond au stade déclaré (symptomatique) de la maladie afin de réaliser les tests de comportement.

2 190 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Une partie subit une chirurgie cérébrale d'environ une heure, porte des fibres optiques sur la tête pendant les enregistrements et passe une semaine seule en cage calorimétrique, cinq jours d'adaptation puis deux jours de mesure. Les autres reçoivent des injections intrapéritonéales, des tests de métabolisme du glucose de quatre heures et des prélèvements de sang sur animal vigile, avec une biopsie de la queue pour les lignées transgéniques. Les retombées annoncées contre l'obésité restent au conditionnel et à long terme, alors que la mise à mort de toutes les souris pour prélever des tissus est déjà programmée.

Objectifs

Le contrôle de la balance énergétique par l'hypothalamus est la résultante d'un équilibre entre l'apport et la dépense énergétique. Cette régulation repose sur la capacité du cerveau à intégrer les signaux provenant des organes périphériques, indiquant les états nutritionnels et énergétiques de l'organisme et à établir des réponses appropriées. Cependant, l'altération de cet équilibre, due à notre environnement alimentaire moderne, peut conduire au développement de troubles métaboliques associés au surpoids et à l'obésité. Malgré les avancées et les progrès accomplis, nous continuons à rechercher des stratégies innovantes et plus efficaces pour lutter contre cette pathologie. Les hormones jouent un rôle majeur dans le maintien de nos fonctions biologiques et régulent de manière critique le développement du cerveau. Cependant, malgré l’importance grandissante donnée aux hormones dans la régulation des fonctions du cerveau, leur mode d’action reste encore largement inconnu. De plus, de nombreuses hormones n’ont pour le moment pas encore été étudiés pour leur effet sur le cerveau. C’est en particulier le cas d’une hormone produite par les glandes parathyroïdiennes : la parathormone ou l’hormone parathyroïdienne. L’hormone parathyroïdienne, sécrétée par la glande parathyroïde est connue pour être impliquée de façon majeure dans l’intégrité des os. Cependant, son rôle dans le contrôle du métabolisme et de la prise alimentaire est très peu connu. Notre projet s’inscrit donc plus précisément dans l’identification et la caractérisation du mode d’action de cette hormone et l’implication de cette dernière dans le contrôle du comportement alimentaire à travers des études réalisées sur des modèles animaux. La règle des trois R sera respectée, le nombre d’animaux sera réduit au minimum en optimisant au maximum les groupes expérimentaux (réutilisation des animaux dans différentes procédures n'entrainant pas de douleur ou de stress) et en raffinant les procédures pour réduire au minimum la douleur, la souffrance et l'angoisse des animaux.

Bénéfices attendus

Les dernières estimations de l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS) révèlent qu'en Europe, plus de la moitié des hommes et des femmes sont en surpoids, et environ un tiers sont obèses. Cela constitue, de ce fait, un fardeau social, économique et sanitaire. Bien que certains traits génétiques (causes monogéniques) aient été identifiés, il est largement reconnu que le syndrome métabolique est par essence un trouble multifactoriel et multidimensionnel qui englobe des réseaux complexes d'inadaptations physiopathologiques en aval. Cependant, et malgré les progrès et les efforts récents, nous sommes toujours confrontés à un besoin de stratégies innovantes et plus efficaces contre les troubles métaboliques. Ce projet vise ainsi à établir un nouveau cadre conceptuel impliquant le rôle du système PTH/PTH1R dans la régulation des processus métaboliques induits par les neurones AgRP. Cette nouvelle régulation de l'équilibre énergétique par le cerveau offre un cadre idéal pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques qui peuvent prévenir les défauts de répartition des nutriments induits par l'obésité. Ce projet nous permettra d'identifier des rôles encore insoupçonnés du PTH1R hypothalamique et de son ligand PTH dans la régulation intégrée du métabolisme du corps entier. En outre, à long terme, les stratégies virales utilisées par ce projet pourraient être plus facilement adaptées et transposées aux troubles humains que les procédures chirurgicales invasives actuellement utilisées en thérapie (sleeve gastrectomie, bypass gastrique).

Procédures

Pour 5 lots à une chirurgie (environ 1h) (classe modérée), puis après une période de repos, les animaux seront soumis à des tests de comportements et/ou de métabolisme du glucose (environ 4h pour chaque test) (classe légère). Pour les études calorimétriques réalisées sur 2 lots d'animaux, environ 1 semaine de procédure est envisagée (environ 5 jours pour permettre aux animaux de s'adapter à l'individualisation et environ 2 jours pour l'enregistrement) (classe légère). Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront fait sur deux de ces lots (classe légère). -pour 4 lots, les animaux seront soumis à des injections de différents modulateurs par voie intrapéritonéale et à des tests de comportement et/ou de métabolisme du glucose (environ 4h pour chaque test) (classe légère). Pour les études calorimétriques réalisées sur 1 lot d'animaux, environ 1 semaine de procédure est envisagée (environ 5 jours pour permettre aux animaux de s'adapter à l'individualisation et environ 2 jours pour l'enregistrement) (classe légère). Des prélèvements sanguins sur animaux vigiles seront fait sur un lot (classe légère). Pour 1 lot de souris à une chirurgie (classe modérée), les souris vont porter des fibres optiques sur la tête pendant les enregistrements ce qui peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement (classe modérée). Pour les souris transgéniques, une biopsie à la queue sera réalisée vers 6 jours (douleur légère de courte durée).

Impact sur les animaux

Le fait de porter des fibres optiques sur la tête de l'animal pendant les enregistrements peut initialement induire un stress. Cela peut entraîner une immobilité ou une mobilité réduite, ce qui constitue un comportement initialement indésirable cependant les fibres étant légères, les animaux s'habituent très rapidement. De plus avant d'imager l'activité neuronale, l'animal sera soumis à plusieurs séances d'habituation d'une durée de 30 min pendant 2 à 3 jours, ce qui lui permettra de s'habituer aux procédures d'enregistrement.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort pour effectuer des prélèvements de tissus.

Remplacement

Dans le cadre de notre projet, nous devons utiliser des souris in vivo. Tout d'abord, nous ne pouvons pas réaliser ces expériences in vitro ou sur cultures de cellules puisque pour notre étude nous avons besoin d'observer les paramètres comportementaux et de physiologie intégrée. De plus, les invertébrés ne possèdent pas les structures cérébrales et endocrines équivalentes aux mammifères pour le contrôle de l'homéostasie énergétique et du comportement.

Réduction

Les groupes expérimentaux ont été créés en considérant la variabilité biologique entre individus et la complexité des procédures envisagées. Le nombre d'animaux utilisé est fortement lié à la puissance statistique afin de s'assurer avec certitude de la validité des résultats obtenus. Afin d'optimiser nos cohortes et réduire le nombre d'animaux transgéniques générés par croisements, nous utiliserons l'ensemble des portées (mâles et femelles).

Raffinement

Les soins apportés aux animaux par le personnel zootechnique et les expérimentateurs a pour but d'améliorer le bien-être des souris en général, et, de réduire, supprimer ou soulager les douleurs dans les procédures invasives en particulier. Pour chaque source potentielle de stress, des mesures bioéthiques sont prises afin de minimiser toute gêne pour l’animal. Les sources de souffrance et l’angoisse des animaux pourraient provenir des conditions d’hébergement et du régime alimentaire. L’accueil est effectué dans une structure d’animalerie agréée en matériel et en personnel. Le milieu de vie en cages d’hébergement est enrichi par des objets adéquats, comme un nid en coton, bâtons de bois ou tunnels en carton. Une visite quotidienne de l’animalerie est organisée pour vérifier l’absence d’anomalie pour les cages, les biberons, les rations alimentaires et le comportement des animaux. Nos protocoles ont été mis au point de façon à veiller au bien-être animal en améliorant leur environnement et en surveillant leur état de santé : notamment nous chercherons à éviter et limiter la douleur et la souffrance, à assurer des soins pré-, per- et postopératoires adéquats, à recourir à l'anesthésie et à l'analgésie, à appliquer les points limites établis préalablement et, enfin, à utiliser les procédures réglementaires et appropriées de mise à mort.

Choix des espèces

Notre étude repose entièrement sur la physiopathologie intégrée et nécessite du modèle rongeur, notamment la souris car celle-ci permet l’utilisation de stratégies transgéniques et virale. Toutes les souris seront utilisées à l’age adulte (au moins 2 mois) afin que les réseaux neuronaux soient stables.

Pour comprendre le rôle de gènes responsables chez l'humain d'une malformation cérébrale appelée hétérotopie, 4 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 171 d'entre elles et modéré pour 1 981. Des femelles gestantes sont opérées quarante-cinq minutes sous anesthésie pour une électroporation in utero, des juvéniles et des adultes subissent une chirurgie de dix minutes sans jamais se réveiller, et des femelles gestantes éveillées reçoivent des injections intrapéritonéales. Le porteur présente l'électroporation comme un moyen de réduire le nombre d'animaux par rapport à la création de lignées transgéniques, tout en portant l'effectif du projet à 4 152 individus. Aucune de ces souris ne peut entrer dans un autre protocole après les injections reçues, et toutes sont tuées pour les analyses histologiques.

Objectifs

Le développement du système nerveux comprend des phases de prolifération et de migration cellulaires et des phases de différenciation au cours desquelles les neurones établissent des connexions entre eux. Il est important d'identifier les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent ces processus pour améliorer notre compréhension du développement normal et physiopathologique du cerveau. L’objectif principal de ce projet est de mieux comprendre les rôles de gènes dont les mutations sont responsables chez l’homme de malformation d’une région du cerveau appelée « hétérotopie ». Notre stratégie repose sur l’étude de souris génétiquement modifiées. Nous avons d’abord étudié une lignée porteuse d’une mutation spontanée responsable d’hétérotopie comme celle observée chez l’homme. Nous avons plus récemment créé d'autres lignées permettant de contrôler l’inactivation du gène spécifiquement dans le temps et l’espace. Ainsi, nous pouvons générer des souris dont la mutation n’est exprimée que pendant la phase de prolifération, alors que chez d’autres souris, la mutation ne sera exprimée que pendant la phase de différenciation des neurones excitateurs. Ces inactivations spécifiques vont nous permettre de décortiquer les mécanismes responsables de l’hétérotopie. En analysant les capacités de prolifération et de différenciation de neurones par des études d'injection de produits et d’immunohistochimie, nous identifierons le défaut primaire lié à une perturbation de ces gènes. L’utilisation de protéines fluorescentes spécifiques de certaines structures subcellulaires nous permettra de préciser et de localiser les anomalies par des techniques dynamiques de videomicroscopie. Nous testerons l’action d’agents pharmacologiques pour pallier les défauts de prolifération, de différentiation et de migration observés aux stades embryonnaires. Nous ferons ensuite des essais de thérapie génique par une approche de chirurgie par électroporation in utero visant à traiter les souris mutantes et donc à mieux comprendre les fonctions des gènes électroporés pendant le développement cortical.

Bénéfices attendus

Les malformations corticales sont des maladies rares (incidence 1: 100000) pour lesquelles les mécanismes pathogéniques et physiopathologiques sont peu étudiés. Elles sont associées à des retards de développement et des déficits intellectuels sévères. S’agissant d’anomalies de neurodéveloppement, les anomalies apparaissent in utéro. L’étude de malformations induites par des mutations génétiques permet de comprendre les mécanismes cellulaires mis en jeu pendant le développement lors de la prolifération, la migration et la différenciation des cellules du système nerveux central. Les mutations génétiques sont très informatives car elles peuvent être modélisées chez l’animal, permettant une vision du développement physiologique in vivo. Les processus sont pour la plupart conservés entre l’Homme et les rongeurs. Les résultats de notre projet pourraient permettre, en inactivant l’expression d’un gène impliqué dans les cellules en division et les neurones de souris, d’identifier des mécanismes cellulaires, subcellulaires et moléculaires clés qui sont pertinents pour identifier de nouvelles cibles thérapeutiques.

Procédures

Femelles gestantes vigiles : une injection d’agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale (1 minute). Juvéniles et adultes : chirurgie sous anesthésie et analgésie, sans réveil (durée : 10 minutes). Femelles gestantes: chirurgie sous anesthésie générale (45 minutes) avec utilisation d’une analgésie (anti-douleur) pré et post opératoire.

Impact sur les animaux

L’injection intrapéritonéale implique une douleur légère au point de piqûre ainsi qu’une contention et donc un stress momentané. Un risque mineur de péritonite est possible. Dans le cadre de la chirurgie, des douleurs sont possibles en période post-opératoire, correspondant à la cicatrisation. Le niveau de douleur sera estimé par rapport à une échelle de grimace et l’observation des difficultés de mouvements. L’anesthésie utilisée peut induire dans de rare cas une hypothermie, une détresse respiratoire, voire un arrêt cardiorespiratoire.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à l’issue de chaque procédure afin de réaliser des analyses histologiques (prélèvements et analyses sont nécessaires post-mortem). Ces souris ne peuvent entrer dans de nouveaux protocoles d’expériences puisqu’elles ont reçu des injections dans le cadre du projet.

Remplacement

Une partie de notre projet est réalisé in vitro (biochimie et biologie cellulaire). Nous utilisons également la culture cellulaire : transfections de lignées cellulaires, afin de limiter le nombre d’animaux. Mais pour des raisons scientifiques (difficulté d’étudier le cerveau en culture) nous devons caractériser ces maladies sur le modèle murin. L’étude d’un système intégré, requis pour la modélisation des altérations du cerveau associées à une pathologie impliquant des réseaux de neurones à différentes échelles, nécessite d’avoir recours à des animaux. De plus, nous avons accès à un modèle animal qui mime la pathologie humaine, qui est une opportunité pour étudier les causes de la maladie. La plupart des gènes que nous étudions sont spécifiquement exprimés dans le système nerveux central et ne sont pas exprimés dans les lignées cellulaires, d’où la nécessité d'étudier in situ les cellules neuronales dans les cerveaux des modèles murins. En effet, les modèles murins que nous étudions sont à ce jour les seuls modèles disponibles. Ils présentent l’avantage de mimer assez bien le phénotype humain. Le développement du cerveau est en effet bien conservé chez la souris, surtout pour les étapes de développement qui nous intéressent, favorisant l’identification de phénotypes robustes.

Réduction

Nous réduisons le nombre d’animaux en combinant plusieurs approches expérimentales sur une même lignée. De plus, chez la souris, la période de gestation est courte et le nombre d’embryons important, ce qui nous permet de générer un nombre d’animaux suffisant pour plusieurs expériences à partir de relativement peu de fondateurs. Nous comparerons également des souris de type sauvage et mutantes issues de la même portée, avec une répartition mendélienne. De même, tous les animaux générés (femelles et mâles) sont étudiés. Nos connaissances des protocoles nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse des résultats. Les lignées de souris mutantes représentent des modèles de déficits intellectuels, pour lesquels il est important de continuer la caractérisation afin d’éclaircir la physiopathologie. Pour cela, nous analyserons l’anatomie et la morphologie du système nerveux centrale de ces souris, par des méthodes d’histologie, d’immunohistochimie et de microscopie. L’objectif est d’identifier et d’étudier les anomalies associées aux inactivations de gènes d’intérêt. Des travaux précédents nous ont permis de valider l’analyse des régions cérébrales considérées avec une excellente reproductibilité et donc de réduire le nombre d’animaux requis. L’inactivation de gènes ou l'expression de protéines (par exemple, protéines fluorescentes rapportrices) de manière locale et aigüe chez la souris, in utero ou dans le cerveau postnatal, a l’avantage d’être rapide et de réduire le nombre de souris nécessaire par comparaison aux méthodes classiques de génération de lignées de souris transgéniques. Cette approche est donc la méthode de choix quand nous testons la fonction de nouveaux gènes de pathologies humaines. Grâce à cette méthode nous éclaircirons les voies biochimiques et les mécanismes subcellulaires essentielles pour le développement cortical. L’étude des mécanismes physiopathologiques liés aux déficits des différents gènes d'intérêt, et réalisée par les approches ci-dessus, est nécessaire à la recherche de nouvelles pistes thérapeutiques. Des approches par chirurgie seront aussi réalisées afin de réduire le nombre d'animaux nécessaire à l'étude. Le projet impliquera l'utilisation de 4152 animaux.

Raffinement

Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être des animaux, en limitant la douleur et le stress (anesthésie, analgésie, etc.). Les souris sont stabulées en portoir ventilés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température, de l’hygrométrie et des pressions, un cycle nycthéméral de 12 :12 et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau, un autoclave et un sas chimique comme barrière, comme défini dans l'agrément de notre établissement. Les animaux sont hébergés en groupes sociaux et ils disposeront dans chaque cage d’un enrichissement de nidification et d'une maison. Des observations du bien-être sont réalisées 1 fois/jour. Les souriceaux et jeunes animaux sont surveillés, afin de s’assurer que la mère s'occupe bien d'eux. Pendant toutes nos expériences, nous prenons toutes les précautions nécessaires afin d’éviter toute douleur, en utilisant des pratiques adaptées. Les souris sont placées dans les cages avec la litière chirurgicale entre 1 et 2 jours avant la chirurgie afin d’avoir le temps de s’y habituer. L’utilisation de cette litière est particulièrement importante afin d’éviter l’infection de la suture des souris qui se situe au niveau de l’abdomen. Lors des actes chirurgicaux, les souris sont placées sur une plaque chauffante, avec une anesthésie générale par ventilation et reçoivent des injections sous-cutanées d'analgésiques en pré et post-opératoire, ainsi qu’une analgésie locale sur le site. Un gel ophtalmique est également utilisé afin d’éviter le dessèchement des yeux. Les animaux font l’objet d’une attention post-chirurgicale particulière (surveillance et traitement des plaies). En cas de comportements anormaux (manque de toilettage, manque d’intérêt pour la nourriture...), l’état des animaux est surveillé plusieurs fois par jour. Mise à disposition d’un aliment enrichi et d’eau directement dans la cage pour animaux apathiques. Afin d’éviter une souffrance de la souris, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées, conformément aux bonnes pratiques vétérinaires.

Choix des espèces

Nous comparerons des souris contrôles et mutantes issues de la même portée. Le développement du cerveau murin est bien caractérisé, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. Le développement embryonnaire du système nerveux centrale de la souris est extrêmement proche de celui de l’homme, ce qui en fait un parfait modèle d’étude. L’utilisation de lignées de souris, avec des croisements en retour réguliers permet d’éviter la dérive génétique, une meilleure reproductibilité des résultats et réduit le nombre d’animaux utilisés. La technique d’électroporation in utero dans le cerveau a été mise au point chez le rat et la souris, c’est une méthode de choix efficace pour analyser le rôle des gènes pendant le développement. Cette procédure est simple et rapide, donne un bon rendement, avec une cytotoxicité faible et implique beaucoup moins d’animaux adultes qu’une lignée transgénique. Pour chaque procédure, des souris adultes sont utilisées pour l’élevage et le maintien des lignées. Plusieurs stades seront ensuite analysés : nous nous intéressons au développement cortical, comprenant les étapes de la prolifération et migration (stades embryonnaires de 12,5 à 18,5 jours post-fécondation), ainsi qu'à l'organisation des couches corticales (stades juvéniles 1 et 10 jours post-natal et adulte à 90 jours post-natal). Ces stades seront nécessaires afin d'apprécier l'impact des mutations sur le développement cortical et la permanence du phénotype.

5 760 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 2 520 d'entre elles et modéré pour 3 240. Des femelles gestantes subissent une chirurgie de trente à quarante-cinq minutes sous anesthésie générale, le temps d'injecter un produit dans le cerveau de chaque embryon, et les souriceaux sont génotypés par prélèvement de queue à dix jours. Le porteur annonce l'identification de cibles thérapeutiques pour les maladies neurodégénératives, sans que le RNT précise laquelle il étudie. Les reproductrices sont tuées à six mois et les reproducteurs à huit, lorsque le porteur observe une baisse de leur reproduction.

Objectifs

Ce projet vise à étudier le développement cérébral dans la maladie neurodégénératives. Nous évaluerons les conséquences de cette maladie sur la génération des différents types cellulaires du cortex en développement, ainsi que les stratégies de compensations qui pourraient se mettre en place dans ces modèles pathologiques pour pallier ces effets. Cette étude permettra la découverte de marqueurs permettant de suivre l’évolution de la maladie à des stades très précoces. Cette étude permettra également d’identifier des cibles thérapeutiques pour retarder ou atténuer les symptômes associés à la neurodégénérescence .

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus qui découlent de ce projet sont les découvertes de mécanismes clés dans les maladies neurodégénérative, notamment l’identification de cibles thérapeutiques possibles pour la prévention et le traitement précoce de la pathologie.

Procédures

Lors de la procédure d’élevage, un prélèvement inférieur à 1mm de l’extrémité de la queue sera réalisé sur les petits âgés de 10 jours. Cet acte se fera une seule fois sur animal vigile et durera moins de 1 minute par animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie générale (30-45minutes) et anti-douleurs afin de réaliser une injection intracérébrale dans le cerveau de chaque embryon. Tous les animaux (femelles adultes, embryons, souriceaux) seront euthanasiés par une méthode réglementaire à la fin des procédures pour collecter des échantillons pour réaliser nos analyses.

Impact sur les animaux

Le prélèvement de 1 mmm de l’extrémité de la queue pour génotypage peut générer une légère et brève douleur chez l’animal. Des femelles gestantes seront soumises à une chirurgie sous anesthésie et analgésie avec les risques inhérents à ce type de geste (dépression cardio-respiratoire, hypothermie, hémorragies, infections, cicatrisation) qui seront maitrisés au maximum par les moyens et le suivi mis en place. La mutation de l’animal peut générer des souffrances à partir de 16 mois : difficultés locomotrices, prostrations et pertes de poids, nous ne maintiendrons pas les animaux à des stades aussi avancés.

Devenir

Tous les animaux reproducteurs ayant permis les générations des animaux seront euthanasiés à 6 mois pour le femelle et 8 mois pour les mâles, lorsqu'une diminution significative de la reproduction est observée. Les femelles gestantes seront euthanasiées car elles ne pourront pas être réutilisées suite à leur chirurgie. Tous les embryons ayant reçu l’injection intracérébrale seront euthanasiés à différents stades pour les études histologiques.

Remplacement

L’étude du cerveau en développement nécessite le recours au modèle souris car il permet de préserver l’environnement du développement utérin (impliquant différents types cellulaires qui interagissent entre eux, ce qui ne peut être reproduit en culture cellulaire). L’influence d’un développement cérébral anormal sur le cerveau adulte ne peut se faire qu’avec des modèles de souris. Nous utiliserons des cultures cellulaires afin de valider les outils moléculaires qui seront ensuite injectés chez l’animal. Ces éléments rendent l’utilisation de l’animal indispensable pour notre étude

Réduction

Le nombre total d’animaux est de 5760. Le nombre d’animaux a été réduit au minimum pour pouvoir atteindre l’objectif scientifique fixé. Il a été déterminé en prenant en compte les lignées murines génétiquement modifiées nécessaires à l'étude et en réduisant au maximum le nombre d’animaux utilisés tout en obtenant des résultats significativement exploitables. Pour cela nous utiliserons des tests statistiques adaptés en fonction du type d’analyses réalisées. Afin d’extraire le plus de données possibles sur un nombre minimum d’animaux, le matériel biologique récupéré sera utilisé au maximum et différentes expériences seront combinées. Si les résultats sont concluants avant l’utilisation de tous les animaux alors ils ne seront pas tous utilisés.

Raffinement

Les cages sont maintenues en portoirs ventilées avec un accès ad libitum à l’eau et à la nourriture. La température et d’hygrométrie seront contrôlées et monitorées. Le cycle d’éclairage est de 12h par jour et se met en place progressivement. Les animaux seront hébergés avec leurs congénères et l’isolement est évité au maximum. Les cages sont enrichies d’un nid et de bâtons en bois. Pré et post chirurgie seront enrichies d’une maison et d’un nid en coton afin d’améliorer le bien-être de la mère. Les souris seront observées quotidiennement par le personnel qualifié des animaleries. Un suivi renforcé sera mis en place à la suite de la chirurgie et jusqu’à la mise bas. Les procédures chirurgicales seront raffinées grâce à un protocole d’anesthésie et d’analgésie approprié à une laparotomie sur une femelle gestante. Le matériel et la préparation du site chirurgical doivent limiter le risque d’infection, le risque hypothermique est limité par l’utilisation de tapis chauffant thermorégulé, d’une cage de réveil thermostatée. Le risque hémorragique sera contrôlé par le choix de la voie d’abord, une manipulation douce des organes et un contrôle de l’hémostase au cours de la chirurgie. Les animaux seront réhydratés et les organes exposés irrigués régulièrement le temps de la chirurgie. La profondeur de l’anesthésie sera vérifiée et adaptée aux gestes à réaliser, la respiration et les réflexes seront appréciés régulièrement. De l’eau sous forme d’hydrogel ainsi que de la nourriture facile d’accès dans la cage seront également fournis à l’animal. Les chirurgies seront réalisées le matin afin de pouvoir observer les animaux le soir et administrer les médicaments nécessaires (analgésie). Après les chirurgies les animaux seront ensuite examinés une fois par jours pendant deux jours. Une attention particulière sera donnée à la surveillance d’éventuelles infections ou à une mauvaise cicatrisation de la laparotomie. Le points limites définis avant la chirurgie seront surveillés : une échelle d’évaluation de la douleur sera utilisée, seront également surveillés l’amaigrissement et des signes de prostration ou d’agitation anormales Les animaux seront observés et toute anomalie sera rapidement prise en charge et confrontée aux points limites définis pour les respecter et éviter toute souffrance. Le génotypage, réalisé par des personnes compétentes dans un endroit calme et dédié, est réalisé au même moment que l’identification pour limiter le nombre de manipulations.

Choix des espèces

Il n’existe pas de méthodes expérimentales in vitro pour étudier le développement et la complexité du cortex. Ces analyses nécessitent l'utilisation de souris pour trois raisons : le comportement des neurones corticaux diffère selon leur environnement ; ils migrent et se différencient différemment in vitro et in vivo ; la mise en place de l'organisation laminaire du cortex, ainsi que les connexions neuronales formées, ne peuvent être reproduites en culture cellulaire ; la complexité des interactions entre les différents types cellulaires du cortex au long de la vie ne peut être étudiée qu’in vivo. Ainsi les modèles in vitro sont insuffisants voire inexistants pour étudier la complexité et la mise en place des réseaux neuronaux dans le cortex. Sachant que le but de ce projet est de suivre le développement de ces animaux, nous allons nous focaliser sur les âges suivants : entre le jour de la naissance et une semaine, ( phase de croissance, maturation en cours) puis au stade de 21 jours, lorsque le cortex est mature.

Deux chirurgies intracérébrales par animal, la première sur des nouveau-nés d'un jour anesthésiés par immersion dans la glace, la seconde de quarante-cinq minutes à l'âge adulte pour implanter une fibre optique. 800 souris vont être utilisées sur cinq ans, toutes tuées pour récupérer leur cerveau, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger pour 480 d'entre elles et modéré pour 320. Le porteur note que le refroidissement rapide de la peau est connu pour être douloureux chez l'homme, et enveloppe donc les souriceaux dans un gant de latex avant de les poser sur la glace. Le bénéfice annoncé se limite à mieux comprendre comment les odeurs facilitent la mémorisation de souvenirs plaisants.

Objectifs

Marcel Proust, dans son livre « Du Côté de Chez Swann » (1919), décrit l'odeur d'une madeleine trempée dans du thé de tilleul comme déclenchant une joie immense, le ramenant au temps des après-midi passés auprès de sa tante. Nos souvenirs sont en effet associés à diverses informations sensorielles, notamment olfactives. Les souvenirs évoqués par les odeurs ont souvent été décrits dans la littérature comme ayant des caractéristiques très spécifiques qui les différencient des autres mémoires sensorielles. Ils ont notamment été rapportés comme étant plus anciens et ayant une charge émotionnelle, notamment positive, plus importante. Cependant, les bases neurales de cette mémoire olfactive formée à l'enfance restent aujourd’hui méconnues. Dans ce contexte, l'objectif est de réaliser une étude longitudinale visant à modéliser un souvenir olfactif précoce chez la souris. Ainsi l’étude consiste à mettre en mémoire une information olfactive durant la période infantile et à tester son rappel à l’âge adulte (ce qui n’est pas envisageable sur le modèle humain). Ce modèle permettra également d’étudier les bases neurales de la mémoire olfactive infantile à l'âge adulte avec un intérêt particulier pour le rôle des neurones nés en post-natal dans le bulbe olfactif, la première structure cérébrale en charge du traitement de l’information olfactive (ce qui est à nouveau inenvisageable sur le modèle humain). Ce projet permettra de mieux comprendre comment ces odeurs d’enfance ont cette faculté de donner ces caractéristiques mnésiques et émotionnelles si particulières à nos souvenirs. Ce projet de recherche fondamental sera mené sur 800 souris sur une période de 5 ans. La signature neurale du souvenir olfactif formé à l’enfance sera étudiée chez l’adulte, principalement post-mortem à l’échelle cellulaire et moléculaire. Nous modulerons également par optogénétique (outil permettant d'activer ou d'inhiber des neurones d'intérêts à l'aide d'une stimulation lumineuse) les neurones du bulbe olfactif nés en post-natal, pour étudier leur rôle dans le souvenir olfactif. Enfin, grâce à la photométrie de fibre optique (technique consistant à enregistrer un signal optique, émis ici par les neurones cibles), nous étudierons l’activité en temps réel, en réponse à l’odeur mise en mémoire, de structures impliquées dans le souvenir olfactif.

Bénéfices attendus

Nous étudions les bases neurales des souvenirs olfactifs de l’enfance. D’un point de vue fondamental, ces résultats permettront de mieux comprendre les mécanismes qui permettent aux odeurs de faciliter la mise en mémoire à long-terme de souvenirs émotionnellement intenses et plaisants.

Procédures

Nous procèderons à des injections cérébrales de vecteurs viraux (la durée de la chirurgie est d'environ 10 minutes par souris, avec un temps d'injection virale de 3 à 6 secondes) et à la mise en place de fibres optiques (la durée de la chirurgie est d'environ 45 minutes par souris) dans la même structure. L'approche utilisée permettra d’étudier le lien causal entre activité de structures cérébrales et comportement, en fonction de la valeur hédonique des odeurs ou du genre de l’animal. L’ensemble de cette procédure chirurgicale comprend 2 chirurgies intracérébrales, avec une l’injection virale chez le nouveau-né et une implantation de fibre optique à l’âge adulte. La phase de récupération et la phase de comportement s’étend sur 3 mois maximum. Les tests comportementaux corresponderont à des mesures de temps d'investigation et de locomotion en présence d'odeurs, pour étudier leur mémorisation, sur de courtes durées (1 à 5 minutes). Les animaux seront également soumis à une injection intrapéritonéale de marqueurs de prolifération aux jours postnataux (P) P1 et P7, respectivement, pour marquer les nouveaux neurones.

Impact sur les animaux

Les animaux implantés (procédure chirurgicale) étant remis entre congénères (pour éviter l'isolement des animaux), ils peuvent être susceptibles de se blesser. Des dégradations du matériel d’implantation et donc de la zone neurale correspondante peuvent aussi être engendrées. Les chirurgies peuvent également induire des effets secondaires indésirables (perte de poids, douleurs, stress, apathie, stéréotypie etc). Enfin, la manipulation des animaux ainsi que les injections intrapéritonéales peuvent induire chez les animaux un stress léger. Une surveillance adaptée sera mise en place à l’aide d’une grille de score évaluant l’état physiologique et comportemental de l’animal, définissant des points limites connus et maitrisés.

Devenir

Tous les animaux utilisés selon cette procédure seront mis à mort afin de récupérer le cerveau et contrôler les injections ou analyser l’activité neuronale.

Remplacement

L’étude de processus physiologiques et plus particulièrement l’étude des bases neurales du comportement nécessite l’utilisation d’animaux vivants et ne peut s’envisager sur modèles strictement in vitro. Notre projet se focalise sur un modèle expérimental nécessitant l’utilisation d’un modèle animal. Il n'existe pas de modèle cellulaire reproduisant nos procédures expérimentales.

Réduction

Pour nos expérimentations, nous avons prévu le nombre nécessaire et suffisant d’animaux (15 souris minimum par groupe), pour garder une puissance statistique dans le traitement des résultats (ANOVA, t-test, test de corrélation). Ces prévisions sont basées sur les précédentes études de l’équipe et les données de la littérature. De plus, pour assurer de la fiabilité statistique nous randomiserons les animaux et les groupes, et afin de réduire au maximum le nombre d’animaux utilisés, nous corrélerons (grâce à des statistiques adaptées) le comportement et les paramètres cellulaires sur les mêmes animaux.

Raffinement

Les animaux feront l’objet d’une surveillance rapprochée, à l’aide d’une grille d’évaluation, pour détecter les points limites de souffrance. Pour réduire le risque d’un impact physique et psychique, une semaine de repos sera effectuée à l’arrivée des animaux avant mise en reproduction. Une sciure avec copeaux longs sera utilisée (avec ajout de coton pour les mères et les petits). Les animaux seront maintenus en groupe (de 5 maximum). Les cages sont transparentes pour favoriser la communication. Procédure chirurgicale chez le nouveau-né (jour postnatal (P) P1) : les souris seront anesthésiées par hypothermie (la température centrale du corps des rongeurs restant ici bien inférieure à celle nécessaire pour éprouver de la douleur). Après chirurgie, les animaux seront placés sur une plaque chauffante jusqu’à leur réveil (~10 minutes) afin de limiter le risque de rejet des nouveau-nés par la mère. Cette méthode d’anesthésie est préférable à d’autres méthodes (inhalation de gaz), du fait de la capacité des nouveaux-nés à stopper leur respiration. Puisque le refroidissement rapide de la peau non protégée est connu pour être douloureux chez l’homme, nous envelopperons les souris dans une protection (gant de latex) avant de les placer dans la glace. Procédure chirurgicale à l’âge adulte : les souris seront placées sous anesthésie générale à l’aide d’un analgésique approprié. Une injection d’antalgique sera pratiquée avant et après chirurgie, réitérée ensuite en fonction de l’état de l’animal. En attendant un réveil partiel, les animaux seront placés sous une lampe chauffante. Le test de pli de peau sera pratiqué pour vérifier le niveau d’hydratation (une injection de NaCl sera faite si besoin). Les animaux seront transportés via des cages à couvercles filtrants jusqu’à une armoire ventilée en secteur conventionnel, pour y être placés dans une cage propre avec nourriture et eau à volonté. Leur poids sera contrôlé pendant les 3j suivants. L'état général sera évalué régulièrement pendant la phase de récupération (3 semaines).

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris car son comportement et l’importance écologique de la fonction olfactive de cette espèce sont particulièrement adaptés à la question de recherche qui nous intéresse. De plus le système olfactif humain et de la souris présentent de grandes similarités, faisant de cette espèce un très bon modèle pour étudier le système olfactif. Enfin, l’ensemble des données antérieures a été obtenu chez cette espèce, elle est classiquement utilisée dans ce type d’étude, et nos données pourront être comparées à celles de la littérature. La période de formation de la mémoire olfactive prend place du jour postnatal (P) P23 à P33, correspondant au stade juvénile chez la souris. C’est en effet cette période qui est la cible de la plus grande partie des souvenirs olfactifs chez l’Homme (c'est-à-dire avant 10 ans). Les tests comportementaux, visant à étudier la mémoire et la préférence de l’odeur d’enfance, seront réalisés aux stades jeune adulte (2 mois), adulte (6 mois), et adulte avancé (1 an), afin d’étudier l’acquisition ainsi que la rétention à long terme du souvenir olfactif. La maturité sexuelle, qui se situe 8 semaines chez les femelles et 10 chez les mâles, est atteinte.