Système nerveux
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Etude de la plasticité de la myéline dans le cadre d’un hébergement individuel chez la souris
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
288 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie est hébergée seule pendant huit semaines, condition dont le porteur reconnaît qu'elle peut provoquer anxiété, agressivité et baisse des capacités cognitives, avant des tests d'interaction sociale avec un congénère. L'étude cherche à savoir si l'isolement modifie la myéline chez des souris porteuses d'une mutation, en écho à l'isolement social des personnes âgées. Le porteur affirme que ces questions "intégrées" rendent les études sur l'animal "incontournables".
Objectifs
Notre groupe étudie la physiopathologie de maladies du cerveau, avec un intérêt plus particulier pour certaines maladies dans lesquelles sont observées des anomalies de la myéline, une structure qui entoure les axones des neurones et permet d’optimiser la vitesse de conduction de l’influx nerveux. Nos travaux ont montré qu’une mutation dans un gène que nous étudions conduit à des anomalies de la myéline chez des souris génétiquement modifiées. L’objectif du projet proposé ici fait suite à ces observations et vise à déterminer si les anomalies de la myéline chez ces souris peuvent être modifiées en fonction des conditions de vie, en particulier dans le cadre d’un hébergement individuel.
Bénéfices attendus
La myéline joue un rôle essentiel dans le fonctionnement du cerveau. Des modifications de la myéline ont été associés à de multiples conditions physiologiques et pathologiques tout au long de la vie, notamment au vieillissement normal du cerveau, et à des troubles neurodéveloppementaux et psychiatriques (schizophrénie, troubles bipolaires, troubles du spectre autistique), des maladies dégénératives (maladie d'Alzheimer) ou démyélinisantes (sclérose en plaques). L’un des enjeux actuels majeur est d’identifier des éléments qui pourraient améliorer ou défavoriser la condition des patients et/ou personnes âgées. Plusieurs études ont démontré, chez l’homme comme chez la souris, que l’état structurel et fonctionnel de la myéline est influencé par les conditions de vie. Par exemple, des modifications structurelles « favorables » de la myéline ont été observées dans le cadre de l'apprentissage d'une nouvelle langue ou de nouvelles tâches motrices, telles que la pratique du piano et du jonglage. À l'inverse, il a été montré que certaines formes de privation sensori-motrice, comme l'isolement social, entraînent une diminution de la myéline et une réduction de l'interaction sociale. De nombreuses mutations du gène que nous étudions ont été identifiées dans la population générale. Nos études ont montré qu’elles pourraient constituer un facteur de variabilité interindividuelle au niveau de la structure de la myéline. Notre projet va permettre d’évaluer leur impact potentiel chez les patients et les personnes âgées qui souffrent fréquemment d’isolement social (Croix Rouge : 23 pourcents des personnes isolées, sans contact social régulier, sont des personnes âgées de plus de 75 ans).
Procédures
1) Hébergement individuel d’animaux vigiles pendant 8 semaines, puis regroupement 4 par cage pendant 4 semaines pour une partie des animaux. 2) Hébergement en groupes (4 par cage) d’animaux vigiles pendant 8 semaines ou 12 semaines. 3) Test d’interaction sociale d’animaux vigiles avec un congénère de même âge et de même sexe : 3 fois 30 minutes par animal. 4) Chirurgie sans réveil sous anesthésie/analgésie : 1 fois par animal, temps inférieur à 2 minutes
Impact sur les animaux
Les souris hébergées en individuel peuvent présenter des comportements anxieux plus importants, de l’agressivité et une diminution de la cognition. Le test de comportement (interaction sociale) peut également induire des comportements anxieux et de l’agressivité chez les animaux. L’administration des anesthésique et antalgique avant la chirurgie sans réveil peut induire un stress et une légère douleur chez l’animal au point d’injection.
Devenir
L’analyse d’état de la myéline sera réalisée par des techniques qui nécessiteront d’euthanasier les souris par des méthodes réglementaires.
Remplacement
Les questions que nous posons dans ce projet concernent des aspects très intégrés pour lesquels les études sur l’animal sont incontournables. La souris constitue un modèle de choix dans la mesure où : 1) le développement et la structure de la myéline sont très bien conservés entre l’homme et la souris; 2) Des études scientifiques ont montré que les conséquences sur la myéline de l’hébergement individuel chez la souris miment les conséquences observées chez l’homme ; 3) le développement et la structure de la myéline ont été extrêmement bien caractérisés chez la souris, favorisant l’identification de phénotypes robustes.
Réduction
Nous veillerons à réduire au maximum le nombre de souris utilisées : 1) en combinant plusieurs approches expérimentales ; ainsi, les couples de reproduction seront réalisés de façon à ce que tous les souris soient utilisées et réparties dans les différentes procédures ; 2) en optimisant au maximum les données obtenues à partir d’une expérience donnée. Par ailleurs : 1) La transmission de la mutation pour la lignée transgénique que nous étudions étant mendélienne, nous serons en mesure de comparer les souris sauvages et mutantes issues d’une même portée ; 2) Tous les animaux générés, mâles ou femelles, seront informatifs ; 3) Nos très bonnes connaissances des protocoles, ainsi que la littérature scientifique, nous ont permis d’évaluer le nombre d’animaux au plus juste pour chaque expérience, en tenant compte de l’importance de l’effet attendu pour assurer une parfaite robustesse et reproductibilité des résultats qui seront analysées avec des tests statistiques. Nous utiliserons pour ce projet 288 souris.
Raffinement
Comme défini dans l'agrément de notre établissement, les animaux seront stabulés dans des hébergements standards dans lesquels il y a un contrôle de la température et de l’hygrométrie, un cycle de lumière (12/12) et un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. Nos activités impliquent toujours une attention particulière sur le soin et le bien-être de l’animal. Afin de minimiser l’impact de l’hébergement individuel, les souris seront hébergées dans un environnement sécurisant (maisonnettes/nid/bâton à ronger) et des observations du bien-être seront réalisées 1 fois/jour. En cas de comportements anormaux des points limites sont définis : manque de toilettage, prostration, léthargie ou manque d’intérêt pour la nourriture, agitation excessive, stéréotypies et/ou de perte de poids. Si un point limite est détecté, l’état des animaux sera surveillé plusieurs fois par jour. En cas de souffrance, les animaux sont anesthésiés et euthanasiés par des méthodes adaptées. L’acte de chirurgie sera réalisé sous anesthésie/analgésie conformément aux bonnes pratiques vétérinaires en vigueur.
Choix des espèces
Choix des souris : 1) Le développement et la structure de la myéline sont très bien caractérisés chez la souris, ce qui rend les études plus aisées et favorise l’identification de phénotypes robustes. 2) Les conséquences de l’hébergement individuel / réintégration sociale sur la structure de la myéline ont été bien caractérisées chez des souris de type sauvage, constituant une référence pour notre étude et permettant d’optimiser les conditions expérimentales pour réduire au maximum le nombre de souris utilisées. 3) Nous pouvons également comparer des souris sauvages et mutantes issues d’une même portée dans la mesure où la transmission de la mutation que nous étudions est mendélienne. Stade de développement : Nous utiliserons des souris adultes de 8 semaines, âge auquel la mise en place de la myéline est terminée, la rendant sujette à modification au cours de l’hébergement individuel. Nous suivrons en ce sens un protocole publié, montrant pour la première fois l'impact de l'hébergement individuel sur la myéline chez des souris adultes.
Plasticité fonctionnelle de la voie descendante réticulo-spinale après lésion de la moelle épinière et stimulation régénérative
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Une lésion de la moelle épinière leur est infligée sous anesthésie, avec deux heures de chirurgie et des injections de traceurs, ce qui provoque une paralysie des membres postérieurs et des difficultés à se nourrir et boire au réveil. La moitié reçoit ensuite une stimulation magnétique, et tous les animaux sont tués vingt à soixante-cinq jours après la lésion pour prélever la moelle. Le porteur affirme qu'aucune alternative ne remplace l'expérimentation in vivo et que le modèle animal reste "nécessaire" pour mesurer la repousse des fibres nerveuses.
Objectifs
Les lésions médullaires traumatiques sont responsables d’une perte des fonctions sensitives, autonomes et motrices liées à une forte inflammation, une démyélinisation ainsi qu’une diminution de la repousse axonale. La thérapie par stimulation magnétique trans-spinale répétitive a permis notament de réduire l’inflammation, induire une remyélinisation et une repousse axonale après lésions médullaires traumatiques. Toutefois, la plasticité et l’identité précises des voies descendantes qui sont influencées par cette stimulation trans-spinale après lésions médullaires ne sont pas connues. C’est pourquoi ici, nous souhaitons mettre en évidence les effets de la lésion médullaire dans un premier temps ainsi que ceux de la thérapie par stimulation magnétique trans-spinale répétitive dans un second temps sur la plasticité des fibres réticulospinales.
Bénéfices attendus
Ce projet s’intéresse à la plasticité des voies descendantes après lésion médullaire traumatique. Ces connaissances sont essentielles afin de mieux prendre en charge ces pathologies et mettre en place des thérapies qui pourront induire une repousse axonale et donc à terme une récupération fonctionnelle chez les patients souffrant de ce type de traumatismes. Cette étude nous permettra également d’avoir une meilleure connaissance sur les bénéfices d’une méthode non invasive (stimulation magnétique répétitive) dans ce contexte lésionnel. Cela permettrait, sur un plus long terme, d’envisager de proposer ce traitement dans le cadre de la prise en charge des lésions médullaires chez l’Homme.
Procédures
120 souris (60 males et 60 femelles) seront utilisées sur lesquelles seront réalisées une lésion de la moelle épinière sous anesthésie générale et locale d’une durée totale de 20 min. Le jour même après la lésion et afin de mettre en évidence les fibres nerveuses ayant survécu, l’injection d’un premier traceur en dessous de la lésion sera également réalisée, la durée de cette intervention sera de 15 minutes. Puis une seconde injection de traceurs, permettant de visualiser les axones des populations neuronales d’intérêt, sera réalisée au niveau du tronc cérébral, cette intervention durera 1 heures et 15 minutes. De ce fait, à J0 l’ensemble des interventions chirurgicales prendra un temps de 2h par souris. Tous les animaux opérés recevront une injection d’antalgique 20 minutes avant la chirurgie et une seconde 6 heures après la chirurgie. De plus, après la chirurgie, à J0, nous procéderons à une injection de sérum physiologique afin de prévenir les animaux d’une déshydratation. Le lendemain et jusqu’au 14 ème jour après la lésion, sous anesthésie générale, la moitié des souris (soit 60 souris) sera utilisée pour la procédure de stimulation magnétique pendant 10 minutes. Le 15ème ou le 60ème jours après la lésion, une troisième injection de traceurs en dessous de la lésion sera réalisée, permettant ainsi de mesurer la repousse des fibres nerveuses, la durée totale de cette intervention prendra 20 minutes. L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié 5 jours après la seconde injection de traceurs, soit 20 et 65 jours maximum après la lésion afin de récupérer la moelle épinière. Cette chirurgie durera 10 minutes par souris.
Impact sur les animaux
- Hypothermie de l’animal suite à l’anesthésie - Paralysie des membres postérieurs, de type hémiplégie - Difficulté à se déplacer pour se nourrir et s’abreuver après le reveil
Devenir
L’ensemble des animaux (120 souris) sera euthanasié à l’issue des expérimentations (65 jours maximum après la lésion médullaire) afin de procéder au prélévement de la moelle et du tronc cérébral. Les souris ayant subis des lésions médullaires (120 souris), ne peuvent de ce fait pas, même si cela était possible d’un point de vue expérimentale, faire l’objet d’un don ou bien d’une « réutilisation ».
Remplacement
Les procédures expérimentales ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. Il n’existe pas, dans notre domaine, d’alternatives satisfaisantes aux méthodes expérimentales proposées dans ce projet (expériences in vivo sur l’animal). Le modèle animal reste nécéssaire pour mesurer la plasticité des fibres descendantes après lésion de la moelle épinière et mise en place de thérapie comme la stimulation magnétique.
Réduction
Le nombre d’animaux a été évalué à partir d’études précédentes, à savoir que les expériences histologiques nécessitent un minimum de 6 à 10 animaux. Il faut prendre en compte dans ces expérimentations le fait que les injections stéréotaxiques au niveau du tronc cérébral peuvent ne pas être effectuées au bon endroit du fait de variations anatomiques inter-individuelles et donc ne pas marquer les fibres d’intérêt. De ce fait, nous prevoyons d’inclure 15 souris par groupe. Des tests statistiques seront utilisés afin de comparer les groupes d’animaux entre eux, nous savons que ces tests permettent de mettre en évidence une différence entre deux groupes d’étude avec une bonne sensibilité dès n=6 par groupe.
Raffinement
Afin de minimiser la souffrance et l’angoisse infligées aux animaux, les procédures se dérouleront sous anesthésie générale avec analgésie, et des points-limites seront établis, entraînant la mise à mort anticipée de l’animal si nécessaire. Pour limiter le stress des animaux, ils seront manipulés par le (ou les) même(s) expérimentateur(s) et sur le même poste expérimental, facteurs auxquels ils auront été habitués préalablement. Ils seront anesthésiés. Le cas échéant, ils recevront un traitement analgésique et seront suivis jusqu’à leur réveil. Par la suite, chaque animal sera surveillé et le traitement analgésique sera poursuivi au-delà du réveil si besoin. Chaque animal bénéficiera d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. La douleur sera rigoureusement contrôlée grâce à des points limites évalués en amont, et gérée grâce aux moyens pharmacologiques appropriés. Par ailleurs, les animaux seront hébergés en groupes dans un environnement enrichi (copeaux, matériel de nidification). Afin de leur permettre aisèment d’avoir accès à la nourriture et à l’eau de boisson ; des croquettes mouillées seront mises dans la cage tous les jours. De plus, des biberons avec une tétine longue seront utilisés de manière à ce que les souris n’aient pas à se redresser. Enfin, l'eau et la nourriture seront mises à disposition ad libitum.
Choix des espèces
Ce projet s’intéresse à la plasticité des voies descendantes après lésion médullaire traumatique. Ces connaissances sont essentielles afin de mieux prendre en charge ces pathologies et mettre en place des thérapies qui pourront induire une repousse axonale et donc à terme une récupération fonctionnelle chez les patients souffrant de ce type de traumatismes. Cela nécessite la mise en place de modèles comparables aux pathologies humaines. Il est donc indispensable pour la bonne réalisation de ce projet de recourir à l’utilisation de modèles animaux. Les animaux utilisés seront agées de 8 semaines, les lésions médullaires chez l’Homme concernent le jeune adulte, de ce fait afin de mimer au mieux ces lésions, nous utiliserons des souris âgées de 8 semaines.
Effet de l’activation du système ocytocinergique sur les consequences d’une alcoolisation intermittente de rats mâles et femelles, stressés en période périnatale
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système nerveux
328 rats vont être utilisés, dont 308 tués à l'issue et 20 femelles reproductrices gardées pour réutilisation, dans des procédures classées en souffrance modérée à sévère. Dix femelles gestantes subissent un stress prénatal, et la descendance est soumise à des alcoolisations répétées de l'adolescence à la vieillesse, à des injections quotidiennes et, pour 72 animaux, à une chirurgie d'implantation pour enregistrement du sommeil. Le porteur teste un agoniste de l'ocytocine, la carbétocine, sur les conséquences de l'alcoolisation, en présentant la modélisation animale comme "indispensable". Il décrit ce modèle de rat stressé en période périnatale comme documenté depuis 1995 par l'équipe.
Objectifs
L’alcoolisation est un problème de santé publique majeur et un symptôme majeur et dramatique de l'alcoolisation est représenté par l’altération chronique de la qualité du sommeil, indicateur principal du bien-être d'une personne. A l’heure actuelle, les thérapies pharmacologiques approuvées dans les soins médicaux de l’alcoolisation présentent des nombreux effets secondaires ainsi qu’une efficacité limitée. Pour cette raison, le besoin d'interventions supplémentaires et innovantes à action bio-pharmacologique et donc avec effets secondaires réduit, est très important. Dans ce cadre le ciblage de l'ocytocine qui avec le glutamate, est le neurotransmetteur majeur intervenant dans la régulation de la sensibilité aux addictions et troubles du sommeil, a gagné un intérêt considérable au cours des dernières années en tant que nouveau traitement potentiel de l'alcoolisme. Ce projet se propose d'utiliser un modèle animal translationnel tel que le rat stressé périnatalement (rat PRS) qui présente des troubles du sommeil et une vulnérabilité accrue aux drogues et de developper par des approches interdisciplinaires, de nouvelles interventions thérapeutiques vis-vis de l’alcoolisation ayant une action commune sur le système anti-stress de l’ocytocine. En particulier, nous allons prendre en compte l’efficacité d’une biomolécule comme la carbétocine puissant agoniste de l’ocytocine et ayant comme molécule de référence l’ocytocine. Les objectifs spécifiques du projet sont les suivants : 1) déterminer l'efficacité de la correction par la carbétocine sur l’alcoolisation, et 2) d'explorer la récupération du sommeil et l'augmentation de la résilience en prenant en compte les différences sexuelles dans un modèle de programmation précoce des maladies de l’adulte comme le rat PRS.
Bénéfices attendus
Comprehension de l'impact à long terme de l'alcool et son intéraction avec le système ocytocinergique, le stress précoce et les différences sexuelles.
Procédures
Parmi les 20 femelles reproductrices, 10 d'entr'elles seront soumis au stress gestationnel pendant les 10 derniers jours de gestation.Tous les animaux expérimentaux issus de la réproduction seront exposés au protocole d'alcoolisation et de traitement pharmacologique , soit 288 animaux repartis comme suit : 144 rats PRS, dont 72 mâles et 72 femelles, et 144 rats non- PRS, dont 72 mâles et 72 femelles. Durée alcoolisation -3 alcoolisations : l'alcoolisation aura lieu à l'adolescence, âge adulte et au vieillissement de manière intermittente, 1 jour sur deux pendant 4 heures pour une durée de 3 semaines pour chaque période ; durée traitement pharmacologiques : 3 semaines d'injections i.p 1 fois/jour; temps d'injection prevu 3 minutes ; Un groupe d'animaux sera soumis à des prelevements sanguins par la queue afin de mesurer les hormones dans le sang et à une procédure de chirurgie implantaire pour l'enregistrement polysomnographique. Il s'agit de 72 animaux repartis comme suit : 36 rats PRS, dont 18 mâles et 18 femelles 36 rat non- PRS, dont 18 mâles et 18 femelles. Durée prelevements sanguins par la queue : la procédure entière de stress-retour à la cage dure 2heures pour 4 prelevements à T0-T30-T75-T120; le geste technique du prélévement par la queue ne prends pas plus que 3 minutes ; durée de la chirurgie : 2 heures; Tous les animaux seront soumis a des test comportementaux non invasifs (durée entre 5 et 15 minutes)
Impact sur les animaux
Au niveau des mères gestantes: Le protocole rallentit l'evolution pondérale au cours de la gestation et reduit la qualité du comportement maternel. Au niveau des descendants : Pour les 72 animaux qui subissent la procédure sevère de chirurgie implantive, la douleur potentielle sera évitée en réalisant l'acte chirurgical sous anesthesie génénérale et en réalisant des injections sous-coutanées d'antalgique Meloxicam (METACAM, 0.2 mg/kg) 1 heure avant l'incision chirurgicale, ainsi que dans les 12 apres l'opération. Pour les autres animaux, pas d'effets indésirables attendus.
Devenir
308 animaux seront mis à mort pour prélèvement d'organes/tissus et 20 animaux seront gardés en vie pour réutilisation.
Remplacement
La modélisation animale est indispensable pour recréer les conditions exposées ci-dessus, car il s’agit de mesurer des éléments intégrés de la molecule au comportement chez l'animal in vivo, en associant stress périnatal et exposition à l’alcool à l’adolescence, à l’âge adulte et au cours du vieillissement. Aucune méthode alternative in vitro ou de substitution permet de predire les réponses comportementales et biochimiques que nous souhaitons explorer chez l'animal in vivo.
Réduction
24 rats/groupe/sexe/traitement pharmacologique sont nécessaires pour étudier la variabilité interindividuelle des réponses au traitements à l’alcool et ensuite la réponse au traitement pharmacologique. Les résultats seront groupés par sexe afin de déterminer les différents effets d’une part du stress/non stress et d’autre part de la prise chronique d’alcool. Une comparaison également suivant le sexe sera effectuée. L’analyse statistique de type ANoVA multi-factorielle, ainsi que les comparaisons multiples en post-hoc tiendront compte des effets du stress/sexe/alcool.
Raffinement
Les animaux seront nourris ad libitum avec accès libre à l’eau de boisson. L'enrichissement de cages, consiste en un melange en partie égales de sciure de bois et cellulose et l'ajout d'un batonnet de bois à grignoter toutes les semaines. Les rats, que ce soit lors de la période de reproduction ou lors des traitements, seront surveillés tous les jours jours afin d'évaluer l'état général (peau, poil, muqueuses, yeux), le comportement et le poids (pesée 1/semaine). Pour les 72 animaux qui subissent la procédure sevère de chirurgie implantive, la douleur potentielle sera évitée en réalisant l'acte chirurgical sous anesthesie génénérale et en réalisant des injections sous-coutanées d'antalgique Méloxicam (METACAM) 1 heure avant l'incision chirurgicale, ainsi que dans les 12h apres l'opération. Pour tous les animaux, la présence de signes cliniques sera évaluée regulierement au moment du contrôle et/ou de la manipulation quotidienne, à l'aide d'une grille de scoring precedemment établie en annexe de la saisine. Les points limites seront differenciés selon la gravité par un code couleur. L'exclusion du protocole se fera en presence d'un seul signe clinique " rouge" (prostrations, tremblements, saignements, désydratations averée, perte de poids > 10% du poids corporel ..); en presence de 2 points limites" orange" (lésion superficielle, troubles moteurs, gonflement abdominal, reduction ou absence de prise de boisson et prise alimentaire..) et de 4 points limites "bleu" (agitation, aggression, poils herissé, vocalisations ..) . Dans ce dernier cas, l'animal sera d'abord isolé et surveillé, et si aucune amélioration n'est observée suit à la mise en place de mesures correctives , celui-ci sera mis à mort. L' euthanasie se fera par une augmentation progressive de la concentration en CO2. Enfin, seul le personnel habilité en expérimentation animale réalisera l’ensemble du projet.
Choix des espèces
L'étude des effets comportementaux et neurochimiques de l’alcool ou lors d’un stress au sein d'un organisme entier n'est possible que sur un modèle physiologique intégré. Il est nécessaire de disposer de modèles animaux correspondants aux paramètres et aux symptômes qu'on souhaite étudier. C'est bien ici que repose l'intérêt du modèle de rat PRS présentant par rapport aux animaux témoins une exacerbation des comportements de type émotionnel, vulnérabilité aux drogues et déficits mnésiques et d’apprentissage. Ce type de protocole expérimental permet à la fois d'évaluer la spécificité du traitement à l’alcool sur les symptômes comportementaux et biologiques ciblés. Par ailleurs, il s'agit d'un modèle bien décrit et documenté, développé depuis 1995 par l'équipe.Le comportement d'alcoolisation sera étudié pendant l'adolescence, période critique au cours du quel le processus de maturation n'est pas terminé et donc les effets de l'alcool sont très perturbateurs, à l'âge adulte pour etudier en quel mesure une consommation d'lacool pendant le developpement peut predire le degrée de consommation d'alcool à l'âge adulte ainsi que au vieillissement pour étudier les conséquences à long terme.
Influence d’un régime riche en graisse sur les réseaux neuronaux en charge du comportement alimentaire chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
3600 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie stéréotaxique pouvant durer jusqu'à deux heures pour injecter un virus et implanter une lentille dans l'hypothalamus, puis des tests comportementaux de quatre à huit semaines, avec hébergement individuel et douleurs post-opératoires possibles. Le porteur étudie la réaction des réseaux neuronaux du comportement alimentaire face à une nourriture grasse, les retombées contre l'obésité étant annoncées "à plus long terme". Sur le remplacement, il affirme qu'aucune méthode in vitro ou in silico ne peut répondre à cette question.
Objectifs
Manger est un processus essentiel à la vie. Afin de de garantir la survie lorsque la présence d’aliment est incertaine, adapter l’apport d’énergie en fonction des besoins, et faciliter la reconnaissance des aliments riches en calories, des composantes plaisir et motivationnelle se sont mises en place pour faciliter la recherche des aliments. Ces deux composantes garantissent un apport en nutriments riches en calories au-delà des besoins immédiats. De nos jours, le déséquilibre qui existe entre cette pulsion naturelle à manger et la disponibilité des aliments 24 heures sur 24, contribue à augmenter le taux d'obésité et le diabète de type 2. Au niveau du cerveau, l'hypothalamus va interpréter les informations hormonales et neuronales, et va prévenir de la disponibilité des nutriments dans l'organisme. Cette structure est composée de plusieurs populations neuronales qui vont exercer des fonctions presque opposées dans la régulation du comportement alimentaire. Jusqu’à présent, nous n’avons que très peu d’informations sur la réaction de ces acteurs lors des premières présentations de nourritures riches en graisse, nous avons donc décidé de les étudier pour en apprendre plus.
Bénéfices attendus
Chez les personnes souffrant d'obésité la préférence pour les aliments riches en graisses et en sucres va prédire une prise de poids importante ou un risque accru d'obésité. Comprendre comment réagissent les neurones contrôlant la prise alimentaire lorsque la nourriture riche en graisse est proposée pour la première fois, lorsque l’animal a le choix entre une nourriture classique et une nourriture riche en graisse, lorsque l’animal aura la possibilité de prévoir la présence de nourriture riche en graisse à l’aide d’un indice extérieur, ou lorsque la nourriture sera à nouveau disponible après une période où elle aura été retirée, devrait nous aider à comprendre ce qu'il se passe lors de la consommation de tels aliments. A plus long terme, ces informations devraient profiter de manière significative à la société, en mettant en évidence de nouveaux mécanismes qui serviront de piste pour traiter l’obésité.
Procédures
Cette étude nécessite de recourir à une chirurgie d'une durée maximale de 120 minutes, qui permettra : 1/d’injecter un virus exprimant les outils génétiques nous permettant de visualiser l'activité neuronale 2/d’implanter une lentille nécessaire à la visualisation de cette activité dans des régions profondes comme l'hypothalamus 3/ d'utiliser des tests comportementaux permettant de relier l'activité des neurones à la présentation de nourriture riche en graisse. Une seule chirurgie sera pratiquée sur chaque souris. De même un seul test comportemental sera réalisé sur un même lot d’animal. Les tests comportementaux ont une durée de 4 à 8 semaines.
Impact sur les animaux
Les éventuelles nuisances que nous avons identifiées sont au nombre de deux : 1/un stress social suite à un hébergement des animaux en cage individuelle. Pour remédier à ces nuisances nous utiliserons un enrichissement accru de l’environnement, nous utiliserons des cages transparentes et rapprocherons au maximum les cages pour que les animaux gardent un contact visuel, olfactif et auditif avec les congénères. 2/de potentielles douleurs/perte de poids rencontrées suite à la chirurgie stéréotaxique. Pour éviter toute douleur, nous utiliserons une médication analgésique pré- et post-opératoire.
Devenir
Tous les animaux de cette études seront mis à mort, et les cerveaux seront récupérés pour des contrôles histologiques réalisés post-mortem.
Remplacement
Le but de ce projet de physiologie intégrée est de comprendre comment les neurones contrôlant le comportement alimentaire vont réagir en présence d’aliments appétissants et hypercaloriques et comment cela peut engendrer une surconsommation d'aliments qui pourrait être à l’origine d'une prise de poids ultérieure. Dans ce contexte, Il est donc nécessaire d’étudier ces phénomènes dans un organisme vivant. Il n'existe à ce jour aucune méthode alternative ou substitutive permettant de répondre à ce type de question par un remplacement in vitro ou in silico.
Réduction
Afin de réduire le nombre d’animaux à son plus petit nombre, nous avons utilisé un test de puissance statistique pour déterminer le nombre minimum d’animaux nécessaire pour obtenir des résultats exploitables.
Raffinement
1) Les animaux arriveront dans la pièce d’hébergement à l’âge de 5 semaines et seront manipulés deux fois par semaine au minimum une semaine avant le début des expériences (souris alors âgées d'au moins 8 semaines). Ce qui permettra d’habituer les animaux aux expérimentateurs et de réduire le stress. 2) Enrichissement : carrés de cellulose/frises de kraft pour nidifier, bâtonnet en bois pour ronger et tunnel en carton pour se cacher. 3) Maintient des souris en cages collectives jusqu’à la réalisation des chirurgies stéréotaxiques 4) Utilisation d’anesthésiques et analgésiques pour les procédures douloureuses 5) Choix de points limites précoces et terminaux appropriés par évaluation de l’apparence, du poids, de l’attitude, des signes cliniques (température et respiration) et aspect de la plaie (le cas échant) 6) Pour la perfusion intracardiaque, utilisation d’un analgésique et de lidocaïne dans la solution barbiturique pour prévenir le risque de douleur abdominale.
Choix des espèces
Les caractéristiques suivantes font de la souris un animal de choix pour notre projet de recherche 1) sa physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain ce qui fait que les résultats obtenus chez la souris sont transposables à l’Homme 2) petite taille facilitant son hébergement 3) court cycle de reproduction permettant d’avoir un nombre suffisant d’animaux rapidement 4) disponibilité de nombreuses souches 5) comportement alimentaire et la balance énergétique depuis longtemps étudié chez la souris 6) bon nombre des tests comportements existants chez la souris, donnent des résultats qui sont transposables à l’Homme Toutes les souris de cette étude seront étudiées à l’âge adulte (à partir de 8 semaines), âge qui correspond à un stade où le crâne a fini sa croissance, ce qui nous permet pour les chirurgies, d’utiliser les coordonnées stéréotaxiques des atlas de référence.
Impact des électrodes biorésorbables sur les tissus cérébraux: une étude in vivo
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
62 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie d'implantation d'électrodes dans le cerveau, puis des enregistrements hebdomadaires sous anesthésie répétée pendant six à douze semaines, avec douleurs post-opératoires et isolement possible. Le porteur teste des électrodes flexibles en soie censées réduire la réaction inflammatoire, un dispositif qu'il qualifie de "révolution conceptuelle". Sur le remplacement, il affirme qu'il n'existe pas de moyen alternatif d'évaluer l'activité neuronale in vivo sur plusieurs semaines.
Objectifs
Malgré de nombreuses avancées technologiques dans le domaine des neurotechnologies, une problématique majeure réside dans la réalisation d’enregistrements électrophysiologiques stables sur le long terme in vivo. L’insertion d'électrodes rigides dans le cerveau induit une forte réaction inflammatoire dans le système nerveux central comme le fait tout corps étranger implanté dans un organisme. Cette réaction vient altérer avec le temps la stabilité mécanique et électrique des électrodes implantées. L’objectif de l’étude est d'améliorer la stabilité des électrodes implantables et de diminuer les réponses inflammatoires associées grâce à un dispositif plus adapté aux mesures dans le cerveau. Dans cette étude, nous utiliserons des électrodes implantables flexibles et biocompatibles qui minimisent leurs empreintes dans le cerveau et en réponse seront capables de détecter l’activité électrophysiologique. Nous allons regarder l’effet de nos électrodes sur le long terme sur le cerveau et essayer de comparer la réponse gliale entre mâle et femelle. Un tel dispositif serait une révolution conceptuelle dans le domaine des neurosciences en fournissant pour la première fois la possibilité de développer des implants biocompatibles stables sur le long terme. Récemment nous avons développé un nouveau type d’électrodes en soie car ce matériau possède des propriétés intéressantes telles que sa résistance, sa flexibilité et sa biocompatibilité et font d’elle un des matériaux les plus remarquables de la nature.
Bénéfices attendus
Les électrodes biocompatibles sont des électrodes conçues pour être utilisées en toute sécurité et bien tolérées par les tissus vivants. Elles sont couramment utilisées dans les dispositifs médicaux, tels que les appareils EEG pour enregistrer les signaux électriques du cerveau. Ce projet a pour objectif d'analyser les électrodes récemment mises au point dans le cerveau, visant spécifiquement à réduire les incompatibilités mécaniques, le stress, et l'activation immunitaire, dans le but de minimiser les dommages cérébraux associés à l'utilisation de ces électrodes.
Procédures
Chaque souris sera soumise à une chirurgie d'implantation d'électrodes unique dans le cerveau de 30 min et des enregistrements électrophysiologiques seront effectués pendant 15 minutes par animal 1 fois par semaine jusqu'à maximum 12 semaines maximum suivant le groupe après l'implantation sur souris anesthésiées.
Impact sur les animaux
Suite à la chirurgie d’implantation des électrodes en soie, les nuisances attendues sont des douleurs post-opératoires, dans les heures suivant la chirurgie. La présence de l’électrode dans le cerveau de la souris pourra conduire à son isolement. De plus la nécessité de faire des enregistrements toutes les semaines implique des anesthésies répétées.
Devenir
A l’issu de la procédure, tous les animaux seront euthanasiés car leur cerveau doit être prélevé pour analyse.
Remplacement
« Remplacer » les modèles animaux : il n'existe pas à l'heure actuelle de moyens alternatifs pour l'évaluation de l’activité neuronale in vivo. Des caractérisations in vitro ont été réalisées en amont au sein du laboratoire. Nous avons pu montrer que les cellules neuronales sont viables et fonctionnelles en présence des électrodes. Les cellules neuronales se différenciaient correctement sur les implants, validant ainsi la biocompatibilité des dispositifs avant les expériences in vivo. Ces études ne peuvent pas être effectuées in vitro car nous avons besoin de déterminer les conséquences directes dans le tissu cérébral pendant plusieurs semaines.
Réduction
L'expérience a été organisée afin de réduire au maximum le nombre d'animaux pour la totalité de l'expérimentation, à la fois pour une puissance statistique convenable et pour palier d'éventuelles pertes d’animaux au cours de l’expérimentation. Le nombre d'animaux a été calculé en fonction de la quantité de données que chaque animal fournira pour une analyse temporelle, pour la fonction de l'électrode et l'intégrité du tissu cérébral. La plupart des études dans la littérature de ce domaine utilisent le même nombre d’animaux pour les tests pilotes et les tests expérimentaux. Nous disposons d'une cohorte plus pertinente pour les études biologiques. Nous prévoyons d’utiliser 52 souris (+10 animaux en cas de problème d’ implantation, électrodes non fonctionnelles ou souffrance de l’animal) afin d’étudier l’effet sur le long terme et l’effet sur le genre (mâle, femelle). Dans un premier temps, nous effectuerons un premier test pendant 30 jours en utilisant au maximum 12 mâles C57bl/6. Nous prévoyons d’inclure un minimum n= 3 souris pour les études préliminaires. Pour les études nous prévoyons n= 4 pour les groupes contrôle et n= 6 pour les groupes implantés avec l’électrode en soie. Chaque souris sera suivie chaque semaine pendant 6 ou 12 semaines ce qui permettra alors à l’animal d’être son propre contrôle. Ces chiffres nous permettront d’obtenir suffisamment de données neurophysiologiques par groupe pour une analyse statistique satisfaisante.
Raffinement
Chaque animal bénéficie d’une attention et de soins de qualité, par du personnel qualifié, pendant les interventions mais aussi en dehors de celles-ci afin d’assurer un bien-être optimal tout au long de l’étude. Le suivi quotidien des animaux permet d’identifier des signes de souffrance caractérisés par l’état du pelage, le comportement de la souris (agressivité / apathie), sa mobilité et son poids. Une fiche de suivi et les mesures conservatoires, jointes en annexe 2, détaillent les critères de points limites et les actions mises en place. Les mesures conservatoires graduées pour le site chirurgical (désinfection, crème cicatrisante, antibiotiques), la perte de poids (granulés de sucre, injection de glucose), l’hydratation (injection de solution saline) et la prise en charge de la douleur (injection d’analgésiques) sont détaillées en annexe 2. Dans le cas où un animal présenterait des signes manifestes de souffrance ou perte de poids excessive (≥20% du poids initial sur 3 jours), il sera sorti des procédures expérimentales et euthanasié si les signes persistent dans les 24h. Par ailleurs, les animaux sont hébergés dans un environnement enrichi (bâtonnets à ronger, nids). Enfin, l'eau et la nourriture sont mises à disposition "ad libitum".
Choix des espèces
L’espèce choisie est la souris qui est un modèle de choix qui permet de prendre en compte de manière intégrative l'impact de l’électrode dans le cerveau d’animal et dont notre équipe dispose de données antérieures concernant l’implantation d’électrodes. Nous allons utiliser des souris adultes âgées de 12 semaines car à cet âge le cerveau est considéré mature.
Insulinorésistance associée à la dépression : une étude expérimentale sur un modèle murin de stress chronique léger imprédictible.
- Recherche fondamentale
- Éthologie / comportement / biologie animale
- Oncologie
- Système cardiaque
- Système endocrinien
- Système nerveux
102 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées en souffrance sévère. Le protocole repose sur l'induction d'un état dépressif par stress chronique léger imprévisible, avec quatorze mesures de glycémie par animal, des jeûnes et des tests comportementaux, le porteur admettant que perte d'appétit, apathie, déshydratation et perte de poids sont probables. Il reconnaît que "le raffinement sera limité du fait de l'objectif du projet", l'induction d'une symptomatologie dépressive. L'étude vise à explorer le lien entre dépression et résistance à l'insuline, les pistes de traitement étant annoncées comme potentielles.
Objectifs
Les personnes qui souffrent de dépression majeure présentent un risque plus important de maladies cardiovasculaires, d’obésité, et de diabète de type 2. La principale hypothèse expliquant ce risque plus élevé est la perturbation de l’action périphérique de l’une des hormones qui régule l’équilibre du glucose (sucre) dans le sang, à savoir l’insuline. On parle alors de résistance à l’insuline ou insulino-résistance. Cette résistance à l’insuline est fréquente chez les personnes qui souffrent de dépression. Comme autre hypothèse, certains scientifiques ont évoqué le rôle d’un système spécifique impliqué dans la modulation de l’activité des neurones : le système endocannabinoïde (SEC). Le SEC est constitué de molécules appelés ligands (on parle de cannabinoïdes), qui se fixent sur des récepteurs (CB1R et C2BR) et qui peuvent être (les ligands) détruites par d’autres molécules appelées enzymes spécifiques. Certains travaux de recherche ont montré qu’avec l’activation du SEC, on observe les mêmes perturbations (troubles) du métabolisme que l’on rencontre chez les personnes souffrant d’obésité et/ou de diabète. Par contre, les études qui ont évalué le SEC chez les personnes avec dépression (pour savoir s’il était hyperactivé ou l’inverse), ne sont pas tombées sur des conclusions similaires, même si la tendance penche vers une faible activité des récepteurs CB1R dans le cerveau des personnes avec dépression sévère. Au vu des éléments évoqués plus haut, étudier le SEC dans la dépression semble avoir un intérêt, pour déterminer si le SEC ne constitue pas une explication du risque plus élevé de maladies cardiovasculaires / métaboliques en cas de dépression majeure. Une étude de ce type nécessite de pouvoir induire une dépression chez des animaux de laboratoire, notamment des rongeurs, et l’une des méthodes validées dans ce sens est le stress chronique léger imprédictible (SCLI). Ainsi, nous envisageons un travail ayant pour objectif de d’induire une dépression chez des souris (par SCLI), et d’explorer les paramètres métaboliques en lien avec la résistance à l’insuline. Nous pourrons ensuite étudier et modifier l’activité du SEC chez les souris avec symptomatologie dépressive et résistance à l’insuline, tout en évaluant si cette modification du SEC a un effet bénéfique sur le plan métabolique. L’idée est de savoir si en situation de dépression avec troubles cardiométaboliques, une action sur le SEC peut avoir des bénéfices sur la santé cardiovasculaire
Bénéfices attendus
La dépression majeure (encore appelée dépression caractérisée), constitue un problème mondial de santé publique à travers sa morbidité (et le handicap psychique qu’il occasionne), mais également sa mortalité. Cette dernière est relative au suicide mais également aux évènements cardiovasculaires, eux-mêmes liés à des altérations cardiométaboliques ayant comme clé mécanistique la résistance à l’insuline. A l’heure actuelle, les éléments de physiopathologie qui associent l’insulino-résistance à la dépression ne sont pas totalement connus, ce qui pourrait expliquer l’absence de marqueurs biologiques spécifiques à l’association dépression – insulino-résistance. De plus, les axes actuels de prise en soin (pharmacologiques ou non) des perturbations cardiométaboliques (obésité, diabète, dyslipidémie, hypertension artérielle) chez les patients avec dépression majeure semblent insuffisants. L’exploration du SEC sur un modèle murin de dépression, l’analyse de l’association entre les modifications du SEC et la résistance à l’insuline, ainsi que la modulation de ce système, pourraient contribuer à renforcer les connaissances actuelles sur le sujet. Un travail de cet ordre permettrait potentiellement de compléter les notions sur les mécanismes de l’insulino-résistance dans la dépression, mais également d’ouvrir des pistes de traitements pharmacologiques destinés à réduire le fardeau des pathologies cardiométaboliques. Ces traitements seraient des inhibiteurs de l’activité du SEC notamment en périphérie (bloqueurs sélectifs du CB1R) ou alors des activateurs du SEC (agonistes CB1R ou inhibiteurs des enzymes de dégradation du SEC), en fonction des perturbations du SEC qui seront retrouvées.
Procédures
Pour chaque test de glycémie, un prélèvement sanguin sera effectué afin de doser la glycémie à l’aide d’un glucomètre. Ce type de prélèvement durera 3-4 secondes et aura lieu 14 fois par animal (2 x 7 prélèvements à 5 jours d’intervalle). Pour ces tests faisant intervenir une mesure de glycémie, un hébergement individuel de 6h préalable sera nécessaire pour effectuer un jeun. Les tests en eux-même dure 2h, l’hébergement individuel total sera de 8h. Pour les tests comportementaux, ceux-ci sont indispensable afin de pouvoir évaluer l’induction du syndrome dépressif. Aucun prélèvement ne sera effectué, la nuisance principale de ces tests étant l’isolement (30 minutes à 2h en fonction du test). Chaque test n’aura lieu qu’une seule fois.
Impact sur les animaux
Le présent travail a pour base l’induction d’une symptomatologie dépressive, à travers des stress répétés, d’intensité légère, de survenue aléatoire pour les animaux. Il est de ce fait possible voire probable que les animaux que nous enrôlerons présentent des manifestations comportementales telles qu’une perte d’envie, une diminution de l’appétit, une baisse d’énergie, une apathie, une diminution de l’élan vital. Dans le même sens, il subsiste un risque de déshydratation et de perte pondérale. Ainsi, l’état général des souris sera surveillé quotidiennement.
Devenir
Les animaux sont mis à mort à la fin de la procédure afin de procéder aux analyses post-mortem et déterminer les mécanismes d’actions mis en jeux.
Remplacement
La dépression et les maladies cardiométaboliques auxquelles elle peut être associée, peuvent être vues dans une approche systémique, avec des conséquences négatives sur de nombreux tissus et organes. Afin d’explorer au mieux cette dimension multi-systémique, il est indispensable de travailler sur l’organisme vivant en entier ce qui justifie ainsi la nécessité de réaliser des expérimentations in vivo. Ainsi, aucun modèle cellulaire ne peut être utilisé pour substituer totalement l’utilisation de modèles animaux. En revanche, l’utilisation de lignées cellulaires in vitro nous permettra de réduire le nombre d’animaux dont nous aurions initialement eu besoin pour les études mécanistiques.
Réduction
Pour réaliser ce travail, nous avons choisis la souche de souris la plus utilisée dans la littérature (dans d’autres travaux de recherche) dans le sens du SCLI. Aussi, les paramètres morphologiques et l’âge des souris, tout comme les stresseurs et la durée totale du SCLI, sont définis dans notre travail sur la base des études antérieurement publiées. Toutes ces précautions ont pour but de contribuer à réduire au maximum le nombre de souris que nous aurons à utiliser.
Raffinement
Avant la mise en application des épreuves constitutives du SCLI (mise en œuvre de la procédure de stress), et ce pendant deux semaines, les animaux seront placés par groupes de cinq dans des cages avec contrôle de la température et de l’humidité, avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau de boisson, et des alternances lumières/obscurité de 12h. Cependant, le raffinement sera limité du fait de l’objectif du projet, en l’occurrence l’induction d’une symptomatologie dépressive. Toutefois, nous avons mis en place une échelle de points limites adaptés avec un arbre décisionnel et des critères d’arrêt de souffrance.
Choix des espèces
L’étude d’une pathologie a pour but d’en comprendre les mécanismes afin d’établir des stratégies thérapeutiques applicables à l’espèce humaine. Dans ce sens, dans le cadre de la recherche fondamentale, il paraît déterminant de choisir un modèle animal dont la physiologie et la physiopathologie sont le plus proche possible de celles de l’Homme. C’est le cas pour la souris, qui sur le plan neurobiologique et métabolique, présente de multiples similarités avec de l’Homme. De plus, cette espèce animale fait partie des espèces les plus étudiées dans la littérature scientifique, notamment en ce qui concerne les maladies mentales (dont la dépression et la schizophrénie), ce qui diminue le risque de duplication inutile de travaux et veille à réduire au mieux le nombre d’animaux utilisés. L’induction de la symptomatologie dépressive par stress chronique léger imprédictible sera réalisée chez des souris de douze semaines. Ce stade correspond à des souris jeunes adultes et est idéal pour induire tout type de conditionnement chez la souris puisque d’après la littérature, ce type d’expérimentation montre son efficacité maximale chez des animaux âgés de 12 à 20 semaines. Considérant une durée de stress de six semaines, les souris CUMS et non-CUMS seront âgées de 18 semaines à la fin de la procédure de SCLI. Les tests comportementaux inhérents à la vérification de la validité du modèle seront réalisés dans les deux semaines après chez toutes les souris, et les prélèvements finals à 20 semaines de vie. De façon pratique, nous travaillerons de façon successive sur des lots de quatre souris. En résumé (pour chaque lot de souris) > Souris sélectionnées à 10 semaines > Phase pré-SCLI de deux semaines > Souris âgées de 12 semaines au début du SCLI > Souris âgées de 18 semaines à la fin du SCLI et au début des tests comportementaux pour tous les animaux > Souris âgées de 20 semaines à la fin des tests comportementaux et mise à mort
Elevage de lignées transgéniques pour l’étude de la maladie d’Alzheimer
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1590 souris d'une lignée transgénique modèle d'Alzheimer vont être utilisées dans un projet d'élevage, déclaré en souffrance légère. Les géniteurs, porteurs d'un phénotype dommageable, sont tués à douze mois pour prévenir un vieillissement cognitif prématuré, et la descendance est orientée en continu vers les autres procédures expérimentales de l'équipe. Le porteur décrit un élevage adapté aux besoins de l'équipe, présenté comme une prise en charge du phénotype dommageable des géniteurs. Sur le remplacement, il affirme que la culture cellulaire ne peut se substituer à l'accès à un réseau cérébral complexe et que la souris transgénique reste un "modèle de choix".
Objectifs
La maladie d'Alzheimer est la plus fréquente des maladies neurodégénératives (900 000 personnes atteintes en France en 2021). Elle est caractérisée par une évolution lente mais progressive de l'atteinte neuronale affectant les capacités de mémorisation des patients réduisant progressivement leur autonomie. Cette pathologie complexe est liée à un dysfonctionnement des connections entre neurones qui aboutit à la dégénérescence des neurones de l'hippocampe (structure du cerveau impliquée dans la mémoire) puis de l'ensemble du cerveau. Les patients doivent endurer une perte irréversible de leurs fonctions cognitives puisqu'à l'heure actuelle, aucun traitement ne permet de stopper l'évolution de la pathologie. Nous avons récemment identifié un stade auquel on peut stopper la progression de la maladie. Nous souhaitons poursuivre nos études afin de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans la mise en place de la maladie. Pour cela, nous avons besoin d’élever et d’utiliser des souris transgéniques modèles de la pathologie. Cette procédure vise à prendre en charge le phénotype dommageable des géniteurs utilisés dans l'élevage et à en réduire les nuisances.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier les défauts structuraux et fonctionnels se mettant en place au tout début de la pathologie. Il permettra une étude de la communication cellulaire à l’échelle de la synapse se produisant au sein du cerveau et des dysfonctions précoces associées à la maladie d’Alzheimer. Une compréhension globale de ces mécanismes précoces permettra de renforcer le développement de stratégies thérapeutiques innovantes neuroprotectrices. Nous réduirons les nuisances en anticipant l'apparition du phénotype dommageable qui se met en place à 12 mois dans les lignées utilisées.
Procédures
Les modèles animaux utilisés développent des troubles de mémorisation à partir de 8 mois et un viellissement cognitif prématuré à partir de 12 mois.
Impact sur les animaux
Vieillissement cognitif prématuré à partir de 12 mois.
Devenir
A l’issue de la procédure délevage, les animaux géniteurs seront mis à mort (à 12 mois). Les animaux issus de l'élevage seront utilisés en continue pour les différentes procédures expérimentales de l'équipe.
Remplacement
Notre approche méthodologique permet d'avoir accès à l’activité d’une structure dans un réseau complexe au sein du cerveau. Ce modèle ne peut être remplacé par des modèles de culture cellulaire ou d’autres approches in vitro. De plus, la souris permet d’avoir accès à des lignées transgéniques modèles de la pathologie humaine. La similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de mémoire chez la souris en fait un modèle de choix pour ce projet.
Réduction
Plusieurs mesures sont appliquées pour réduire le nombre d'animaux utilisés dans ce projet. Grâce à une approche statistique, le nombre d'animaux sera limité au minimum nécessaire par groupe sans compromettre les objectifs du projet. La production d'animaux sera adaptée aux besoins de l'équipe, avec une réduction de l'élevage quand les besoins sont réduits.
Raffinement
Les animaux seront élevés dans des conditions répondant aux critères relatifs aux soins et à l’hébergement des animaux de l’Annexe II du 1er février 2013 de l’arrêté fixant les conditions d’agrément, limitant ainsi les angoisses qui pourraient être induites par l’environnement. Ainsi, les animaux seront hébergés dans un environnement contrôlé avec accès à volonté à l’eau et à la nourriture et présence d’enrichissements dans les cages. Un enrichissement supplémentaire (nid, nourriture appétante) est ajouté au moment des naissances. Les conditions d'hébergement vont être identiques et homogènes pour tous les groupes qui seront hébergés dans la même pièce. L’état de santé des animaux sera surveillé tout au long des procédures. Des échelles de cotation de problèmes cognitifs et de viellissement basées sur des signes indicatifs de troubles du comportement seront utilisées afin d’évaluer l’état général de chaque animal et de définir les points limites, permettant ainsi de prendre le plus rapidement possible les mesures nécessaires pour préserver le bien-être de l’animal. En prévention de l'apparition du viellissement cognitif prématuré, les animaux ne seront pas gardés au-delà de 12 mois.
Choix des espèces
Le modèle souris permet d’avoir accès à des modèles transgéniques mimant certaines pathologies humaines. Dans notre cas, l'existence de modèles transgéniques murins exprimant des mutations humaines de deux protéines impliquées dans les formes familiales génétiques de la maladie et responsables d’une surproduction d'une protéine toxique, permet de mimer la maladie d’Alzheimer et de l'étudier dès les stades précoces asymptomatiques. Cette lignée permet l’utilisation de contrôles issus de la même portée. De plus, la similarité moléculaire, cellulaire et fonctionnelle des circuits impliqués dans les processus de la mémorisation, notamment l’hippocampe, en fait un modèle de choix pour ce projet.
Effet de l’enrichissement de l’environnement et de l’activité physique sur une maladie du cerveau EU 2/2
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
480 souris porteuses d'un modèle de maladie du cerveau vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles sont hébergées en cage individuelle jusqu'à trois mois, certaines avec une roue d'activité, et soumises à des tests comportementaux et mnésiques, dont une immersion dans l'eau à 22°C pouvant provoquer un stress thermique et une hypothermie transitoire. Le porteur cherche à identifier les marqueurs génétiques et épigénétiques des effets de l'environnement enrichi et de l'exercice sur un modèle de type Alzheimer, les bénéfices pour la santé humaine étant annoncés comme des pistes à long terme. Sur le remplacement, il affirme qu'aucune alternative cellulaire ne convient et qu'il faut recourir à "l'animal entier".
Objectifs
L’environnement, tel que l’augmentation des activités sociales, de la nouveauté et de l’activité physique, influence positivement l’expression des gènes nécessaires à la plasticité neuronale dans le cerveau. Cela est possible grâce à des mécanismes appelés épigénétiques, c’est à dire qu’ils permettent l’adaptation des programmes génétiques. L’objectif de ce projet vise à établir ces régulations génétiques/épigénétiques à l’échelle de tout le génome, c’est à dire de doser tous les gènes qui seront changés par les conditions d’hébergement, et leur régulation au sein même du génome, ainsi que ceux qui seront relargués dans le sang. Pour ce faire, nous utilisons un modèle animal (souris) de maladie du cerveau. Une fois les transcrits identifiés dans le sang, ils pourraient servir de biomarqueurs pour faire valoir de l’efficacité d’un hébergement enrichi (environnement ou exercice physique). De plus, ces études seront menées de façon cellule-spécifique (cellules neuronales et non neuronales) car toutes les cellules ne répondent pas de la même façon à l’environnement. Ce projet questionne les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents aux effets bénéfiques de ces changements d’environnement, leur efficacité au niveau cognitif (évaluations comportementales) et les modifications structurelles et fonctionnelles qu’ils induisent sur le cerveau (imagerie). Le projet sera mené sur des souris mâles et des souris femelles.
Bénéfices attendus
Le principal bénéfice attendu de ces études est l'obtention de données claires démontrant si des (et quelles) modifications épigénétiques et programmes génétiques sous-tendent les effets bénéfiques de l’environnement enrichi et de l’exercice physique dans un modèle de maladie du cerveau aussi répandu que la maladie d’Alzheimer. De plus, cette étude apportera des réponses concrètes sur les mécanismes d’action impactés par l’environnement et l’exercice sur le plan comportemental, cellulaire et moléculaire : formation de la mémoire à long terme dans l’hippocampe et le cortex frontal, transcription des gènes dans l’hippocampe, formation d’épine dendritiques dans l’hippocampe, impact sur les différentes structures cérébrales. En apportant des bases mécanistiques, ces études permettront d’étayer les connaissances plus fondamentales de l’effet bénéfique de l’environnement et leur implication en santé humaine. Ces études apporteront des bénéfices en santé humaine car elles dévoileront des pistes et des preuves de concept pour la mise en place de stratégies de prévention. En fournissant des informations sur les mécanismes moléculaires/cellulaires, dépendants du sexe et de l'âge, qui sous-tendent les interventions non pharmacologiques telles que l'environnement enrichi et l’exercice physqiue dans les principales régions cérébrales affectées par la maladie d’Alzheimer, nos données offriront de nouvelles opportunités pour la personnalisation de la médecine et leur mise en place aux stades les plus précoces. Ce projet devrait in fine permettre un traçage biologique (dans le sang) visant à utiliser des stratégies thérapeutiques nouvelles, ou combinatoires soutenant des stratégies non pharmacologiques (épi-médicaments ou thérapies basées sur l'ARN). Ces études permettront aussi de mieux comprendre la maladie d’Alzheimer, son développement et sa progression dans les modèles animaux, qui pourront être ensuite rapportés/étudiés chez l’Homme. Enfin, ce projet comprend les analyses conjointes sur les souris mâles et femelles. Les taux de prévalence de la maladie d'Alzheimer varient en fonction de l'âge mais aussi du sexe, les femmes représentant deux tiers des patients atteints. En apportant une analyse complète (cognitif, moléculaire, imagerie cérébrale) des différences entre mâles et femelles, ce projet apportera donc un bénéfice sur la compréhension de mécanismes pouvant être spécifiquement liés au sexe.
Procédures
240 animaux vigiles seront hébergés en cage isolée avec dispositif de nidification pendant 3 mois (de 6 à 9 mois), 120 bénéficieront d’une roue d’activité sur laquelle ils pourront tourner, cette roue sera bloquée pour les 120 autres animaux. Comportement réalisé sur 160 animaux vigiles sur une période de 33 jours/animal, période durant laquelle les animaux sont hébergés en cage individuelle pour tester différents aspects comportementaux et mnésiques (en moyenne 15 minutes par jour) sur 13 jours environ avec des phases de repos de 3 jours entre les tests. Les souris transgéniques modèle de maladie développent des déficits mnésiques à l’âge de 9 mois.
Impact sur les animaux
L’isolement des congénères nécessaire pendant les tests comportementaux (33 jours) et pendant l’hébergement en cage d’exercice, ainsi que et leurs contrôles (3 mois) peut générer un stress. Dans un des tests comportementaux, les animaux sont placés dans l’eau à 22°C pendant un temps inférieur à une minute (4 fois/jour pendant 6 jours), ce qui peut produire un stress thermique ainsi qu’une hypothermie transitoire. Les études de comportement pourront induire du stress aux animaux.
Devenir
Tous les animaux (480) seront mis à mort à l’issue de chaque procédure pour prélèvements et analyses post-mortem.
Remplacement
Dans la mesure où nos travaux portent sur les caractérisations comportementales et moléculaires suite à un changement des conditions environnementales (hébergement spécifique), il n’est pas possible de recourir à un autre type de modèle d’étude qu’à celui de l’animal entier. Nous ne pouvons pas utiliser d’alternative cellulaire. Notons que les modèles murins (souris) récapitulent les symptômes majeurs de la maladie (déficit de mémoire) et restent ainsi des outils uniques pour l'étude des mécanismes physiopathologiques, la validation de cibles thérapeutiques et la réalisation de tests précliniques.
Réduction
Nous avons réduit au strict nécessaire le nombre d’animaux pour permettre des analyses statistiques sur des groupes incluant mâles et femelles, soit 20 souris/groupe (10 mâles et 10 femelles) pour le comportement et l’imagerie cérébrale, et 6 souris/groupe (soit 3 mâles et 3 femelles) ainsi que 4 souris/groupe (soit 2 mâles et 2 femelles) pour les approches moléculaires. L’efficacité de chaque type d’hébergement sera effectuée à l’aide de tests statistiques adaptés. Les calculs fait tiennent compte de la variabilité interindividuelle. Ainsi, pour toutes nos analyses, nous utiliserons à la fois des animaux mâles et femelles dans nos expériences de manière à ne pas biaiser nos résultats, et les sexe ratios seront conservés entre les différents groupes.
Raffinement
Pour appliquer le principe de raffinement, un enrichissement environnemental est apporté dans les cages standards ainsi que dans les cages à roue : dispositif de nidification (certifié contact alimentaire) chaque semaine. Les changes seront opérés par les animaliers à l’aide de tunnels (polycarbonate transparent), permettant de réduire le stress des animaux, notamment efficace chez les souris (raffinement d’hébergement). Dans le cas d’hébergement en cage isolé (cages à roue et comportement), plusieurs cages (3 au minimum) seront maintenues côte à côte sur les rayonnages des racks de stabulation. Des points limites prédictifs sont mis en place pour limiter la souffrance : les souris sont observées lors de la visite journalière, et une surveillance plus détaillée des souris se fait tous les 15 jours (observation visuelle de l’aspect général, posture). Les souris sont habituées à la manipulation par l’expérimentateur pour réduire le stress lié à la manipulation lors des tests comportementaux. Les animaux sont testés dès le début de l’apparition des déficiences mnésiques afin de réduire le temps d’hébergement des animaux en animalerie. Les souris sont maintenues sous anesthésie lors des procédures d'imagerie pour réduire au maximum le stress de l'animal. Enfin, par mesure de raffinement lors de l'examen terminal, la combinaison anesthésie/analgésie générale sera renforcée par un analgésique locale.
Choix des espèces
Le modèle rongeur représente une alternative de choix pour la modélisation préclinique des maladies du cerveau ayant une origine génétique. En effet, les maladies du cerveau que nous étudions dans ce projet apparaissent à l’âge adulte (40-50 ans) lorsque ce sont des formes génétiques. Elles apparaissent plus tardivement, quand leur origine n’est pas connue, le vieillissement étant un facteur de risque majeur de ces pathologies. Ainsi, les animaux étudiés seront testés à l'âge de 9 mois, nos études antérieures ayant montré que cela correspond au moment où les premiers signes de déficits mnésiques apparaissent dans ce modèle. De plus, ces modèles permettent de répondre à la question posée car les souris possèdent des structures neuro-anatomiques comparables à celles du cerveau humain.
Perturbations vasculaires d’origine inflammatoire dans un modèle d’accident vasculaire cérébral thrombo-embolique ou thrombotique : une opportunité thérapeutique ?
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Organes sensoriels
- Système immunitaire
- Système nerveux
1430 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dont 1160 dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. On leur provoque un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère du cerveau, après pose d'une prothèse crânienne, avec suivi par imagerie puis exsanguination par ponction cardiaque, pour étudier le rôle de l'inflammation dans les lésions post-AVC. Le porteur indique des douleurs postopératoires et des déficits fonctionnels, et prévoit une mise à mort au-delà de 15 % de perte de poids ou d'un score de douleur élevé. Il affirme que ces procédures ont un "caractère de stricte nécessité" et ne peuvent pas être remplacées, les stratégies d'amélioration de la reperfusion restant à développer.
Objectifs
Dans la pathogenèse des accidents vasculaires cérébraux (AVC) ischémiques, différents compartiments vont être séquentiellement touchés : le compartiment vasculaire sera immédiatement affecté, suite à la formation d’un thrombus qui induit in situ une diminution du débit sanguin cérébral (DSC). S’ensuit une perte de l’intégrité de la barrière hémato-encéphalique (BHE) et l’apparition de dommages parenchymateux. L'inflammation est connue pour jouer un rôle central dans l’extension de l’atteinte vasculaire au parenchyme. Ainsi, Ddans ce projet, nous allons identifier, dans un premier temps, l’impact d’une inflammation systémique sur le débit sanguin cérébral. Dans un second temps, nous caractériserons l’influence de l’inflammation ischémique sur la modulation de la reperfusion cérébrale post-ischémie dans deux modèles d’AVC (thrombo-embolique et thrombotique). Enfin nous chercherons à limiter les effets de cette inflammation pour améliorer le devenir post-AVC.
Bénéfices attendus
D’un point de vue scientifique, cette étude va nous permettre d’acquérir des données fondamentales visant à améliorer les connaissances sur la physiopathologie de l’AVC et plus particulièrement sur la modulation de la reperfusion post-ischémie par l’inflammation périphérique, afin de développer des stratégies thérapeutiques d’amélioration de la reperfusion.
Procédures
Procédure 1 : injection intrapéritonéale de Lipopolysaccharide (ou sérum physiologique) + évaluation par Imagerie par Résonance Magnétique (durée : 50min) ou par Imagerie par Ultrasons (durée : 40min) et exsanguination par perfusion intracardiaque. Procédures 2 & 3 : J-10 : Pose d’une prothèse crânienne (durée : 40min). J0 : Induction de l’ischémie cérébrale +/- Thrombolyse à 20 minutes ou 4 heures après l’occlusion artérielle (durée : 50min). +10min, +1h, J+1, J+5 : Evaluation par Imagerie par Résonance Magnétique structurelle et moléculaire (durée : 50min) ou par Imagerie par Ultrasons (durée : 40min). J+1, J+3, J+5 : Etude de la récupération fonctionnelle des animaux (durée : 5min). J+5 : Exsanguination par perfusion intracardiaque.
Impact sur les animaux
Les nuisances et effets indésirables étant susceptibles d’apparaître seraient, selon leurs degrés de gravité du stress pour l’ensemble des procédures : Leger. Une perte de poids pour l’ensemble des procédures, une hypothermie lors des phases d’anesthésies : Modéré. Des douleurs post-opératoires, des déficits fonctionnels dans le cadre de l’ischémie cérébrale : Sévère.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de pouvoir récupérer leurs tissus pour des analyses cytologiques et histologiques.
Remplacement
Les procédures expérimentales pour réaliser ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacées par d'autres méthodes expérimentales n'impliquant pas l'utilisation d'animaux vivants et susceptibles d'apporter le même niveau d'information. En effet, des approches in silico ne permettent pas d’obtenir le même niveau de sensibilité. De même, des approches in vitro ne permettent pas de reproduire la complexité d’un modèle in vivo. Nous avons sélectionné le modèle présentant le meilleur compromis entre pertinence scientifique et sensibilité de l’espèce. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Le projet est justifié d’un point de vue scientifique car il permettra des recherches fondamentales, translationnelles et/ou appliquées pour le diagnostic et le traitement d’une pathologie humaine neurovasculaire : l’AVC.
Réduction
Notre projet ne nous permet pas d’utiliser d'autres moyens que l’expérimentation animale. Avant de procéder à une telle étude, nous nous sommes assurés d’utiliser le nombre minimal d’animaux adéquat pour atteindre le résultat souhaité afin de souscrire au principe de réduction. Ainsi, les procédures expérimentales décrites dans ce projet ont un caractère de stricte nécessité et ne peuvent pas être remplacés par d’autres méthodes expérimentales n’impliquant pas l’utilisation d’animaux vivants et susceptibles d’apporter le même niveau d’information disponible. Dans ce projet, le nombre minimum d’animaux pour chaque procédure a été défini à partir de nos expériences précédentes, de nos données sur chaque modèle et des données disponibles dans la littérature. En fonction de l'expérimentateur (habileté, expérience, prédisposition pour ce type de gestes), le nombre d'animaux pourra être revu à la baisse en fonction de son aisance. L’ensemble des échantillons collectés permettra un partage de tissus, une réutilisation et donc une réduction du nombre d'animaux nécessaires.
Raffinement
Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés pendant tout le projet. Les animaux seront hébergés par groupes sociaux stables (n=5) avec un enrichissement minimum (maison en carton, produits de nidification tels que des lanières de paipier kraft et/ou des carrés de coton nestlets) dans des cages standards aux normes européennes (type IV). Nous utiliserons une litière plus douce et variée et moins poussiéreuse et allergisante, permettant de réduire le niveau de stress des animaux. Le bien-être des animaux sera contrôlé 7j/7 par du personnel qualifié, ce qui permettra de détecter tout signe clinique de souffrance et d’agir rapidement pour mettre fin à une éventuelle détresse. L’ensemble des connaissances et acquis dont nous disposons au laboratoire pour les techniques utilisées dans ce projet montre que les animaux se déplacent et s'alimentent normalement, prennent bien soin de leur pelage, n’émettent aucun son audible à l'oreille humaine et ne présentent aucun « sickness behavior syndrom ». Une fois entrés en protocole, les animaux seront pesés tous les jours pour surveiller leur poids et mis à mort si une perte de poids de plus de 15% est observée et/ou si leur score sur l’échelle de la douleur (Mouse Grimace Scale) est supérieur à 7 pendant les 48h critiques au modèle. Durant la pose de prothèse, les souris seront sous anesthésie générale et sous analgésie. Les animaux recevront une anesthésie locale sur la peau au niveau de l'artère cérébrale moyenne (ACM). Les yeux seront couverts avec du gel oculaire afin de ne pas éblouir les animaux et prévenir la déshydratation. Après chirurgie, les souris seront placées dans des enceintes post-opératoires chauffées puis remises dans leurs cages propres et disposeront de croquettes humides dans une coupelle sur le sol de leur cage pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Un système de pastilles à code couleur collé sur la cage permettra d’identifier les animaux les plus « à risque ».
Choix des espèces
La souris (Mus musculus) est l’espèce animale la plus étudiée dans la recherche sur les AVC et les techniques employées sont bien maitrisées. L’anatomie du système nerveux murin et la physiologie de la souris sont également bien connues et sont proches de celles de l’Homme, ce qui fait des modèles utilisés dans ce projet des approches expérimentales fiables. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour cette étude. Qui plus est, il n’existe pas de modèle fiable utilisant des vertébrés moins sensibles ou des invertébrés, compte tenu de leur anatomie et de leur physiologie très différentes de l’Homme. Concernant l’ensemble des procédures, seuls des animaux adultes âgés de 8 semaines seront nécessaires, afin d’être comparable aux données présentes dans la littérature sur ces modèles pré-clinique.
Mise au point d’une technique de prélèvement de liquide céphalo-rachidien (LCR) chez la souris anesthésiée
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
60 souris vont être utilisées, opérées sous anesthésie et tuées avant tout réveil. Chaque animal subit une chirurgie de trente minutes destinée à mettre au point un geste de prélèvement de liquide céphalo-rachidien, sans objectif de connaissance au-delà de la maîtrise de la technique. Le porteur indique que les animaux, inconscients pendant l'acte, ne devraient ressentir aucune douleur, et précise recourir en partie à des animaux de réforme. Il affirme ne pas pouvoir éviter l'usage d'animaux pour développer ce geste, présenté comme "essentiel" à de futurs projets en neurosciences.
Objectifs
Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est le liquide dans lequel baignent le cerveau et la moelle épinière. Il amortit ainsi les mouvements et les chocs qui risqueraient d’endommager le cerveau, mais permet également le passage de substances du cerveau et de la moelle épinière vers le système nerveux périphérique. Ce liquide présente une importance capitale dans le cadre clinique puisque son analyse permet déjà de diagnostiquer certaines maladies neurodégénératives. Ce liquide est aussi très important dans le cadre de la recherche car son analyse pourrait aider à une meilleure compréhension de différentes maladies du cerveau et de la moelle épinière dont les mécanismes sont encore inconnus. Cependant, son prélèvement est délicat, d’autant plus chez la souris du fait de la petitesse de la zone d’accès. Ainsi, nous proposons de mettre au point une technique de prélèvement de LCR chez la souris anesthésiée pour pouvoir étudier ce liquide, sa composition, et comprendre certains mécanismes sous-jacents aux pathologies du cerveau et de la moelle épinière.
Bénéfices attendus
A l’issue de ce projet, nous maitriserons une nouvelle technique de prélèvement de LCR chez la souris, technique plus précise et permettant l’obtention d’échantillons sans contamination par des cellules sanguines. Plus généralement, la maîtrise d’une technique de prélèvement du LCR sans contamination sanguine chez la souris est essentielle pour le développement des projets dans le domaine des neurosciences et plus particulièrement pour la compréhension des mécanismes à l’origine des pathologies inflammatoires et neurodégénératives du cerveau et de la moelle épinière. Ce projet permettra donc d’assurer le raffinement maximal et une réduction des animaux dans les futurs projets en améliorant la technique et la qualité des échantillons.
Procédures
Les souris seront soumises à une chirurgie sous anesthésie à l’isoflurane d’une durée de 30 minutes.
Impact sur les animaux
En pré-anesthésie, il peut y avoir stress de contention. Par contre, le restant des actes étant fait sous anesthésie/antalgie adaptées et surveillées tout le temps de la procédure, l'animal inconscient ne doit ressentir aucune douleur.
Devenir
Cette étude servant à la mise au point du geste de prélèvement de LCR, nous mettons à mort à l’issue de la réalisation du geste.
Remplacement
Les études prévues dans cette demande ayant pour finalité de mettre au point, développer et améliorer le geste de prélèvement du LCR chez la souris anesthésiée, nous ne pouvons éviter l’utilisation d’animaux.
Réduction
Nous avons estimé le nombre minimum d’animaux nécessaires à ces mises au point en intégrant le risque de possibles contaminations du LCR lors des prélèvements. De façon générale, et autant que possible, nous utiliserons des animaux de réforme disponibles sur la plateforme d’animalerie. Cette technique permettra également de réduire le nombre d’animaux car il sera possible de prélever le LCR et d’autres organes et tissus à partir d'une même souris.
Raffinement
Les souris seront anesthésiées durant la procédure de prélèvement du LCR. La profondeur de l’anesthésie sera évaluée par le réflexe de retrait de la patte ou le pincement de la queue. L’hypothermie due à l’anesthésie sera limitée grâce à l’utilisation d’un tapis chauffant pendant la durée totale du geste. Enfin, du gel ophtalmique sera également appliqué sur les yeux de manière à éviter un dessèchement oculaire. Une période d’acclimatation d’un moins dix jours sera respectée entre l’arrivée des souris dans l’établissement utilisateur où elles seront hébergées en groupe dans un milieu enrichi (tunnel, coton, frisure, bâton à ronger). Le tunnel servira également à la manipulation des souris éveillées, limitant le stress de la manipulation. Enfin, des points limites ont été définis.
Choix des espèces
La souris étant actuellement l’organisme-modèle le plus utilisé pour l’étude des neuropathologies, nous réaliserons nos mises au point sur cette espèce à un stade « adulte », à partir de 8-10 semaines, qui correspond au stade de développement des animaux généralement utilisés dans les études de neuropathologies.
2. Etude des conséquences de la modulation du métabolisme dans la voie nigro-striée chez le rat sain et dans des modèles rat de la maladie de parkinson
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
300 rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils subissent une à deux chirurgies du cerveau reproduisant la maladie de Parkinson, des prélèvements sanguins, des tests moteurs, un test d'anxiété et un test de motivation répété chaque jour pendant dix-sept semaines, avant d'être mis à mort pour prélever le cerveau. Le porteur indique des douleurs postopératoires et, aux stades avancés du modèle, des déficits moteurs entraînant des difficultés à se déplacer, à se nourrir et une perte de poids. Il affirme qu'aucune méthode sans animaux ne permet d'évaluer à la fois le comportement, la mort des neurones et les marqueurs sanguins, et qu'une étude des stades précoces est impossible chez l'humain.
Objectifs
Notre objectif principal est de mieux comprendre les mécanismes qui sont à l’origine de la mort des neurones dans la maladie de Parkinson afin de développer une stratégie de détection précoce de la maladie et proposer de nouvelles cibles thérapeutiques, en explorant particulièrement le rôle des marqueurs métaboliques.
Bénéfices attendus
Mieux comprendre l'origine de la maladie de Parkinson pour proposer une nouvelle cible thérapeutique plus efficace que celles existantes.
Procédures
Les animaux subissent une à deux neurochirurgies d'une durée maximale de 1h, anesthésie incluse. Ils subissent 2 à 3 prélèvements sanguins, espacés de plus de 5 semaines et n’excédant pas plus de 10 minutes, anesthésie incluse. Ils sont soumis 2 ou 3 fois à 2 tests moteurs complémentaires (durée maximum 1 heure) et un test d’anxiété (durée maximum 5 minutes), chaque session de tests étant séparée de la suivante d’au moins 6 semaines. Ils sont également soumis quotidiennement à un test pour mesurer la motivation (durée maximal 1 heure) pendant 17 semaines maximum.
Impact sur les animaux
Pour les procédures de chirurgie du cerveau, une nuisance ou des effets indésirables modérés pourront concerner essentiellement les douleurs post-opératoires. Pour les modèles de la maladie utilisés, ceux-ci peuvent présenter uniquement des déficits psychiatriques légers telle qu’une baisse de motivation (stade précoce) n’entraînant pas de difficulté à s’hydrater ou se nourrir ; ou également des déficits moteurs (stade avancé) pouvant conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids. Une souffrance légère pourra être liée aux échantillonnages sanguins réalisés par ponction de la veine de la queue sur animal anesthésié, pouvant induire chez l’animal stress et hémorragie locale. Enfin, l’ensemble des tests comportementaux pourra induire une nuisance légère due au stress généré par la préhension des animaux par l’expérimentateur.
Devenir
Les animaux seront euthanasiés afin de pouvoir prélever leur cerveau pour réaliser les analyses nécessaires à l'étude
Remplacement
Il n’existe pas de méthodes alternatives, n’impliquant pas d’animaux vivants, qui permettront l’évaluation à la fois du comportement, de la mort des neurones et des modifications des niveaux de certaines molécules exprimées dans le sang et le cerveau. D’autre part, une étude sur les stades précoces de la maladie de Parkinson ne peut pas être réalisée chez l’homme pour le moment car nous ne savons pas détecter la maladie si précocement.
Réduction
Le nombre d’animaux sera limité au nombre minimum nécessaire et suffisant par groupe afin d’avoir une chance de détecter une différence significative. Ce nombre a été estimé à l’aide d’approches statistiques appropriées à chaque type de données.
Raffinement
Les animaux sont hébergés pendant une semaine à leur arrivée pendant laquelle ils sont manipulés quotidiennement, avant le début des expérimentations, afin d’atténuer le stress pouvant être lié aux manipulations et aux contentions. Ins sont hébergés selon la procédure mise en place par l’animalerie afin de maintenir un milieu socialement riche et d’éviter tout stress supplémentaire. Les prélèvements sanguins sont réalisés sur les animaux endormis puis maintenus sous anesthésie volatile permettant un recueil de sang dans la queue. Chaque recueil se fait en un point différent du précédent pour limiter les risques lésionnels. Les chirurgies du cerveau sont réalisées sous anesthésie générale, les yeux sont protégés de la dessication et les points de contentions et d’incisions sont préalablement analgésiés. La température est maintenue constante. En post-opératoire les animaux sont placés sous une lampe chauffante jusqu’à leur réveil avec contrôle de la température. Les douleurs post-opératoires sont prévenues par injection d’un antalgique. A leur réveil, les animaux sont retournés dans leur cage avec leurs congénères. Le projet implique la mise en place d’un état pathologique de classe modérée chez le rongeur. Deux modèles sont utilisés car ils miment des aspects différents mais complémentaires de la maladie. Pour les animaux mimant la phase avancée de la maladie, les déficits moteurs peuvent conduire à des difficultés pour se déplacer et se nourrir et s’accompagner d’une perte de poids qui sera limitée par l’ajout dans la cage d’hébergement d’une nourriture appétante hypercalorique et humidifiée. Dans tous les cas, le suivi biquotidien et les pesées bihebdomadaires des animaux permettent de veiller à ce que les animaux ne souffrent pas et à mettre en place des stratégies de soin et des points limites adaptés.
Choix des espèces
Le rat apparaît comme l’espèce adéquate car il possède un degré de similitude important avec le cerveau humain, notamment au niveau des réseaux impliqués dans le développement de la maladie de Parkinson, et il est couramment utilisé (modèle animal principalement utilisé) pour les études sur cette maladie. Par ailleurs, cette étude étant basée sur de précédents résultats de la littérature obtenus dans la même espèce, il semble cohérent de continuer sur cette espèce. Au début de l’étude, les rats seront de jeunes adultes (7-8 semaines), ce qui permettra de travailler sur un système cérébral stable, mature, qui n’évoluera pas au cours des procédures expérimentales qui prendront plusieurs mois.
Suivi fonctionnel et biologique de souris Apc pré-cachectiques et cachectiques
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système endocrinien
- Système musculosquelettique
- Système nerveux
208 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, la moitié dans des procédures menées sous anesthésie sans réveil et l'autre dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles portent une mutation qui provoque un cancer de l'intestin et une fonte musculaire, avec sang dans les selles et prolapsus, subissent des tests fonctionnels et des prélèvements de tissus, pour étudier l'activation de l'axe hormonal du stress lors de la cachexie cancéreuse. Le porteur classe le maintien de cette lignée en gravité sévère à cause de la souffrance liée à l'avancée de la maladie et prévoit une mise à mort dès l'apparition de ces signes. Il affirme qu'un système in vitro ne reproduit pas la complexité de ce processus et que seul le modèle murin le permet, les stratégies thérapeutiques restant à proposer.
Objectifs
Le déconditionnement musculaire désigne une perte de masse et de force musculaire qui peut être observé dans différentes situations pathologiques (cancer, myopathie, insuffisances cardiaque, rénale ou respiratoire). Dans le cas du cancer, ce déconditionnement musculaire est extrêmement marqué (on parle de cachexie associée au cancer) et constitue un facteur majeur contribuant à la réduction de l'état de santé et de la qualité de vie des patients. Connaitre les mécanismes responsables du déconditionnement musculaire associé au cancer et développer des stratégies thérapeutiques pour lutter contre ce déconditionnement constituent un des enjeux actuels majeurs de la recherche en cancérologie. Les travaux antérieurs conduits par notre équipe de recherche chez un modèle murin de cancer de l'intestin, ont mis en évidence une activation de l'axe corticotrope (axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien) associée à une augmentation de la concentration en glucocorticoïdes dans le compartiment sanguin, le muscle et le foie, ainsi qu'à la mise en place d'une réponse transcriptionnelle dépendante des glucocorticoïdes dans le muscle et le foie. Dans ce contexte, l'objectif de ce projet est de déterminer la nature des mécanismes, qui au niveau central, sont à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope chez ces souris.
Bénéfices attendus
En déterminant les mécanismes potentiels à l'origine de l'activation de l'axe corticotrope, ce projet permettra de développer notre compréhension des mécanismes mis en jeu lors de la cachexie associée au cancer, et de proposer des stratégies d'intervention visant à limiter l'activation de l'axe corticotrope dans un modèle pré-clinique de cachexie associée au cancer.
Procédures
Les animaux subiront : 2 tests fonctionnels non invasifs et indolores d'environ 5 à 10 min chacun en fonction de la participation volontaire de l'animal, soit un prelèvement sous anesthésie gazeuse d'une durée de 5 min, soit 1 procédure invasive sous anesthésie générale et sans réveil d'une durée de 1h30; enfin les prélèvements tissulaires seront réalisés sous anesthésie chimique sans réveil.
Impact sur les animaux
Concernant les souris contrôles, aucune nuisance n'est attendue à l'exception du prélèvement sanguin sous anesthésie gazeuse. Concernant les souris spécifiques (s'agissant d'un génotype dommageable : suivi et entretien de la lignée), certaines nuisances peuvent apparaitre (sang dans les fèces, prolapsus). Compte tenu des risques de souffrance pouvant apparaitre en lien avec l'avancée de la maladie, le maintien et l'entretien de la lignée implose une classification de gravité sévère. Dans les cas où ces symptômes évocateurs d'une souffrance animale seraient atteints, les animaux seront immédiatement sortis du protocole et une mise à mort éthique sera effectuée sous anesthésie générale.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort afin de procéder aux différentes analyses et prélèvements de tissus.
Remplacement
Le déconditionnement musculaire associé au cancer est un processus catabolique multifactoriel sollicitant de nombreux tissus (muscle, foie, tissu adipeux, tissus endocriniens, système immunitaire, système nerveux central). Un système expérimental in vitro ne permettrait pas de reproduire la complexité de ces régulations. Seul un modèle animal murin permet de reproduire la complexité des mécanismes biologiques mis en oeuvre.
Réduction
Nous avons calculé l'effectif par groupe sur la base du critère d'évaluation principal : surface de section transversale des fibres musculaires qui permet d'apprécier l'ampleur de la perte de masse musculaire Après avoir intégré différents paramètres statistiques, il ressort que 12 animaux/groupe seront nécessaires. Afin d'anticiper le cas rare où une interruption précoce de la procédure serait nécessaire pour certains animaux, nous prévoyons des lots de 14 animaux par groupe. Ces animaux supplémentaires ne seront utilisés qu’en cas de besoin afin d’obtenir au final les 12 animaux par groupe nécessaires à la significativité des résultats. Cette stratégie expérimentale permet le meilleur respect possible de la règle des 3R et nous permettra d’évaluer les différences significatives pour l'analyse des données.
Raffinement
Le bien-être animal est une préoccupation majeure lors de la réalisation de nos expérimentations. Dans ce projet, nous veillerons à ce que l'hébergement des animaux leur permettent d'avoir un enrichissement (paille, bois et coton) suffisant et stimulant pour réaliser leur nid. Les animaux seront hébergés à 3 individus par cage dans un local à température contrôlée avec un cycle lumière/obscurité de 12H00. Les souris auront libres accès à l'eau et à la nourriture. Afin de réduire le stress des animaux, les souris seront habituées aux expérimentateurs qui les manipuleront de façon bi-hebdomadaire (suivi de poids). Nous serons aussi particulièrement vigilants à l'apparition de tout signe évocateur d'une souffrance animale. Une observation quotidienne des animaux sera réalisée afin de déceler l'apparition des signes généraux évocateurs de souffrance. Les animaux seront scorés sur 3 critères : le changement de poids corporel, l'apparence physique, et le comportement.
Choix des espèces
L'essentiel des études expérimentales consacrées à la cachexie associée au cancer a été réalisé en utilisant des modèles souris de cancer. En travaillant sur le modèle souris nous pourront donc comparer nos données à celles de la littérature scientifique. Par ailleurs notre expertise scientifique et technique sur le modèle souris, nous permettra de réaliser ce projet sans étape de mise au point préalable. Afin d'étudier la régulation de l'axe corticotrope lors de la cachexie associée au cancer, les souris seront analysées à un stade pré-cachectique (absence de perte de masse musculaire) à l’âge de 11 semaines et à un stade cachectique (présence d'une perte de masse musculaire) à l'âge de 15 semaines. Nos travaux antérieurs ont permis de valider ces 2 points d'analyse. Des souris de type sauvage issues des mêmes portées que les souris mutées seront utilisées comme animaux contrôles.