Système nerveux
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Etudes des propriétés intrinseques des neurones néocorticaux chez trois modèles transgéniques (souris) de maladie neurodéveloppementale
- Recherche fondamentale
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2 384 souris vont être utilisées dans des procédures impliquant un niveau de souffrance allant de l'anesthésie sans réveil au modéré. Des modèles transgéniques de troubles neurodéveloppementaux subissent des enregistrements cérébraux de quatre heures sous anesthésie, des tests de réaction aux sons et au toucher et des administrations par gavage ou injection. Une partie des souris est tuée sous anesthésie pour prélever le cerveau, tandis que le porteur indique en garder 540 vivantes pour des expériences ultérieures. Il affirme que le modèle animal est "absolument nécessaire" et qu'aucun remplacement in vitro ou in silico n'est possible.
Objectifs
Les troubles neurodéveloppementaux (TN) touchent environ 1 enfant sur 60. Les facteurs génétiques, ainsi que les facteurs environnementaux, jouent un rôle important dans l'étiologie de ce trouble complexe. Certains TN se caractérisent par des déficiences en matière de communication et d'interaction sociale ainsi que par des comportements stéréotypés répétitifs. Les personnes atteintes de ce trouble présentent souvent une réponse inappropriée aux stimuli sensoriels. Cette sensibilité anormale peut avoir un impact dévastateur sur leur vie quotidienne (par exemple, incapacité à porter certains vêtements, à tolérer le bruit ou la lumière dans un centre commercial ou une école) et peut entraîner des inégalités dans l'accès à l'éducation, etc. A ce jour, il n'existe aucun traitement permettant d'améliorer la vie de ces personnes. L'objectif de notre projet actuel est de mieux comprendre les processus neurobiologiques qui sous-tendent les défauts de traitement de l'information sensorielle dans les modèles murins de la TN. Nous effectuerons des enregistrements cérébraux et des tests comportementaux afin de tester la capacité de molécules potentiellement thérapeutiques à corriger les défauts de traitement sensoriel dans le cerveau.
Bénéfices attendus
Notre projet s'attaque à des défis importants pour comprendre la base neurobiologique de l'expérience sensorielle atypique dans les TN (et sa remédiation). Les innovations particulières de notre approche sont (1) l'utilisation d'un système cérébral qui est hautement conservé entre les souris et les humains, fournissant ainsi un système modèle idéal pour les études translationnelles. (2) Nous utilisons une approche thérapeutique basée sur un mécanisme, soutenue par de solides données préliminaires et publiées et par la génétique humaine. Notre proposition aborde un certain nombre de défis importants en suspens dans la recherche sur les TN, y compris la pertinence de développer des approches expérimentales comparables dans les modèles de recherche humains et rongeurs, et le rôle critique des caractéristiques sensorielles altérées dans les TN. De plus, comme les caractéristiques sensorielles sont fortement déterminantes pour d'autres symptômes des TN, toute approche thérapeutique ciblant le traitement atypique de l'information sensorielle a le potentiel d'améliorer d'autres symptômes de ce trouble.
Procédures
Nous effectuerons des enregistrements cérébraux sur des souris anesthésiées qui recevront une analgésie tout au long de l'expérience pour gérer toute douleur. La durée de cette expérience sera de 4 heures. Nous effectuerons des tests comportementaux pour observer la capacité exploratoire des souris et leur réaction aux sons et au toucher. Les souris seront manipulées et habituées avant ces tests comportementaux. Les tâches comportementales seront effectuées pendant 10 jours, à raison de 20 minutes maximum par jour. Pour certains tests, les souris reçoivent un produit médicamenteux par injection intrapéritonéale ou par gavage. Chaque prise de médicament durera environ 5 seconds.
Impact sur les animaux
Les animaux subiront à des test de comportement. Certains de ces tests sont légèrement anxiogènes, ou implique une contention de l'animal. Certains animaux reçoivent une drogue expérimentale. Cela implique une injection intraperitonéale ou l'adminsitration par gavage. L'administration par voie i.p. peut provoquer une légère douleur au site d'injection. Le gavage peut conduire à une irritation au niveau de l'oesophage. L'administration d'anesthésique implique également une injection qui est légèrement douloureuse.
Devenir
Pour certaines procédures, les souris seront gardées en vie pour des expériences ultérieures afin de réduire le nombre d'animaux utilisés dans les études futures. Pour les expériences impliquant les enregistrements cérébraux, les souris seront euthanasiées humainement alors qu'elles sont encore sous anesthésie et leur cerveau sera collecté pour un examen morphologique des neurones. Pour les expériences comportementales, les souris seront euthanasiées humainement par une personne formée et selon les méthodes réglementaires approuvées.
Remplacement
Le modèle animal est absolument nécessaire pour reproduire la complexité des interactions neuronales nécessaire pour le traitement de l’information sensorielle qui demande un système intact. Le remplacement par les méthodes in vitro ou in silico n’est pas possible à ce jour. Cependant, certaines expériences préliminaires visant à tester le potentiel des nouvelles molécules thérapeutiques seront réalisées in vitro avant l'application de ces molécules chez l’animal.
Réduction
Pour les enregistrements cérébraux, notre stratégie d’expérimentation nous permet d’effectuer une analyse précoce de nos données au fur et a mesure et de modifier la taille d’echantillon si besoin. Pour les tests comportementaux, la taille de nos échantillons est similaire à celle suggérée par d'autres études similaires. Nous ne pouvons pas utiliser les mêmes souris dans les groupes non traités, administrés avec le véhicule et administrés avec le traitement, car cela aurait pour conséquence que les mêmes souris subissent chaque test comportemental plusieurs fois, ce qui pourrait confondre nos résultats comportementaux, comme cela a été rapporté dans plusieurs études précédentes. Il s'agit d'une considération particulièrement importante dans nos tests, car nous examinerons l'accoutumance sensorielle, qui pourrait être affectée par la répétition des mêmes tests sur les souris plusieurs fois. En outre, nous effectuerons certaines études pilotes pour tester, a priori, la faisabilité technique de certaines manipulations. Cela nous permettra de poursuivre nos études dans les meilleures conditions expérimentales, afin de limiter le nombre d'animaux utilisés dans l'ensemble de notre étude.
Raffinement
Avant expérimentation: Surveillance quotidienne et vérification de l’état de l’animal (posture, comportement, vivacité, état de pelage). Pendant les enregistrements cérébraux: Le séance d'enregistrement se fait sous anesthésie générale. Le mélange anesthésique utilisé a une action analgésique. Un crème ophtalmique est appliqué aux yeux. L'animal est maintenu sur tapis chauffant. Durant la séance d’enregistrement la température de l’animal est contrôlée grâce à une sonde rectale. Pour les enregistrements longs: injection s.c. d'une solution physiologique. Réduire au maximum l’angoisse : Hébergement de manière à correspondre aux besoins de l’animal – mise à disposition du matériel pour la construction d’un nid. Utilisation d'un tube de transfert afin de limiter le stress lié à l'interaction avec l'expérimentateur.
Choix des espèces
Ce modèle (la souris) a été choisi car les rongeurs ont un système sensoriel très développé et sont considérés comme une espèce modèle pour les études concernant le traitement de certains types d'informations sensorielles. De plus, la souris est actuellement la seule espèce de mammifère dont il est possible de modifier le génome en routine pour créer des modèles de maladies humaines. 4 à 16 semaines, selon le type de manipulation prévu. Justification : Nous nous appuyons sur des études antérieures réalisées au sein de notre laboratoire ou de celui de nos collaborateurs pour définir les meilleures conditions expérimentales afin d'assurer le bon déroulement de nos expériences.
Étude anatomo-fonctionnelle du noyau arqué et de ses connexions dans la perturbation des rythmes circadiens liée à un régime alimentaire hypercalorique chez la souris
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135 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent des chirurgies stéréotaxiques et des injections dans le foie, un régime hypercalorique et un isolement social de deux semaines décrit comme un stress important, ainsi que des prélèvements sanguins répétés. Le porteur veut cartographier les connexions cérébrales impliquées dans les troubles du rythme alimentaire liés à l'obésité. Il affirme que ces interactions ne peuvent pas être étudiées sur organes isolés ou cultures cellulaires.
Objectifs
Des perturbateurs extérieurs comme une alimentation riche en graisses et en sucres favorise la prise de masse et l’obésité. Chez l’homme tout comme chez les souris, une telle alimentation provoque non seulement un surpoids, mais aussi une altération des rythmes circadiens dont le rythme de prise alimentaire, perturbation qui à son tour favorise la prise de poids. Ce projet propose d’étudier le réseau de connexions cérébrales de certaines structures impliquées dans ces altérations ainsi que de leurs connexions avec des organes périphériques impliqués dans la régulation de la prise alimentaire, comme le foie. Grâce à ses connexions privilégiées avec les noyaux suprachiasmatiques (NSC), siège de l’horloge circadienne principale, et les afférences viscéro-sensorielles en provenance des organes en lien avec la prise alimentaire comme le foie, le noyau arqué (ARC) de l’hypothalamus est un candidat de premier ordre dans la recherche d’un centre intégrateur des informations circadiennes dont l’activité serait perturbée par une alimentation hypercalorique. Ce projet aura donc pour objectifs 1) de mettre en évidence les connexions cérébrales de ARC ainsi que ses connexions avec le foie, organe majeur dans la prise alimentaire et 2) étudier les différences d’activité de ces réseaux lorsque l’animal suit un régime hypercalorique.
Bénéfices attendus
L’étude de l’implication de ARC dans la perturbation des rythmes de prise alimentaire liée à une alimentation hypercalorique apportera des connaissances essentielles pour mieux comprendre les désordres alimentaires pouvant être à l’origine de maladie métaboliques telles que le diabète et l’obésité, et potentiellement permettre d’améliorer la prévention et le traitement de ces physiopathologies.
Procédures
Une partie des animaux sera soumise à des procédures chirurgicales (chirurgie stéréotaxique et injections dans le foie et la ganglion jugulaire noueux). Une partie des animaux sera nourrie avec un régime hypercalorique pendant 2 semaines. Cette même procédure nécessitera un isolement des animaux pendant 2 semaines. Enfin, les prélèvements sanguins au niveau de la veine submandibulaire auront lieu deux fois par semaine pendant deux semaines.
Impact sur les animaux
Le régime hypercalorique devrait entraîner un surpoids progressif des souris, ce qui est l’objet même du modèle expérimental. Les différentes chirurgies peuvent induire de la douleur postopératoire modérée, un inconfort et/ou une inflammation locale transitoire au niveau des sutures. L’isolement social de deux semaines peut créer un stress important aux animaux. Les prélèvements sanguins peuvent induire une hémorragie, une douleur transitoire aiguë et/ou une inflammation locale.
Devenir
La mise en évidence des connexions cérébrales de ARC et de ses connexions avec le foie, ainsi que l’étude de l’effet d’un régime HFD sur la rythmicité de la prise alimentaire et sur le recrutement de ces réseaux de connexions impliquent la mise à mort des animaux pour prélever les différents tissus.
Remplacement
La régulation des cycles journaliers de la prise alimentaire et du métabolisme impliquant un grand nombre d’organes différents (cerveau, foie mais aussi pancréas, surrénales, muscles), l’investigation des interactions entre horloges circadiennes et nutrition nécessite donc l’utilisation de modèles animaux. Ainsi est-il impossible de réaliser ces études sur des organes isolés ou des cultures cellulaires in vitro.
Réduction
Au regard des données de la littérature, de notre expérience et de la variabilité phénotypique individuelle, nous avons réalisé une analyse statistique de puissance (power analysis) qui a déterminé que les données sont statistiquement exploitables et publiables avec des cohortes de 25 et 30 souris pour les investigations neuroanatomiques et de 40 souris par sexe pour le comportement. Les expériences seront réalisées avec la volonté de réduire au maximum le nombre d’animaux, tout en obtenant le maximum d’informations scientifiques pour chaque animal. Pour les procédures d’investigation anatomique des réseaux neuronaux, la difficulté est d’avoir une efficacité d’infection virale suffisante et des injections très précises tout en réduisant le nombre d’animaux utilisés. Pour ce faire, ces procédures ne seront réalisées que chez les mâles, aucune différence anatomique et neuroanatomique n’ayant été mise en évidence par la littérature dans les différentes régions ciblées par ce projet. Les animaux utilisés pour pratiquer les injections dans le ganglion noueux jugulaire seront également utilisés pour pratiquer les injections dans le foie. Enfin, la combinaison de procédures comportementales avec des procédures de prélèvements sanguins, de suivi de consommation alimentaire et d’évolution du poids des animaux permettra de ne générer qu’une cohorte de souris par sexe pour répondre à plusieurs questions scientifiques.
Raffinement
Tout au long des expériences, les animaux isolés ou non sont hébergés dans un milieu enrichi (matériel de nidification, bâton de bois et tunnel) et observés quotidiennement par l’expérimentateur ou une personne compétente de façon à optimiser leur confort et limiter une quelconque souffrance. Les souris sont habituées à l’expérimentateur et à l’expérimentation afin de limiter leur angoisse et le stress. Pour chaque procédure, des points limites adaptés ont été définis. Pour le suivi du bien-être animal lors de l’isolement, de même qu’à la suite des prélèvements sanguins, des grilles de score, évaluant essentiellement l’état général de l’animal, son poids et sa réactivité à la manipulation, seront utilisées. Elles permettront d’objectiver des points limites définis selon les directives éthiques indiquées par l’association internationale pour l’étude de la douleur. La vétérinaire désignée pourra être sollicitée pour émettre un diagnostic et mettre en place les mesures correctives adaptées si nécessaire de façon à limiter la souffrance animale. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale et analgésie pendant et après la chirurgie. De plus, en complément de la grille de score du suivi de l’isolement social, après chaque chirurgie, l’état de santé des animaux sera évalué à l‘aide d’une grille de score spécifique à la procédure chirurgicale, ciblant notamment les risques d’inflammation au niveau de la zone opérée et la reprise de poids de l’animal. Si de nouvelles approches moins stressantes ou douloureuses pour l’animal venaient à être mises au point après le début de ce projet, elles pourraient être intégrées dans nos procédures.
Choix des espèces
La souris est devenue un modèle classique en nutrition et en chronobiologie. C’est aussi un modèle incontournable dans l’utilisation des nouveaux outils technologiques permettant entre autres l’enregistrement en temps réel et la manipulation des réseaux neuronaux, qui sont des techniques envisagées pour la suite de ce projet. L’étude de la neuroanatomie et des comportements nécessitant des systèmes neurobiologiques totalement matures, des animaux adultes seront utilisés (début des procédures à 8 semaines, poids supérieur à 20g).
Etude de molécules favorisant la remyélinisation dans la Sclérose en plaques, grâce au modèle de Xénope (Xenopus laevis) transgénique
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12 000 têtards de xénope vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Ils sont exposés au métronidazole pendant dix jours puis à des molécules à tester, avec quatre anesthésies et quatre tests comportementaux, pour cribler cinquante molécules candidates contre la sclérose en plaques. Le porteur estime la mortalité prématurée à environ 10 % pour le développement et 10 % pour l'exposition au métronidazole, et certaines doses peuvent être toxiques. Il justifie le recours au têtard par sa transparence et par le grand nombre d'individus que produit l'espèce.
Objectifs
La sclérose en plaques (SEP) est une maladie neurologique et inflammatoire, c’est la première cause d’handicap chez le jeune adulte, et touche environ 110 000 personnes en France, avec 4 000 à 6 000 nouveaux cas par an. Dans cette maladie, la perte de la gaine de myéline (structure graisseuse qui entoure et protège une partie du neurone, permettant la conduction de l’information nerveuse) peut se traduire par un ralentissement voire une interruption de la conduction du message nerveux. Les personnes atteintes de ce type de désordres sont progressivement ou d’amblée handicapées, sur le plan physique et cognitif. Au cours des 20-25 dernières années, des progrès remarquables ont été réalisés dans la prise en charge des patients par l’introduction de traitements visant la composante inflammatoire de la maladie. Cependant bien que ces traitements diminuent notoirement les symptômes, ils ne semblent pas avoir une forte influence sur l’amélioration du statut clinique ou pour prévenir la progression du handicap, comme évalués par les scores cliniques classiques. Des faisceaux d’arguments (modèles expérimentaux, examens neuropathologiques de cerveaux de SEP, nouvelles méthodes d’imagerie chez les patients SEP) suggèrent que la remyélinisation (régénération de la myéline) est un élément clé dans la restauration des capacités motrices et cognitives. L’effort international actuel est donc d’essayer de développer des molécules favorisant la remyélinisation, pour améliorer la prise en charge de la maladie et donc la qualité de vie des patients. Le but de notre projet est d’étudier des molécules améliorant la remyélinisation dans un modèle animal de sclérose en plaques (Xenopus laevis), en couplant des analyses histologiques et comportementales adaptées aux têtards. A plus grande échelle, si ces molécules présentent un effet bénéfique sur la remyélinisation, elles pourront présenter un espoir thérapeutique pour les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques, ou plus largement les maladies affectant la myéline.
Bénéfices attendus
Ce projet permettra d’identifier des molécules pouvant favoriser la remyélinisation. Identifier des molécules remyélinisantes permettrait dans le cas de maladies démyélinisantes comme la sclérose en plaques, d’éviter la neurodégénérescence et à terme la dégradation des capacités fonctionnelles. Les molécules pro-remyélinisantes identifiées pourraient ensuite être utilisées comme piste thérapeutiques.
Procédures
Les têtards sont mis en contact avec du métronidazole (molécule permettant de mettre en place le modèle) durant 10 jours, puis avec des molécules à tester pro-myélinisantes pour une durée de 3 jours maximum. Les têtards sont mis en contact avec les molécules dans leur eau de balnéation. Les têtards vont être anesthésiés 4 fois 5 minutes (3 jours minimum entre chaque anesthésie) pendant toute la durée de la procédure. Ils effectueront 4 tests comportementaux de moins de 5 minutes avec un temps de 3 jours minimum entre chaque test.
Impact sur les animaux
L’anesthésie est maintenue durant toute la procédure pour ne pas engendrer de stress chez l’animal, mais peut entrainer des risques cardio-respiratoires, les battements du cœur sont donc fréquemment contrôlés durant l’anesthésie (facilement visible chez les têtards). La capture à l’épuisette, pour les tests comportementaux, peuvent aussi induire un léger stress chez le têtard, sans entrainer de blessures ou de comportements anormaux. Malgré le soin que nous portons au choix de la dose des molécules, d’après la littérature et les tests in vitro, il arrive que certaines de ces concentrations soient toxiques et peuvent entrainer la mort des têtards. Une mort prématurée des têtards est possible pendant le développement, nous estimons cette perte à 10 pour cent, ainsi que suite à l’exposition au métronidazole, que nous estimons à 10 pour cent également.
Devenir
Afin d’étudier les différents mécanismes impliqués suite à l’exposition aux molécules à tester, il est ensuite nécessaire d’euthanasier les têtards pour faire des études immunologiques plus poussées sur leurs tissus.
Remplacement
Le développement de stratégies thérapeutiques visant les maladies démyélinisantes est confronté à la difficulté de suivre les mécanismes pathologiques au sein de la complexité du système nerveux. C’est la raison pour laquelle les modèles de culture cellulaire ne suffisent pas. A l’opposé, le recours à des animaux vertébrés, qui ont un système nerveux organisé avec des couches de myéline, comparable à ce qui est retrouvé chez l’Homme (et donc intéressant pour étudier les maladies qui atteignent cette structure) peut permettre une première démonstration de l’action d’une molécule in vivo. Cette étape permet de choisir plus objectivement les molécules efficaces et de les tester ensuite chez l’homme. Le choix de l’utilisation du modèle Xenopus laevis repose sur les arguments suivants : - Il s’agit d’un modèle animal, donc un modèle intégré contrairement à des modèles ex vivo et in vitro - La transparence du têtard permet de visualiser tout le système nerveux central sans euthanasie, ce qui permet un suivi in vivo et longitudinal - Le Xénope est une espèce qui génère beaucoup de têtards, facilitant les études toxicologiques et pharmacologiques qui nécessitent un grand nombre d’animaux - Le Xenopus laevis est un animal robuste et facile d’élevage en comparaison à d’autres modèles animaux - Enfin, il existe une grande conservation des protéines de la myéline inter-espèces (amphibiens versus mammifères)
Réduction
Dans le souci de respecter la règle des 3R, ce sont les mêmes têtards qui sont utilisés pour compter le nombre de cellules oligodendrocytaires dans le nerf optique qui seront soumis au test visuel. La transparence des têtards de Xénope permet de suivre in vivo la progression des expériences grâce à l’observation des têtards au macroscope, et ainsi d’éviter des suivis histologiques tout au long du protocole nécessitant l’euthanasie des têtards expérimentaux. Nous souhaitons utiliser environ 240 têtards par molécule, en sachant qu’une molécule est testée en triplicat à 7 concentrations différentes, en comparaison avec un groupe contrôle (8 groupes au total), avec 10 têtards par condition (soit 80 têtards en triplicat donc 240 têtards au total). Ces calculs ont été réalisés à la suite de calculs de puissance pour les expériences proposées. Le nombre de 10 têtards par groupe prend en compte la mortalité spontanée au cours du développement pour certains têtards. Chaque molécule nécessitera 240 (80x3) têtards, et nous avons 50 molécules à tester, soit au total environ 12 000 têtards.
Raffinement
Les têtards sont placés dans un bain de 4L d’eau (moitié eau dure, moitié eau osmosée) à une température de 23 degrés avec une pompe pour oxygéner l’eau. L’eau est renouvelée au minimum une fois par semaine avant le commencement du protocole pour maintenir un volume suffisant et réduire l’accumulation des déchets urémiques, et tous les 3 jours suite à l’exposition au métronidazole. Les têtards sont observés quotidiennement, et ceux qui présentent des anomalies (déformations, retard de développement, troubles de la nage…) sont euthanasiés, les cadavres liés aux problèmes de développement et les surplus de nourriture sont aussi retirés de l’eau quotidiennement. De plus, des souches d’arbres flottants en composite plastique sont placées dans les bacs des têtards, qui leurs permettent de se cacher dessous. Des points limites sont définis et respectés pour éviter toute souffrance animale. Si les doses n’ont pas précédemment été déterminées dans d’autres modèles animaux, elles sont adaptées à partir de l’efficacité des molécules in vitro. Par notre expérience, ces doses sont peu ou pas toxiques chez le têtard de Xénope. Suite à l’anesthésie, les animaux sont placés dans un bac avec une oxygénation de l’eau plus importante et avec leurs congénères, et surveillés dans les minutes suivantes jusqu’au réveil, qui a lieu généralement 5 minutes après la fin de l’anesthésie, avec une reprise de la nage normale. Durant l’exposition au métronidazole, les têtards sont placés dans un incubateur opaque. Cette absence de cycle jour et nuit n’impacte pas les têtards car nous n’avons pas observé de stress ou d’augmentation de la mortalité durant les 10 jours d’exposition.
Choix des espèces
La transparence des têtards facilite le suivi in vivo de l’expérimentation (respect du critère réduction car étude longitudinale), de plus la grande homologie des protéines de la myéline des Xénopes avec celle des mammifères justifie l’utilisation de ce modèle. Les têtards sont utilisés entre stade 50 et 55. A cette période de développement, on peut facilement observer la dynamique de la mort et de la réapparition des oligodendrocytes in vivo et sans recours à l’euthanasie des animaux. De plus, le stade 48 correspond au début de la myélinisation dans le système nerveux central, au stade 50-55 la myélinisation est beaucoup plus avancée, donc plus facile à étudier.
Régulation de l’évitement comportemental par la dopamine
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- Éthologie / comportement / biologie animale
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710 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance léger à modéré. Elles reçoivent des chocs électriques d'intensité modérée dans un test d'évitement de place, subissent une à deux chirurgies stéréotaxiques du cerveau et un isolement de deux semaines, pour étudier les circuits neuronaux de l'évitement. Le porteur rattache ce travail au syndrome de stress post-traumatique et situe les retombées thérapeutiques pour les patients au conditionnel. Il affirme qu'il est impossible de remplacer l'animal vivant pour l'étude du comportement d'évitement.
Objectifs
Ce projet a pour objectif général d’identifier les circuits neuronaux impliqués dans l’évitement de place chez la souris. Ce projet se focalisera sur les neurones de l’aire tegmentale ventrale qui jouent un rôle clef dans le comportement de défense. Or, aucune étude à ce jour n’a cherché à comprendre comment l’aire tegmentale ventrale contrôle l’évitement de place chez la souris. Ce projet nécessitera ainsi l'utilisation de différentes lignées de souris transgéniques permettant la manipulation et enregistrement de l’activité au sein de ce circuit.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à identifier comment les souris apprennent à éviter un lieu dangereux et à cesser d’éviter un lieu qui ne l’est plus. Ce phénomène, autrement appelé persistance d’évitement est couramment observé dans le syndrôme de stress post traumatique. Cet évitement comportemental et cognitif excessif limite l’efficacité de la thérapie comportementale. Comprendre son corrélat neuronal pourrait donc permettre d’identifier des cibles thérapeutiques pour le traitement de l’évitement persistant chez les patients atteints de stress post-traumatique.
Procédures
Ce projet implique une série d’expériences de validation comportementale durant 1 semaine. Des expériences complementaires impliquent une a deux chirurgies stéréotaxiques d'une heure (espacées de 3 semaines) pour étudier des circuits neuronaux impliqués dans le comportement d’évitement de place durant 1 semaine.
Impact sur les animaux
Le comportement d’évitement de place engendre de l’inconfort pour l’animal puisque des chocs électriques d’intensité modérée sont administrés à l’animal. Les approches de chirurgie stéréotaxique sont des procédures douloureuses. L’isolement des souris pendant 2 semaines engendre de l’inconfort pour l’animal.
Devenir
A l’issue de chaque procédure, les souris seront euthanasiées et ne seront donc pas impliquées dans une autre procédure.
Remplacement
Il est impossible de remplacer l’animal vivant pour l’étude du comportement d’évitement. La souris représente un modèle de choix pour notre projet par la possibilité d’étudier des individus génétiquement modifiés et dont la physiologie générale est suffisamment proche de celle de l’être humain pour que les informations obtenues soient pertinentes sur un plan médical.
Réduction
Nous prévoyons d’utiliser un maximum de 646 souris adultes (mâles et femelles) sur un période de 5 ans. Nous avons optimisé les protocoles afin de réduire au maximum le nombre de souris utilisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux. De plus, ce chiffre comprend le nombre d’animaux utilisés pour des études préliminaires (pilotes), afin de 1) déterminer les conditions optimales lors des tâches comportementales de conditionnement et 2) mettre en place de nouvelles techniques, ce qui permettra de diminuer la quantité d’animaux utilisés à long terme. Les animaux mâles et femelles seront utilisés pour toutes les expériences. L'analyse des données se fera en tenant compte du sexe car dans de nombreux cas le niveau basal dans les tâches comportementales est différent. Ceci nous permettra d'utiliser toutes les souris générées.
Raffinement
Enfin, en vue du raffinement des procédures, un soin particulier est apporté aux questions relatives au bien-être animal. Le manque d’interactions sociales pour les expériences ou les souris sont stabulées individuellement est compensé par un enrichissement des cages avec des cylindres de coton permettant de stimuler l’activité naturelle, diminuer le stress et faciliter la thermorégulation. En outre, les cages, transparentes, sont proches les unes des autres afin que chaque animal puisse avoir un contact visuel avec ses congénères. Avant chaque procédure expérimentale, les animaux sont manipulés fréquemment afin de les habituer aux expérimentateurs et réduire ainsi leur stress. Enfin, pour les procédures impliquant une neurochirurgie, un protocole d’anesthésie et d’analgésie péri- opératoire est en place afin de garantir la bonne prise en charge de nos animaux. La santé des animaux sera surveillée tout au long de l'expérience et évaluée grâce à une grille codifiant le niveau de bien être. Cela nous permettra d'intervenir immédiatement et de manière appropriée si un premier signe de souffrance est détecté.
Choix des espèces
L’évitement est un comportement extrêmement important pour la survie et est donc conservé chez les mammifères. Par ailleurs, ce projet requiert l’étude fine de populations de neurones accessibles uniquement via des modèles murins transgéniques. Les souris se reproduisent rapidement (une portée par mois) et leur système nerveux atteint son développement adulte en 12 semaines. Ainsi, la souris adulte représente un modèle de choix pour étudier les mécanismes neuronaux qui contrôlent le comportement d’évitement.
Modulation des déficits cognitifs et phénotypes moteurs par blocage de l’inhibition dendritique dans un modèle murin du Syndrome de Down
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160 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles suivent huit semaines de tests comportementaux (discrimination visuelle, mémoire spatiale, coordination motrice, mémoire de travail) et reçoivent une injection bihebdomadaire d'un traitement, avant d'être tuées pour prélever cerveau, foie et muscles. Le porteur indique n'attendre aucun phénotype dommageable de la lignée trisomique et recourir à une eau de boisson légèrement acide pour renforcer l'apprentissage sans priver les animaux. Il affirme que l'étude de fonctions cognitives impose de travailler sur un "organisme vivant dans son intégrité".
Objectifs
Le projet consiste à comprendre les mécanismes des déficiences intellectuelles associées à des trisomies. Nous nous intéressons plus spécifiquement dans cette étude à la restauration de déficits cognitifs (apprentissage, mémoire) et de coordination motrice dans un modèle de trisomie. Un traitement potentiel, déjà évalué sur un autre modèle de trisomie, a montré son effet positif sur des fonctions simples. Le présent projet souhaite étendre la caractérisation du traitement sur d’autres fonctions d’apprentissage et de mémoire. Il permettra de qualifier plus précisément les effets de l’administration du traitement.
Bénéfices attendus
Cette étude vise à étudier les effets thérapeutiques visant à réduire des défauts de coordination motrice et d’apprentissage et de mémoire. Cette étude constitue donc la base pour la recherche de voie d’amélioration pour les patients.
Procédures
Les animaux seront évalués lors d’un ensemble de tests comportementaux visant à observer leurs performances cognitives. Ces tests seront réalisés pendant une durée totale de 8 semaines. 4 semaines d’apprentissage de discrimination de motif visuelle, 2 semaines de tests évaluant la mémoire spatiale, 2 ou 3 (suivant le test choisi) jours de mesure de coordination d’activité motrice et 1 jour d’évaluation de la mémoire de travail + jours de repos entre les tests. Les animaux subissent une injection (30 s) bi-hebdomadaire (sur les 8 semaines de tests) d’un traitement visant à améliorer leurs fonctions cognitives sans effet négatif décrit.
Impact sur les animaux
Aucun phénotype dommagable n’a été rapporté lors d’études précédentes de la lignée de souris étudiée. L’injection du traitement par voir intra-péritonéale entraînera une légère douleur. Les souris seront soumises à un stress léger ou modéré lors des tests comportementaux (stimuli lumineux et changement ponctuel du pH de l’eau (acidification de l’eau de boisson en cage d’hébergement, qui rend plus appétente l’eau lors des tests d’apprentissage réalisés en dehors de la cage d’hébergement)) afin de favoriser l’apprentissage et ainsi réduire la durée des tests. Cela permet d’optimiser la durée de la procédure globale. L’apparence des animaux (état du pelage qui doit rester brillant et propre, perte de poids visible par saillie des hanches) sera surveillée au cours des manipulations quotidiennes des animaux pendant les tests comportementaux.
Devenir
Tous les animaux de la lignée transgénique étudiée seront mis à mort car nous allons faire des prélévements (cerveau, foie, muscles …) pour faire des études approfondies des tissus et des processus moléculaires
Remplacement
La compréhension des mécanismes de maladies génétiques associées à des retards mentaux requiert l’étude d’un organisme vivant dans son intégrité. L’utilisation d’animaux est donc nécessaire notamment pour évaluer l’effet d’un traitement sur les processus cognitifs et moteurs. La souris est une espèce suffisamment proche de l’Homme, physiologiquement et génétiquement, chez laquelle nous pouvons modéliser des pathologies humaines.
Réduction
Les effectifs nécessaires ont été calculés par rapport aux études précédentes afin d’obtenir des résultats robustes. Nous analyserons les résultats de chaque test avec des tests statistiques adaptés. Nous prélèverons un maximum d’échantillons (organes, tissus…) sur chaque animal afin de pouvoir créer une banque pouvant être utilisée dans d’autres études.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux stables. Les animaux auront une eau de boisson quotidienne légèrement aversive afin de faciliter l’apprentissage du test par renforcement positif (la récompense dans le test d’apprentissage est constituée par du lait mélangé à du sirop de fraise) sans à avoir subir de privation ou de renforcement négatif. La boisson sucrée présentée dans le test devient d’autant plus appétente que l’eau de boisson quotidienne est acide ; cela renforce donc l’apprentissage des animaux, sans les priver. Des études précédentes ont montré que les souris ne perdent pas de poids malgré l’acidité de l’eau quotidienne.
Choix des espèces
La souris est l'espèce de choix pour générer des modèles de maladies humaines. Son anatomie, sa physiologie et sa génétique sont bien connues. De plus, les méthodes pour la manipulation génétique de ces animaux sont les plus développées. La nécessité d'utiliser des transgéniques est liée à l'absence de tout mutant spontané dans une espèce de mammifères qui correspond à la pathologie humaine étudiée (trisomie). Les souris seront testées une fois adultes (8 semaines). Nous avons choisi cet âge car il correspond à une période hors développement. Les patients porteurs de trisomie montrent des défauts cognitifs à l’âge adulte.
Évaluation du rôle de l’ankyrine 3 (ANK3) dans la régulation du système sérotoninergique et des comportements anxio/dépressifs associés chez la souris
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
448 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Elles subissent une à deux chirurgies cérébrales, un isolement de vingt-quatre heures, jusqu'à vingt et une injections, une privation de nourriture et trois tests comportementaux d'anxiété et de dépression, avant d'être tuées pour prélever le cerveau. Le porteur mentionne un "modèle validé" exposant les souris à un médiateur du stress et les rendant résistantes aux antidépresseurs, sans détailler ce qu'elles subissent dans ce modèle. Il affirme qu'étudier des comportements complexes impose de travailler sur un modèle animal.
Objectifs
Avec un taux de 15 à 20 % pour la population générale, la dépression majeure est le trouble psychiatrique le plus fréquent. L’Organisation Mondiale de la Santé prédit que la dépression majeure va devenir la première cause d’handicap d’ici 2030. Cependant, malgré la grande variété de médicaments disponibles pour traiter cette maladie, deux problèmes majeurs restent encore non résolus : un tiers des patients ne répondent à aucun traitement, et il existe un délai de 3-8 semaines avant le début de la réponse thérapeutique. Ces questions mettent l’accent sur la nécessité d’intensifier les recherches afin de développer des traitements plus efficaces et d’accélérer la réponse antidépressive. Un déficit de sérotonine dans le cerveau serait une des causes neurobiologiques de cette maladie psychiatrique. L’objectif principal des traitements actuels est donc de rétablir des taux normaux de sérotonine. Le segment initial de l’axone (AIS) est un élément clé de régulation de l’activité électriques des neurones. Ce projet vise à mieux comprendre le rôle de l'AIS dans la régulation des neurones qui produisent la sérotonine. Ceci pourrait permettre de découvrir un rôle crucial de l’AIS dans la régulation de l’humeur et ainsi identifier une nouvelle cible pour le développement de stratégies thérapeutiques antidépressives innovantes.
Bénéfices attendus
Ces études devraient permettre de mettre en évidence le rôle du segment initial de l’axone (AIS) dans la régulation d'un neurotransmetteur, la sérotonine et des comportements émotionnels associés. La perspective à plus long terme sera de proposer de nouveaux traitements anxiolytiques et/ou antidépresseurs plus efficaces que ceux actuellement disponibles en agissant sur l’AIS. Enfin, nous croyons que les résultats du présent projet aideront à orienter les recherches futures axées sur les causes de la dépression.
Procédures
1 ou 2 chirurgies sous anesthésie générale d'environ 30 minutes. Isolement de 24 heures suite à une chirurgie. 1 à 21 injections (10-20 secondes). Jeûne de 24 heures avant un test comportemental. Les souris seront exposées à 3 tests comportementaux destinés à évaluer le niveau d'anxiété ou de dépression, espacés d'au moins 24h et durant chacun entre 5 et 10 minutes. Certains animaux recevront des injections quotidiennes pendant 1 à 21 jours qui impliquent une contention d'environ 10 à 20 secondes.
Impact sur les animaux
Les chirurgies impliqueront une anesthésie générale d'environ 30 minutes et pourront être suivies d'une douleur modérée au niveau de l'incision pendant les heures qui suivent le réveil. Une partie des animaux subira une deuxième chirurgie pour l'implantation d'une sonde qui implique les mêmes nuisances. Les injections quotidiennes pendant 1 à 21 jours induisent un stress léger d'environ 10 à 20 secondes. Certains animaux seront exposés à des tests comportementaux pouvant induire un stress léger à modéré pendant 5 à 6 minutes. Certains animaux seront exposés à un test qui nécessite une privation de nourriture de 24h, ce qui peut engendrer du stress modéré.
Devenir
Les animaux seront mis à mort à la fin de chaque procédure pour récupérer le cerveau afin d’analyser les résultats du traitement.
Remplacement
L’objectif du projet est l’étude de comportements complexes, les symptômes de type anxio-dépressifs, sous tendus par des modifications électrophysiologiques et neurobiochimiques du système sérotonine. Pour cela il est indispensable de travailler sur un modèle animal.
Réduction
Le nombre d’animaux par groupe a été déterminé sur la base de nos études antérieures et est réduit au minimum nécessaire pour obtenir une puissance suffisante pour les analyses statistiques. Afin de limiter le nombre d'animaux, les comportements seront étudiés sur les mêmes individus en prenant soin de limiter le nombre total de tests à 3. De même, les analyses complémentaires seront réalisées sur les souris utilisées pour l'évaluation comportementale.
Raffinement
Les animaux sont habitués à l'expérimentateur lors de 3 séances de manipulation. Les animaux sont suivis de manière quotidienne par du personnel formé au soin. Si une altération de l'état est observée (isolement, baisse du comportement exploratoire, attitude prostrée, expression faciale modifiée, défense à la manipulation), une grille de scoring est utilisée pour déterminer la conduite à tenir. Les chirurgies sont réalisées sous anesthésie générale. En cas de signes de douleur dans les heures/jours qui suivent , les animaux sont traités par un analgésique.
Choix des espèces
Les souris génétiquement modifiées sont aujourd’hui le principal modèle animal pour l’étude du rôle de certaines protéines dans différentes fonctions biologiques. Dans ce projet, l’utilisation d’un modèle original de souris présentant une perturbation de l'AIS spécifiquement dans les neurones permettra de déterminer le rôle de cette structure sur le comportement émotionnel. Il n'existe pas d'outil équivalent dans une autre espèce. Ce rôle sera notamment déterminé dans un modèle validé d'exposition à un médiateur du stress. Ce modèle présente la particularité de conduite à une résistance aux traitements antidépresseurs conventionnels. Il s’agit d’un modèle de résistance aux antidépresseurs chez l’adulte. Les expériences débuteront sur des animaux âgés de 8 semaines.
Etude de la chondroïtine sulfate comme nouvel agent thérapeutique dans le cadre du traitement de l’accident ischémique cérébral chez l’animal vigile
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
120 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. Elles subissent trois chirurgies, dont l'induction d'un accident vasculaire cérébral sur animal éveillé, seulement sous analgésie et anesthésie locale, puis des séances de contention, d'imagerie et de tests de récupération fonctionnelle. Le porteur reconnaît le stress lié à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée et les déficits fonctionnels qui en résultent, et fixe des points limites déclenchant la mise à mort. Il affirme que les approches in vitro ne reproduisent pas l'AVC et teste une molécule déjà employée chez l'humain, la chondroïtine sulfate.
Objectifs
L’Accident Vasculaire Cérébral (AVC) est la 1ère cause de handicap acquis chez l’adulte, posant un problème majeur tant dans le domaine de la santé publique que sur le plan humain. Chaque année environ 17 millions de personnes dans le monde connaitront un épisode d’AVC pouvant entrainer des séquelles plus ou moins sévères voir la mort de l’individu. Actuellement, la prise en charge des patients repose sur l’injection intraveineuse de l’activateur tissulaire du plasminogène (tPA) recombinant (lyse du caillot sanguin) associée ou non à la thrombectomie (intervention mécanique). Toutefois, seule une faible proportion des patients (inférieur à 10%) y sont éligibles. L’AVC est donc un problème de santé publique et nécessite le développement de nouvelles approches thérapeutiques afin d’élargir la prise en charge des patients. L'objectif de ce projet est donc d'étudier la capacité de la Chondroïtine Sulfate (CS) à améliorer la lyse des caillots en synergie avec le tPA et de regarder l’impact sur les lésions cérébrale, les variations hémodynaliques ainsi que la récupération fonctionnelle suite à un AVC ischémique. Dans l'optique d’adopter une démarche translationnelle dans ce projet de recherche nous ferons usage d’un modèle davantage en adéquation avec la clinique notamment le modèle murin d’AVC ischémique chez l’animal vigile qui a été précédemment mis en place dans notre laboratoire. Ce modèle permet d’exclure tout impact de l’anesthésie sur les évènements associés à cette pathologie. En effet, les agents anesthésiants peuvent modifier le fonctionnement cérébral et notamment au niveau de la dynamique du réseau vasculaire ce qui peut interférer avec le décours de l’AVC mais également biaiser les résultats obtenus quant à l’efficacité de certaines molécules.
Bénéfices attendus
Grâce à la démarche translationnelle que nous adopterons lors de ce projet, les résultats de nos travaux permettront de démontrer l'intérêt de la Chondroïtine Sulfate, une molécule déjà utilisée chez l’Homme, notamment dans le traitement de l’arthrose. Ce traitement visera à améliorer la prise en charge des AVC ischémiques en favorisant la lyse des caillots en synergie avec le tPA.
Procédures
Les animaux seront soumis à : - 3 chirurgies : Une chirurgie de pose de prothèse crânienne de 20 minutes sous anesthésie générale avec une couverture analgésique. Une chirurgie permettant une pose de cathéter caudal et l'accès à l'artère cérébrale moyenne par craniotomie sous anesthésie générale et couverture analgésique d'une durée de 30 à 45 minutes. Une chirurgie d'induction de l'ischémie sans anesthésie générale, sous couverture analgésique et sous anesthésie locale d’une durée de 40 minutes. - 2 protocoles comportementaux : Un protocole d'habituation à la contention et à l'IRM vigile par jour pendant 4 jours consécutifs, avec des sessions augmentant progressivement de 15 min jusqu'à 1h15 au total. Un protocole de récupération fonctionnelle à 24 heures post-AVC avec des sessions durant moins de 5 minutes par souris au total pour le premier test de comportement et une session de 1 minute par souris pour le second test de comportement. - 2 protocoles d'imagerie vigile : 5 acquisitions par échographie ultrasonore, où chaque acquisition dure 5 minutes (15min avant AVC, 10 min, 20min 60 min et 24h post-AVC). Une acquisition à l'IRM de 15 minutes, 24 heures après l’AVC.
Impact sur les animaux
Les effets indésirables susceptibles d'apparaître chez les animaux lors de la procédure incluent le stress lors des premières sessions d'habituation à la contention, les douleurs postopératoires après la pose de la prothèse, la perte de masse corporelle après les anesthésies et l'induction de l'AVC, les douleurs post-opératoires après la chirurgie d'accès à l'ACM, le stress dû à la survenue de l'AVC chez la souris éveillée, et les déficits fonctionnels à la suite de l'AVC.
Devenir
Le caractère sévère des procédures suivies par tous les animaux ce projet rends impossible toute réutilisation ou proposition à une adoption. A la fin de chaque procédure les animaux seront donc mis à mort.
Remplacement
Les expériences in vitro ou ex vivo ne parviennent pas à reproduire parfaitement l'AVC en raison des multiples interactions cellulaires et tissulaires au sein du système nerveux central. Par conséquent, les procédures expérimentales de ce projet ne peuvent être remplacées par d'autres méthodes ne faisant pas appel à l'utilisation d'animaux vivants. Les techniques de substitution ne sont pas susceptibles d'apporter le même niveau d'information pour évaluer une récupération fonctionnelle.
Réduction
Conformément à la règle des 3R, le nombre d'animaux nécessaires au projet a été réduit au maximum, en se basant sur l'expertise acquise dans la réalisation des gestes techniques, ainsi que sur les données d'études antérieures utilisant le modèle d’AVC ischémique chez l’animal vigile. Ces études ont démontré des résultats significatifs tout en réduisant au maximum les effectifs. Nous avons pris soin de déterminer un nombre minimal d’animaux, respectant ainsi le principe de réduction, tout en garantissant la bonne acquisition des gestes techniques et chirurgicaux, ainsi que la reproductibilité des résultats. Le nombre d’animaux utilisé est déterminé en fonction de la spécificité et de la sensibilité des méthodes employées, ainsi que de l'expertise nécessaire à la réalisation précise des gestes techniques. L'utilisation d'outils d'imagerie non invasive tels que l'IRM et l'échographie contribue significativement à réduire le nombre d'animaux nécessaires dans le projet. Le nombre d’animaux utilisés dans ce projet (nombre d’animaux total de 120) a été évalué via un test d’analyse de puissance (α égal à 0.05 ; β égal à 0.8). Les échantillons sont suffisamment importants pour pouvoir utiliser des tests paramétriques de type ANOVA à deux facteurs puis le test post-hock de Dunette. Nous pourrons également utiliser des tests de Mann-Whitney et de Wilcoxon.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans des cages standards répondant aux normes européennes actuelles (Directive 2010/63/UE). Les cages seront enrichies (coton et papier kraft en quantité pour la fabrication d'un nid, ainsi que des paillettes). Les souris sont surveillées quotidiennement par du personnel qualifié. Une attention particulière est accordée à l'état général, à l'évolution de la masse corporelle, ainsi qu'au comportement de chaque animal. Les animaux seront gardés en acclimatation avant expérimentation pendant une semaine. Puis ils seront habitués à la manipulation chaque jour pendant une semaine avant le début du protocole, afin de limiter le stress lié à l'expérimentateur, et apprendre aux souris à coopérer. Le protocole d'habituation progressif à la contention permet de réduire le stress des souris lors de l'induction de l'AVC et de l'imagerie vigile. Durant l'induction de l'AVC, les souris sont sous analgésie et sous anesthésie locale au niveau de l'ACM. Les yeux de la souris sont couverts afin de ne pas l'éblouir avec la lampe de la loupe binoculaire et des bouchons d'oreilles sont prévus pour l'IRM vigile afin de réduire le bruit ambiant. Après la chirurgie d'induction de l'AVC, une période de récupération de 3 jours est prévue : les souris disposent de croquettes humides dans une coupelle placée au sol pour faciliter la prise de nourriture et l'hydratation. Les expériences seront réalisées en respectant les règles de bonnes pratiques de laboratoire pour le respect des animaux, tout en veillant à ne pas dépasser les points limites fixés au préalable. Les principes éthiques et les standards de raffinement seront utilisés jusqu’à la mise à mort de l’animal. Concernant l'application des points limites, les animaux seront mis à mort dans l'une des situations suivantes : - signes de douleur extérieure indexés sur le grimace-scale souris (NC3Rs) (Score supérieur à 5 plus de 48h) ; - absence de réaction ; - animal inactif dans sa cage ; - complications chirurgicales inattendues (hémorragie impossible à stopper, détresse cadio-respiratoire, échec) ; - perte de poids supérieur à 20%. - décollement de la prothèse crânienne.
Choix des espèces
La souris (mus musculus) est l’espèce animale qui a été la plus étudiée dans le domaine des neurosciences, et notamment dans le cadre de développement de stratégies de thérapies pharmacologiques. C’est également l’espèce de référence pour étudier l’inflammation et l’ischémie cérébrale dans la littérature. L’ensemble des connaissances et des acquis dont nous disposons au laboratoire et dans la littérature rend cette espèce particulièrement intéressante pour étudier les évènements précoces au cours de l’AVC ischémique. L’anatomie et la physiologie de la circulation cérébrale sanguine de la souris sont également bien connues et sont semblables par leurs grands traits à celles de l’homme. De plus, un travail préliminaire de développement du modèle d’AVC ischémique chez l’animal vigile au laboratoire a été mené chez le souris et permet d’avoir une expertise pour l’application de ce protocole chez la souris.
Identification des neurones du tronc cérébral impliqués dans la régulation de l’activité cardiovasculaire pendant la respiration
- Recherche appliquée
- Troubles cardiaques
- Recherche fondamentale
- Système cardiaque
- Système nerveux
- Système respiratoire
Rats : 1320
2 472 souris et rats vont être utilisés, tous tués à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré à sévère. Les animaux subissent dès l'âge d'une semaine une amputation de phalange sur animal vigile, puis une à deux chirurgies d'une à deux heures et demie, des injections intracérébrales de virus, la pose de cathéters et de sondes et des injections répétées, avant d'être tués pour prélever le cerveau. Le porteur qualifie la phalangectomie de "nuisance" et reconnaît le stress des contentions et des chambres de pléthysmographie, tout en affirmant l'absence d'inflammation liée aux virus. Il indique qu'aucune approche autre que l'expérimentation animale n'est envisageable en l'état, espérant que ces données fonderont de futures études in silico.
Objectifs
La respiration et l'activité du cœur et des vaisseaux sanguins sont contrôlées par des réseaux de neurones situés dans une partie du cerveau nommée tronc cérébral. Ces deux fonctions vitales participent ensemble au renouvellement de l’oxygène (O2) et du dioxyde de carbone (CO2) dans l’organisme. Cependant, nous ne savons toujours pas précisément quels sont les mécanismes nerveux qui permettent à l’activité cardiovasculaire de varier pendant la respiration. L’objectif général du projet est d’identifier les neurones impliqués dans ce processus et d’en expliquer les mécanismes. A l’aide de techniques innovantes basées sur l’utilisation de virus modifiés, nous localiserons d’abord ces neurones avec une grande précision dans le tronc cérébral. Ensuite, il s’agira de stimuler les neurones que nous aurons identifiés afin de mesurer les effets physiologiques provoqués. Dans d’autres expériences basées sur des techniques récentes d’imagerie, l’activité électrique de ces neurones sera enregistrée. Enfin, nous chercherons à savoir comment les paramètres cardiovasculaires et respiratoires contrôlés par ces neurones varient dans le cadre de comportements spécifiques. Les expériences proposées devraient permettre de démontrer que les neurones identifiés participent bien au contrôle cardiovasculaire pendant la respiration, notamment grâce à notre capacité de les activer ou les inactiver. Chez l’homme, ce contrôle nerveux cardiovasculaire que nous étudions est présent chez les individus en bonne santé, tandis qu’il est altéré dans de nombreuses pathologies. Notre projet a donc pour ambition de mieux comprendre les mécanismes impliqués dans ces processus physiopathologiques dans l’espoir de disposer de nouvelles pistes thérapeutiques.
Bénéfices attendus
Le projet de recherche proposé vise a améliorer nos connaissances sur le contrôle nerveux de deux fonctions vitales que sont la respiration et le système cardiovasculaire. Les résultats obtenus devraient permettre d'élucider les mécanismes neuronaux à l'origine de la genèse du rythme respiratoire et du couplage cardiorespiratoire. Plus précisément, il s'agit d'itentifier les populations de neurones qui contrôlent l’activité respiratoire et qui régulent l’activité cardiovasculaire et ainsi de mieux comprendre l’origine de la synergie entre les activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces mécanismes sont d’une importance cruciale tant d’un point de vue fondamental que clinique. En effet, le fonctionnement normal de ces systèmes garantit l'oxygénation optimale de toutes les cellules de l'organisme, tandis que l’altération de ces mécanismes conduit à des pathologies mortelles telles que l’hypertension artérielle ou encore l’insuffisance cardiaque chronique. Les explorations fonctionnelles réalisées dans ce projet permettront pour la première fois d’établir une relation de cause à effet entre l’activité des neurones identifiés et le fonctionnement en synergie des activités respiratoire et cardiovasculaire. Ces découvertes pourraient donc permettre d'identifier des cibles thérapeutiques potentielles et de lutter plus efficacement contre ces maladies. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront également de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Procédures
Une biopsie de la phalange distale sera effectuée sur tous les animaux (rats et souris) âgés d'une semaine. En effet, le jour postnatal 7 (P7) semble être l'âge le plus adéquat pour réaliser cette biopsie. Une seule intervention chirurgicale d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 sera réalisée dans deux procédures chez le rat et/ou la souris. Dans les deux autres procédures, deux interventions chirurgicales d'une durée comprise entre 1h30 et 2h30 seront effectuées chez la souris et/ou le rat. Ces deux interventions seront séparées d'une vingtaine ou d'une quarantaine de jours. Selon les procédures, les animaux seront soumis à différents types d’interventions. Tous les animaux recevront une ou plusieurs micro-injections cérébrales de virus modifiés (une seule fois, durée de l’intervention : 20-30 minutes). Chez certains animaux, une ou deux canules optiques intracérébrales seront fixées à la surface du crâne (une seule fois, durée : 45 minutes environ) et un cathéter sera également inséré dans une artère pour mesurer la pression artérielle (une seule implantation fixe, durée : environ 35 minutes). Dans d’autres cas, une sonde de télémétrie sera implantée en sous-cutané chez les animaux pour mesurer l’activité électrique cardiaque (une seule implantation fixe, durée : environ 40 minutes). Chez d’autres animaux, plusieurs injections de composés pharmacologiques seront réalisées par voie intrapéritonéale (fréquence : 2 injections par jour espacées de 12h, pendant 15 jours ; durée d’une injection sous anesthésie légère: 5 minutes). Enfin, pour mesurer les paramètres respiratoires sur le long terme, certains animaux seront d’abord acclimatés dans un pléthysmographe (1h par jour pendant 10 jours), avant de les placer de nouveau dans cet appareil pour les enregistrements chroniques (1h par jour, pendant 2 semaines environ).
Impact sur les animaux
Les nuisances et les effets indésirables attendus sur les animaux sont inhérents à la mise en œuvre de plusieurs protocoles décrits dans le présent projet. C’est notamment le cas de la phalangectomie sur animal vigile qui représente une nuisance et de l’anesthésie qui en soi génère du stress. Le test de contention utilisé afin de mesurer le niveau de stress des animaux génère également du stress. Le fait de placer les animaux dans une chambre de pléthysmographie de manière répétée ou encore d’effectuer plusieurs fois des injections de composé 21 sous anesthésie induit un stress. Dans tous les protocoles, la douleur, la souffrance et le stress liés aux procédures chirurgicales seront réduits à un niveau minimum grâce à l'emploi d'une anesthésie, d'une antalgie et de soins médicamenteux appropriés. Les responsables de projet ont une grande expérience dans la mise en œuvre des techniques de chirurgie et de la prise en charge ainsi que du suivi post-opératoire des animaux. Une réduction transitoire, plus ou moins marquée de l'activité locomotrice est observée pendant 12 à 24h environ suivant la chirurgie. La cicatrisation complète des plans cutanés suturés est observée dans les 5 à 7 jours qui suivent la chirurgie. Enfin, il n'y aura pas de nuisances ou effets indésirables suite à l'injection intracérébrale des virus utilisés dans ce projet. En effet, il s’agit de virus non-réplicatifs dont le génome a été altéré dans le but de ne produire que certaines protéines essentielles à la fonction virale souhaitée (ciblage et manipulation des neurones d’intérêt). Les données de la littérature et notre propre expérience indiquent que les conditions dans lesquelles ces virus sont injectés (niveau de titre, volumes injectés etc.) n'induisent pas d'inflammation notoire au niveau du site d'injection ou ailleurs dans le cerveau (tissu nerveux sain dans la zone d'injection, cellules aux aspects normaux etc).
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort à l'issue de chaque procédure. En effet, dans la plupart des cas le cerveau des animaux devra être prélevé dans le but de localiser les neurones d’intérêt. Dans d’autres cas, le modèle expérimental mis en œuvre nécessitera une euthanasie préalable.
Remplacement
Ce projet a pour but d'élucider les mécanismes de genèse du rythme respiratoire et de couplage entre neurones respiratoires et cardiovasculaires. Pour l’instant, les connaissances incomplètes sur le sujet ne permettent pas d’envisager d’approches autres que l’expérimentation animale pour répondre à ces questions (comme une étude in silico par exemple). En effet, il s'agit de mécanismes physiopathologiques fondamentaux pour lesquels il n'existe que très peu ou pas de résultats antérieurs. Cette absence de connaissances a priori sur ces mécanismes explique donc l'incapacité actuelle à modéliser le fonctionnement des réseaux cardiorespiratoires centraux. Nous espérons que les données obtenues dans cette étude permettront de proposer de nouveaux concepts sur lesquels fonder des études in silico.
Réduction
Le présent projet repose sur l’utilisation de techniques modernes, encore jamais employées pour étudier le contrôle central cardiorespiratoire. L'aspect novateur de l'étude garantit des avancées majeures et indispensables sur la physiopathologie de ces systèmes. En particulier, la technique d’enregistrement des activités cellulaires par imagerie du voltage sur la préparation perfusée in situ nous permettra de répondre à de nombreuses questions grâce à la mise en œuvre de plusieurs protocoles expérimentaux. Cela sert le double objectif d’optimisation des aspects scientifiques et éthiques. De plus, la variabilité interindividuelle sera réduite par l’utilisation de souches murines fixées génétiquement. Enfin, une analyse de puissance statistique sera réalisée systématiquement avant chaque expérimentation afin de déterminer le nombre d’animaux nécessaires pour répondre à la question expérimentale. Une fois les expérimentations réalisées, des tests statistiques appropriés permettront de valider ou non la question initiale posée. Les différentes stratégies expérimentales proposées ici nous permettront de réduire le nombre d’animaux utilisés pour servir les objectifs scientifiques de cette étude en utilisant les outils, approches techniques et modèles murins les plus appropriés à chaque partie de l’étude. En particulier l'usage de souches transgéniques chez la souris et le rat, combiné aux approches opto- ou pharmacogénétiques, permet de cibler beaucoup plus spécifiquement les neurones d'intérêt par rapport aux autres techniques existantes, ce qui contribue à la réduction du nombre d'animaux utilisés.
Raffinement
Les animaux seront hébergés dans une animalerie conventionnelle, dans des pièces où la température est contrôlée et dans des cages avec environnement enrichi. Le nombre limite d’animaux par cage sera respecté et les animaux auront accès à l’eau et la nourriture ad libitum. Les animaux seront anesthésiés pour toutes les procédures expérimentales induisant de la douleur, ici des approches chirurgicales. Cette anesthésie, sous forme gazeuse, suit les protocoles standards, notamment pour ce qui concerne les pourcentages de gaz dans l’air lors des phases d’induction et de maintien. Elle sera accompagnée d’une analgésie et d’un suivi post-opératoire rigoureux en utilisant notamment une fiche individuelle de suivi. Les responsables du projet possèdent une grande expérience dans ce domaine.
Choix des espèces
Dans ce projet, deux espèces d’animaux seront utilisées, souris et rats. L’intérêt général de ces deux modèles repose essentiellement dans leur proximité physiopathologique avec l’Homme (transférabilité des résultats), la reproduction rapide des animaux, et les conditions requises pour leur stabulation qui sont relativement peu contraignantes. Le modèle souris présente l’avantage d’être très permissif à la transgenèse, il existe aujourd’hui une banque importante de souris transgéniques qui nous permettra d'identifier précisément les mécanismes en jeu grâce à la variété de recombinaisons génétiques possibles. Le modèle rat présente l’avantage d’être plus robuste physiologiquement que le modèle souris, notamment en ce qui concerne l’approche in situ (voir procédure 3), permettant d’utiliser moins d’animaux (car moins de perte expérimentale) pour chaque objectif expérimental. Les animaux adultes provenant des établissements éleveurs seront maintenus dans l'établissement utilisateur et les expériences seront effectuées sur la descendance. Une biopsie de phalange distale (phalangectomie) sera d'abord effectuée à l'âge d'une semaine (P7), ce qui permettra de réaliser le génotypage et d’identifier ainsi chaque animal. Pour pouvoir comparer les résultats obtenus dans l'ensemble du projet de recherche, toutes les expérimentations reposeront sur des injections virales effectuées à l'âge de trois semaines (P21). A cet âge, le génotype des animaux sera donc connu. Les expérimentations finales des procédures 1, 2 et 4 seront réalisées chez le rat et/ou la souris à l’âge adulte (2-5 mois), et celles de la procédure 3 sera réalisée chez le rat à un stade juvénile (P30-35). Nous cherchons à déterminer les mécanismes générant le rythme respiratoire et le couplage central cardiorespiratoire dans les conditions les plus physiologiques possibles, chez des organismes pleinement développés et non-sénescents. Ces mécanismes sont pour l’instant mieux connus pour les stades développementaux précoces, notamment grâce aux approches in vitro qui ne fonctionnent qu’à ces âges. La préparation in situ, utilisée en procédure 3, est optimale chez le rat juvénile à condition d'être réalisée à P30-35 maximum. C'est donc cette contrainte temporelle qui justifie d'effectuer les injections virales à P21 (sevrage) pour permettre un temps d’expression suffisant des transgènes.
Exploration du métabolisme du fer en physiologie et dans les maladies neurodégénératives et inflammatoires_1
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Multisystémique
- Oncologie
- Système nerveux
408 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures classées légères ou menées sous anesthésie terminale sans réveil. Le porteur indique que 160 d'entre elles reçoivent une injection intrapéritonéale de fer et 80 un prélèvement sanguin à la queue, l'ensemble étant euthanasié pour des nécropsies et des cultures cellulaires. Il décrit peu d'effets attendus de l'injection de fer, l'euthanasie survenant sept jours après. Sur le remplacement, il affirme recourir à des cultures issues des animaux mais conclut que la complexité du cerveau impose pour l'instant le modèle in vivo, en disant surveiller les avancées des organoïdes.
Objectifs
Les héparanes sulfate (HS) sont des sucres complexes. Des mutations ou des défauts dans cette machinerie de recyclage des HS provoquent généralement une accumulation progressive de fragments de sucres partiellement dégradés dans un compartiment cellulaire spécifique; le lysosome. Cela conduit à une pathologie métabolique grave nommée mucopolysaccharidose de type III. Cette maladie neurodégénérative pédiatrique est caractérisée par l’accumulation de sucres défectueux essentiellement dans le cerveau. Les conséquences cliniques de celle-ci sont la perte des facultés d’élocution, de compréhension et de motricité des jeunes enfants atteints ainsi que des décès prématurés. A l’heure actuelle, établir un diagnostic précoce de la pathologie est complexe et aucun traitement ne permet de ralentir la détérioration mentale. Des essais de thérapie génique sont en cours d'étude (notre équipe et collaborateurs). Un premier essai à base de vecteurs a été réalisé chez 4 patients, le suivi de 5 ans montre des résultats encourageants. La poursuite de l’amélioration de cette approche prometteuse continue et des essais précliniques avec le vecteur sont en cours dans notre équipe. Ainsi, d’autres alternatives thérapeutiques restent à être recherchées pour les patients qui seront exclus de cette approche et pour les patients chez qui la thérapie génique aurait échoué. Parmi elles, l’exploration de l’accumulation du fer observée dans le cerveau de patients et dans notre modèle de souris. Les dépôts de fer s’accumulent progressivement avec l’âge aussi bien chez les patients que dans le modèle de souris. Le fer est extrêmement toxique et est capable de produire du stress oxydant, de l’inflammation, voire une mort cellulaire dépendante du fer ou ferroptose. De ce fait, nous souhaitons explorer la ferroptose dans la maladie, en vue de diagnostic et/ou traitement associant la thérapie génique en cours. Les objectifs de ce projet sont de mettre en évidence de la ferroptose dans cette maladie et identifier les populations cellulaires touchées dans le contexte de la maladie de Sanfilippo.
Bénéfices attendus
Ce travail va nous permettre de mieux comprendre la physiopathologie de la maladie de Sanfilippo . A travers l'étude approfondie des cultures cellulaires issues des animaux, nous allons pouvoir decrypter les mécanismes de la ferropotose associés. La modélisation de la surcharge en fer va aussi nous permettre d'étudier avec précision aussi bien sur l’inflammation que le stress oxydant. l'étape suivante sera la perspective de se projeter vers une solution thérapeutique majeure à cette pathologie pédiatrique grave qui n’est actuellement toujours pas soignée.
Procédures
80 animaux vont subir un prélevement sanguin à la veine caudale. Pour les 80 souris cela se fera en quelques secondes avec une couverture analgésique et un anesthésique approprié. Toutes les 368 souris (males et femelles) suivront une anesthésie et analgésie terminale en vue d'une euthanalise réglementaire necessaire à la bonne réalisation des expériences de nécropsie associées (immunologie et culture). 160 souris vont avoir une injection non douloureuse de fer en solution ou de serum physiologique en intrapéritonéale en une seule fois avec un volume réglementaire. c'est un geste qui sera réalisé avec un minimum de contention par des personnes habitués et qui dure moins de 10 secondes.
Impact sur les animaux
160 souris de ce projet recoivent une injection unique en intrapéritonéale d'une solution tamponnée contenant du fer. L'observation de l'animal en continu dans l'heure qui suit permet de déceller toute anomalie synonyme de douleurs (prostration, changement dans l'aspect de l'animal). Le personnel de la zootechnie qui les observent quotidiennement peut détecter d’éventuelles blessures, un comportement anormal ou un amaigrissement. Il n'est pas attendu d'effets particulier car nous avons une euthanasie de l'animal qui se déroule 7 jours après l'injection de fer.
Devenir
Les animaux sont euthanasiés à l'issue de chaque procédure expérimentale
Remplacement
Quand cela est possible, le modèle animal est remplacé par des cultures cellulaires mais qui reste issues de l’animal. Nous avons une étape « in vitro » indispensable à la compréhension et au décryptage des interactions cellulaires et des voies de signalisation de la ferroptose dans notre modèle Afin de valider ces interactions cellulaires au sein du cerveau, actuellement seul le modèle in vivo peut modéliser les interactions entre plusieurs cellules du cerveau pour une démarche thérapeutique. Nous sommes également vigilantes sur les avancées des modèles organoïdes afin de mettre en perspective le remplacement de notre modèle animal. Pour l’instant, la complexité physiologique et les réponses systémiques de ce projet ne peuvent pas être reproduites in vitro.
Réduction
Un nombre restreint de souris est utilisé dans chaque groupe (n=10) afin de perfectionner la procédure et de maximiser les chances de réussite et de réduire le nombre de pertes potentiels. Notre étude utilise des méthodes expérimentales validées, publiées et utilisées extensivement par les laboratoires de recherche. Les analyses statistiques seront effectuées à l'aide d'un logiciel de statistique performant. des tests statistiques adaptés seront utilisés. Les résultats avec p
Raffinement
Afin de réduire au maximum les douleurs et l’inconfort des animaux, cette étude sera conduite par un expérimentateur formé à l’expérimentation animale et avec le diplôme de chirurgie. Pour les injections IP, elles seront réalisées par un personnel compétent et habitué. De toute façon, nos procédures nécessitent une manipulation fréquente des animaux qui permettra à l’expérimentateur d’observer et d’évaluer l’état de santé de l’animal ainsi que son évolution dans le temps. En particulier, nous observerons : Les altérations physiques : • Les variations du poids de l’animal (et variations de l’ingestion de nourriture et d’eau), flan creusé/dos vouté, yeux enfoncés/vitreux • Les signes cliniques observables (fréquence respiratoire et cardiaque) •Les changements du comportement •Les réponses comportementales aux stimuli externes Tout écart de la normalité sera répertorié et des solutions seront considérées pour pallier à cette situation. L’ensemble de ces 4 critères sera utilisé pour déterminer l’état de santé de l’animale. Dans le cas où une souris montrerait un état de santé détérioré qui ne pourra être amélioré par les traitements (antidouleur, antibiotiques, administrations de solutions glucosées, etc…), la souris sera euthanasiée. En tous cas, une perte de poids supérieure à 20 % dans l’espace d’une semaine est considérée en soi comme un point limite et engendra l’euthanasie de l’animal. Ces cas sont très rares, dans le cadre de nos expériences mais le nombre d’animaux utilisés prend en considération ces éventuelles pertes pour les tests statistiques. Nous réaliserons les expériences anatomiques, cellulaires et moléculaires sur les mêmes animaux utilisés. La technique de préhension de l’animal sera réalisée sans lui tenir la queue suivant les recommandations du service du bien-être animal.
Choix des espèces
Le métabolisme du fer a été très étudié chez la souris qui s'est révélé être un modèle pertinent. Les hypothèses scientifiques sur lesquelles reposent le projet ont été élaborée sur la base de travaux déjà publiés chez la souris. Cette souche mutée est adaptée pour examiner la pathophysiologie de la maladie de Sanfilippo B et développer des thérapies pour les maladies lysosomales. Notre projet de recherche est basé sur l’utilisation de modèles animaux génétiquement modifiés qui nécessitent d’utiliser des animaux contrôles sauvages. Aucune autre espèce n’est disponible avec autant d’outils précieux (Ac, protéines recombinantes) qui sont indispensables pour disséquer les mécanismes cellulaires et moléculaires impliqués. Cette espèce présente certains intérêts pratiques décisifs justifiant l’utilisation des souris comme modèles dans ce type de projet : faibles coûts, cycles de reproduction courts, croissance rapide, facilité de transport, facilité de manipulation et une bonne adaptabilité aux conditions expérimentales. Les stades de développements sont adaptés aux caractéristiques physiopathologiques de la maladie que nous voulons étudier. Les animaux seront utilisés à 2 et 5 mois. Ce sont des ages assez précoce qui vont nous permettre de pourvoir étudier le développement de la pathologie + ou- en présence de fer exogène. A 2 mois ces animaux ont les 1er influx de fer et à 5 mois on peut voir les consequences de cette accumulation les fonctions du cerveau et des differents types cellulaires qui y coexistent.
Rôle des neurones thalamo-corticaux dans la cognition sensorielle physiologique et pathologique chez la souris
- Maintien des lignées génétiquement modifiées
- Recherche appliquée
- Troubles nerveux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
1 520 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une biopsie de la queue, une chirurgie stéréotaxique intracérébrale de quarante minutes, une légère décharge électrique et une série de tests comportementaux (activité motrice, exploration, anxiété, attention, mémoire associative), avant d'être tuées pour prélever le cerveau. Le porteur décrit des atteintes limitées, un stress lié à l'anesthésie et aux tests, mais ne précise pas les effets de la décharge électrique. Il affirme que ces explorations sur animal vigile ne peuvent pas être remplacées par des approches in vitro et espère identifier des cibles thérapeutiques contre les troubles neuropsychiatriques.
Objectifs
Percevoir avec précision la réalité extérieure est essentiel à notre survie. En particulier, les modifications de la perception sont une des caractéristiques majeures de la plupart des troubles neuropsychiatriques et neurodéveloppementaux, eux-mêmes source de souffrance et d ́exclusion sociale. Bien qu'elles soient fondamentales, les bases biologiques d'une perception précise ou altérée sont très peu comprises. Dans cette étude, nous allons étudier d'une part chez des souris comment les neurones des régions cérébrales clés de la perception échangent des informations. D'autre part, nous allons nous demander quel est le rôle de ces régions spécifiques dans la cognition sensorielle. Dans les deux cas, nous évaluerons les mécanismes qui conduisent au fonctionnement et au dysfonctionnement, grâce à l'utilisation d'un modèle de souris à haut risque de troubles neuropsychiatriques. Nous espérons que cette recherche fera progresser nos connaissances limitées sur la façon dont les troubles neurodéveloppementaux modifient les circuits neuronaux sensoriels et affectent ainsi la perception. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Bénéfices attendus
Les résultats de ce projet permettront de disséquer de manière fonctionnelle l’implication du système thalamo-corticale dans la mémoire sensorielle chez la souris, modèle bien adapté pour mimer la physiologie et certains aspects de la pathologie humaine. L’utilisation de modèles murins transgéniques appropriés apportera des données au niveau cellulaire, anatomique et fonctionnel en identifiant les structures cérébrales fonctionnellement mises en jeu. Mieux comprendre le système thalamo-corticale sensorielle permettra d’appréhender les processus d'apprentissage, de mémorisation et de perception, mais aussi une meilleure compréhension des maladies psychiatriques dans lesquelles elle est altérée. Ces expériences permettront l’identification de cibles thérapeutiques nouvelles et précises.
Procédures
Biopsie de queue: 1 fois de moins d'une seconde. Injection sous-cutanée : 3 fois pour la chirurgie stéréotaxique, durée 5 secondes. Chirurgie pour injection stéréotaxique intracérébrale, 1 fois de 40 minutes. Légère décharge électrique, 1 fois de 1 seconde. Injection intra-péritonéale: 1 injection, durée 5 secondes. Etudes du comportement, 1 fois chacun: moteur (5 minutes), d’exploration (10 minutes), d’anxiété (10 minutes), d’attention (15 minutes) et de mémoire associatif (15 minutes/jour, 3 jours), répartis sur 4 à 7 jours.
Impact sur les animaux
L’anesthésie des animaux lors de la chirurgie peut entraîner un stress. Une douleur peut également être associée à la biopsie de queue et aux injections d’analgésique et à l’acte chirurgical. Le test de memoire peut entraîner de l'inconfort et du stress.
Devenir
Tous les animaux seront mis à mort: 1) pour prélever le cerveau en vue d'études physio-histologiques sur les souris expérimentales; 2) à la fin de la période de reproduction chez les souris utilisées pour les croisements.
Remplacement
Ce projet met en jeu des approches intégrées sur animal entier, des explorations fonctionnelles et comportementales complexes (cognition) sur animal vigile, mimant la pathologie humaine et qui ne peuvent donc pas être substituées par des approches in vitro.
Réduction
Des analyses a priori de puissance statistique permettent de déterminer le nombre d'animaux minimum nécessaire. D'autres tests statistiques a posteriori choisis en fonction des distributions des populations nous permettre de comparer les moyennes et identifier des différences deux à deux entre groupes expérimentaux et génotypes. Les tests statistiques permettent également de trouver des corrélations entre les variables étudiées.
Raffinement
Les animaux seront maintenus en groupes sociaux de plusieurs animaux afin d'éviter tout stress produit par un isolement social, dans un environnement avec matériel pour faire un nid. L’état de sante des animaux et leur accès à l’eau et nourriture sont surveillés quotidiennement. La chirurgie et le post-opératoire se déroule dans des conditions qui protègent la santé de l'animal, en lui protégeant de l’hypothermie grâce à un tapis chauffant et de la déshydratation avec une solution de serum physiologique. Des analgésiques sont utilisés avant et après la chirurgie, et sur les jours suivants. A la fin de la chirurgie, après le réveil complet, l'animal est replacé dans sa cage collective avec de la nourriture et de l'eau ad libitum. Les animaux sont habitués aux mains de l'expérimentateur afin de réduire leur stress par leur manipulation.
Choix des espèces
Le modèle murin est un modèle de choix pour l'exploration du comportement car les régulations cellulaires mises en jeu ont été bien caractérisées dans cette espèce et une littérature abondante existe montrant une similitude avec les observations chez l’Homme. L’organisation anatomique et fonctionnelle du cerveau est relativement proche de celle de l’Homme, ce qui permet des études anatomiques et fonctionnelles. De plus, les modèles génétiquement modifiés utilisés dans ce projet ont été créés chez la souris et nous permettent de réaliser des études phénotypiques comparatives pour caractériser les voies cellulaires ou mimer certains aspects de pathologies humaines. Pour les experiences, nous utiliserons des souris adolescentes et adultes entre 5 semaines et 6 mois car c'est au cours du jeune âge adulte que la plupart des altérations de la perception sensorielle apparaissent dans les troubles neurodéveloppementaux.
Mécanotransduction dans les interactions système nerveux – tumeur
- Recherche fondamentale
- Oncologie
- Système nerveux
48 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance sévère. La moitié porte des mutations qui provoquent un cancer du pancréas mortel, et toutes reçoivent des injections intrapéritonéales quotidiennes pendant deux semaines avant d'être tuées, une partie par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde sous anesthésie, pour prélever le pancréas. Le porteur indique utiliser les animaux avant l'apparition des symptômes terminaux, perte de poids, baisse d'activité et douleur, et administrer le composé BAPN à un âge où il ne provoquerait pas de dissections aortiques. Les retombées thérapeutiques évoquées, cibler l'innervation tumorale, restent renvoyées au long terme, l'objectif immédiat étant d'accroître les connaissances fondamentales.
Objectifs
Récemment, il a été montré que système nerveux périphérique régule le développement tumoral. Cette fonction repose sur la capacité des neurones à infiltrer les tumeurs et à y libérer des substances qui influencent la croissance de la tumeur. Les mécanismes impliqués dans l’innervation tumorale sont encore mal connus. Notre équipe s’intéresse à l’adénocarcinome canalaire du pancréas (ADKP) qui est abondamment innervé par le système nerveux sensoriel. Ce projet explorera le rôle des propriétés mécaniques des tissus (ex : rigidité) dans l’innervation tumorale. Nos objectifs scientifiques sont de moduler la rigidité du tissu tumoral afin d’évaluer l’impact sur l’innervation des tumeurs par le système nerveux sensoriel.
Bénéfices attendus
A court terme, les résultats de ce projet augmenteront nos connaissances sur les mécanismes fondamentaux régulant l’innervation tumorale. A plus long terme, les résultats pourraient avoir des applications médicales concrètes dans le traitement du cancer et l'amélioration de la qualité de vie des patients. En effet, la découverte d'un rôle direct du système nerveux dans la régulation de la tumorigenèse a ouvert l'espoir de nouvelles approches thérapeutiques contre le cancer ciblant l'activité neuronale. Les stratégies cliniques actuellement en cours d'évaluation utilisent des inhibiteurs de la signalisation synaptique ou postsynaptique (par exemple, les bêta-bloquants, le botox). Cependant, une inactivation générale de l'activité neuronale chez les patients pourrait avoir des effets secondaires importants et délétères. Perturber l’innervation tumorale pourrait constituer une nouvelle approche thérapeutique plus cibler pour le traitement de l’ADKP.
Procédures
Les procédures de ce projet impliquent des injections intrapéritonéales journalières sur une durée de 2 semaines, à partir de 6 semaines, sur 48 souris (24 souris tumorales et 24 souris contrôles). Une procédure de ce projet implique également une mise à mort de 24 de ces animaux (12 KIC et 12 contrôles) par perfusion intracardiaque de paraformaldéhyde 4% sur animal anesthésié.
Impact sur les animaux
Ce projet utilise des animaux transgéniques modèles de l’ADKP. Les souris développent des tumeurs malignes vers l’âge de 6.5 semaines dont la progression est fatale (survie médiane 9.5 semaines). En phase terminale, les souris présentent une perte de poids et une baisse d’activité et de la douleur liée à la progression du cancer. Dans nos procédures, les individus sont utilisés avant l’apparition de ces symptômes (entre 6 et 8 semaines). Ce projet utilise également du bêta-aminopropionitrile (BAPN) afin de diminuer la rigidité tissulaire/tumorale in vivo. L’utilisation de BAPN sur de jeunes individus (3-4 semaines) est connu pour entrainer des dissections aortiques douloureuses. Cependant, le traitement au BAPN seul n’est pas suffisant pour induire des dissections aortiques chez des individus âgés de 6 semaines ou plus. Notre étude utilise le BAPN sur des individus âgés de 6 à 8 semaines, ne laissant pas présager de nuisance supplémentaires à celles induites par l’injection intrapéritonéale elle-même (mode d’administration).
Devenir
Le prélèvement des tissus pancréatiques est nécessaire au projet. Toutes les souris seront donc mises à mort afin de prélever le pancréas.
Remplacement
A l’heure actuelle, il n’existe pas d’alternative non-animale permettant d’étudier les interactions physiologiques entre deux organes (système nerveux et tumeur pancréatique ici).
Réduction
Afin d’utiliser le moins d’animaux possible, en l’absence de données préliminaires, nous utilisons la méthode de « resource equation » qui estime qu’un n=6 individus/groupe est une taille de cohorte suffisante pour comparer deux conditions expérimentales.
Raffinement
Dans la mesure du possible, les individus sont maintenus dans les en groupes sociaux de même sexe (5 individus maximum). Le bien-être des animaux est amélioré par un enrichissement des cages qui est maintenu en permanence. Des pièces de coton, de bois ou des nids sont ajoutés dans les cages en alternance toutes les 3 semaines. Nous utiliserons un modèle de souris transgéniques KIC développant des tumeurs pancréatiques après 6.5 semaines. Plusieurs mutations génétiques sont nécessaires à l’apparition des tumeurs pancréatiques. Deux lignées de souris portant uniquement certaines de ces mutations, et ne développant donc pas de tumeurs, seront conservées. Le croisement entre les deux lignées ne sera effectué que pour générer les individus KIC nécessaires aux expérimentations. Les souris KIC, qui développent des tumeurs, ne seront donc générées que pour les besoins de l’expérimentation et nous utiliserons les souris entre 6 et 8 semaines, c’est à-dire avant l’apparition des symptômes liés à la phase terminale (perte de poids, réduction d’activité et douleur importante).
Choix des espèces
Ce projet utilise des animaux transgéniques KIC modèles de l’ADKP. Les souris développent des tumeurs malignes vers l’âge de 6.5 semaines dont la progression est fatale (survie médiane 9.5 semaines). Notre projet s'intéresse au stade tumoral. Dans nos procédures, les individus sont utilisés au stade tumoral, mais avant l’apparition de des symptômes de la phase terminale (perte de poids, baisse d’activité et douleur manifeste qui apparaissent après 8 semaines généralement). Le prélèvement des tissus pour analyse sera réalisé sur des individus de 8 semaines.
Etude dans un modèle murin des sous-régions du cervelet dans les troubles neurodéveloppementaux
- Recherche fondamentale
- Système nerveux
410 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent des chirurgies du crâne pour injection de virus et implantation d'électrodes, jusqu'à quatre heures, puis des enregistrements et tests comportementaux sur l'animal vigile, avec une restriction alimentaire maintenant la faim pendant dix à vingt jours et une perte de poids jusqu'à 15 %, pour étudier le rôle du cervelet dans l'autisme. Le porteur reconnaît que les chirurgies provoquent une douleur de 24 à 48 heures et que l'isolement postopératoire génère un stress, jugés "indispensables" pour cibler des sous-régions cérébrales. Il affirme que les études in vitro et sur invertébrés ne permettent pas d'étudier ces comportements complexes.
Objectifs
Le syndrome de Phelan McDermid (PMS), qui est dû à une mutation génétique du gène Shank3, provoque des déficits moteurs, des troubles du spectre autistiques (TSA) et des déficiences intellectuelles. Ce gène est fortement exprimé dans plusieurs régions du cerveau et chaque région touchée pourrait donc contribuer à un sous-ensemble des déficits exprimés par les patients. Notre projet a pour objectif de caractériser en détail la contribution spécifique du cervelet à ce trouble neuro-developpemental.
Bénéfices attendus
Ce projet vise à comprendre l'implication du cervelet dans l'expression de certains troubles comportementaux associés au syndrome de Phelan Mc Dermid. Il contribuera ainsi non seulement à mieux cibler les causes des troubles neurodeveloppementaux associés à une dysfonction du cervelet mais apportera plus largement des pistes sur de nouveaux mécanismes physiopathologiques sous-jacents aux troubles du spectre autistique.
Procédures
Un groupe de 6 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 20 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h), euthanasie par mode réglementaire. Un groupe de 288 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique injection de virus sous anesthesie/analgésie (2h) - Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 20 j max) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 96 animaux suivra les étapes suivantes : Chirurgie stéréotaxique implantation d'electrodes sous anesthesie/analgésie (4h) - Test comportementaux et enregistrements electrophysiologiques à l’état vigile (3h max par jour pendant 20 j max) - chirurgie sans réveil sous anesthesie/analgésie (30min). Un groupe de 24 animaux suivra l'étape suivante : test comportemental.
Impact sur les animaux
Les procédures de chirurgie (injection de virus et implantation d'éléctrodes) peuvent être à l'origine d’une perte de poids transitoire (inférieur à 20 pour cent de leur poids initial) et provoquer une douleur pendant 24/48h. Néanmoins elles sont indispensables à notre projet car seule une chirurgie stéréotaxique permet de cibler spécifiquement des sous régions cérébrales (placement d’électrodes et injection locale de virus). L'isolement post-chrirugie (après la pose d'implant) ainsi que certaines tâches comportementales mesurant l'anxiété pourront entraîner une sensation de stress pour l'animal. Enfin certaines tâches comportementales reposent sur la motivation de l'animal à chercher des récompenses alimentaires et nécéssitent donc que les animaux ressentent de la faim. Une restriction aimentaire est donc maintenue pendant 10 à 20 jours maximum et la perte de poids est limitée à 15 pour cent du poids initial.
Devenir
Le prélèvement et l’analyse des cerveaux post-mortem sont indispensables à la validation des procédures d'injection virale et d'implantation d'électrodes. Cela implique donc l’euthanasie de l’ensemble des animaux par différentes méthodes réglementaires en fonction des analyses nécessaires.
Remplacement
La modélisation permet d’apporter des informations sur le fonctionnement et les opérations faites par le cerveau mais nécessite les données cellulaires et comportementales. La modélisation ne nous permet pas d’étudier le rôle précis de notre gène d'intérêt dans les différentes sous régions du cervelet impliquées dans la cognition et les troubles du spectre autisitque. Les etudes in vitro et les animaux invertebres ne permettent pas l'etude des comportements complexes ; la souris est donc l'espece la plus appropriee pour ce type d'etudes.
Réduction
En se basant sur plusieurs articles utilisant des tests comportementaux et des analyses statistiques similaires, nous estimons le nombre de souris par groupe à 12 souris pour les études comportementales et 5 souris pour les analyses moléculaires. La taille des effectifs nécessaires par groupe a également été confirmé par un calcul de puissance et des tests stattistiques seront réalisés afin d'avoir une interprétation stable des résultats. Au total, nous estimons donc que pour réaliser l’ensemble du projet, 434 souris seront nécessaires.
Raffinement
Les souris provenant d'un fournisseur extérieur ont un temps d'adaptation à la pièce d'hébergement de 5-7 jours. Afin de réduire au maximum le stress, les animaux sont habitués à être manipulés 5min par jour par l’expérimentateur avant le début du protocole expérimental. Les animaux sont placés dans des cages en communauté de 2 à 5. Lorsque la procédure nécessite l’isolement des animaux, du nid végétal et un jouet d'exploration (cube, tunnel ou abri) est placé dans chacune des cages de manière à offrir aux animaux plus d’enrichissement. De plus, les cages utilisées sont transparentes, placées les unes à côté des autres dans la pièce de stabulation. . Des points limites sont mis en place afin de réduire, supprimer ou soulager l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subis par les animaux. Ils seront suivis quotidiennement par les mêmes manipulateurs et les procédures nécessaires seront mises en place pour garantir leur bien-être. Pendant les chirurgies, les animaux seront anesthésiés et recevront des analgésiques.
Choix des espèces
Le modèle murin est idéal pour répondre à notre question scientifique. En effet, il existe un grand nombre de lignées de souris transgéniques que nous pourrions utiliser dans le cadre de notre projet d’étude du rôle du cervelet dans les troubles du spectre autistique. L’utilisation de modèles murins transgénique permettra de déléter spécifiquement un gène d'intérét dans les cellules granulaire de tout le cervelet ou dans les cellules granulaires de lobules spécifiques du cervelet. De plus, la souris est un animal explorateur pour lequel de très nombreux tests de comportement ont été développés. le projet utilisera des souris adultes âgées de 2 à 6 mois nous permettant d’étudier le comportement et la physiologique sur un cerveau stable d'un point de vue développemental (2 mois). Nous arrêterons les tests avant l'effet du vieillissement cérébral (6 mois).