Système nerveux

6500 rats vont être utilisés dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré, la plupart tués à l'issue et jusqu'à 100 réutilisés pour de la formation ou d'autres études. Un tiers subit une neurochirurgie crânienne d'environ une heure, puis les rats reçoivent des stimulations sonores et des injections de candidats médicaments jusqu'à deux fois par jour pendant 28 jours, avec des prélèvements sanguins répétés. Le porteur indique que les rats sont hébergés seuls après l'implantation, ce qui les isole socialement, et que les molécules testées peuvent provoquer perte de tonus, somnolence ou excitation. Il affirme que ces mécanismes complexes ne peuvent être reproduits par des modèles cellulaires ou informatiques et qu'une preuve d'innocuité chez l'animal est "indispensable" avant toute mise sur le marché.

Objectifs

Les maladies neurologiques et psychiatriques représentent un enjeu majeur de santé publique et touchent de plus en plus de personnes du fait de la croissance et du vieillissement de la population mondiale. Développer de nouvelles thérapies ciblant ces maladies est un axe majeur actuellement. L’objectif aujourd’hui est d’identifier des méthodologies précliniques précoces capables de sélectionner des composés sur la base de leur efficacité potentielle chez l’homme. Les méthodes se basent sur des biomarqueurs utilisables à la fois chez l’animal et chez l’homme. Parmis eux, les activités oscillatoires de base et les potentiels évoqués sont particulièrement intéressants. Dans ce projet, les activités oscillatoires spontanées et évoquées chez des animaux contrôles et des animaux reproduisant des symptômes de pathologies humaines seront étudiées.

Bénéfices attendus

Afin d'optimiser le développement de nouveaux médicaments et ainsi fournir aux patients des traitements efficaces, la priorité est donnée à la découverte et l'utilisation de marqueurs d'évaluation d'efficacité quantifiables, fiables et facilement transposables enter les études précliniques et cliniques. Les activités électriques cérébrales sont largement conservées à travers les mammifères permettant ainsi une transposition fiable entre l'humain et le rongeur. Dans ce projet nous utiliserons des rats.Nous chercherons à mettre en évidence de nouveaux marqueurs biologiques sur ces animaux. Ces marqueurs biologiques translationnels permettront de tester de nouveaux candidats médicament.

Procédures

1/3 des animaux de ce projet vont subir une neurochirurgie d’environ une heure, réalisée sous anesthésie générale. Les animaux pourront être soumis à des stimulations sonores (2 heures maximum en pulse de stimulation, non continu) qui seront réalisées sur l’animal vigile une à deux fois par semaine. Lors des tests pharmacologiques en courte durée (injections aigues durant quelques minutes), un protocole de stimulation sonore sera appliqué avant et après l’administration d’un candidat médicament. Une période de repos de 2 jours minimum sera respectée entre 2 sessions (en fonction du delais possible d'admission des candidats médicaments). Lors des tests pharmacologiques en administration de longue durée (chronique), les injections pourront être réalisées jusqu’à deux fois par jour, sur une durée maximum de 28 jours. Des prélèvements sanguins (d'une durée de quelques minutes) pourront être faits au cours de la procédue expérimentale en fonction du plan expérimental établi. Le volume de prélèvement dépendra de la fréquence de prélèvement : le volume prélevé pourra aller jusqu’à 7.5% de volume sanguin circulant avec une période de récupération d’une semaine (pour un rat de 300g, 1.2 ml), et jusqu’à 10% avec 2 semaines de récupération (pour un rat de 300g, 2 mL). Les prélèvements seront effectués de manière à ne pas dépasser le volume de sang maximm autorisé (1.2 ml sur 1 semaine) pouvant etre fait en prelèvement retro-orbitaire, ou caudal (en fin d'EEG par exemple, ou 200 µl de sang sont prélévés, répatable (si besoin de prelevement à différents temps pour la pharmacocinétique, avec une limite de 3 prélèvements maximum par jour), avec en moyenne 2 EEG par semaine)

Impact sur les animaux

Suite à la chirurgie, une diminution de l'activité locomotrice et une deshydratation passagère pourront être observées. Une douleur modérée pourra apparaitre dans les heures suivant l'intervention chirurgicale. Lors de la stimulation cérébrale, malgré l'intensité faible utilisée, une réaction comportementale (freezing, sursaut, clignement d'yeux) pourra être induite dans de rares cas. Malgré les études toxicologiques préalablement conduites et exigées avant tous tests de composés sur nos animaux, certains effets indésirables non attendus peuvent survenir, notamment une perte de tonus musculaire, une somnolence ou à l'inverse une excitation dûe au fait des mécanismes d'action des molécules testées. Les animaux sont hébergés en cage individuelle (portoir ventilé) après l'implantation des dispositifs d'enregistrement ce qui engendre un isolement social.

Devenir

Il sera nécessaire de vérifier l’exposition aux molécules testées et une caractérisation histologique des tissus de tous les animaux engagés dans ce projet. Si toutefois cette vérification n'est pas nécessaire (demandé dans le plan expérimental), les animaux pourront être réutilisés (pour de la formation ou pour un autre plan d'étude) si : - le nombre d'injection maximum n'a pas été atteint - le bien être de l'animal le permet.

Remplacement

Cette étude nécessite l'utilisation de modèles animaux car elle adresse des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être représentés par des modèles plus simples (ex. modèle cellulaire ou computationnel). Pour toute demande de mise sur le marché, et quel que soit le pays de vente ciblé, il est indispensable pour les industries pharmaceutiques de prouver l’innocuité et l’efficacité d’une molécule. Avant de réaliser des essais cliniques, des tests in vitro et in vivo sont nécessaires. Les mécanismes d’apparition, puis de mise en place des troubles neurologiques, sont encore peu connus et nécessitent des explorations supplémentaires. Cette étude nécessite donc l'utilisation de modèles animaux car elle cible des mécanismes physiopathologiques complexes qui ne peuvent pas être récapitulés par des modèles plus simples (ex. culture de neurones).

Réduction

Dans ce projet, chaque animal est son propore contrôle et chaque animal recoit toutes les conditions pharmacologiques dans un ordre aléatoire (= plan d'étude croisée), ce qui permet de reduire le nombre de groupe d'animaux (évite d'avoir un groupe d'animaux contrôle). Le nombnre d'animaux nécessaire pour avoir des réultats significatifs est calculé avant d'établir le plan expérimental en utilisant des tests statistiques adaptés.

Raffinement

Dès réception, les animaux s'acclimatent 1 semaine à leur environnement. Une injection de morphinique sera faite avant la procédure chirurgicale et sera renouvelée 6 à 8 h après afin de prévenir toute douleur liée à la phase de chirurgie. Les chirurgies se déroulent sous anesthésie générale volatile. L'état de santé des animaux sera surveillé tout au long des expériences et évalué grâce à une grille codifiant le niveau de douleur et définissant les points limites adaptés. Cela permettra d’intervenir immédiatement et de manière appropriée dès le moindre signe de souffrance. Les animaux seront hébergés dans des cages individuelles avec enrichissement. Il sera proposé aux animaux, 1 fois par semaine pendant 30 minutes, un temps de regroupement et de sociabilisation au sein d'une enceinte contenant différents enrichissements.

Choix des espèces

Dans ce projet nous utiliserons des rats. Ces animaux présentent des similarités anatomiques et fonctionnelles avec le cerveau humain et notamment au niveau des activités électriques cérébrales spontanées et induites et ils peuvent être utilisés pour le développement de nouveaux médicaments. Les animaux sont manipulés au minimum à l’age de 8 semaines puisque nous souhaitons évaluer les modifications électrophysiologiques chez des animaux adultes, car les circuits, à cet âge là sont matures.

32 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une chirurgie fixe une ailette métallique sur le crâne, puis chaque souris est maintenue par la tête et imagée éveillée une fois par semaine pendant trois semaines pour valider une méthode d'échographie photoacoustique de l'activité cérébrovasculaire. Le porteur indique que l'ouverture du cuir chevelu peut provoquer une douleur au réveil et que la contention induit un stress qu'il compte atténuer par habituation. Les applications cliniques et l'étude de maladies neurodégénératives sont renvoyées au conditionnel et au long terme, l'objectif immédiat restant de valider l'outil d'imagerie.

Objectifs

Nous souhaitons étudier et valider une approche innovante d'imagerie non invasive de la fonction cérébrale chez la souris éveillée (mâles et femelles) grâce à l'utilisation des ultrasons à haute résolution associé à la photoacoustique.

Bénéfices attendus

Le développement de ce modèle nous permettra de mieux comprendre la fonction cérébrovasculaire chez des animaux éveillés en utilisant des approches novatrices d'imagerie non invasive. Ce modèle pourra être étendu à l'étude de pathologies comportementales ou de neurodégénérescence. À terme, nous pensons que l'imagerie fonctionnelle par échographie photoacoustique permettra d'identifier précocement des biomarqueurs de ces maladies, offrant ainsi un fort potentiel de transfert vers des applications cliniques

Procédures

La mise en place d'une ailette métallique sur le crâne de l'animal nécessitera une chirurgie peu invasive sous anesthésie et analgésie. La période de récupération post-chirurgicale sera de 7 jours. Une période d'acclimatation et d'habituation au système de fixation de l'ailette sur l'appareil de stéréotaxie sera réalisée pendant 7 jours. Cet appareillage permettra de maintenir la tête de l'animal sans entraver ses mouvements de marche. Le protocole d'imagerie par échographie/photoacoustique permettra l'enregistrement de l'activité cérébrovasculaire en réponse à différents stimuli. Ce protocole sera réalisé une fois par semaine pendant 3 semaines et durera de 20 à 30 minutes

Impact sur les animaux

L'intervention chirurgicale, impliquant l'ouverture de la peau du crâne et le placement d'une petite ailette métallique sur le crâne, peut provoquer une douleur chez les animaux au moment du réveil. En revanche, le suivi par échographie/photoacoustique à haute résolution est une approche non invasive et non douloureuse. La fixation de l'animal sur le système peut induire un stress temporaire (d'une durée de 20 à 30 minutes par animal), que nous atténuerons en habituant progressivement les animaux à ces procédures.

Devenir

L'ensemble des animaux sera euthanasié à la fin du suivi échographique/photoacoustique pour des analyses des organes en biochimie et en histologie.

Remplacement

Malheureusement, il n'existe pas de modèle alternatif (in vitro ou in silico) bien validé pour étudier l'activité cérébrovasculaire dans sa globalité. Il est essentiel d'avoir des neurones connectés aux cellules gliales, au système immunitaire et aux vaisseaux sanguins pour étudier l'activité neurophysiologique au fil du temps. Le modèle d'imagerie sur animal éveillé est largement utilisé, accepté, documenté et adopté par la communauté des neurosciences. Le modèle d'imagerie sur animal éveillé est largement utilisé, accepté, documenté, et est largement adopté par la communauté des neurosciences.

Réduction

Nous avons limité le nombre de souris au minimum nécessaire. Cette étude permettra de faire des analyses en longitudinales répétées sur chaque souris. Les mêmes séries d'animaux seront utilisées pour les explorations fonctionnelles et en histologie pour les explorations moléculaires. Enfin, nous avons prévu de créer une banque d'échantillons à partir des prélèvements qui seront effectués (organes et sang). Elle nous servira à la suite du projet ou encore pour des études préliminaires pour des nouveaux projets.

Raffinement

Pour réduire la souffrance et le stress des animaux, des mesures sont mises en place pour gérer la douleur et le stress, comprenant l'utilisation d'analgésiques jusqu'à la mise à mort. Pour améliorer le bien-être des souris, des matériaux de litière et des structures de repos adaptées, tels que des mouchoirs en papier ou des rouleaux en carton, sont installés dans les cages.

Choix des espèces

Nous avons choisi la souris en fonction des modèles nécessaires à notre étude, tout en respectant les principes scientifiques des 3R (Remplacer, Réduire, Raffiner) en recherche animale. Les souris sont fréquemment utilisées dans la littérature pour étudier la fonction cérébrale. Nous utiliserons des animaux âgés de 6 à 8 semaines pour étudier la fonction cérébrovasculaire, car il n'est pas techniquement possible de le faire chez des animaux plus jeunes. De plus, selon la littérature, la réactivité cérébrovasculaire en réponse à différents stimuli est optimale entre 6 et 8 semaines d'âge.

28 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Dans cette seconde partie de l'étude, elles subissent une ovariectomie sous anesthésie avec implant d'estradiol, des traitements intranasaux au sulfate de zinc et la pose d'une éponge intravaginale pendant douze jours, pour mesurer l'activation de neurones du bulbe olfactif par les odeurs de béliers. Le porteur signale des hématomes, douleurs et pertes de poids possibles après les interventions. Il justifie l'étude par l'"effet mâle" pratiqué en élevage et affirme qu'elle exige des "animaux entiers", les brebis étant euthanasiées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Chez les mammifères, les neurones exprimant la gonadolibérine (GnRH) ont un rôle déterminant dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ceux ci, permettent la stimulation des cellules de l'hypophyse et la sécrétion d'hormones gonadotropes (que sont les hormones lutéinisantes et folliculo-stimulantes). A leur tour, ces hormones vont agir sur les gonades (ovaires chez les femelles, testicules chez les mâles) pour stimuler la production de gamètes (ovules, spermatozoïdes) ainsi que la prodction d'hormones stéroidiennes (estradiol, progestérone), qui vont rétroagir au niveau central sur le cerveau formant ainsi une boucle de régulation. Il a été montré que, au niveau central, cette boucle de régulation est, chez les ovins, sensible à l'exposition aux odeurs des partenaires sexuels, permettant ainsi de stimuler également le comportement sexuel. Dans ce contexte, les neurones à GnRH de l'hypothalamus semblent être une cible de choix. Cependant, les neurones à GnRH sont également localisés dans le bulbe olfactif, et sont relativement peu étudiés dans le contexte des expositions olfactives de congénères. L'objectif de ce projet est donc de déterminer dans quelle mesure les neurones exprimant la GnRH et localisés dans le bulbe olfactif de la brebis sont stimulés par les odeurs de partenaires sexuels chez la brebis. Le projet se déroule dans 2 etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à étudier l'activation des neurones à GnRH présents dans le bulbe olfactif de brebis suite à l'exposition aux odeurs de mâles. Celui ci apportera une meilleure compréhension de l'implication de ces neurones dans l'effet mâle et donnera lieu à d'autres expérimentations visant à décortiquer le circuit neuronal contrôlant l'effet mâle.

Procédures

Sous anesthésie générale, les brebis seront soumises à des ovariectomies avec pose d'implant d'estradiol sous cutané ainsi que des traitements intranasaux au sulfate de zinc ou solution saline, des injections d'antibiotiques et d'anti-inflammatoires non stéroidiens. La procédure complète nécessite une anesthésie générale d'environ 30 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°1 (EU1). Les animaux seront soumis à 3 mises à jeun de 15h maximum, à la pose d'une éponge intravaginale (procédure d'une durée inférieure à une minute) qui restera en place pendant 12 jours, et à des déplacements de quelques minutes pour le transfert d'un batiment à un autre. Les batiments étant très proches les uns des autres, la durée estimée des déplacement sera inférieure à 15 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°2 (EU2).

Impact sur les animaux

A la suite de ces interventions, des hématomes, douleurs, perte de poids, de mobilité peuvent cependant être observées. Les différentes injections nécessaires aux anesthésies et les différentes étapes de transport peuvent engendrer du stress pour les animaux. La pose des éponges intravaginales peut aussi constituer un acte désagréable pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les tissus seront récupérés pour des études immunohistochimiques ultérieures

Remplacement

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entier et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique et préciser le rôle des neurones à GnRH du bulbe olfactif dans le contrôle de l'effet mâle.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Aussi, une partie des animaux utilisés dans le cadre de ce protocole sont des animaux issus d'un protocole précédent. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 9 animaux par type d'exposition afin d'obtenir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Nous raffinerons chaque procédure dans le but de réduire au maximum l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes lors des procédures afin de réduire le stress au maximum. Aussi, la priorité sera mise sur l'habituation des animaux au maniements et aux différents déplacements nécessaires à l'étude. Ces habituations permettrons de réduire le stress au maximum et d'obtenir des résultats beaucoup plus propres (le moindre stress pouvant induire une activation neuronale pouvant biaiser les résultats finaux). Le comportement (notamment l'isolement du groupe) et l'apparence des brebis sera suivi avec attention et les animaux seront pesés pendant 3 jours après l'ovariectomie, en pretant attention à ce que je lpourcentage de perte de poids ne dépasse pas 15%. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Dans tout les cas, la décision sera prise avec l'appui d'un avis vétérinaire. En cas d'hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l'naimal sera réanesthésié et nous rechercherons le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entiers et ne peux être substituée par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique. L'étude nécessite des animaux ayant une fonction de reproduction bien développée et mature, donc des animaux ayant passé le stade de la puberté. Ainsi les brebis auront atteint l'âge adulte.

28 brebis vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent une ovariectomie sous anesthésie avec pose d'un implant d'estradiol, des traitements intranasaux au sulfate de zinc, la pose d'une éponge intravaginale pendant douze jours et trois mises à jeun de quinze heures, pour étudier comment les odeurs de béliers activent certains neurones du bulbe olfactif. Le porteur indique que ces interventions peuvent provoquer hématomes, douleurs et perte de poids. Il rattache l'étude à l'"effet mâle" utilisé en élevage et affirme qu'elle exige des "animaux entiers", sans substitution possible, les brebis étant euthanasiées pour prélever leurs tissus.

Objectifs

Chez les mammifères, les neurones exprimant la gonadolibérine (GnRH) ont un rôle déterminant dans le contrôle de la fonction de reproduction. En effet, ceux ci, permettent la stimulation des cellules de l'hypophyse et la sécrétion d'hormones gonadotropes (que sont les hormones lutéinisantes et folliculo-stimulantes). A leur tour, ces hormones vont agir sur les gonades (ovaires chez les femelles, testicules chez les mâles) pour stimuler la production de gamètes (ovules, spermatozoïdes) ainsi que la prodction d'hormones stéroidiennes (estradiol, progestérone), qui vont rétroagir au niveau central sur le cerveau formant ainsi une boucle de régulation. Il a été montré que, au niveau central, cette boucle de régulation est, chez les ovins, sensible à l'exposition aux odeurs des partenaires sexuels, permettant ainsi de stimuler également le comportement sexuel. Dans ce contexte, les neurones à GnRH de l'hypothalamus semblent être une cible de choix. Cependant, les neurones à GnRH sont également localisés dans le bulbe olfactif, et sont relativement peu étudiés dans le contexte des expositions olfactives de congénères. L'objectif de ce projet est donc de déterminer dans quelle mesure les neurones exprimant la GnRH et localisés dans le bulbe olfactif de la brebis sont stimulés par les odeurs de partenaires sexuels chez la brebis. Le projet se déroule dans 2 etablissements utilisateurs.

Bénéfices attendus

Le présent projet vise à étudier l'activation des neurones à GnRH présents dans le bulbe olfactif de brebis suite à l'exposition aux odeurs de mâles. Celui ci apportera une meilleure compréhension de l'implication de ces neurones dans l'effet mâle et donnera lieu à d'autres expérimentations visant à décortiquer le circuit neuronal contrôlant l'effet mâle.

Procédures

Sous anesthésie générale, les brebis seront soumises à des ovariectomies avec pose d'implant d'estradiol sous cutané ainsi que des traitements intranasaux au sulfate de zinc ou solution saline, des injections d'antibiotiques et d'anti-inflammatoires non stéroidiens. La procédure complète nécessite une anesthésie générale d'environ 30 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°1 (EU1). Les animaux seront soumis à 3 mises à jeun de 15h maximum, à la pose d'une éponge intravaginale (procédure d'une durée inférieure à une minute) qui restera en place pendant 12 jours, et à des déplacements de quelques minutes pour le transfert d'un batiment à un autre. Les batiments étant très proches les uns des autres, la durée estimée des déplacement sera inférieure à 15 minutes. Ces interventions seront menées dans l'établissement n°2 (EU2).

Impact sur les animaux

A la suite de ces interventions, des hématomes, douleurs, perte de poids, de mobilité peuvent cependant être observées. Les différentes injections nécessaires aux anesthésies et les différentes étapes de transport peuvent engendrer du stress pour les animaux. La pose des éponges intravaginales peut aussi constituer un acte désagréable pour les animaux.

Devenir

Tous les animaux seront euthanasiés et les tissus seront récupérés pour des études immunohistochimiques ultérieures

Remplacement

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entier et ne peux être substitué par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique et préciser le rôle des neurones à GnRH du bulbe olfactif dans le contrôle de l'effet mâle.

Réduction

Notre protocole expérimental a été mis en place de sorte à réduire au maximum le nombre d'animaux utilisés. Aussi, une partie des animaux utilisés dans le cadre de ce protocole sont des animaux issus d'un protocole précédent. A la lumière des études publiées dans le domaine et de notre expérience, il nous sera nécessaire de constituer des groupes de 9 animaux par type d'exposition afin d'obtenir une puissance statistique suffisante.

Raffinement

Nous raffinerons chaque procédure dans le but de réduire au maximum l'inconfort, la douleur ou l'angoisse subie par les animaux. Les animaux seront hébergés en groupes lors des procédures afin de réduire le stress au maximum. Aussi, la priorité sera mise sur l'habituation des animaux au maniements et aux différents déplacements nécessaires à l'étude. Ces habituations permettrons de réduire le stress au maximum et d'obtenir des résultats beaucoup plus propres (le moindre stress pouvant induire une activation neuronale pouvant biaiser les résultats finaux). Le comportement (notamment l'isolement du groupe) et l'apparence des brebis sera suivi avec attention et les animaux seront pesés pendant 3 jours après l'ovariectomie, en pretant attention à ce que je lpourcentage de perte de poids ne dépasse pas 15%. Ce suivi permettra d'évaluer le bien-être des animaux et de décider de l'euthanasie ou le soulagement de la douleur des animaux suivant le stade d'atteinte des points limites. Dans tout les cas, la décision sera prise avec l'appui d'un avis vétérinaire. En cas d'hémorragie post-opératoire (muqueuses pâles), l'naimal sera réanesthésié et nous rechercherons le site hémorragique pour procéder à la suture vasculaire.

Choix des espèces

L'effet mâle est une pratique qui est utilisée en élevage pour induire l'activation de la fonction de reproduction en dehors de la saison sexuelle chez les animaux d'élevage. L'étude de l'effet mâle et des processus neurologiques mis en jeux nécessite, de fait, l'utilisation d'animaux entiers et ne peux être substituée par une approche alternative. Le modèle ovin a été choisi ici, car c'est un modèle pour lequel cet effet a été le plus caractérisé. Les résultats acquis par le présent projet viendront donc s'ajouter à la masse de connaissances sur le sujet afin de nourrir la compréhension du phénomène physiologique. L'étude nécessite des animaux ayant une fonction de reproduction bien développée et mature, donc des animaux ayant passé le stade de la puberté. Ainsi les brebis auront atteint l'âge adulte.

960 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. La moitié subit une ischémie oculaire chirurgicale de 90 minutes par augmentation de la pression, avec injections virales intravitréennes, tests visuels et électrorétinogrammes, pour étudier le rôle d'un récepteur des cannabinoïdes dans la protection des neurones de la rétine. Le porteur indique que la manipulation de l'œil peut provoquer douleurs, cataractes et baisse de l'acuité visuelle. Il affirme qu'une caractérisation in vitro a été menée mais que le mécanisme ne peut être étudié que sur un modèle de lésion in vivo, les yeux étant prélevés après la mise à mort.

Objectifs

La rétine, située dans l'œil, transforme la lumière en signaux électriques pour nous permettre de voir. Bien qu'elle se trouve en périphérie, la rétine fait partie du système nerveux central, composé de neurones et de cellules gliales, qui soutiennent les neurones. La perte de ces neurones peut entraîner une cécité irréversible. Le glaucome et la rétinopathie diabétique, qui sont les principales causes de cécité dans le monde, surviennent lorsque les neurones meurent à la suite d'une augmentation de la pression ou de l'obstruction d'un vaisseau. Les traitements actuels atténuent les symptômes sans se concentrer sur la protection des neurones. Des études montrent que certains composés dérivés du cannabis peuvent contribuer à sauver ces cellules en agissant sur des récepteurs spécifiques de l'organisme. Ce projet vise à comprendre comment cela fonctionne, offrant ainsi un espoir pour le traitement des maladies oculaires.

Bénéfices attendus

L'ischémie oculaire, présente dans des maladies rétiniennes telles que le glaucome et le diabète rétinopathique, provoque la mort des cellules responsables de la transmission visuelle au cerveau, entraînant une cécité incurable. Actuellement, le glaucome est la principale cause de cécité irréversible, touchant 3,5% des personnes de 40 à 80 ans. Un défi majeur est que la perte de vision commence en périphérie du champ visuel, souvent imperceptible, d'où son surnom de "maladie silencieuse". Lorsqu'elle est détectée, environ la moitié des neurones sont déjà perdus, irrécupérables comme dans la maladie d'Alzheimer. Les cellules de Müller, abondantes dans la rétine, jouent un rôle clé. Normalement, elles sécrètent des facteurs protégeant les neurones rétiniens, mais en cas de dommages, ces facteurs altérés déclenchent la mort des cellules ganglionnaires de la rétine, induisant la cécité glaucomateuse. Ce projet vise à élucider le rôle neuroprotecteur des cannabinoïdes dans la rétine pour développer des traitements sauvant les cellules ganglionnaires de la rétine de la mort en cas de dommages rétiniens, notamment l'ischémie oculaire. Avec de nombreux patients affectés, des traitements efficaces auront un impact social et économique majeur, améliorant la qualité de vie et économisant des ressources. À court terme, le projet permettra d'explorer le système endocannabinoïde rétinien. Le récepteur cannabinoïde, crucial dans divers processus physiologiques et pathologiques, reste peu étudié dans l'organe visuel. Bien que la fonction neuroprotectrice des cannabinoïdes dans la rétine soit établie, le mécanisme précis reste inconnu. Comprendre cette neuroprotection permettrait le développement de traitements spécifiques pour les maladies cellules ganglionnaires de la rétine-induites, offrant un espoir crucial pour ceux confrontés à une cécité irréversible.

Procédures

Ischémie oculaire (90min). Tous les animaux seront soumis à une intervention chirurgicale visant à provoquer une ischémie oculaire. La moitié d'entre eux appartiendra au groupe sham (seul l'œil sera canulé mais la pression ne sera pas augmentée) et l'autre moitié appartiendra au groupe ischémie oculaire (la pression sera augmentée). Cette procédure ne sera réalisée qu'une seule fois sur chaque animal et l'opération durera 90 minutes. Injection virale intravitréenne. A réaliser sur certains génotype d´animaux. Elle sera réalisée une seule fois et la procédure durera moins de 15 minutes. Test comportemental visuel (40min) et électrorétinogramme (25min). À effectuer sur tous les animaux à deux reprises : en préopératoire et en postopératoire. Traitement local aux cannabinoïdes (7jours) . À effectuer sur tous les animaux une fois par jour pendant 7 jours après l'opération. Traitement pharmacologique (8jours). À administrer à certains animaux, une fois par jour pendant 8 jours.

Impact sur les animaux

Les procédures expérimentales prévues sont généralement douces, à l'exception de l'ischémie oculaire, et ne devraient pas causer d'inconfort ou d'effets indésirables significatifs. Les procédures peuvent être regroupées en fonction de la similitude des effets indésirables. L'ischémie oculaire aiguë et l'injection intravitréenne sont des procédures chirurgicales au cours desquelles la chambre antérieure et la chambre postérieure de l'œil seront manipulées, respectivement. Les deux procédures ainsi que l'électrorétinogramme seront effectués sous anesthésie, ce qui pourrait entraîner une hypothermie. En outre, la manipulation de l'œil peut provoquer des douleurs, des cataractes et une baisse de l'acuité visuelle. Le traitement intrapéritonéal peut provoquer un stress aigu chez les animaux injectés. Enfin, les tests comportementaux visuels peuvent être stressants pour les animaux, même s'ils ont été habitués à ces tests. Afin de minimiser les effets négatifs des tests effectués, toutes les précautions possibles doivent être prises pour assurer le bien-être des animaux tout au long de l'expérience.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort et les yeux seront récupérés.

Remplacement

D'un point de vue méthodologique, nous nous sommes engagés à respecter les règles de remplacement, de réduction et de raffinement. Par conséquent, nous avons effectué une première caractérisation du système in vitro, où l'expression du récepteur CB1 dans les cellules d'intérêt : les cellules de Müller et les cellules ganglionnaires de la rétine a été testée. En outre, la littérature et l'expérience antérieure des deux groupes démontrent le rôle neuroprotecteur des cannabinoïdes dans un modèle de lésions. Cependant, le mécanisme détaillé par lequel les cannabinoïdes sauvent les cellules ganglionnaires de la rétine de la mort n'a jamais été étudié. Malheureusement, cette question ne peut être résolue qu'avec un modèle de dommage in vivo, car il n'est pas possible de reproduire in vitro la complexité des interactions rétiniennes d'une part et, d'autre part, l'ischémie oculaire due à l'augmentation de la pression intraoculaire.

Réduction

Afin de respecter le principe de réduction, nous nous engageons à utiliser le nombre minimum d'animaux strictement nécessaire pour tirer une conclusion statistiquement valable de cette population. Le laboratoire collabore avec des experts des pathologies oculaires et en particulier des maladies de la rétine, et possède donc une grande expérience dans leur étude et dans la création de modèles animaux de pathologies oculaires telles que l'ischémie. Lors d'une expérience pilote réalisée dans son laboratoire, le protocole d'ischémie oculaire a été affiné, ce qui permet de réduire le nombre d'animaux à utiliser. Les groupes expérimentaux ne doivent pas dépasser 12 animaux. Ce nombre de souris est le minimum requis pour obtenir une signification statistique et est cohérent avec les études précédentes utilisant des méthodologies similaires. Toutefois, si nos premières expériences démontrent qu'il est possible de réduire le nombre de souris, ce nombre sera réduit en conséquence. Ce nombre d'animaux/groupe a été fixé (i) par des calculs de puissance qui nous permettraient d'obtenir une différence significative pour les différentes variables d'intérêt à évaluer dans l'étude et de rejeter une hypothèse nulle, et (ii) en se référant à des publications dans le domaine (iii) en tenant compte de la variabilité que nous trouvons habituellement dans le comportement d'intérêt. En outre, nous essaierons de minimiser le nombre d'animaux en étudiant le comportement visuel avant et après le dommage et après le traitement. Le traitement statistique des données suit les conventions traditionnelles dans ce domaine. Les méthodes d'analyse statistique sont choisies de manière à minimiser le nombre d'animaux par groupe.

Raffinement

Les animaux de cette étude bénéficient d'une surveillance constante par un personnel qualifié et l'expérimentateur. Hébergées dans des cages collectives, elles ont accès à la nourriture et à l'eau, assurant leur bien-être physique. À leur arrivée à l'animalerie, elles ont une semaine pour s'acclimater au cycle jour/nuit.Tous les animaux seront opérés soit dans le groupe sham, soit dans le groupe ischémie oculaire. À cette fin, une anesthésie générale est appliquée. La température corporelle est surveillée, évitant l'hypothermie avec une couverture thermique. Avant l'opération, de l´analgésique est injectée aux animaux pour atténuer la douleur causée par l'opération. Pendant la chirurgie, l'œil opéré est maintenu humide avec du sérum physiologique. Après, une anesthésie locale est appliquée et elles sont logées dans des cages collectives enrichies. Une injection intrapéritonéale de médicament anti-inflammatoire est administrée pour prévenir la douleur et répétée pendant deux jours. Le suivi quotidien rigoureux par du personnel qualifié et l'expérimentateur permet de détecter toute douleur ou détresse. Le poids est enregistré à l'arrivée et une fois par semaine, avec des mesures quotidiennes les trois jours suivant l'opération. Une perte de poids excessive sur deux jours ou des signes graves déclenchent des mesures appropriées. Les animaux sont habitués aux procédures pour minimiser la souffrance. Des précautions sont prises pour assurer le respect maximal des procédures, garantissant le bien-être et la santé des animaux tout au long de l'expérimentation. Pour toutes les procédures, des seuils ont été fixés pour arrêter la procédure si le bien-être de l'animal ne peut être assuré.

Choix des espèces

La souris est le modèle animal privilégié en raison de ses nombreux avantages. Les circuits neuronaux de la rétine sont conservés entre les rongeurs et les humains, assurant la pertinence des résultats obtenus. De plus, le système visuel est bien caractérisé fonctionnellement et histologiquement, facilitant l'affinement des procédures et la comparaison des résultats avec la littérature existante. La disponibilité de souris transgéniques CB1 permettra d'explorer en détail le mécanisme d'action des cannabinoïdes dans la neuroprotection rétinienne, en identifiant les cellules cruciales pour cette protection. Enfin, les installations sont équipées pour l'étude systématique des souris, garantissant leur bien-être conforme aux normes requises. Les souris utilisées seront des souris adultes âgées de 7 à 16 semaines. Le modèle d'ischémie et son traitement seront réalisés sur des animaux adultes car l'organe visuel est entièrement développé pour l'étude.

72 rates gestantes ou allaitantes vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement d'organes, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles reçoivent un cocktail de polyphénols par gavage puis subissent quatre prélèvements de lait sous anesthésie, afin de mesurer le passage des composés dans le sang, le cerveau, le foie et les urines. L'objectif, présenté comme une étape vers un complément alimentaire destiné à la femme enceinte, prolonge des travaux antérieurs sur la neuroprotection de ratons soumis à une hypoxie-ischémie. Le porteur affirme que l'évaluation du métabolisme "nécessite une approche intégrative" sans remplacement disponible.

Objectifs

Les précédents travaux de l'équipe ont montré un rôle neuroprotecteur d'une supplémentation maternelle en polyphénols, dans le cadre de l'hypoxie-ischémie néonatale. L'administration orale de polyphénols chez des femelles Wistar gestantes ou allaitantes a induit une neuroprotection des ratons ayant subi une hypoxie-ischémie néonatale (modèle Rice-Vannucci). L'effet préventif des polyphénols s'est illustré par (i) une diminution des volumes lésionnels cérébraux, mesurée par IRM ainsi que par une préservation des aptitudes sensori-motrices des ratons mise en évidence par des tests comportementaux. Les doses utilisées étaient nutritionnelles, rendant impossible le suivi des polyphénols chez les mères de même que chez les ratons (doses inférieures au seuil de détectabilité). Afin d'attribuer les effets bénéfiques à un composé phénolique ou à un de ses métabolites et d'évaluer la capacité des polyphénols/métabolites à franchir les différentes barrières biologiques (placenta, barrière hémato-encéphalique), l'objectif du projet sera de mesurer dans différents tissus (urines, sang, cerveau, foie), les concentrations de polyphénols ainsi que de leurs métabolites, chez les mères ainsi que chez les ratons.

Bénéfices attendus

Les bénéfices attendus de ce projet sont une compréhension de la biodisponibilité et du métabolisme d'un cocktail naturel de polyphénols (extraits à partir du fruit de la passion), tant chez la rate gestante allaitante que chez les ratons (fœtus et nouveau-nés). Cela pourrait faire la lumière sur les effets bioactifs de ces molécules, ainsi que sur certains mécanismes d’action potentiels. Ce travail pourra participer à la mise sur le marché d'un complément alimentaire à destination de la femme enceinte.

Procédures

Les animaux seront soumis à : - un gavage. Fréquence : 1 fois. Durée : quelques secondes – prélèvements de lait. Fréquence : 4 fois. Durée : 10 min. - prélèvement d'organes après mise à mort. Fréquence : 1 fois.

Impact sur les animaux

Le gavage nécessaire à l'administration du cocktail polyphénolique pourra entraîner un stress des femelles. Les prélèvements de lait pourraient entraîner un inconfort et un stress. Ces prélèvements seront réalisés sur des animaux anesthésiés. L'anesthésie pourrait entraîner un changement du rythme cardiaque et/ou respiratoire, mesurés grâce à un capteur placé sous l'animal.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort afin d'effectuer les prélèvements d'organes nécessaires aux dosages permettant de quantifier les polyphénols ainsi que leurs métabolites.

Remplacement

Le but final du projet est d'évaluer la biodisponibilité d'un cocktail polyphénolique ayant montré, in vivo, une neuroprotection d'une supplémentation maternelle dans le cadre d'une hypoxie-ischémie néonatale. L'évaluation du devenir du cocktail et de son métabolisme nécessite une approche intégrative, il n'existe pas de remplacement disponible à notre modèle expérimental.

Réduction

Les dosages polyphénoliques seront réalisés sur un nombre minimum d'animaux permettant de réduire les erreurs standard à la moyenne intergroupe sous les 5%..

Raffinement

Pour le gavage, les rates seront conditionnées à la contention un à deux jours avant la procédure. Le gavage est une procédure délicate, il sera réalisé par un expérimentateur expérimenté. Une canule à bout rond en plastique à usage unique sera utilisée afin de limiter les risques de blessure pour l'animal (perforation du tube digestif). Le volume administré, à température ambiante sera inférieur à 10 ml/kg. En l'absence de détresse respiratoire et de reflux, l'animal sera remis à sa cage. Dans l'heure qui suit, les signes cliniques de l’animal suite à l’exécution d’un gavage seront surveillés (détresse respiratoire, muqueuse pâle, isolement). Au niveau de l'hébergement, les animaux seront en cage (mère + portée), sur une litière de peuplier, caractérisée par un fort pouvoir absorbant et une granulométrie adaptée. L'hébergement sera enrichi avec un nid végétal, du coton et un tunnel en carton. Les animaux seront observés de façon journalière par le zootechnicien et/ou la personne en charge de l'expérimentation. Lors de ces observations, la capacité de l'animal à s'alimenter, le comportement et sa vivacité, la couleur de la peau ou l'état du pelage seront vérifiés. Un échange quotidien avec le zootechnicien et l'expérimentateur permettra une intervention et une prise de décision rapide en cas de souffrance constatée.

Choix des espèces

Le rat présente des avantages par rapport à la souris qui rendent le choix de l'espèce pertinent : la physiologie du rat est plus proche de celle de l'homme que ne l'est la physiologie de la souris. Ce point est important puisque ce projet devrait, en partie, mener au développement d'un complément alimentaire destiné à la femme enceinte. Les animaux seront utilisés aux stades de développement : - adulte, afin de définir la biodisponibilité chez les femelles gestantes ou allaitantes - fœtal, afin de définir la biodisponibilité chez les fœtus ainsi que la capacité des polyphénols et métabolites à traverser la barrière placentaire - nouveau-né, âgés de 8 jours, afin de définir la biodisponibilité chez les nouveau-nés et de déterminer la part de l'allaitement dans la neuroprotection.