Système nerveux

60 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Chaque souris subit une chirurgie sous anesthésie pour provoquer un accident vasculaire cérébral par occlusion d'une artère cérébrale, reçoit des injections puis est tuée pour prélever son sang et ses tissus, afin d'étudier le rôle des cellules sanguines dans le défaut de recirculation. Le porteur indique que le modèle induit une douleur et une perte sensorimotrice, avec perte de poids et déshydratation possibles. Il justifie le recours aux souris par la durée de vie très courte des cellules sanguines et affirme que le projet ne peut s'envisager que dans un "organisme entier".

Objectifs

Chaque année, les accidents vasculaires cérébraux touchent plus de 13,7 millions de personnes, ce qui représente la deuxième cause de décès et la première cause d'invalidité dans le monde. Ceux-ci sont dans 80% des cas liés à l’occlusion d’une artère cérébrale par un caillot sanguin. La recirculation sanguine peut être réalisée par le retrait du caillot lors d’une intervention chirurgicale ou par sa dégradation grâce à l’injection intraveineuse d’un traitement médicamenteux. Cependant, même après la dégradation du caillot par ce traitement, la circulation sanguine reste insuffisante chez plus de 50 % des patients ce qui est à l’origine d’une évolution défavorable voire de leur décès. De nombreuses études cliniques et précliniques semblent indiquer que la principale cause de l'absence de flux sanguin est l’obstruction des capillaires par des cellules sanguines. L’objectif de la présente étude est de déterminer les mécanismes par lesquels les cellules sanguines bloquent les capillaires cérébraux. Notre hypothèse est que leur propriété de déformation et d’élasticité est diminuée après un accident vasculaire cérébral. Il a été récemment démontré qu’une enzyme modifie la forme des cellules sanguines et que l’inhibition de celle-ci améliore la circulation de ces cellules. L’inhibiteur n’a pas été testé dans un contexte d’accident vasculaire cérébral, mais pourrait être un outil intéressant pour réduire l’obstruction des vaisseaux cérébraux. Pour étudier cela, nous souhaitons réaliser des mesures d’élasticité des cellules sanguines de souris ayant subi un accident vasculaire cérébral traitées ou non par l’inhibiteur, afin de comprendre les mécanismes responsables de l’obstruction des capillaires. Cette étude pourrait permettrait d’améliorer la recirculation sanguine chez les patients victimes d’un accident vasculaire cérébral. La demande de ce projet d’expérimentation animale est justifiée par le fait que le modèle d’accident vasculaire cérébral chez la souris ne peut pas être remplacé par une approche in vitro.

Bénéfices attendus

Ce projet permettra de déterminer si l’obstruction des capillaires cérébraux par les cellules sanguines à la suite d’un accident vasculaire cérébral est due à une modification de leur élasticité ; à terme cela pourrait permettre d’identifier des cibles thérapeutiques afin de rétablir cette élasticité et d’augmenter la recirculation sanguine après un accident vasculaire cérébral et ainsi d’améliorer le pronostic des patients.

Procédures

Les animaux seront soumis à plusieurs types d’interventions : Les quatre traitements analgésiques seront réalisés par injection en sous cutanée. Chaque injection sera réalisée sur les souris vigiles et aura une durée d’environ 30 secondes. Une chirurgie sera réalisée sous anesthésie générales (avec une analgésie préalable) avec une durée d’anesthésie / chirurgie d’environ 45 minutes. Deux traitements par voie intraveineuse seront réalisés 30 minutes après le début de l’ischémie sur souris anesthésiées et seront d’environ 1 minute pour l’injection de l’inhibiteur ou de son solvant et de 30 minutes pour l’injection de l'activateur tissulaire recombinant du plasminogène; en effet, dans ce cas, 10% de la dose sont injectés en environ une minute, le reste (90%) est injecté pendant les 29 minutes suivantes à l’aide d’un pousse seringue. Une anesthésie générale profonde, avec aussi une analgésie préalable, d’environ 10 minutes sera réalisée lors de la fin de l’étude pour le prélèvement sanguin. Deux injections de solution physiologique pour la réhydratation post opératoire seront réalisées sur souris vigile en sous cutanée. Chaque injection sera d’une durée d’environ 30 secondes.

Impact sur les animaux

Le modèle d’accident vasculaire cérébrale induit une douleur peropératoire et une perte sensorimotrice. Une perte de poids et une déshydratation peuvent également être attendues. Un stress lié à l’anesthésie et des douleurs associées aux injections peuvent être présents lors des manipulations.

Devenir

La mise à mort est nécessaire pour récupérer le sang et des tissus

Remplacement

Le projet a pour but d’étudier le rôle des cellules sanguines dans la mauvaise recirculation sanguine survenant après un accident vasculaire cérébral. Les cellules sanguines ont une durée de vie très courtes (quelques heures) et il est nécessaire d’utiliser des cellules fraichement isolées de souris pour étudier leur comportement et maintenir leurs propriétés afin de mieux comprendre leur implication dans les vaisseaux sanguins après l’accident vasculaire cérébral. Ce projet ne peut s'envisager que dans un organisme entier.

Réduction

Nous avons réduit le nombre de souris utilisées au minimum nécessaire et suffisant pour valider scientifiquement notre étude du point de vue de l’analyse statistique. Les résultats obtenus seront analysés avec des tests statistiques adaptés. De plus, le nombre de cellules sanguines isolées à partir d’une souris est élevé, ce qui permet de réduire le nombre de souris nécessaires.

Raffinement

Afin de prévenir toute douleur qui pourrait être associée au modèle, les animaux recevront un traitement analgésique en pré- et post-opératoire. Avant la chirurgie, une anesthésie locale sera appliquée sur la zone de chirurgie. La chirurgie est par ailleurs réalisée au cours d’une anesthésie générale. En post-chirurgie une attention particulière sera portée aux animaux jusqu’au réveil. Après leur réveil, quelques croquettes pulvérisées au pilon humidifiées seront placée dans la cage, pour faciliter l’alimentation. De l’eau sous forme d’hydrogel sera également proposée. Un suivi clinique et une surveillance des animaux seront réalisés à l’aide d’une grille de score avec la mise en place de points limites. Tout animal présentant des signes de souffrance sera pris en charge selon le score. En cas de réouverture de la plaie chirurgicale lors du suivi post opératoire, elle sera nettoyée et un point de suture sera réalisé sous anesthésie générale ; pour permettre à l’animal de récupérer dans un environnement calme, il sera isolé dans une autre cage pendant le reste de l’expérience (inférieur à 24h). Les souris seront gardées 24 heures après l’accident vasculaire cérébral et le prélèvement de sang sera réalisé sous anesthésie profonde et traitement analgésique.

Choix des espèces

Des études précédentes ont montré la pertinence de la souris pour étudier les maladies cardiovasculaires. Le modèle d’occlusion de l’artère cérébrale moyenne réalisé chez la souris est lui-même reconnu pour reproduire la pathologie humaine de l’accident vasculaire cérébral, et permettre de mieux comprendre le phénomène chez l’humain. L’ischémie cérébrale étant essentiellement une pathologie de l’âge adulte, le modèle sera réalisé sur des souris adultes d’au moins 2 mois.

540 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Des souriceaux sont séparés de leur mère puis exposés de façon répétée à une baisse d'oxygène (hypoxie intermittente), avec imagerie du cerveau sous anesthésie et tests d'exploration, pour étudier les conséquences de l'apnée du sommeil de l'enfant. Le porteur indique que la séparation maternelle peut générer de l'angoisse et que le protocole ralentit la croissance, et que toutes les souris sont tuées entre 30 et 35 jours pour prélever leur cerveau. Il affirme que les méthodes sans animaux ne peuvent répondre à la complexité d'un "organisme entier" et juge le modèle animal "indispensable".

Objectifs

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil (SAOS) de l’enfant est une maladie fréquente (4% des enfants) responsable à moyen terme de difficultés scolaires, de troubles du déficit de l’attention avec ou sans hyperactivité et à long terme potentiellement de complications cardiovasculaires. Le SAOS est caractérisé par une alternance de périodes d’apnées et de périodes de respiration sans apnées. Durant les phases d’apnées, les patients présentent une diminution du taux d’oxygène (hypoxie) dans le sang pouvant être plus ou moins sévère. Le modèle de SAOS le plus utilisé est l'hypoxie intermittente caractérisée par des épisodes de diminution du taux d’oxygène dans le sang. Pour ce faire, nous faisons alors varier la quantité inspirée en oxygène et sa durée et mesurer les conséquences. Ce modèle permet donc d’étudier de façon spécifique les conséquences d’une hypoxie intermittente sur le plan cognitif et physiologique dans un modèle murin juvénile.

Bénéfices attendus

Le syndrome d’apnées obstructives du sommeil chez l’enfant est très peu étudié pourtant cela concerne beaucoup d’enfants (4% de la population). Ce projet permetterait de mieux comprendre les déterminants du pronostic de ce syndrome en terme de fonction cognitive (mémoire) et de fonction cardio-vasculaire. Une meilleure compréhension permet une meilleure prise en charge.

Procédures

Séparation maternelle de 2 fois 3h pour les souris âgées de 15 à 27 jours. Entre 30 et 35 jours de vie : ces souris seront soumises une fois à une courte anesthésie (30 minutes maximum) afin de réaliser une imagerie ultrasonore fonctionnelle à temps réel du cerveau . C'est une imagerie éveillée sur boîte cranienne et peau intactes (sans cranioctomie) ) qui mesure les variations du flux sanguin cérébral et renseigne ainsi l’activité cérébrale. Gestes techniques : prise de poids et de température, tests de comportements par exposition des animaux dans une arène vide puis dans une arène munie de deux objets, préhension des animaux pour la lecture du tatouage d'identification sur les pattes, pour le déplacement dans les chambres d'exposition et pour l’administration une fois d’anesthésiant et le rasage au niveau de la tête pour l'imagerie fonctionnelle

Impact sur les animaux

- séparation maternelle limitant le contact maternel pouvant générer de l'angoisse - troubles cardio-vasculaires selon le protocole d'hypoxie intermittente (hypoxie intermittente = épisode de diminution de la fraction inspirée en oxygène réalisée de manière intermittente et non continue) - croissance pondérale ralentit selon le protocole.

Devenir

Tous les animaux seront mis à mort avant prélèvement du cerveau pour des études histologiques entre 30 et 35 jours de vie.

Remplacement

Dans le SAOS, les études épidémiologiques enrichissent déjà les connaissances de la maladie mais sont limitées par la possibilité d’étudier plus finement les paramètres connus et ceux potentiellement contributifs pour des raisons éthiques évidentes des tests chez l’humain. Bien que des méthodes non-animales jouent un rôle important dans la recherche scientifique pour comprendre isolément des mécanismes, elles ne peuvent pas répondre à la complexité d’un système intégré d’un organisme entier. De plus, les animaux et les humains partagent une grande similarité aussi bien sur le plan anatomique, génétique que fonctionnel. Pour étudier les maladies humaines et répondre aux exigences de sécurité pour la santé humaine, l’utilisation de modèle animal est indispensable.

Réduction

Nos méthodes de mesures étant non invasives, nous privilégions au maximum une étude longitudinale ce qui réduit le nombre d’animaux utilisés. Ainsi, nous effectuerons le bilan physiologique (ventilation, fréquence cardiaque, croissance pondérale,....), cognitif (mémoire) et cérébro-vasculaire (activité neuronal, fluctuatio du débit sanguin cérébral) sur les mêmes portées. Compte tenu de la grande variabilité inter-individuelle dans les paramètres physiologiques, nous avons déterminé un lot expérimental de 30 animaux par groupe pour mettre en évidence une différence biologiquement significative. Si toutefois, par des analyses intermédiaires, nous obtenons une puissance statistique suffisante dans le test de nos hypothèses, nous n’augmenterons pas le nombre d’animaux pour respecter le lot de 30 animaux.

Raffinement

Mesures pour minimiser une possible angoisse des animaux : durée de mesure courte, regroupement des souris lors de l’exposition à l’hypoxie intermittente, fourniture d’une quantité de sciure maternelle dans les chambres d’exposition (boîtes dans lesquelles les souris sont exposées à l'hypoxie intermittente), remise à la mère d’une heure entre les 2 sessions journalière d’hypoxie intermittente afin de maintenir le contact maternel. Fréquence de la surveillance : pesée journalière pendant l’exposition à l’hypoxie intermittente (15 à 27 jours) et à chaque point de mesure (tests comportementaux, mesures physiologiques), vérification journalière pour les besoins en eau et nourriture de la mère et de sa portée, vérification journalière des points limites (état du pelage, du comportement de la souris dans sa portée et comportement de la mère envers sa portée). Une dose letale d'aneshésiant est administrée à l'animal avant le prélèvement de cerveau pour des études histologiques.

Choix des espèces

Les souris, étant des mammifères, elles sont suffisamment proches de l’Homme. Nous partageons 95% de nos gènes avec la souris. La souris est de petite taille, la reproduction est rapide car la durée de gestation est courte, la manipulation est facile ce qui en fait un modèle efficace pour la recherche. La période choisie pour l’exposition à l’hypoxie intermittente correspond à la petite enfance jusqu'au début de l’adolescence, période de manifestation du syndrome d’apnées obstructives du sommeil de l’enfant.

424 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Une partie reçoit des injections quotidiennes pendant quatorze jours, une autre subit une chirurgie du cerveau, et toutes passent un test de sociabilité de dix minutes avant une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde. Le porteur décrit un risque d'inflammation aux points d'injection et de complications post-opératoires comme une hémorragie ou une infection. Il conclut que l'autisme, faute de marqueur biologique, ne peut être modélisé qu'au niveau de l'animal entier exprimant son répertoire comportemental, et justifie ainsi le recours à la souris.

Objectifs

Parmi les troubles affectant la capacité à interagir socialement, les troubles du spectre autistique (TSA) sont les plus courants, touchant environ 1% de la population selon des études récentes à grande échelle. Ces troubles englobent des pathologies dont les causes sont connues (syndrome du X fragile, de Prader-Willi, de Rett) et d'autres dont l'origine reste inconnue, regroupées sous le terme de "troubles du spectre autistique" (TSA). Ce projet de recherche vise à approfondir notre compréhension des bases neurobiologiques des TSA et à développer des molécules atténuant les symptômes, en particulier les déficits d'interaction sociale, particulièrement impactants pour les patients et leurs proches. Le défi majeur ici est de trouver de nouvelles molécules agissant sur divers modèles précliniques des TSA. Des études récentes ont mis en évidence un déséquilibre dans la transmission d'informations nerveuses dans certains modèles de souris TSA, notamment celles présentant une déficience génétique pour des protéines spécifiques. Des traitements pharmacologiques ont montré des effets bénéfiques en atténuant les déficits sociaux et les comportements stéréotypés chez ces souris. Ces résultats indiquent que moduler l'activité de deux récepteur peut soulager ces symptômes. L'objectif actuel de la recherche est d'explorer les mécanismes biologiques sous-jacents à ces effets bénéfiques, en se concentrant sur des modèles murins d'autisme.

Bénéfices attendus

Le projet permettra une meilleure compréhension des populations de neurones impliquées dans le développement de l'autisme et proposera de nouvelles solutions thérapeutiques pour soulager cette pathologie.

Procédures

Une partie des animaux de nos procédures expérimentales seront soumis à des injections chroniques (14 jours) de composés par voie intrapéritonéale. Un groupe d'animaux subira une chirurgie stéréotaxique. Tous les animaux seront exposés à une tâche de sociabilité d'une durée de 10 minutes.

Impact sur les animaux

Des animaux seront soumis à des administrations répétées d'agents pharmacologiques par voie intrapéritonéale. On ne peut donc pas exclure une inflammation au niveau du site d'injection. D'autres animaux feront l'objet d'une chirurgie stéréotaxique. Ces animaux subiront donc une douleur post-opératoire, les conséquences d'une anesthésie et un risque de complication post-opératoire (hémorragie, infection). L'ensemble des animaux sera soumis à une perfusion intracardiaque sous anesthésie profonde.

Devenir

A la fin de chaque expérience, les animaux seront mis a mort pour des expériences ex-vivo ultérieur

Remplacement

e développement de nouvelles approches thérapeutiques pour le traitement de l'autisme nécessite la mise à disposition de la communauté scientifique de modèles précliniques de ces pathologies. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées ont été créées à cette fin, basées sur les mutations identifiées chez les patients autistes. L'évaluation des effets bénéfiques d'un traitement ne peut être réalisée dans ces modèles qu'au niveau comportemental. En effet, il n'existe pas de marqueur biologique pour l'autisme, et le diagnostic clinique repose entièrement sur une évaluation comportementale. Cette pathologie ne peut donc être modélisée qu'au niveau de l'animal entier, exprimant toute la variété de son répertoire comportemental.

Réduction

Les effectifs ont été calculés afin de permettre une réduction des effectifs optimisée permettant de suivre les recommandations éthiques en maintenant une puissance statistique adéquate

Raffinement

Nous prendrons en charge l’ensemble des contraintes que subissent les animaux au cours des expériences. Concernant l’hébergement, les souris seront regroupées en groupes sociaux de 2 à 4 individus, avec du matériel approprié pour la construction de nids (ouate et cabane en carton). Les animaux seront manipulés quotidiennement par le même expérimentateur. Pour réduire le nombre d’animaux, nous utiliserons des individus des deux sexes, les testerons dans différentes tâches, et appliquerons les tests statistiques appropriés. Pendant les expériences, nous surveillerons quotidiennement le bien-être des animaux, en particulier leur poids, leur posture et leur point d’injection. Pour les chirurgies, nous mettrons en place une procédure d'anesthésie appropriée (anesthésique associé à un analgésique), ainsi qu'un suivi post-opératoire renforcé. Nous administrerons un traitement anti-inflammatoire pour réduire la douleur, et nous assurerons un suivi quotidien de la cicatrisation de la plaie, du poids et de la posture des animaux. Des critères limites seront établis pour éviter toute souffrance inutile aux animaux. Bien que nous ne puissions nous passer du modèle animal, l'autisme étant une pathologie complexe, nous veillerons à minimiser la détresse des animaux en exprimant l'ensemble de leur répertoire comportemental.

Choix des espèces

Les souris sont des animaux sociaux chez lesquels les altérations des compétences sociales, symptômes clés de la pathologie autistique, peuvent être aisément étudiées. De plus, le répertoire comportemental de ces animaux est suffisamment étendu pour compléter cette étude par une évaluation de nombreuses autres réponses comportementales connues pour être affectées par la pathologie autistique. Plusieurs lignées de souris génétiquement modifiées sont disponibles pour modéliser cette pathologie au niveau préclinique. Les déficits comportementaux détectés chez ces souris modèles sont suffisamment importants et robustes pour permettre de révéler des effets bénéfiques potentiels de composés pharmacologiques. Les animaux seront utilisés à l’âge adulte (8-12 semaines), alors que le répertoire comportemental est totalement développé et les éventuels déficits comportementaux fixés.

2 152 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue pour prélèvement des tissus, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles subissent notamment une séparation maternelle quotidienne de trois heures pendant les trois premières semaines de vie, l'injection d'un composé perturbant la puberté, des prélèvements vaginaux quotidiens et jusqu'à seize prélèvements sanguins par coupure de la queue. Le porteur décrit la séparation maternelle comme une "situation de fort stress pour la mère et les petits" et reconnaît que les prélèvements répétés génèrent douleur et stress. Il affirme que l'animal vivant "ne peut être remplacé" faute de conserver le lien cerveau-gonades et qu'il n'existe "pas d'autre méthode ni de modèle alternatif" pour étudier l'âge de la puberté.

Objectifs

La puberté est une étape cruciale du développement qui permet d’assurer le maintien des espèces par la reproduction sexuée. Cette période se caractérise par l’acquisition de caractères sexuels secondaires et dépend de l’activation de neurones localisés dans une région spécifique du cerveau : l’hypothalamus. Une fois activés, ils sécrètent dans le sang une neurohormone : la GnRH ou gonadolibérine et sont donc appelés neurones GnRH. Cette sécrétion de GnRH est l’élément déclencheur de la maturation des gonades et de la puberté. L’activation des neurones GnRH, jusque-là en dormance, est donc une étape clé dont le moment est finement régulé. En général, la puberté débute entre 8 et 13 ans chez la fille, et entre 9 et 14 ans chez le garçon. Cependant, certains enfants souffrent de dysfonctionnement du développement cérébral altérant l’activation des neurones GnRH et entrainant une puberté qui survient trop précocement (puberté précoce centrale) ou bien qui ne démarre pas. Les causes de ces altérations sont encore largement méconnues. Notre projet a pour objectifs d’identifier les mécanismes permettant de contrôler l’activation des neurones GnRH et leurs perturbations lors de troubles de la puberté. Pour cela nous utilisons tout d’abord des approches in vitro sur des cultures de cellules neurales humaines reproduisant des mutations retrouvées chez des enfants atteints de troubles pubertaires soit des cellules directement issues de ces patients. Néanmoins, cette approche n’est pas suffisante car elle ne permet pas une observation intégrée. L’analyse in vivo de l’activité du système GnRH chez la souris est donc nécessaire afin de déterminer 1/ l’impact de l’environnement et 2/ le rôle des gènes mutés identifiés chez les patients, sur le fonctionnement des neurones GnRH, l’initiation de la puberté et les capacités reproductives. Ce projet permettra in fine de comprendre les mécanismes d’activation des neurones GnRH et le rôle combiné des gènes et de l’environnement sur l’âge de la puberté. Les résultats apporteront des données précieuses sur le contrôle par le cerveau de la reproduction et plus généralement renforcera nos connaissances du développement cérébral durant l’enfance.

Bénéfices attendus

Les capacités de reproduction s’acquièrent lors de la puberté, un moment clé du développement qui permet la transition de l’enfance à l’adulte. Il existe différents troubles pubertaires dont les répercussions peuvent être variables : allant de l’altération de l’âge de la puberté (précoce ou retardée) avec des retombées importantes sur la croissance et la psychologie de l’enfant, à des atteintes plus graves conduisant à l’infertilité. Nombreuses de ces atteintes ont pour origine un défaut du développement cérébral et plus précisément touchent le fonctionnement des neurones GnRH. Pour la plupart les causes et les mécanismes de ces dysfonctionnements restent incertains. Notre projet se base sur une approche multifactorielle (environnement externe et génétique) et interdisciplinaire alliant recherche clinique et fondamentale. Il permettra 1/ de développer des modèles murins reproduisant des troubles de la puberté similaires à ceux observés chez l’enfant 2/ d’identifier des facteurs génétiques et environnementaux important pour la puberté et la reproduction et 3/ de déterminer les mécanismes d’activation des neurones GnRH et ainsi de mieux contrôler la puberté et le moment de son initiation. Puisque la mise en place des neurones GnRH et leur activation font parties du développement cérébral, nos découvertes pourront apporter des connaissances plus larges et précieuses pour la compréhension du neurodéveloppement et de ces atteintes lors de pathologies neurologiques. Ce projet aura des retentissements importants dans le domaine de la santé publique puisqu’il y a une baisse de l’âge de la puberté depuis le milieu du 19ème siècle dont les causes restent incomprises. De nombreux facteurs semblent pouvoir être impliqués, le surpoids, les perturbateurs endocriniens et l’adoption. Notre projet permettra d’apporter des réponses cruciales sur les rôles de ces différents paramètres sur le développement cérébral et l’initiation de la puberté. Il est important de souligner que notre projet aura des impacts multiples et interdisciplinaires. En effet, plusieurs études ont montré que les pubertés précoces chez la femme sont plus souvent associées à la survenue de pathologies communes chez l’adulte telles que le cancer du sein ou le diabète, suggérant qu’il puisse exister des mécanismes communs. Ce projet pourrait ainsi identifier ces mécanismes et participer à la mise en place d’actions de prévention.

Procédures

Ce projet vise à déterminer le rôle de l’environnement et des gènes dans l’âge de la puberté et la reproduction. 4 facteurs seront testés : l’injection d’un composé qui perturbe le fonctionnement des régions cérébrales impliquées dans la puberté et la reproduction, la séparation maternelle et deux mutations génétiques. Les interventions seront réalisées sur des groupes d’animaux différents : -Injection unique ou deux injections espacées de 5h à 6h d’un composé qui perturbe la puberté à 8 jours après la naissance -Séparation maternelle quotidienne pendant 3h de 1 jour après la naissance à 21 jours de vie -Manipulation, observation et pesée quotidienne de 8 jours après la naissance jusqu’à l’âge adulte : Analyse de l’âge de la puberté. Ces manipulations n’excèderont pas 5 min par animal. Pour les femelles, dès l’ouverture vaginale (environ 30 jours après la naissance), des prélèvements vaginaux seront réalisés tous les jours jusqu’à l’âge adulte (environ 60 jours après la naissance). -Mise en accouplement durant 8 semaines -Prélèvements sanguins répétés à partir d’une coupure unique de l’extrémité de la queue préalablement analgésiées (lidocaïne en crème), puis massage (10 à 30 s / prélèvement). 16 prélèvements sanguins pour dosages hormonaux a différents temps, espacés de 20 à 60 min. Ce groupe sera soumis à une injection unique d’un composé activant les sécrétions hormonales, répétée deux fois à 15 jours d’intervalle. -Prélèvements rapide de queue (un prélèvement unique fait à 6 jours après la naissance)

Impact sur les animaux

Dans ce projet, différents effets nuisibles sont à prévoir : La séparation maternelle prévue est une situation de fort stress pour la mère et les petits. Les souris pourront ressentir un état de stress lié à la manipulation quotidienne par l’expérimentateur lors des mesures anatomiques (pesée, vérification de l’ouverture vaginale, de la séparation préputiale) Les souris pourront ressentir de l‘inconfort et stress durant les prélèvements vaginaux Une douleur légère de courte durée sera induite lors du prélèvement d’un bout de queue pour identifier la nature génétique des souris La coupure unique de l’extrémité de la queue lors des dosages hormonaux répétés pourra également être source de stress et d’inconfort. L’absence de cicatrisation lors d’une série de 16 prélèvements permet d’éviter la douleur lors des prélèvements répétés. Le volume total prélevé est très faible (moins de 3% du volume sanguin total) et aura été récupéré entre les deux séries espacées de 15 jours. La deuxième série qui a lieu après 15 jours de récupération, se fera sur une queue cicatrisée donc plus sensible ce qui pourra générer de la douleur et du stress lors de la première et unique incision.

Devenir

Les animaux seront euthanasiés à différents temps afin de pouvoir prélever les tissus en fin de procédure et analyser les cellules et leur fonctionnement. Cela permettra de mieux comprendre le rôle de l’environnement et des gènes sur le développement après la naissance des cellules cérébrales et l’impact sur l’âge de la puberté.

Remplacement

La puberté est un processus physiologique complexe et progressif qui débute lors de l’activation de neurones localisés dans le cerveau. Une fois activés, ces neurones sécrètent une neurhormone qui va agir au niveau des gonades. En réponse les gonades sécrètent des hormones stéroides sexuelles qui excercent en retour un effet sur le cerveau. Il s’agit d’une boucle cerveau-hormones-gonades dont le terme est la maturation totale de la fonction de reproduction. Afin de comprendre les rôles des facteurs environnementaux et génétiques sur la puberté, l’animal vivant ne peut être remplacé, car cela necessite de conserver le lien entre le cerveau et les gonades. Ce projet est mis en place pour apporter une analyse complémentaire et indispensable aux études in vitro réalisées dans l’équipe, à partir de lignées de cellules humaines et de cellules neurales produites à partir de cellules prélevées chez les patients. Il permettra de faire le lien entre les mécanismes purement cellulaires décrits in vitro et l’effet sur la physiologie de l’animal. L’ensemble de ces résultats apportera des données cruciales pour la compréhension des mécanismes d’initiation de la puberté et la contribution des gènes et de l’environnement sur l’âge de la puberté et la reproduction. Il n’y a pas d’autre méthode ni de modèle alternatif.

Réduction

LLe projet a été établi de manière à limiter au strict nécessaire le nombre d’animaux. Pour cela, les études in vivo font suite à des analyses préliminaires in vitro (culture cellulaire) qui certifient l’intérêt de l’utilisation de l’animal. Les expériences pour chaque procédure, seront réalisées séquentiellement et seules les expériences préalablement réalisées sur un groupe restreint d’animaux (124 souris) et qui montrent une altération de la puberté ou de la reproduction, seront reconduites pour une analyse plus poussée des mécanismes. Pour cela, une partie du projet utilise des souris génétiquement modifiées, dont le fond génétique est contrôlé et homogène avec des souris contrôles provenant des mêmes croisements que les souris mutées. Cela permet de réduire la différence de résultats entre les individus, donc de réduire le nombre d’animaux nécessaires pour observer des modifications significatives. En utilisant les mêmes animaux dans différentes expérimentations au cours d’une procédure (les animaux utilisés pour l’observation anatomique, la détermination de la puberté et l’étude des capacités reproductives seront également utilisés pour l’analyse des tissus, des cellules et des molécules), nous augmentons les mesures multiples sur un seul animal et réduisons le nombre d’animaux nécessaires à l’étude. La taille de l’échantillon est basée sur des études précédentes réalisées dans le domaine et tient compte : de la variabilité entre les différents individus et au sein du même animal ainsi que de la baisse d’effectif en cours de procédure (euthanasies expérimentales). Cet échantillon permet d’obtenir en fin de procédure un nombre d’animaux suffisant, en accord avec les études précédentes, pour une analyse statistique fiable.

Raffinement

Afin de prévenir tout mal être des animaux utilisés dans cette étude, ils seront quotidiennement monitorés par les membres qualifiés de l’animalerie pour s’assurer de leur bien-être. Tout comportement anormal est directement communiqué à la personne responsable du projet ou personnel formé participant au projet, qui fournira l’ensemble des soins nécessaires en concertation avec l’équipe vétérinaire. Les animaux seront également monitorés quotidiennement par les expérimentateurs confirmés responsables du projet et connaissant bien le modèle murin. Les animaux en cours d’expérimentation auront un double suivi : une surveillance quotidienne visuelle à heure fixe et une surveillance plus approfondie avec grille d’évaluation adaptée à l’âge de l’animal. Cette grille permettra d’évaluer par des critères objectifs le bien-être animal et de décider, en cas de souffrance s’il est préférable pour l’animal d’être euthanasié. Les protocoles expérimentaux ont été mis au point afin de prendre toutes les mesures nécessaires pour atténuer et à minimiser la douleur, la souffrance ou le stress subis par l’animal, ils incluent des périodes d’habituation, un renforcement positif, l’utilisation de crème analgésique et de produits anesthésiants. Ils permettront d’assurer le bien-être animal au cours de cette étude. Pour limiter le stress lié aux manipulations, les animaux seront préalablement habitués et seul l’expérimentateur ayant réalisé l’habituation sera en charge de réaliser les mesures. Afin de réduire le stress lié aux prélèvements sanguins et permettre l’habituation des animaux à cette procédure, une friandise pour rongeur de 2g morcelée au préalable en 16 petits morceaux sera apportée aux animaux après chaque prélèvement. Il n’y a pas de conséquence digestive. Les animaux seront hébergés en groupe en milieu enrichi (sopalin, maisons en plexiglas autoclavable rouge) pour minimiser leur stress.

Choix des espèces

A ce jour, la souris est le modèle mammifère le plus propice aux modifications génétiques. L’ensemble des modèles mutants et transgéniques indispensables à la faisabilité du projet ont déjà été développé, ce qui permet de faciliter et accélérer de façon considérable la réalisation du projet. Il existe une grande littérature sur la physiologie de la puberté et le fonctionnement des neurones de l'hypothalamus chez la souris contrôle. Cela permet d’avoir des références de comparaisons indispensables à l’étude, qui limiteront les besoins expérimentaux et le nombre d’animaux. Le laboratoire a une grande expertise dans le modèle murin et les travaux précédents de l’équipe ont ainsi permis d’identifier des gènes responsables troubles pubertaires et de comprendre les mécanismes impliqués. Les nombreuses collaborations de l’équipe avec des chercheurs travaillant sur la souris permettent de faciliter l’étude et d’assurer son accomplissement éclairé par le partage de connaissances et d’expertises. L’ensemble du projet est axé sur l’étude d’un phénomène développemental, qui justifie l’utilisation de souris à différents âges après la naissance. La puberté se fait relativement rapidement chez la souris autour de P30 chez la souris femelle et P40 chez le mâle. Enfin la durée de gestation relativement courte (environ 20 jours) et la facilité d’accouplement en fait un modèle de choix pour l’étude des capacités reproductives.

30 souris vont être utilisées, toutes tuées à l'issue, dans des procédures impliquant un niveau de souffrance modéré. Elles sont infectées par le cytomégalovirus murin puis soumises à une série de tests comportementaux, reconnaissance d'objets, préférence à l'eau sucrée et enfouissement de billes, pour tester l'hypothèse que les cytokines d'une infection induisent un état proche de la dépression. Le porteur indique que les souris génétiquement immunodéficientes contrôlent moins bien l'infection et peuvent perdre du poids et présenter douleur, stress et baisse d'activité. Il présente le travail comme une "étude pilote" et affirme qu'un "système vivant et complet" rend l'usage d'animaux "indispensable", les applications pour les patients dépressifs restant hypothétiques.

Objectifs

Le système immunitaire est requis pour la défense de l’hôte contre les agressions par différents types de pathogène (virus, bactéries, etc..). Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs clef du système immunitaire, en première ligne dans la reconnaissance des microbes. Lorsqu’elles détectent un pathogène, les DC produisent des molécules, dites cytokines, véhiculées dans tout le corps pour orchestrer l’activation de tous les autres acteurs du système immunitaire. Une production de cytokines dérégulée en temps et/ou en quantité peut avoir un rôle délétère, parfois fatal, sur l’individu infecté, comme observé récemment dans la Covid. Au cours des infections virales les cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) sont la principale source de cytokines dites Interférons (IFN), ainsi que de nombreuses autres cytokines inflammatoires. Les IFN sont indispensables pour établir une immunité antivirale efficace. Cependant, lorsque les pDC sont absentes ou incapables à produire des IFN, on n’observe pas chez l’hôte une sensibilité accrue aux infections virales. Etant donné que la capacité des pDC à produire des IFN est retrouvée dans la majorité des vertébrés, il est possible que cette fonction ait été conservée pour d’autres raisons. Notre hypothèse est que les cytokines produites par les pDC promouvraient, au-delà des réponses immunes, un état de prostration et d’isolement. Ceci aurait été initialement sélectionné au cours de l’évolution afin d’éviter la transmission de l’infection aux autres individus de la même espèce et éloigner le malade, affaibli par l’infection, du risque d’attaque de prédateurs. Ce type de comportement ressemble aux états dépressifs. D’ailleurs, des hauts taux de cytokines inflammatoires ont été retrouvé chez les patients dépressifs. L’exemple plus flagrant est représenté par les patients souffrant de tumeur ou d’hépatite C qui, lorsque traités avec des IFN, développent des syndromes dépressifs très sévères. Afin de tester cette hypothèse nous souhaitons effectuer une étude pilote sur souris ayant ou pas des pDC ou incapables de produire des cytokines inflammatoires. Nous utiliserons le modèle d’infection systémique par le cytomégalovirus murin (MCMV), un pathogène naturel de la souris, afin d’induire la production de hauts taux de cytokines inflammatoires, en particulier les IFN. Nous évaluerons l’impact de cette infection sur le comportement des souris par une batterie de tests comportementaux.

Bénéfices attendus

Nos travaux vont certainement contribuer à accroitre nos connaissances concernant les interactions entre systèmes immune et nerveux. Si notre hypothèse est correcte, il sera envisageable de cibler la production des cytokines, en particulier par les pDC, pour développer de nouvelles stratégies de thérapie pour les patients dépressifs. Ces nouvelles approches seront d’abord validées dans le modèle infectieux, ensuite elles pourront être étendues à d’autres contextes inflammatoires impliquant une activation de pDC, comme les maladies auto-immunes ou l’obésité.

Procédures

Les tests comportementaux ne représentent aucune source de douleur. Tous les tests sont effectués une seule fois. Les tests de localisation et de reconnaissance d'objets durent 20 minutes. Le test de préférence à l'eau sucrée dure 3 heures. Le test à enfouissement des billes dure 30 minutes. L’infection par MCMV est faite une seule fois en injectant par voie intrapéritonéale. L'infection dure entre 30 et 60 secondes maximum. Aucun prélèvement ou procédure chirurgicale sont prévus.

Impact sur les animaux

L'infection par le MCMV est généralement bien tolerée par les souris immunocompetentes. Les souris pDC-less tolèrent également bien l'infection par le MCMV, alors que les souris Myd88KO, étant immunodéficientes, contrôlent moins bien l'infection et peuvent avoir une morbidité accrue par rapport aux paramètres suivants: perte de poids, douleur, stress, inactivité, mobilité et posture.

Devenir

Mis à mort de tous les animaux car ils ne peuvent pas être utilisés pour d'autres expériences

Remplacement

Ce projet nécessite la mesure de différents paramètres de la réponse immunitaire et comportementale au cours d’une infection virale in vivo. Ainsi, l’intégration d’un système vivant et complet est indispensable, donc l'utilisation des animaux vivants est nécessaire. Nous effectuerons nos études avec des souris car nous pouvons disposer de modèles mutants pour les cellules et/ou molécules en étude.

Réduction

Nous utiliserons 30 souris pour mener à bien cette étude pilote. Tous ces animaux seront sous fond génétique homogène pour nous permettre de réduire le nombre d’animaux utilisés en évitant au maximum les variabilités interindividuelles des animaux sous fonds génétiques mixtes. Nous avons une expérience de très longue durée dans le protocole d'infection, ce qui nous permet d'obtenir des résultats statistiquement significatifs avec 5 souris/génotype/traitement. Les résultats obtenus seront analysés à l'aide de tests statistiques.

Raffinement

Les souris sont élevées dans des services de zootechnie exempts d'organisme pathogène spécifique (EOPS). EOPS). Pour limiter l’anxiété et l’impact environnemental, les souris seront hébergées en groupe de 2 à 5 individus dans des cages d’une superficie adequate, en conditions d'humidité, temperature et luminosité adaptées à leur physiologie. La nourriture et l’eau de boisson sont fournies ad libitum. Le change de la litière est réalisé 1 fois toutes les 2 semaines. Les animaux ont 1 semaine d’acclimatation avant que le protocole ne débute. Une surveillance journalière de routine de l'état des souris (toilettage, mobilité, poids, respiration) par les zootechniciens et l’expérimentateur permettra de détecter toute souffrance des animaux. Les animaux seront gardés tant que possible en groupes sociaux stables formés d’individus compatibles. Ils disposeront de matériel pour confectionner des nids et des dômes protecteurs. Pour les animaux affaiblis, l’accès à la nourriture et à l’eau sera favorisé. Les points limites ont été définis dans la procédure . Les animaux atteignant les points limites définis seront immédiatement euthanasiés.

Choix des espèces

La physiopathologie de la souris est suffisamment proche de celle de l’homme pour que son étude nous permette d’accroître nos connaissances sur le fonctionnement du système immunitaire et nerveux des 2 espèces. Nous avons maintenant formellement établi ce point en ce qui concerne l’étude des sous-populations de cellules dendritiques. Par ailleurs, la taille, la rapidité du cycle de reproduction et la génétique de la souris en font le modèle le mieux approprié pour les études envisagées pour lesquelles des animaux génétiquement modifiés sont nécessaires. Nous utiliserons des souris adultes à un age de 8-14 semaines car le système immunitaire rejoint sa maturité entre 2 et 3 mois d'âge.